ヒト腋窩における悪臭前駆体輸送の構造基盤
ヒト腋窩における悪臭前駆体輸送の構造基盤
https://elifesciences.org/articles/34995
グルディープ・S・ミンハス
ダニエル・ボードン
レイミー・ハーマン
ミシェル・ラッデン
アンドリュー・P・ストーン
A・ゴードン・ジェームス
ギャビン・H・トーマス
サイモン・ニューステッド
他、著者リスト
オックスフォード大学（英国
ヨーク大学（英国
ユニリーバ・ディスカバー（英国
et al.著者リストを展開
2018年7月3日
https://doi.org/10.7554/eLife.34995
オープンアクセス
著作権情報
記録のバージョン
査読と修正を経て出版が受理された。
ダウンロード
論文または論文の一部を様々な形式でダウンロードできるリンクの2部構成リスト。
ダウンロード(論文をPDFでダウンロードするためのリンク)
論文PDF
図表PDF
引用文献を開く(この記事の引用文献を様々なオンライン参考文献管理サービスで開くためのリンク)
メンデレー
この記事を引用する(様々な参考文献管理ツールと互換性のある形式でこの記事からの引用をダウンロードするためのリンク)
グルディープ・S・ミンハス
ダニエル・ボードン
レイミー・ハーマン
ミシェル・ラッデン
アンドリュー・P・ストーン
A・ゴードン・ジェームズ
ギャビン・H・トーマス
サイモン・ニューステッド
(2018)
ヒト腋窩における悪臭前駆体輸送の構造基盤
eLife 7:e34995.
https://doi.org/10.7554/eLife.34995
BibTeXをダウンロード
.RISをダウンロード
引用
共有
コメント (1)注釈を開く（現在このページには1件の注釈があります）。
公開された記録のバージョン
2018年7月25日（本バージョン）
全文
図表
概要
哺乳類は、さまざまな種類の社会情報を伝える揮発性の臭いを発する。ホモ・サピエンスでは現在、これが体臭として認識されており、その主要な化学成分は亜硫酸チオアルコールである3-メチル-3-スルファニルヘキサン-1-オール（3M3SH）である。揮発性の3M3SHは、特定の微生物の活動の結果として脇の下で産生される。この微生物は、結核の際に腋窩（脇の下）で分泌される無臭のジペプチド含有悪臭前駆体分子、S-Cys-Gly-3M3SHに作用する。これらの細菌がS-Cys-Gly-3M3SHを認識し、体臭を発生させるメカニズムはまだ十分に解明されていない。ここでは、スタフィロコッカス・ホミニスによるS-Cys-Gly-3M3SHの細菌輸送の構造的・生化学的基盤について報告する。S-Cys-Gly-3M3SHは細菌細胞質で亜硫酸チオアルコール成分3M3SHに変換された後、環境中に放出される。体臭形成に不可欠な前駆体輸送の分子基盤に関する知識は、ヒトにおける悪臭生成の特異的阻害剤を設計する新たな機会を提供する。
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.001
eLifeダイジェスト
ヒトの体臭には多くの化学物質が含まれるが、最も刺激的で認識しやすいのはチオアルコールである。これらの分子は、脇の下にある分泌腺で生成される無臭の前駆体から始まる一連の化学反応によって作られる。そして、スタフィロコッカス・ホミニスと呼ばれるバクテリアの一種がこれらの分子を取り込み、臭いチオアルコールに変化させる。細菌がどのようにしてこのようなことをするのか、その正確な詳細は明らかになっていない。
今回、Minhas、Bawdonらは、S. hominisがその膜にある輸送タンパク質を使って、無臭の前駆体をどのように内部に取り込むかを明らかにした。実験では、X線結晶構造解析などのツールによって、このトランスポーターが化合物を細菌内に移動させる際のスナップショットが撮影された。これにより、バクテリアがどのように前駆物質を認識するのか、またこれらの分子やトランスポーターの正確な構造を理解することができた。
この実験では、臭いを発生させないバクテリアも、この同じプロセスで前駆物質を摂取できることも明らかになった。このことは、臭いの生成は、これらの分子がホミニス菌の体内に入った時点で起こる独自のプロセスであることを示唆している。
この発見は、ヒトと体臭を発生させるバクテリアはおそらく一緒に進化してきたことを示唆している。他の哺乳類では、細菌による体臭の生産は、コミュニケーションや性的パートナーの選択に関与する化学物質であるフェロモンの放出と関連している。これがヒトにも当てはまるかどうかは定かではない。最終的には、S.ホミニスがどのようにして前駆体分子をチオアルコールに変換するのかを知ることで、体臭の芽を摘む新しい方法につながる可能性がある。
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.002
はじめに
ホモ・サピエンスの脇の下（腋窩）の皮膚は、細菌にとってユニークなニッチを提供している。皮膚や毛包に開口する様々な分泌腺からの分泌物を通じて、この環境は栄養に富み、ユニークな微生物群を受け入れている（Taylor et al.） エステル化脂肪酸やその他の脂質は皮脂腺から分泌され、エクリン腺からは乳酸やその他の有機溶質が分泌され、希薄な塩類溶液が生成される（Bovell, 2015）。第3の外分泌腺であるアポクリン腺はより特殊で、腋窩、乳輪、生殖器、外耳道にのみ存在し（Collins, 1989）、思春期の開始とともに無臭の脂質に富んだ粘性の分泌物を分泌し始める（図1A）。この脂質に富んだ分泌物はエクリン腺のような体温調節には関与せず、哺乳類では匂いの発生に関与している可能性が高い（Collins, 1989）。
図1
資産をダウンロードする 資産を開く
腋臭前駆体ペプチドS-Cys-Gly-3M3SHの生化学的経路。
(A）腋窩の模式図。皮膚表面は腋窩微生物叢で構成され、一般的にコリネバクテリウムかブドウ球菌が優勢である。腋窩アポクリン腺 ... もっと見る
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.003
ヒトにおいて、腋窩アポクリン腺、脇の下の細菌、体臭（BO）の間の関連性は、50年以上前に初めて認識され（Shelley et al.、1953）、この関係に関する初期の培養ベースの研究では、腋窩微生物叢はブドウ球菌、コリネバクテリウム、プロピオニバクテリウムの種で占められており、特にコリネバクテリウムは悪臭強度と相関していた（Taylor et al.、2003；Leyden et al.、1981）。より最近の培養によらないメタ分類学的研究により、腋窩はこれらの属で占められていることが確認されているが、培養に基づく方法ではこれまで指摘されていなかった分類群、特にAnaerococcus属とPeptoniphilus属に属するグラム陽性嫌気性球菌（GPAC）の存在も明らかになっている（Costelloら、2009；Egertら、2011；Troccazら、2015）。腋窩で産生される様々な分子が悪臭に関連しており、これには16-アンドロステン・ステロイド（Gowerら、1994）や、いくつかの代謝経路を経て腋窩細菌によって産生される短鎖（C2-C5）揮発性脂肪酸（VFA）が含まれる（Jamesら、2004）。しかし、現在では16-アンドロステンは腋臭のわずかな要因に過ぎないと考えられており（James et al.、2013）、BOに最も大きく関与するVFAは、アポクリン汗に存在するN-アシルグルタミン前駆体に由来する一連の構造的に特異な中鎖（C6-C10）酸であることが認められている（Natsch et al.、2003；Natsch et al.、2006）。第三の分子群であるチオアルコール（スルファニルアルカノールとも呼ばれる）は、最近、ヒトの体臭の重要な成分として同定され、脇の下から放出される揮発性物質の中に、これらの分子が多数検出されている（Troccaz et al.、2004；Natsch et al.、2004；Hasegawa et al.、2004）。これらは特に刺激性が強く、皮膚から発散される他の多くの揮発性化学物質よりも一桁低いpg.l-1の量で検出される（Natsch et al.、2004）。これらのチオアルコールの中で最も豊富で刺激的なものは、3-メチル-3-スルファニルヘキサン-1-オール（3M3SH）（図1B）であり、腋臭とそれに続くBOの主な原因分子である（Troccazら、2004；Hasegawaら、2004）。
チオアルコールは、毛包に直接分泌されるアポクリン腺から、ペプチドと共役した前駆体として放出されることが知られている（図1A）。チオアルコール前駆体の生合成起源は現在のところよくわかっていないが、無臭のグルタチオン抱合体としてABCトランスポーターABCC11を介して腋窩に分泌されると考えられている（Baumann et al.） グルタチオン抱合体（SG-3M3SH）は腋窩汗から検出されたことはないが、L-システイニルグリシンジペプチド抱合体であるS-[1-(2-ヒドロキシエチル)-1-メチルブチル]-L-システイニルグリシン（S-Cys-Gly-3M3SH）（図1B）は容易に検出される（Starkenmann et al、 2005）、そして最近、γ-グルタミルトランスフェラーゼ（GGT1）がアポクリン汗腺に局在し、SG-3M3SHをS-Cys-Gly-3M3SHに変換することが証明された（Baumann et al. 我々や他の研究者は、S-Cys-Gly-3M3SHが、腋窩に存在する極めて限られた範囲のブドウ球菌種、すなわちStaphylococcus hominis、Staphylococcus haemolyticus、Staphylocooccus lugdunensisによって取り込まれ代謝され、3M3SHを遊離し、その後、未定義のメカニズムで細胞外に排出されることを証明した（Troccaz et al、 2004; Starkenmann et al., 2005; Bawdon et al., 2015）。最近、S. hominisと体臭産生との間に強い相関関係が、腋窩微生物叢の培養に依存しない分類学的研究を用いて確立され（Troccazら、2015）、ヒトのBO産生における腋窩内のこの低存在種の生物学的意義が確認された。しかしながら、S-Cys-Gly-3M3SH前駆体分子がS. hominisおよび関連するチオアルコール産生菌に取り込まれるメカニズムは現在のところ不明であり、このプロセスを阻害してヒトの臭気産生を制御する新たなメカニズムを同定する努力を妨げている。
我々は、悪臭前駆体ペプチドS-Cys-Gly-3M3SHがS. hominisに認識され、特異的に輸送される生化学的および構造的基盤を明らかにした。我々はまず、S-Cys-Gly-3M3SHが、プロトン結合オリゴペプチドトランスポーター（POT）ファミリー（Hagtingら、1994；PaulsenとSkurray、1994）のメンバーである特異的な二次活性トランスポーター、STAH0001_1446（SH1446）を介して、S. hominisに積極的に取り込まれることを示す。構造的、生化学的、細胞ベースのアッセイを組み合わせて、このペプチド・トランスポーターがどのようにしてチオアルコール結合ペプチドを認識できるかを明らかにし、さらに、輸送が内向きのプロトン電気化学的勾配と結合していることを示した。この結果は、SH1446が悪臭生成を防ぐための阻害剤設計の明確なターゲットであることを示唆しており、ヒトの香り生成における皮膚微生物叢の役割について、さらなる分子的洞察を与えるものである。
結果
POTトランスポーターは大腸菌におけるチオール結合ジペプチドの輸送に必須である
チオール結合ジペプチドが細菌によってどのように輸送されるかを解明するため、まずモデル生物である大腸菌を調べた。大腸菌は、非生理的な悪臭前駆体であるS-ベンジル-L-システインのジペプチドバージョン、すなわちS-ベンジル-L-システイニルグリシンを認識し、代謝することができる（James et al.） 大腸菌の静止細胞は、確かにS-ベンジル-L-システイニルグリシンを溶液から除去し、分解してチオール活性産物であるベンジルメルカプタンを放出することができた（図2の図1A,B）。細胞内に輸送された後、ジペプチドは切断されてベンジルメルカプタンを放出しなければならないが、これはおそらくシステイン-S-共役β-リアーゼ型活性によるもので、大腸菌ではMetCやMalYなど多くの活性が報告されている（Dwivediら、1982；Zdychら、1995；Awanoら、2003）。興味深いことに、L-システイン脱離酵素活性を持つことが知られているトリプトファナーゼであるTnaA（Awano et al.
metCとmalYを個別に破壊しても、大腸菌が産生するベンジルメルカプタンの量は減少しなかったが、tnaAを破壊すると、生体内変換がほぼ完全に消失した（図2-図1C）。このことは、大腸菌がS-ベンジル-L-システイニルグリシンを取り込み、TnaAがS-ベンジル-システインを切断する前に、宿主のジペプチダーゼがグリシン残基を切断してベンジルメルカプタンを放出することを示唆している。
これらのチオール結合ジペプチドの輸送と代謝の遺伝的基盤を発見するために、我々は大腸菌K-12の単一遺伝子破壊のノックアウト（KO）ライブラリーを利用した（Baba et al.） われわれは、ジペプチド部分がペプチドトランスポーターを介して分子を誘導するのではないかと考えた。大腸菌では、主なペプチド輸送系は比較的よく特徴付けられており、ATP結合カセット（ABC）ファミリーとプロトン依存性オリゴペプチドトランスポーター（POT）ファミリーの2つが主な輸送系である（図2B）。大腸菌のOppおよびDpp ABCトランスポーターは、大腸菌および近縁のサルモネラ・チフスムリウムで広く研究されてきた（Smith et al.、1999；Klepsch et al.、2011；Abouhamad et al、 1991; Goodell and Higgins, 1987; Tame et al., 1995）、およびOppおよびDpp系（ΔDB1）が機能しない大腸菌BW25113株を用いて、ベンジルメルカプタンの生産におけるこれらのトランスポーターの役割を評価した。驚くべきことに、ベンジルメルカプタンの生産は野生型株と同様であったことから、どちらのABCトランスポーターもCys-Gly結合体の輸送には重要ではないことが示唆された（図2A）。ABCペプチドトランスポーターを介した輸送が除外されたので、次に、大腸菌で報告されている追加のペプチドトランスポーターを含めるために検索範囲を広げた。これらはdtpA-Dがコードするプロトン依存性オリゴペプチドトランスポーター（POT）ファミリーの4つのメンバーであり、ペプチド上での増殖中の生理的役割はあまり定義されていない（Harder et al、 2009）、CstAタンパク質、そのオルソログがペプチドトランスポーターであることが証明されている（Garai et al.、2016）、カチオン性抗菌ペプチドの取り込みに関与するSap系（Groisman et al.、1992）。これらの菌株のほとんどは、野生型と同レベルのベンジルメルカプタン産生を示したが、dtpBは例外で、チオール産生が全体的に50％低下した（図2A）。これらのデータから、POTファミリーに属するトランスポーターがCys-Gly-(S)結合体の輸送を担っている可能性が高いことが示唆され、Cys-Gly-(S)結合体の取り込みにおけるPOTトランスポーターの新たな生物学的役割が明らかになった。
図2と5つの補足
アセットをダウンロードする アセットを開く
モデル生物E.coli K-12によるモデル基質（S-ベンジル-L-システイニルグリシン）と生理的基質S-Cys-Gly-3M3SHの生物変換。
(A)既知または予測されるペプチドトランスポーターの欠失を有する大腸菌株によるS-ベンジル-L-システイニルグリシンの生物変換。ΔDB1株はoppA dppA二重変異株である。チオアルコール収量 ... 詳しく見る
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.004
図2-図5
資産をダウンロードする 資産を開く
L-AlaペプチドはTnaAによるCys-3M3SHのin vitro切断を阻害しない。
1μMの精製TnaAと1mMのCys-3M3SH基質を、L-Alaペプチドの濃度を変えながら37℃で30分間インキュベートした。反応液50μLをDTNBで標識し、A412nmで測定した。... もっと見る
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.009
図2-図4
アセットをダウンロードする アセットを開く
L-Alaペプチド存在下でのCG-3M3SHの生体内変換の阻害。
CG-3M3SHの生体内変換はDTNBアッセイで測定した。OD600nmの細胞を2.5 mMのCG-3M3SHと様々な濃度のL-Alaペプチドとインキュベートした。チオラコール収量 ... もっと見る
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.008
図2-図3
アセットをダウンロードする アセットを開く
ブドウ球菌SH1446オルソログの系統関係。
(A) S. hominis SK119におけるS. hominisトランスポーター遺伝子SH1446およびSH0415のゲノム状況。(B）ブドウ球菌POTトランスポーターの系統樹。樹は最尤法を用いて構築された。
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.007
図2-図2
アセットをダウンロード アセットを開く
DtpBは大腸菌K-12におけるS-ベンジル-L-システイニルグリシンの生物変換を増加させるが、S. hominisトランスポーターSH1446は増加させない。
(A）大腸菌トランスポーターDtpA, DtpB, DtpC, DtpDを過剰発現した大腸菌K-12によるS-ベンジル-L-システイニルグリシンの生物変換。エンプティーベクター」とは、pBADcLIC2005を発現させた大腸菌で、遺伝子 ... もっと見る
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.006
図2-図1
アセットをダウンロードする アセットを開く
大腸菌K-12によるチオール結合ジペプチドの取り込みと生体内変換。
(A)静止大腸菌K-12細胞によるS-ベンジル-L-システイニルグリシン除去の薄層クロマトグラフィー解析。US'と表示されたレーンは、細胞が存在しない基質である。
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.005
大腸菌に悪臭生産をもたらすS. hominis由来POTトランスポーターの同定
大腸菌がCys-Gly-(S)結合基質を輸送し、切断する能力を持つことを確立したことから、POTトランスポーターを過剰発現させることで、生理的な悪臭前駆体S-Cys-Gly-3M3SHを認識する能力を付与できるのではないかと考えた。つのdtp遺伝子を、膜トランスポーターの過剰発現によく使われるpBADベクターにクローニングし（Mulligan et al. その後、得られた菌株のS-Cys-Gly-3M3SHを3M3SHに変換する能力を測定した（Bawdon et al.） 図2Aで報告されたベンジルメルカプタン産生の低下と一致して、dtpB遺伝子は単独で大腸菌に悪臭産生（BO+）表現型を付与することができたが、これは他のdtp遺伝子では見られなかった（図2C）。同じパターンがS-ベンジル-Cys-Glyを基質として観察され（図2-図2B）、DtpBがこのような珍しい共役ペプチドを輸送するユニークな能力を持っていることが示唆された。
悪臭を産生するブドウ球菌におけるS-Cys-Gly-3M3H輸送の分子的基盤は不明であり、また、これらのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌種は遺伝学的に難解であるため、遺伝学的アプローチによる研究は困難である。そこで我々は、トランスポーターのトランスでの発現が大腸菌にBO+表現型をもたらすという発見を利用した別のアプローチを用いた。大腸菌POTファミリーのペプチドトランスポーターがS-Cys-Gly-3M3SHを輸送するという発見を踏まえ、我々はS. hominis SK1119のゲノムを調べた。大腸菌とは異なり、S. hominisには単一のPOTファミリーメンバーDtpT（SH1446）のみが存在し、そのオルソログは配列決定された全てのブドウ球菌に見られた（図2-図3A）。よく研究されている黄色ブドウ球菌では、dtpTによってコードされる単一のPOTトランスポーターが、この種におけるジペプチド取り込みの唯一の経路であるが（Hiron et al.） また、STAHO0001_0415（SH0415）がコードする第二の系も同定した。これはMFSトランスポーターとしてアノテーションされており、チオアルコール生産者として知られるS. hominisとS. haemolyticusにのみ存在し、ペプチドとアミノ酸代謝に関わる遺伝子と遺伝的に関連している（図2-図3B）。両方のトランスポーターをpBADcLIC2005にクローニングし、機能解析のために大腸菌に形質転換した。これらの株で3M3SH産生レベルを測定したところ、取り込みはSH1446の存在によってのみ促進され、SH0415は3M3SH活性にほとんど影響を及ぼさなかった（図2D）。対照的に、基質としてS-ベンジル-システイニルグリシンを用いた場合、SH1446ではベンジルメルカプタンの産生量の増加は見られなかったが、SH0415では有意な増加が観察された（図2-図2B）。これらのデータを総合すると、S. hominisのS-Cys-Gly-3M3SHトランスポーターはPOTトランスポーターSTAH0001_1446（SH1446）であるという結論が強く支持される。
S-Cys-Gly-3M3SHの生理的輸送におけるSH1446の重要性をさらに証明するために、我々は生化学的アプローチを用いて、ペプチドがS-Cys-Gly-3M3SHの取り込みと競合することによって3M3SHの産生を阻害できるかどうかを調べた。まず、SH1446をトランスで発現させたときに3M3SH産生が見られる大腸菌の系を用いたところ、ジ-アラペプチドとトリ-アラペプチドの両方で3M3SH産生の明らかな阻害が観察された（図2-図4）が、L-アラ単独やテトラ-アラでは観察されなかった。Cys-3M3SHを切断する精製TnaA酵素は、これらのペプチドでは阻害されなかった（図2-図5）ことから、細胞全体の阻害はペプチド輸送の阻害によるものであるという仮説が支持される。同様に、S. hominisで直接3M3SH産生を阻害する同じペプチドの能力を測定したところ（図2-図4 ）、同等のプロフィールが観察された。S. hominis野生型では、25 mM tetra-Alaで有意な影響が観察されたが、この影響はペプチドを溶解するのに必要な酸性pHによるもので、S. hominisでは代謝を阻害するが、大腸菌では阻害しないようである。
S. hominisのPOTトランスポーターPepTShはS-Cys-Gly-3M3SHを輸送する。
POTトランスポーターはMajor Facilitator Superfamily (MFS)に属し、内向きのプロトン電気化学的勾配を利用して、代謝同化のために細胞膜を横切ってジ-およびトリ-ペプチドを濃縮的に取り込む (Daniel and Kottra, 2004)。SH1446がS-Cys-Gly-3M3SHの認識と輸送を担うタンパク質であることを証明するために、この遺伝子をクローニングし、大腸菌で過剰発現させ、機能的および構造的研究を行った。精製されたタンパク質（以下PepTSh（Peptide Transporter Staphylococcus hominis）と呼ぶ）は精製され、リポソームに再構成された。リポソームの内部pHの変化を介して輸送を測定する（Parkerら、2014）、以前に採用されたピラニンベースのレポーターアッセイを用いて輸送を研究した（図3A）。リポソーム内腔の酸性化は、膜電位（ΔΨ、内部がマイナス）の存在下、外部のジ-またはトリ-ペプチド基質の添加で観察され、PepTShがプロトン結合ペプチド輸送体であることが示された。重要なことは、S-Cys-Gly-3M3SH前駆体ペプチドの存在下での酸性化も観察されたことで、PepTShがS. hominisのこの分子のトランスポーターであることが確認されたことである。
図3
アセットをダウンロード アセットを開く
PepTShの機能的特徴。
(A）pH感受性色素を用いたプロトン結合ペプチドの取り込みモニタリング。PepTShはピラニンと高濃度のカリウムイオンを含むリポソームに再構成された。外部溶液... もっと見る
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.010
天然ペプチドと比較したS-Cys-Gly-3M3SHの認識を理解するために、3H-ジ-アラニンとの競合を用いてIC50値を決定した。トリ-アラニン、ジ-アラニン、Cys-GlyのIC50値はそれぞれ23.7±3.4、72.2±9.7、115±22.2μMであり（図3B）、PepTShはジ-アラニンよりもトリ-アラニンを認識できることが示された。 しかし、S-Cys-Gly-3M3SHのIC50値は362±21.8μMで、Cys-Glyペプチドよりも3倍高かった。したがって、我々のデータは、PepTShは修飾ペプチドを輸送することができるが、システイン側鎖にチオアルコール基を付加することによって、天然ペプチドに対する認識と輸送が大幅に損なわれていることを示している。
S-Cys-Gly-3M3SHと結合したPepTShの結晶構造
基質結合のメカニズムについてさらに理解を深めるために、我々はメソ結晶化法を用いてS-Cys-Gly-3M3SHと結合したPepTShの2.5Åの高分解能共結晶構造を得ることに成功した（図4A、表1、図4-図1）。PepTShはH1-H6がN末端の束を形成し、H7-H12がC末端の束を形成する標準的なMFSフォールドを採用している。PepTShは、POTファミリーの他のメンバーで以前に観察された（Newstead, 2015）、内向きに開いた状態で結晶化され、N末端とC末端のバンドルからそれぞれH1-2とH7-8らせんからなる細胞外ゲートが閉じ、H4-5とH10-11らせんからなる細胞内ゲートが開いている。他の細菌POTファミリーメンバーと同様に、PepTShはN末端とC末端のバンドルの間に挿入された2つの付加的ならせんを含み、HAとHBと呼ばれている（図4Bと図4-図2）。しかしながら、これまでのPOT構造とは異なり、PepTShは膜の細胞外側のヘリックスH7とH8の間に、脂質の頭部基と一直線上に伸びる、よく構造化されたβ-ヘアピンモチーフも含んでいる。興味深いことに、β-ヘアピンと、HAとHBの間にできたトランスポータードメインとの空洞の両方に、多くのモノオレイン脂質分子が集まっているのが観察された。原核生物のPOTファミリートランスポーターヘリックスHAとHBの役割はまだ不明である。しかしながら、これらのヘリックスとトランスポートドメインの間に結合した脂質分子が観察されたことから、これらのトランスポーターを膜内で安定化させる役割の可能性が示唆され、これはPOTファミリーの原核生物メンバーに特異的な適応かもしれない(Newstead et al., 2011)。
図4と4つの補足
アセットをダウンロードする アセットを開く
PepTShの結晶構造。
(A) PepTShの結晶構造を膜平面で示す。N末端の束であるH1-H6を構成する膜貫通らせんは緑色で着色されており、C末端の束である... もっと見る
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.011
図4-図4
アセットをダウンロードする アセットを開く
S-Cys-Gly-3M3SHの結合位置と、PepTStと共結晶化した天然のジおよびトリペプチドとの比較。
(A) S-Cys-Gly-3M3SH（オレンジ）と結合したPepTSh（青）と、L-Ala-L-Phe（ピンクの棒）と結合したPepTSt（緑）を重ねたもの（PDB: 4D2C）。(B) (A)のPepTShの等価図であるが、L-Ala-L-Pheで結合したPepTSt（緑）と重ねた。
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.015
図4-図3
アセットをダウンロードする アセットを開く
修飾ペプチドS-Cys-Gly-3M3SHと結合したPepTShの構造。
膜の平面から見たPepTShの漫画表現。N末端とC末端の束はそれぞれ緑と青に着色されている。S-Cys-Gly-3M3SHは... もっと見る
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.014
図4-図2
アセットをダウンロードする アセットを開く
PepTShとヒト腋窩に存在する細菌種およびヒトペプチドトランスポーターとの配列アラインメント。
厳密に保存されたアミノ酸は赤で示されている。類似のアミノ酸は青い枠で囲んである。PepTShの膜貫通らせんの位置は、タンパク質配列の上にハイライトされている。
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.013
図4-図1
アセットをダウンロードする アセットを開く
PepTShの最終精製電子密度マップ。
(A) PepTShの最終的な2mFo-DFc電子密度マップ。(B）H1およびH2の電子密度マップの拡大図（特定の側鎖のラベル付き）。
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.012
表1
データ収集と精密化の統計。
括弧内は最高分解能シェルの統計。
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.016
PepTSh
(PDB: 6EXS)波長0.8729分解能範囲45.1-2.5 (2.589-2.5)空間群P 1 21 1単位セル60.04 55.576 100.866 90 104.749 90全反射151797 (14474)ユニーク反射22501 (2204)多重度6. 7 (6.6)完全性(%)99.43 (99.73)平均I/シグマ(I)9.76 (1.48)ウィルソンB因子43.87R-マージ0.159 (1.28)R-ミース0.172 (1.39)R-ピム0.07 (0.54)CC1/20.997 (0.59)CC*0.999 (0.) 86)精密化に使用した反射22504 (2204)R-freeに使用した反射1137 (110)R-work0.21 (0.21)R-free0.23 (0.24)CC(work)0.88 (0.69)CC(free)0.85 (0.52)非水素原子の数4063高分子3614配位子384溶媒65タンパク質残基487RMS(結合)0. 01RMS(角度)1.04ラマチャンドラン有利(%)98.35ラマチャンドラン許容(%)1.65ラマチャンドラン外れ値(%)0ロータマー外れ値(%)1.47Clashscore2.59平均B因子57.0高分子54.72リガンド80.53溶媒51.2
広範なスクリーニングと共結晶化の結果、ペプチド結合部位のS-Cys-Gly-3M3SHリガンドについて、明確なmFo-DFc差電子密度が観察された（図4Cおよび図4-図3）。前駆体のCys-Gly部分は、ペプチドのカルボキシ末端が結合部位の細胞内側に向くように配置されている。末端のカルボキシル基は2つの水素結合相互作用をする。1つはH1のTyr41と、もう1つは水分子（W107）との相互作用で、カルボキシル基はH8のAsn347と結合する。CGペプチドのカルボニル基もこの水分子と水素結合を作り、ペプチドとAsn347の間によく協調した相互作用ネットワークを作っている（図4D）。末端アミノ基は、Tyr41の隣に位置する水分子と、H8のさらに上に位置するGln344のカルボニル基と、さらに2つの極性相互作用をする。対照的に、チオアルコール部分は細胞外ゲートの方を向いており、硫黄原子はH7上のGln310の近くに位置し、アルコール基はヘリックスH8に向かって伸びており、それぞれPhe343とAsn347の骨格カルボニル基とアミド基と相互作用している。アシル基はヘリックスH7とH10の間にある大きなポケットに伸びている（図4E）。この長いポケット（〜10Å）は、中央のペプチド結合部位からトランスポーターのC末端束へと伸びており、疎水性と極性の両方の性質を持っている。
以前我々は、関連するPOTファミリーのトランスポーターであるPepTStが、結合部位で異なる向きのペプチドを結合できることを示し（ジペプチドは水平に、トリペプチドは垂直に）、この柔軟性が大きなペプチドリガンドの適合に関与している可能性を示唆した（Newstead, 2017）。しかし、相互作用には大きな違いがある。S-Cys-Gly-3M3SHペプチドの構造を重ね合わせると、PepTStで捕捉された天然ペプチドと比較して、結合部位のかなり上の方に位置していることがわかる（図4の補足4AとB）。これはアミノ末端とカルボキシ末端の位置に関してもノックオン効果がある。PepTStでは、ジペプチドのアミノ末端基はヘリックスH8とH10と直接相互作用するが、トリペプチドはカルボニル基を介してはるかに弱い相互作用をする。対照的にPepTShでは、この相互作用は水を介した水素結合によって達成される（図4D）。
ペプチドとその結合部位との間の相互作用を媒介する水の役割は、側鎖に依存しない結合ではあるが、ABCトランスポーターの結合ドメインで以前に観察されている (Tame et al., 1995)。我々がS-Cys-Gly-3M3SHで観察したように、立体的に制限されている場合、ペプチドとトランスポーターの間の直接的な相互作用を置き換えることによって、修飾ペプチドの輸送を促進するために、PepTShによって同様のメカニズムが採用されているのかもしれない。ペプチドのアミノ末端と哺乳類と細菌のPOTファミリー・トランスポーターとの相互作用は、高親和性結合を促進するものとして同定されている（Weitzら、2007；Meredithら、2000）。従って、PepTShの修飾ペプチドのIC50値の減少（図3B）は、伸長した側鎖基の収容による立体的拘束と、それに続く結合部位における保存側鎖とアミノ基とカルボキシ基との相互作用の位置に対するノックオン効果の組み合わせであると考えられる。
PepTSh結合部位の機能解析
S-Cys-Gly-3M3SHは、POTファミリー・トランスポーターに捕捉された最初のヒト由来の側鎖修飾ペプチドであり、生理的ペプチド（Cys-Gly）に類似した生化学的特徴を持つが、非ペプチド性チオアルコール基（3M3SH）も組み込んでいる。そこで我々は、S-Cys-Gly-3M3SHが生理的ペプチドと同様のメカニズムで認識されるかどうかを調べたいと考えた。そこで、細菌POTファミリー内のペプチド認識において重要な役割を果たすことが以前に示されている結合部位の変異をいくつか作製した（Newstead, 2017）。チロシン41はTM1に保存されたE33xxxERFxYY41モチーフの一部を形成しており（Solcanら、2012）、いくつかのPOTファミリーメンバーにおいてプロトンカップリングに役割を果たし、ペプチドの取り込みに影響を与えている（Dokiら、2013；Ernstら、2009；Guettouら、2014；Lyonsら、2014）。PepTShでは、Tyr41はS-Cys-Gly-3M3SHの末端グリシンアミノ酸のカルボキシル末端と水素結合している（図4C,D）。Tyr41をフェニルアラニンまたはアラニンに変異させると、ジアラニンの輸送はWTタンパク質に比べて著しく減少した（図5A）。輸送に対する同様の負の効果は、Streptococcus thermophilus由来の関連するPOTファミリートランスポーターPepTStで観察され(Solcan et al., 2012)、POTファミリーのペプチド認識における保存されたチロシンの共通の役割を示唆している。次に、同じ変異体を3M3SH産生の全細胞アッセイに用いた。興味深いことに、Tyr41Phe変異体もTyr41Ala変異体も野生型タンパク質の約50%と活性が低下していたが（図5B）、その表現型はリポソームを用いたアッセイで観察されたほど深刻ではなかった。この結果は、S-Cys-Gly-3M3SHの認識はdi-Alaよりもこの残基への依存性が低いことを示していると解釈される。
図5
資産をダウンロードする 資産を開く
結合部位残基の機能的特徴。
(A) PepTShのWTおよび変異体のジ-アラニン取り込みを示す棒グラフ。 挿入-アッセイに用いた再構成タンパク質のSDS-PAGE解析。(B）S-Cys-Gly-3M3の生物変換... もっと見る
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.017
次に、S-Cys-Gly-3M3SHリガンドの近くに存在する他の残基の役割を調べたいと考えた。特に、リガンドのカルボキシル基とカルボニル基の両方を結合する水分子（W107）を結合部位に配位するAsn347とGlu418の寄与に興味を持った（図4B）。相同なPOTファミリートランスポーターにおける同等の残基は、ペプチド認識（Lyons et al., 2014）とゲーティング（Solcan et al., 2012）の両方に関与しており、Glu418の場合、ペプチド認識、プロトン移動、輸送の間の結合を促進する可能性がある（Parker et al.） Glu418Ala変異体は我々のアッセイでは活性を示さなかったが、細胞内ゲートの調整におけるその役割（Fowler et al.、2015）と一致し、Asn347Ala変異体ではdi-Alaの取り込みの減少が観察された（図5A）。興味深いことに、この減少はin vivoアッセイでははるかに深刻であり（図5B）、この相互作用がdi-AlaよりもS-Cys-Gly-3M3SHペプチドの輸送に重要であることを示している。 これは、ペプチドと細胞内ゲート側鎖Glu418をつなぐ水分子を調整するためにAsn347が必要であることを反映しているのかもしれない。
共結晶構造から、チオアルコール基のアシル鎖部分が、結合部位の細胞外側近くに形成された拡張ポケット内に収容されていることも同定された（図4E）。S-Cys-Gly-3M3SH輸送におけるこのポケットの重要性を調べるため、空洞を塞ぐTyr411Trp変異体を作製した。取り込みは顕著に減少したが、それでもWTと比較すると約19％と測定可能であった（図5A）。同じ変異は、S-Cys-Gly-3M3SHの生体内変換において同様の大きな減少をもたらしたが、Tyr411Ala変異は野生型の生体内変換率を示した（図5B）。PepTShの疎水性ポケットが、結合ポケットにおけるチオアルコール基の認識を促進する上で重要な役割を果たしていることは明らかであり、後述するように、阻害剤設計の潜在的な部位である。
今回のデータを総合すると、POTファミリーは化学的に多様なペプチドやその誘導体に対応することができ、保存残基との側鎖相互作用と水を介した相互作用の両方を利用し、異なる化学的側鎖に対応するために異なる特異性ポケットを持つという我々のモデルをさらに支持するものである。
考察
ヒトによる悪臭の発生は、進化的に古い嗅覚のプロセスであり、おそらく交尾相手の選択と、化学的シグナル伝達に依存する進化過程に関与していた（Stoddart, 1990）。化学シグナル分子が微生物起源である証拠は、キツネ、シカ、ネコ、カブトムシなど他の動物にも見られるが（Wyatt, 2003）、ヒトにおけるこのプロセスの詳細はあまりよく分かっていない。体臭の主成分であるチオアルコール3M3SHは、グルタチオンと結合した前駆体としてヒトの腋窩で産生され、独特のジペプチド構造に加工される（図1）。S. hominis、S. lugdunensis、S. heamolyticusの腋窩分離株が3M3SHを産生できるという発見により、このプロセスの分子基盤の探索が始まった（Bawdon et al.） S-Cys-Gly-3M3SHは高度に修飾されたヒト特有のジペプチドであるが、この部位が悪臭を産生する細菌への取り込み機構を決定している可能性があると考え、ここでは二次活性トランスポーターのPOTファミリーに属するペプチドトランスポーターPepTSh（SH1446）がこのプロセスを担っていると同定した。これらの菌株はそれぞれ、PepTShと近縁のPOTファミリートランスポーターを持っており（図4-図2）、S-Cys-Gly-3M3SHも取り込むことができると予想される。
S. hominisの遺伝的難治性から、SH1446がS-Cys-Gly-3M3SHの唯一の取り込み経路である可能性が高いことを示すために、生化学的アプローチを用いることになった。まず、この黄色ブドウ球菌は、POTトランスポーターとOpp ABCトランスポーターを1つずつ持っているという点で、黄色ブドウ球菌と同じようなペプチドトランスポーターのレパートリーを持っており、黄色ブドウ球菌のこれまでの研究で、POTトランスポーターであるDtpTはジペプチドといくつかのトリペプチドでの増殖に必須である一方、ABCトランスポーター（Opp3）はより長いオリゴペプチドを輸送する機能を持っていることが証明されている（Hiron et al.） この研究では、阻害剤としてL-Ala含有ペプチドを使用し、POTファミリートランスポーターの特性と一致する3M3SH産生阻害効果を示した。S.aureusやS.epidermidis用に開発されたツールを用いて、S.hominisのSH1446を遺伝子的に破壊する試みが何度か行われたが、失敗に終わった。これは、他の多くのコアグラーゼ陰性(CoNS)種と同様に、この生物を遺伝子的に難治性にしている複数の種特異的制限修飾(RM)系の存在によるものと思われる。
大腸菌のオリゴペプチドおよびジペプチドABCトランスポーターであるOppとDppは、S-Cys-Gly-3M3SHを認識し輸送することができない。S-Cys-Gly-3M3SHが事実上、最初のアミノ酸に高度に拡張したR基を持つジペプチドであることを考えると、POT結合部位のプロミスキャスな性質だけがこのリガンドを認識できることは注目に値する。最初にABCシステムによって輸送されるペプチドを認識する基質結合タンパク質であるOppAとDppAでは、結合ポケットはよく定義されており、タンパク質が配列に依存せずにペプチドを結合できるように、一般的な主鎖-主鎖相互作用を行う（Tameら、1995；Sleighら、1997；Sleighら、1999）。しかしながら、このポケットは通常のアミノ酸側鎖を収容するように進化してきたため、チオアルコール結合の異常に大きな構造は、OppAやDppAによる認識とは立体的に相容れない可能性が高い。ここで示されたデータは、POTトランスポーターが、修飾ペプチドを基質として受け入れる際に進化的に有利な役割を果たすかもしれない、異常に多様な結合部位を持つという考えをさらに支持するものである。
最近、ヒトのPOTファミリー・トランスポーターであるPepT1とPepT2は、ペプチド修飾プロドラッグを含むいくつかの重要なクラスの薬物分子の吸収と保持における役割のために、さらに注目を集めている（Smith et al. S-Cys-Gly-3M3SHと同様に、これらのプロドラッグはペプチドやアミノ酸に結合した薬物分子である（Brandsch, 2013）。プロドラッグは、PepT1やPepT2を介して輸送される天然ペプチドと競合することができるため、体内に積極的に輸送される（Ganapathyら、1998；Guptaら、2013；Terada and Inui、2012）。POTファミリーの結合部位の多様な性質は、部分的には、異なるコンフォメーションのペプチドを認識する能力と、化学的に異なるクラスのペプチドを収容できる異なる特異性ポケットを利用できることに由来することが示されている（Newstead, 2017）。今回の結果は、特異性ポケットがエキゾチックな化学的拡張にも対応できることを示す最初の証拠となる。水がS-Cys-Gly-3M3SHペプチドとPepTShの相互作用を促進する役割を果たすという観察は、異種ペプチドの認識を促進する水のより広範な役割も示しているのかもしれない。特に、水が結合部位とリガンドのアミノ基あるいはカルボキシ基との間の相互作用を橋渡しするという観察結果は、トランスポーター内でペプチドが取りうるコンフォメーションの数を大幅に増やし、それでもなおプロトン結合輸送を引き起こす可能性がある。
最後に、なぜこれらの細菌はS-Cys-Gly-3M3SHを輸送するのか、そしてこのプロセスを阻害して効果的な悪臭制御を行うことができるのか、という疑問を投げかけることができる。推定されるS-Cys-Gly-3M3SHの分解生化学的経路の概略を図6に示す。第一段階はジペプチダーゼによるグリシンの除去であり、次に炭素-硫黄結合を切断するリアーゼ反応によって、3M3SHに加えてピルビン酸とアンモニアが放出されると考えられる。3M3SHの輸出経路は不明であるが、現在のところ細菌内膜を横切る拡散であると推測されている。細菌はS-Cys-Gly-3M3SHの異化により、窒素と炭素の両方をグリシン、ピルビン酸、アンモニアとして放出することで栄養上の利益を得る（図6）。S-Cys-Gly-3M3SH（図1）の分泌に関与するトランスポーターであるABCC11に一塩基多型（SNPs）を持つアジア人が研究されてきた（Nakano et al.） 最近、ABCC11の野生型対立遺伝子を持つ個体について、ヘテロ接合型や二重変異型遺伝子型と比較した微生物学的調査から、前駆体を産生するヒトの脇の下ではブドウ球菌属の割合が高いことが明らかになった（Harker et al.） これらの研究は、種レベルの同定ができないという点で限定的ではあるが、少なくとも、前駆体の産生が脇の下のブドウ球菌属の存在と正の相関があるという考えと一致している。トランスポーターの発見とS-Cys-Gly-3M3SHの結合様式の分子的理解は、現在、トランスポーターSH1446を直接阻害することにより、悪臭産生阻害剤を開発する特異的な経路を示唆している（Grice, 2014）。重要なことは、このような介入は腋窩マイクロバイオーム全体に影響を与えるのではなく、体臭産生の減少を特異的に標的とすることである。
図6
アセットをダウンロードする アセットを開く
Staphylococcus hominisにおけるS-Cys-Gly-3M3SHの輸送と細胞内生体内変換の概要。
Cys-Gly-(S)-3M3SHは、プロトンの移動とともに、ジ/トリペプチドトランスポーターPepTShによって活発に膜を横切って輸送される。2. ジペプチダーゼは、Cys-Gly-(S)-3M3SHの末端グリシン残基を切断する。
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.018
材料と方法
主要資源表
試薬タイプ
(種)またはresourceDesignationSourceまたはreferenceIdentifiersAdditional
遺伝子
(大腸菌)dtpABW25113b1634, ECK1630POT トランスポーター
ファミリー遺伝子
(大腸菌)dtpBBW25113b3496, ECK3481POT トランスポーター
ファミリー遺伝子
(大腸菌）dtpCBW25113b4130、ECK4124POTトランスポーター
ファミリー遺伝子
(大腸菌）dtpDBW25113b0709, ECK0698POT トランスポーター
ファミリー遺伝子
(大腸菌）tnaABW25113b3708、ECK3701トリプトファナーゼ遺伝子
(ブドウ球菌
hominis)SH1446SK119STAHO0001_1446
(GenBank: EEK12089.1)POTトランスポーター
ファミリー遺伝子
(ブドウ球菌
hominis)SH0415SK119STAHO0001_0415
(GenBank: EEK11635.1)MFSトランスポーター
ファミリーStrain, strain
背景
(Escherichia coli)BW25113Baba et al., 2006F-, Δ(araD-araB)567、
ΔlacZ4787(::rrnB-3)、
λ-、rph-1、
Δ(rhaD-rhaB)568、
hsdR514系統、系統
背景
(大腸菌）JW1237Babaら、2006ΔoppC::kanR菌株、株背景
背景
(大腸菌）JW3511Babaら、2006ΔdppC::kanR菌株、株背景
バックグラウンド
(大腸菌）JW1626Babaら、2006ΔdtpA::kanRStrain、株背景
バックグラウンド
(大腸菌）JW3463Babaら、2006ΔdtpB::kanRStrain、株背景
バックグラウンド
(大腸菌）JW4091Babaら、2006ΔdtpC::kanRStrain、株背景
バックグラウンド
(大腸菌）JW0699Babaら、2006ΔdtpD::kanRStrain、株背景
バックグラウンド
(大腸菌）JW3686Babaら、2006ΔtnaA::kanRStrain、株背景
バックグラウンド
(大腸菌）JW2975Babaら、2006ΔmetC::kanRStrain、株背景
バックグラウンド
(大腸菌）JW1614Babaら、2006ΔmalY::kanRStrain、株背景
バックグラウンド
(大腸菌）JW1285Babaら、2006ΔsapC::kanRStrain、株背景
バックグラウンド
(大腸菌）JW0590Babaら、2006ΔcstA::kanRStrain、株背景
バックグラウンド
(Escherichia coli)ΔoppCT本研究。KanR
を親株から除去したΔoppCStrain, strain
バックグラウンド
(大腸菌）ΔdppCT本研究。KanR
親株から除去ΔdppC株、株背景
背景
(大腸菌）ΔdtpAT本研究。KanR
を除去した
親株ΔdtpAStrain, strain
バックグラウンド
(大腸菌）ΔdtpB本研究。KanR
を除去した
親株ΔdtpBS株、株
バックグラウンド
(大腸菌）ΔdtpCT本研究。KanR
を除去した
親株ΔdtpC株、株背景
バックグラウンド
(大腸菌）ΔdtpDT本研究。KanR
を除去した
親株ΔdtpD株、株
バックグラウンド
(大腸菌）ΔtnaAT本研究。KanR
から除去
親株ΔtnaAStrain, strain
バックグラウンド
(Escherichia coli)ΔDB1本研究。KanR
を除去した
親株ΔoppC ΔdppC株、株
バックグラウンド
(ブドウ球菌
ホミニス）SK119Taxonomy ID: 629742
(アクセッション: PRJNA34087)菌株
バックグラウンドC43(DE3)Miroux and Walker, 1996菌株
バックグラウンドpWaldo-GFPeDrewら, 2001遺伝学的
試薬
(大腸菌)pBADcLIC2005Geertsma and Poolman, 2007pBADベクターをLICカセッ
LICカセットで修飾したPBAD遺伝子試薬
試薬
(大腸菌）pKD46Datsenko and Wanner, 2000KanRを含む
カセットを含む
試薬
(大腸菌）pCP20Cherepanov and Wackernagel, 1995FLP+、pSC101由来、
λ cI857+、λ pR Repts、
AmpR、CmRR組換え
DNA試薬pBADcLIC-dtpAT本研究。クローン化
のプライマーを用いてクローニングした。
補足ファイル1組換え
DNA reagentpBADcLIC-dtpB本研究。クローニング
のプライマーを用いてクローニングした。
補足ファイル1組換え
DNA reagentpBADcLIC-dtpCT本研究。クローニング
のプライマーを用いてクローニングした。
補足ファイル1組み換え
DNA reagentpBADcLIC-dtpDT 本研究で得られた。クローニング
のプライマーを用いてクローニングした。
補足ファイル1組換え
DNA reagentpBADcLIC-SH0415本研究で得られた。クローニング
のプライマーを用いてクローニングした。
補足ファイル1組換え
DNA reagentpBADcLIC-SH1446本研究で得られた。クローニング
のプライマーを用いてクローニングした。
補足ファイル1ペプチド
リコンビナントタンパク質SH1446本研究。から精製した
大腸菌BW25113
pBADcLIC-SH1446を含むペプチド、
組換えタンパク質TnaAT本研究。から精製
大腸菌BW25113
pBADcLIC-Tnaを含む大腸菌BW25113から精製した。
化合物、薬剤S-Cys-Gly-3M3SHPeakdale Molecular (UK)特注品
悪臭基質化合物
化合物、薬剤L-AlaSigma-Aldrich
(米国ミズーリ州セントルイス)A7627Chemical
化合物、薬剤L-Ala-Alaシグマ・アルドリッチ
(米国ミズーリ州セントルイス）A9502化合物
化合物、薬剤L-Ala-Ala-AlaSigma-Aldrich
(米国ミズーリ州セントルイス）A9627化合物
化合物、薬剤L-Ala-Ala-Ala-AlaCambridge BiosciencesH-1260.0250化合物、薬剤
化合物、薬剤デシル-β-D-マルトピラノシドアナトレースD322LAChemical
化合物、薬剤ドデシル-β-D-マルトピラノシドアナトレイスD310LAC
化合物、薬剤ニッケル-NTAスーパーフロー樹脂サーモフィッシャー88221
菌株、培地、プラスミド
詳細なプロトコールを請求する
モデル生物としてEscherichia coli K-12を用いた。Escherichia coli K-12の単一遺伝子欠失株は、University of Yorkの大腸菌慶應コレクションから入手した。本研究で使用した菌株とプラスミドをSupplementary file 1および2に示す。抗生物質は以下の濃度で使用した。 アンピシリン100μg/mL、カナマイシン50μg/mL；L-アラビノース濃度を示す。PCR、プラスミド抽出、形質転換は標準プロトコールに従って行った。日常的なクローニングには、ゲノムDNAをBW25113から抽出し、高忠実度KODポリメラーゼを用いた（Novagen）。正しいクローンはDNA配列決定により確認した。プラスミド構築の具体的な詳細は以下の通りである。
単一keio欠失における複数変異体の構築
詳細なプロトコルはこちら
単一keio欠失株に複数の遺伝子ノックアウト株を作製した。二重KO株DB1(ΔoppC ΔdppC)を作製するために、pCP20(Flpリコンビナーゼをコード)を用いて30℃で標的遺伝子からKanRカセットを除去し、PCRと塩基配列決定により抗生物質カセットの消失を確認した。第二の遺伝子破壊は、keioコレクション中の単一遺伝子欠失株から、FRTフランキングKanRカセットを含む100bp相同性のPCR増幅を行った。標的遺伝子破壊は、前述したようにλRed組換えを用いて作製した（Datsenko and Wanner, 2000）。
プラスミド構築とタンパク質精製：pBAD-dtpA, dtpB, dtpC, tnaA
詳細なプロトコールを請求する
大腸菌POTトランスポーターの過剰発現を、アラビノースのコントロール下でpBADcLIC2005ベクターにクローニングした。全長遺伝子は、大腸菌BW25113ゲノムDNAから高忠実度KODポリメラーゼ（メルク社製）を用いて、補足ファイル3に記載した対応するプライマーを用いて増幅した。入手可能なStaphylococcus hominis SK1119ゲノムのインシリコ解析により、すべての配列決定済みブドウ球菌にオルソログが存在するPOTファミリーメンバーとしてSTAH0001_1446（SH1446）が同定され、S. hominisとS. haemolyticusのみに存在するMFSトランスポーターSTAH0001_0415（SH0415）が同定された。SH0415およびSH1446遺伝子は、S. hominisのゲノムDNAから、補足ファイル3に記載されているプライマーを用いて、高忠実度KODポリメラーゼ（Merck社製）を用いて増幅した。全てのPCR産物をWizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)を用いて精製し、標準的なライゲーション非依存クローニング(LIC)技術を用いてpBADcLIC2005ベクターにクローニングした。すべての断片はPCRとDNA配列決定（GATC Biotech）によって確認された。
SH1446の部位特異的変異導入
詳細なプロトコールを請求する
発現プラスミドpBADcLIC2005にクローニングした野生型STAHO0001_1446（SH1446）を用いて、Y411W、Y411A、Y41A、Y41F、N167A、N347A変異体を個別に作製した。変異を導入するために、1対につき1つが変異誘発性を持つ分岐プライマーを用いて、高忠実度のインバースPCRを行った（補足ファイル3）。得られた産物をブラントエンドライゲーションで環状化し、大腸菌BW25113に形質転換した。変異配列はDNA配列決定（GATC Biotech）により確認した。
悪臭前駆体生物変換アッセイ悪臭前駆体基質
詳細プロトコールを請求する
S-ベンジル-L-システイニルグリシンおよび(S)-(1-(2-ヒドロキシエチル)-1-メチルブチル)-L-システイニルグリシン（S-Cys-Gly-3M3SH）（Peakdale Molecular）をM9塩（6g Na2HPO4 g/L, 3g KH2PO4 g/L, 0.5g NaCl g/L）中10 mMのストック濃度で調製し、4℃で保存した。
安静細胞を用いたS-Benzyl-L-cysteinylglycineおよびS-Cys-Gly-3M3SHの生体内変換アッセイ
詳細なプロトコールはこちら
大腸菌をLBで一晩培養し、3, 500 rpm 10分間の遠心分離で細胞を回収し、滅菌M9塩に懸濁した。必要に応じて、pBADcLIC2005プラスミド上の誘導性遺伝子を保有する大腸菌株を、0.0001% L-アラビノースで一晩増殖中に予め誘導した。滅菌したエッペンドルフに、2mMの基質（S-Benzyl-L-cysteinylglycineまたはS-Cys-Gly-3M3SH）、OD650nmが5になるように細胞、および200μLまでのM9塩を加えた。細胞のみ（基質無添加）と基質のみ（細胞無添加）の反応も個々の実験に含まれた。反応は37℃で48時間までインキュベートし、適切な時点でサンプルを採取した。解放されたチオールは、以下に詳述するように、MTS/PMSまたはDTNB標識のいずれかを用いて定量した。
(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム)(MTS)およびフェナジンメトサルフェート(PMS)媒介によるベンジル-メルカプタンチオアルコールの化学標識法
詳細プロトコールを請求する
解放されたベンジルメルカプタンは以下のように標識された。各反応から500μlを適切な時点で採取し、13,000 r.p.m.で2分間遠心分離した。ベンジルメルカプタンを化学的に標識するために、4.09 mM 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) (Promega)と0.2 mM phenazine methosulfate (PMS) (Sigma)からなる標識試薬50μlをdHHに溶解した (Goodwin et al., 1995)、 1995）をdH2Oに溶解し、96ウェルマイクロプレートまたは0.5mlエッペンドルフチューブに分注した。96ウェルマイクロプ レートを用いた反応では、200μlの反応上清を50μlのMTS/PMSに添加した。プレートを半透過性フィルムの蓋で密閉し、室温で50分間インキュベートした後、Biotek PowerWave XSマイクロプレート分光光度計でA492nmを記録した。データはKC juniorに取り込まれ、Microsoft Excelにエクスポートされた。エッペンドルフチューブでの反応では、20μl～50μlの反応上清を50μlのMTS/PMSに添加した。反応液を室温で50分間インキュベートした後、20μlを取り出し、980μlのdH2Oで希釈し、1.5mlの使い捨てプラスチックキュベットに入れた。A492nmを記録した。
5,5'-ジチオビス-（2-ニトロ安息香酸）（DTNB）を介した3M3SHの化学標識化
プロトコールの詳細
遊離3M3SHを定量するために、各反応（上記のように単離）から75μlを適切な時点で採取し、13,000rpmで2分間遠心分離した： 800 µl dH2O、100 µl UltraPure Tris（pH 8.0）、50 µl DTNB（Ellman, 1958）ストック溶液（50 mM酢酸ナトリウム、2 mM DTNB、dH2Oに溶解）を1.5 ml使い捨てキュベットに加えた。50μlの反応上清をキュベットに加え、ピペッティングで混合し、室温で5分間インキュベートした。Jenway 6305分光光度計でA412nmを記録した。(Van Horn, 2003）。必要に応じて、pBADcLIC2005プラスミド上の誘導性遺伝子を保有する大腸菌株を、0.0001%L-アラビノースで一晩増殖中に予備誘導した。すべての実験において、細胞のみ（基質無添加）と基質のみ（細胞無添加）も含まれた。
タンパク質の発現と精製
詳細なプロトコールを請求する
S. hominis SH1446をコードする遺伝子をC末端オクタヒスチジンGFP融合ベクター（pWaldo-GFPe）にクローニングし（Drewら、2006）、続いて大腸菌C43(DE3)細胞に形質転換した（Miroux and Walker、1996）。変異は、部位特異的変異導入法を用いて導入し、その後DpnI消化を行った。一晩スターター培養したものを4 LのTerrific Broth（TB）に接種した。細胞は37℃で培養し、250rpmで振とうして通気した。イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を最終濃度0.4 mMまで添加し、培養液がOD600～0.6に達した時点で融合タンパク質の過剰発現を誘導した。誘導後、温度を25℃に下げた。16時間後に細胞を回収し、ウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼIを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に再懸濁し、-80℃で保存した。細胞を解凍し、32 kpsi（Constant Systems, UK）で破砕した。細胞残屑を30,000 x gで30分間遠心分離して除去し、膜を230,000 x gで120分間超遠心分離して単離した。膜はダウスホモジナイザーを用いてPBSに再懸濁し、急速凍結し、-80℃で保存した。解凍した膜を1xPBS（膜1gあたり10mL）、20mMイミダゾール（pH8.0）、150mM NaCl、1% n-ドデシル-β-D-マルトシド（DDM）で希釈し、攪拌しながら60分間放置して可溶化した。非可溶化膜は230,000gで60分間超遠心して除去した。ニッケルNTA樹脂（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を、膜1gあたり1mLの樹脂の割合でサンプルに添加し、撹拌しながら約90分間放置して結合させた。その後、樹脂を重力下でガラス製エコノカラム（BioRad、USA）に充填した。樹脂を20カラム容量（CV）の洗浄バッファー（1x PBS、20mMイミダゾール（pH8.0）、150mM NaCl、0.05% DDM）で洗浄した。樹脂はさらに30mMイミダゾールを含む10CVの洗浄バッファーで洗浄した。結合したGFP-SH1446融合タンパク質を250mMイミダゾールを含む洗浄バッファーで溶出した。この溶出液に等価濃度のヘキサヒスチジンタグTEVプロテアーゼを加え、20mM Tris-HCl（pH7.5）、150mM NaCl、0.03% DDMに対して一晩透析した。切断されたタンパク質は0.22μmフィルター（Millipore, USA）を用いてろ過し、Ni-NTA 5 mL HisTrapカラム（GE Healthcare）に通して未切断のGFP-SH1446タンパク質とTEVプロテアーゼを除去した。フロースルーを回収し、50 kDa MWCO濃縮器（Vivapsin 20、Sartorius AG）を用いて300 μlに濃縮し、20 mM Tris-HCl（pH7.5）、150 mM NaCl、0.03% DDMで予め平衡化したサイズ排除カラム（Superdex 200 10/30、GE Healthcare）に適用した。精製SH1446タンパク質を含む画分をプールし、最終濃度15-20 mg.ml-1に濃縮した。
TnaAの発現と精製のために、一晩培養したLBを37℃、200rpmで培養した。1LのLBにスターターカルチャーを1:50で接種し、OD600nm～0.6～0.8まで増殖させた後、0.001%アラビノースで標的タンパク質の発現を誘導した。誘導後、培養液を37℃で8時間培養した。細胞を4,500rpm、15分間の遠心分離で回収し、35mLの再懸濁バッファー（50mM Kpi、20％グリセロール、200mM NaCl、10mLイミダゾール、pH7.8）に再懸濁し、-80℃で保存した。タンパク質を精製するために、細胞を解凍し、3分間のパルス3秒、休止7秒の超音波処理で溶解した。溶解液を25,000rpm～30分間の遠心分離で清澄化した。清澄化した上清を5mLのHisTrapカラム（GE Healthcare社製）にロードし、AKTA Start（GE Healthcare社製）にて、製造元の指示に従って標準プロトコルを用いてアフィニティー精製した。
タンパク質の結晶化
詳細なプロトコールを請求する
SH1446の結晶をin-meso phaseで得た。簡単に言うと、濃縮タンパク質を9.9モノアシルグリセロール（Monoolein, Sigma-Aldrich）とタンパク質：脂質の比率が2：3になるように、20℃の機械式シリンジミキサーで混合した（Ai and Caffrey, 2000）。50nLのメソフェーズと800nLの沈殿液を、in meso robot（Gryphon, Art Robbins Instruments）を用いて96ウェルガラスプレートに分注した。SH1446 S-Cys-Gly-3M3SH複合体は、26-27% (v/v) PEG 200、220 mM (NH4)2HPO4、110 mM クエン酸ナトリウム (pH 5.0)、5 mM S-Cys-Gly-3M3SH (Peakdale Molecular)を含む沈殿剤溶液中で結晶化させ、結晶化前に4℃で一晩放置した。結晶は2-3日後に現れ、10日後に最大サイズまで成長した。結晶化ウェルにはタングステンカーバイドのガラスカッターでアクセスし、結晶は50-100μmのマイクロループ（MiTeGen）に直接マウントし、100Kで瞬間凍結した。
X線回折データは、European Synchrotron Radiation FacilityのID23-2において、Pilatus3 2M検出器を用い、0.05秒の露光設定で、360°にわたって0.2°の振動範囲で収集した。回折データは、XDS (Kabsch, 2010)でインデックス付け、統合し、Aimless (Evans, 2011)でマージした。
構造解析と精密化
詳細なプロトコルはこちら
リガンド結合複合体は、Streptococcus thermophilus由来の細菌ペプチド輸送体PepTSt（Lyons et al. COOT (Emsley et al., 2010)での手動モデル構築、autoBUSTER (Bricogne G. 2017)での精密化、Phenix (Adams et al., 2010)での精密化の反復ラウンドの結果、最終モデルが得られ、Molprobityサーバー (Chen et al., 2010)を用いて検証された。結合部位に追加的な差密度が観察され、S-CG3M3SHの立体化学的性質とサイズに一致した。リガンド拘束はGrade Web Server (http://grade.globalphasing.org)を用いて作成した。図はPyMOL (Schrödinger, LLC)を用いて作成した。
プロテオリポソームへの再構成と輸送アッセイ
詳細なプロトコールはこちら
精製したSH1446を、20 mM Tris-HCl（pH7.5）、150 mM NaCl、0.3% DMで予め平衡化したサイズ排除カラム（Superdex 200 10/30、GE Healthcare）を用いて、n-Decyl-β-D-maltopyranoside（DM、Anatrace）にデタージェント交換した。脂質（POPE:POPGを3:1の割合で）を60:1の割合で溶出タンパク質と混合した。タンパク質と脂質の混合物を50mM KPO4 (pH 7.0)バッファーでDMのCMC値以下まで急速に希釈した。超遠心分離（234,000 xg）で120分間、タンパク質リポソームを回収した。ペレットを50mM KPO4に再懸濁し、3Lの50mM KPO4 (pH 7.0)に対して一晩透析した。プロテオリポソームを回収し、-80℃で保存する前に3回の凍結融解を行った。
プロテオリポソームを解凍し、150,000 gで超遠心して回収した。得られたペレットをINSIDEバッファー（120 mM KCl, 2 mM MgSO4, 5 mM HEPES pH 6.8）と1 mMピラニン（8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸三ナトリウム）に注意深く懸濁した。プロテオリポソームは、液体窒素中で11回の凍結融解サイクルを行った後、0.4μmのポリカーボネート膜を通してサンプルを押し出し、前述と同様に超遠心分離で回収した。余分なピラニン色素は、ピラニンを含まないINSIDEバッファーであらかじめ平衡化したMicrospin G-25 column（GE Healthcare）で除去した。アッセイ用に、プロテオリポソームをOUTSIDEバッファー（120mM NaCl、5mM HEPES（pH6.8）、2mM MgSO4）に希釈した。
輸送アッセイの実施には、キュベットとマグネティックフ リーを装備したCary Eclipse蛍光分光光度計（Agilent Technologies）を使用した。二重蛍光励起は460/415 nm、発光は510 nmに設定した。輸送は1μMのバリノマイシンで開始され、得られたデータはエクスポートされ、Prism（GraphPad Software）を用いて分析された。輸送データは、複数の条件から収集したデータとの比較を容易にするために、1に正規化した。
競合アッセイ
詳細プロトコールを請求する
プロテオリポソームを前と同様に回収し、得られたペレットをINSIDE緩衝液に再懸濁した後、液体窒素中で3回の凍結融解サイクルを行い、0.4μmのポリカーボネート膜を通して押し出し、もう一度超遠心して回収した。アッセイでは、プロテオリポソームを外部緩衝液（110mM NaCl、10mM NaPO4、2mM MgSO4）で希釈し、微量のトリチウム化3H-ジ-アラニン（比活性30Ci/mmol）を含む50μMのジ-アラニンペプチドと、指示したように濃度を増加させた競合基質を添加した。競合アッセイは30℃で行われ、サンプルは指定された時点で採取され、2mLのH2O添加により輸送が停止された。プロテオリポソームは、直ちに真空マニホールドを用いて0.22μmセルロースフィルター（Merck Millipore）に濾過し、その後2mL H2Oでさらに2回洗浄した。リポソーム中に輸送されたペプチドの量は、メーカーが詳述する各ペプチドの比活性と、Wallacシンチレーションカウンターで計数したUltima Gold（PerkinElmer）の放射性同位体の計数効率（3H、計数効率45%）に基づいて計算した。輸送アッセイは、全体の平均値とS.E.M.を算出するために最低3回行った。
データの入手
詳細なプロトコルを請求する
原子モデルの原子座標はProtein Data Bankにアクセッション番号6EXSで登録されている。
ADD A COMMENT 1アノテーションを開く。このページの現在のアノテーション数は1です。
データの利用可能性
回折データはPDBにアクセッション番号6EXSで寄託されています。ベクターはAddgeneに寄託されている（寄託番号75759）。
以下のデータセットが作成された
Gurdeep SM
ニューステッド S
(2018) SH1446とS-Cys-Gly-3M3SHとの複合体の結晶構造
RCSB Protein Data Bank（アクセッション番号：6EXS）で公開。
http://www.rcsb.org/structure/6EXS
参考文献
アブーハマド WN
マンソン M
ギブソンMM
ヒギンズ CF
(1991)大腸菌とサルモネラ菌におけるペプチド輸送と走化性：ジペプチドパーミアーゼ（Dpp）とジペプチド結合タンパク質の特性解析
Molecular Microbiology 5:1035-1047.
https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.1991.tb01876.x
PubMed
グーグル奨学生
アダムス PD
アフォニンPV
ブンコチG
チェン VB
デイビスIW
エコールズ N
ハッドJJ
ハングLW
カプラールGJ
グロス・クンストレブ RW
マッコイAJ
モリアーティNW
オエフナーR
リードRJ
リチャードソンDC
リチャードソンJS
ターウィリガーTC
Zwart PH
(2010) PHENIX: 高分子構造解析のための包括的なPythonベースのシステム
アクタ・クリスタログラフィカ・セクションD生物学的結晶学 66:213-221.
https://doi.org/10.1107/S0907444909052925
PubMed
Google Scholar
Ai X
Caffrey M
(2000) 脂質メソ相における膜タンパク質の結晶化：界面活性剤の効果
Biophysical Journal 79:394-405.
https://doi.org/10.1016/S0006-3495(00)76301-6
PubMed
グーグル奨学生
粟野 直樹
和田昌宏
晃道
及川 徹
高木秀雄
中森慎一
(2003) 大腸菌のL-システイン過剰生産に及ぼすシステイン脱硫酵素遺伝子破壊の影響
応用微生物学・生物工学 62:239-243.
https://doi.org/10.1007/s00253-003-1262-2
PubMed
Google Scholar
粟野直樹
和田昌宏
森秀行
中森慎一
高木秀行
(2005) 大腸菌システイン脱硫酵素の同定と機能解析
応用・環境微生物学 71:4149-4152.
https://doi.org/10.1128/AEM.71.7.4149-4152.2005
PubMed
Google Scholar
馬場 哲也
荒 隆
長谷川雅史
高井雄一
奥村康弘
馬場正幸
ダツェンコ KA
冨田昌宏
ワナーBL
森 博之
(2006) 大腸菌K-12のインフレーム単一遺伝子ノックアウト変異体の構築：keioコレクション
Molecular Systems Biology 2:2006.0008.
https://doi.org/10.1038/msb4100050
PubMed
Google Scholar
バウマン T
バーグマンS
シュミット-ローズT
マックス H
マーティン A
エンタラー B
テルステーゲンL
シュヴァイガー D
カルバッハー H
ウェンク H
イェドリツキー G
ヨヴァノヴィッチ Z
(2014a) グルタチオン共役スルファニルアルカノールはABCC11とγ-グルタミルトランスフェラーゼ1の基質である：アポクリン汗腺における臭気物質前駆体形成の新しい経路の可能性
実験皮膚科学 23:247-252.
https://doi.org/10.1111/exd.12354
PubMed
グーグル奨学生
バウマンT
ヨバノビッチZ
エンタラーB
シュミット-ローズT
マックス H
マーティン A
テルステーゲンL
シュヴァイガー D
(2014b) ABCC11-重要な抗臭気ターゲットとして
Flavour 3:P16.
https://doi.org/10.1186/2044-7248-3-S1-P16
Google Scholar
ボードン D
コックスDS
アッシュフォードD
ジェームズAG
トーマス GH
(2015) 悪臭を放つチオアルコール3-メチル-3-スファニルヘキサン-1-オールの生産に関与する腋窩ブドウ球菌属の同定
FEMS Microbiology Letters 362:fnv111.
https://doi.org/10.1093/femsle/fnv111
パブコメ
グーグル奨学生
ボベル D
(2015) ヒトのエクリン汗腺：構造、機能、障害
Journal of Local and Global Health Science 2015:5.
https://doi.org/10.5339/jlghs.2015.5
Google Scholar
ブランシュ M
(2013) 腸管ペプチドトランスポーターPepT1を介した薬物輸送
Current Opinion in Pharmacology 13:881-887.
https://doi.org/10.1016/j.coph.2013.08.004
PubMed
Google Scholar
カサグランデ F
ハーダーD
シェンクA
ムーリーM
ウクルムZ
エンゲル A
ヴァイツ D
ダニエル・H
フォティアディス D
(2009) ペプチドトランスポーターファミリーの原核生物メンバーDtpD（YbgH）の投影構造
Journal of Molecular Biology 394:708-717.
https://doi.org/10.1016/j.jmb.2009.09.048
PubMed
Google Scholar
チェンVB
アレンダルWB
ハッドJJ
キーディーDA
イモルミーノRM
カプラールGJ
マレーLW
リチャードソンJS
リチャードソンDC
(2010) MolProbity: 高分子結晶学のための全原子構造検証
アクタ・クリスタログラフィカ・セクションD生物学的結晶学 66:12-21.
https://doi.org/10.1107/S0907444909042073
PubMed
Google Scholar
チェレパノフ PP
Wackernagel W
(1995) 大腸菌における遺伝子破壊：抗生物質耐性決定基のFlp触媒による切除をオプションとするtcrおよびKmRカセット
Gene 158:9-14.
https://doi.org/10.1016/0378-1119(95)00193-A
PubMed
Google Scholar
著書
コリンズ KJ
(1989)
汗腺： エクリンとアポクリン
ベルリン、ハイデルベルク： Springer.
Google Scholar
コステロEK
ラウバーCL
ハマディ M
フィーラーN
ゴードンJI
ナイト R
(2009) ヒトの体内生息地における細菌群集の空間的・時間的変動
Science 326:1694-1697.
https://doi.org/10.1126/science.1177486
PubMed
Google Scholar
ダニエル H
コトラG
(2004) 生理学と薬理学におけるプロトンオリゴペプチド共輸送体ファミリーSLC15
Pflugers Archiv : European Journal of Physiology 447:610-618.
https://doi.org/10.1007/s00424-003-1101-4
PubMed
Google Scholar
ダツェンコ KA
ワナーBL
(2000) PCR産物を用いた大腸菌K-12の染色体遺伝子の一段階不活化
米国科学アカデミー紀要 97:6640-6645.
https://doi.org/10.1073/pnas.120163297
PubMed
グーグル奨学生
堂木 聡
加藤秀一
ソルカン N
岩城正明
小山雅史
服部正明
岩瀬仁紀
塚崎哲也
杉田祐一
神取裕之
ニューステッド S
石谷亮
濡木 修
(2013) ペプチド輸送体POTによるプロトン共役輸送の動的機構の構造的基盤
Proceedings of the National Academy of Sciences 110:11343-11348.
https://doi.org/10.1073/pnas.1301079110
PubMed
Google Scholar
ドリュー D
レルヒ M
クンジE
スロットブームDJ
デ・ギアーJW
(2006) GFP融合体を用いた膜タンパク質の過剰発現と精製の最適化
Nature Methods 3:303-313.
https://doi.org/10.1038/nmeth0406-303
PubMed
Google Scholar
ドリューDE
フォン・ハイネG
ノルドルンドP
de Gier JW
(2001) 大腸菌における膜タンパク質の過剰発現をモニターする指標としての緑色蛍光タンパク質
FEBS Letters 507:220-224.
https://doi.org/10.1016/S0014-5793(01)02980-5
PubMed
グーグル奨学生
Dwivedi CM
ラギンRC
Uren JR
(1982) 大腸菌由来β-シスタチオナーゼのクローニング、精製および特性解析
Biochemistry 21:3064-3069.
https://doi.org/10.1021/bi00256a005
PubMed
Google Scholar
エガート M
シュミット I
ヘーネHM
ラクニットT
シュミッツRA
ブレーブスR
(2011) 健康な男性の腋窩における細菌のrRNAベースのプロファイリングは、細菌の活性における左右非対称性を示唆している。
FEMS Microbiology Ecology 77:146-153.
https://doi.org/10.1111/j.1574-6941.2011.01097.x
PubMed
Google Scholar
エルマンGL
(1958) 低濃度のメルカプタン類の比色定量法
Archives of Biochemistry and Biophysics 74:443-450.
https://doi.org/10.1016/0003-9861(58)90014-6
PubMed
グーグル奨学生
エムズリー P
ローカンプB
スコット WG
カウタン K
(2010) クートの特徴と発達
Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography 66:486-501.
https://doi.org/10.1107/S0907444910007493
PubMed
Google Scholar
エムターR
Natsch A
(2008)コリネバクテリアによる分泌型Cys-Gly-(S)結合体からのヒト体臭物質3-メチル-3-スルファニルヘキサン-1-オールの放出には、ジペプチダーゼとβ-リアーゼの連続作用が必要である。
Journal of Biological Chemistry 283:20645-20652.
https://doi.org/10.1074/jbc.M800730200
PubMed
Google Scholar
エルンストHA
ファムA
ハルドH
カストラップJS
ラーマン M
ミルザ O
(2009) 大腸菌由来推定ペプチドトランスポーターYjdLのリガンド結合解析により、ジペプチドに対する有意な選択性が示された。
Biochemical and Biophysical Research Communications 389:112-116.
https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2009.08.098
PubMed
Google Scholar
エバンス PR
(2011) データ削減入門：空間群の決定、スケーリング、強度統計量
Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 67:282-292.
https://doi.org/10.1107/S090744491003982X
PubMed
Google Scholar
ファルカシュ R
(2015) アポクリン分泌：古い現象への新しい洞察
Biochimica Et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 1850:1740-1750.
https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2015.05.003
PubMed
Google Scholar
ファウラーPW
オーウィック-ライドマークM
ラデストックS
ソルカンN
ダイクマンPM
ライオンズJA
クオック J
キャフリー M
ワッツ A
フォレストLR
ニューステッド S
(2015) プロトン結合オリゴペプチドシンポーターのゲーティングトポロジー
Structure 23:290-301.
https://doi.org/10.1016/j.str.2014.12.012
PubMed
Google Scholar
ガナパシー ME
黄 W
ワン・エイチ
ガナパシーV
ライバックFH
(1998) バラシクロビル：腸および腎ペプチド輸送体PEPT1およびPEPT2の基質
Biochemical and Biophysical Research Communications 246:470-475.
https://doi.org/10.1006/bbrc.1998.8628
PubMed
グーグル奨学生
ガライ P
ラヒリ A
ゴーシュD
チャタルジー J
Chakravortty D
(2016) ペプチドを利用する炭素飢餓遺伝子yjiYはサルモネラ菌による鞭毛を介した感染に必要である。
Microbiology 162:100-116.
https://doi.org/10.1099/mic.0.000204
PubMed
Google Scholar
ゲルツマ ER
プールマン B
(2007) 難治性細菌におけるハイスループットなクローニングと発現
Nature Methods 4:705-707.
https://doi.org/10.1038/nmeth1073
PubMed
Google Scholar
グッデル EW
Higgins CF
(1987) Salmonella typhimuriumおよびEscherichia coliによる細胞壁ペプチドの取り込み
Journal of Bacteriology 169:3861-3865.
https://doi.org/10.1128/jb.169.8.3861-3865.1987
PubMed
Google Scholar
グッドウィン CJ
ホルトSJ
ダウネスS
マーシャル NJ
(1995) 微培養テトラゾリウムアッセイ：2つの新しいテトラゾリウム塩、XTTとMTSの比較
Journal of Immunological Methods 179:95-103.
https://doi.org/10.1016/0022-1759(94)00277-4
PubMed
グーグル奨学生
ガウアーDB
ホランドKT
マレットAI
レニーPJ
ワトキンス WJ
(1994)無菌アポクリン汗と腋窩分泌物中の16-アンドロステン・ステロイド濃度の比較：腋窩微生物叢による16-アンドロステンの相互変換--ヒトにおける腋臭生成のメカニズム？
ステロイド生化学・分子生物学ジャーナル 48:409-418.
https://doi.org/10.1016/0960-0760(94)90082-5
PubMed
グーグル奨学生
グライス EA
(2014) 皮膚マイクロバイオーム：皮膚疾患に対する新規診断・治療アプローチの可能性
Seminars in Cutaneous Medicine and Surgery 33:98-103.
https://doi.org/10.12788/j.sder.0087
PubMed
Google Scholar
グロイスマン EA
パラ-ロペスC
サルセドM
リップスCJ
ヘフロン F
(1992) サルモネラの病原性には宿主の抗菌ペプチドに対する耐性が必要である。
PNA 89:11939-11943.
https://doi.org/10.1073/pnas.89.24.11939
PubMed
Google Scholar
ゲトウF
クイストゴーEM
ラバ M
モバーグP
レウ C
ノードランド P
(2014) ヒト薬物ペプチド輸送体PepT1およびPepT2の細菌ホモログの選択性メカニズム
Nature Structural & Molecular Biology 21:728-731.
https://doi.org/10.1038/nsmb.2860
PubMed
グーグル奨学生
グプタ D
グプタ
ダハン A
ツメ
ヒルフィンガーJ
リー KD
アミドンGL
(2013) 極性ノイラミニダーゼ阻害剤の経口吸収性の向上：オセルタミビルアナログに応用したプロドラッグトランスポーターのアプローチ
Molecular Pharmaceutics 10:512-522.
https://doi.org/10.1021/mp300564v
PubMed
Google Scholar
Hagting A
クンジER
リーンハウトKJ
プールマンB
コニングスWN
(1994)
Lactococcus lactisのジおよびトリペプチド輸送タンパク質。新しいタイプの細菌性ペプチド輸送体
(1994)ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)のジおよびトリペプチド輸送タンパク質。
PubMed
グーグル奨学生
ハーダーD
シュトルツJ
カサグランデF
オブドリクP
ヴァイツ D
フォティアディス D
ダニエル H
(2008) DtpB（YhiP）とDtpA（TppB、YdgR）は大腸菌のプロトン依存性ペプチド輸送体の原型である。
FEBS Journal 275:3290-3298.
https://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2008.06477.x
PubMed
Google Scholar
ハーカー M
カーベルAM
マルティVP
リアザンスカイアS
ケルソ H
テイラー D
グリムショー S
アーノルドDS
ジルマー R
ショー J
カーク JM
アルカシッドZM
ゴンザレス・タノン S
チャン GP
ロージングEA
スミス AM
(2014) ABCC11対立遺伝子におけるSNPの機能的特徴-腋窩皮膚代謝、臭気発生および関連行動への影響
Journal of Dermatological Science 73:23-30.
https://doi.org/10.1016/j.jdermsci.2013.08.016
PubMed
グーグル奨学生
長谷川 泰
矢吹雅彦
松金正人
(2004) ヒトの腋窩汗に含まれる新規臭気成分の同定
Chemistry & Biodiversity 1:2042-2050.
https://doi.org/10.1002/cbdv.200490157
PubMed
グーグル奨学生
ハイロン A
ボレゼ・デュラン E
ピアールJC
Juillard V
(2007) 黄色ブドウ球菌の窒素栄養を仲介する4つのオリゴペプチド輸送系のうち1つのみ
Journal of Bacteriology 189:5119-5129.
https://doi.org/10.1128/JB.00274-07
PubMed
Google Scholar
ジェームズAG
オースティンCJ
コックスDS
テイラーD
カルバート R
(2013) ヒトの腋臭の微生物学的および生化学的起源
FEMS Microbiology Ecology 83:527-540.
https://doi.org/10.1111/1574-6941.12054
PubMed
Google Scholar
ジェームスAG
ケイシーJ
ハイリアンズD
マイコックG
(2004) 皮膚細菌による脂肪酸代謝と腋臭における役割
World Journal of Microbiology & Biotechnology 20:787-793.
https://doi.org/10.1007/s11274-004-5843-8
Google Scholar
カブシュ W
(2010) XDS
Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography 66:125-132.
https://doi.org/10.1107/S0907444909047337
PubMed
Google Scholar
クレプシュMM
コバーマンM
Löw C
バルバッハJ
ペルマンティエHP
フセッティ F
デ・ギエJW
スロットブームDJ
Berntsson RP
(2011) 大腸菌ペプチド結合タンパク質OppAは正電荷ペプチドを好む
Journal of Molecular Biology 414:75-85.
https://doi.org/10.1016/j.jmb.2011.09.043
PubMed
Google Scholar
ライデン JJ
マッギンレーKJ
ホルツレE
ラボウズJN
クリグマン AM
(1981) ヒト腋窩の微生物学と腋窩臭との関係
Journal of Investigative Dermatology 77:413-416.
https://doi.org/10.1111/1523-1747.ep12494624
PubMed
Google Scholar
ライオンズJA
パーカーJL
ソルカンN
ブリントA
リーD
シャーST
キャフリー M
ニューステッド S
(2014) プロトン結合オリゴペプチド輸送体POTファミリーにおける多特異性の構造基盤
EMBO Reports 15:886-893.
https://doi.org/10.15252/embr.201338403
PubMed
Google Scholar
マッコイ AJ
グロッセ-クンストレブRW
アダムスPD
ウィンMD
ストローニLC
リード RJ
(2007) Phaser結晶学ソフトウェア
Journal of Applied Crystallography 40:658-674.
https://doi.org/10.1107/S0021889807021206
PubMed
Google Scholar
メレディス D
テンプルCS
グハN
ソードCJ
ボイドCA
コリアーID
モーガン KM
ベイリーPD
(2000) 腸管ペプチドトランスポーターPepT1の基質としての修飾アミノ酸とペプチド
European Journal of Biochemistry 267:3723-3728.
https://doi.org/10.1046/j.1432-1327.2000.01405.x
PubMed
Google Scholar
Miroux B
ウォーカーJE
(1996) 大腸菌におけるタンパク質の過剰生産：いくつかの膜タンパク質と球状タンパク質の高レベル合成を可能にする変異宿主
Journal of Molecular Biology 260:289-298.
https://doi.org/10.1006/jmbi.1996.0399
PubMed
Google Scholar
マリガン C
ゲルツマER
セヴェリE
ケリーDJ
プールマンB
トーマス GH
(2009) 基質結合タンパク質が電気化学的ナトリウム勾配駆動型TRAPトランスポーターに方向性を与える
pnas 106:1778-1783.
https://doi.org/10.1073/pnas.0809979106
PubMed
Google Scholar
マリガン C
リーチAP
ケリーDJ
トーマス GH
(2012)コレラ菌由来ATP非依存性シアル酸トランスポーターSiaPQM（VC1777-1779）において、膜タンパク質SiaQとSiaMは必須の化学量論的複合体を形成している。
Journal of Biological Chemistry 287:3598-3608.
https://doi.org/10.1074/jbc.M111.281030
PubMed
グーグル奨学生
中野雅之
三輪直人
平野 敦
吉浦和彦
新川直樹
(2009) ABCC11遺伝子の遺伝子型解析による腋窩浸透圧症と耳垢湿潤型との強い関連性
BMC Genetics 10:42.
https://doi.org/10.1186/1471-2156-10-42
PubMed
Google Scholar
ナッチュ A
デラーS
フラックスマンF
Schmid J
(2006) 腋窩分泌物から細菌性アミノアシラーゼによって放出される揮発性カルボン酸の多様性。
Chemistry & Biodiversity 3:1-20.
https://doi.org/10.1002/cbdv.200690015
PubMed
グーグル奨学生
ナッチュ A
Gfeller H
ギガックスP
シュミットJ
アクナ G
(2003) 細菌特異的アミノアシラーゼはヒト腋窩に分泌される匂い物質前駆体を切断する。
Journal of Biological Chemistry 278:5718-5727.
https://doi.org/10.1074/jbc.M210142200
PubMed
Google Scholar
ナッチュ A
シュミットJ
フラックスマン F
(2004) ヒト腋窩分泌物中のスルファニルアルカノールの同定と、腋窩細菌から単離されたC-Sリアーゼによるシステイン前駆体の切断を介したそれらの生成。
Chemistry & Biodiversity 1:1058-1072.
https://doi.org/10.1002/cbdv.200490079
PubMed
グーグル奨学生
ニューステッド S
ドリュー D
キャメロンAD
ポスティスVL
Xia X
ファウラーPW
イングラム JC
カーペンターEP
サンソムMS
マクファーソン MJ
ボールドウィン SA
岩田 聡
(2011) 哺乳類オリゴペプチドプロトンシンポーターPepT1およびPepT2の原核生物ホモログの結晶構造
EMBO Journal 30:417-426.
https://doi.org/10.1038/emboj.2010.309
PubMed
グーグル奨学生
ニューステッド S
(2015) オリゴペプチド輸送体PTRファミリーのプロトン結合ペプチド輸送に関する分子的洞察
Biochimica Et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 1850:488-499.
https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2014.05.011
PubMed
Google Scholar
ニューステッド S
(2017) POTファミリーを介したプロトン結合ペプチド輸送の理解における最近の進歩
Current Opinion in Structural Biology 45:17-24.
https://doi.org/10.1016/j.sbi.2016.10.018
PubMed
Google Scholar
パーカー JL
李 C
ブリントA
王 Z
ヴォゲリーL
ソルカン N
レデルボージュ・ヴチニッチG
スワンソンJMJ
キャフリー M
ヴォートGA
ニューステッド S
(2017) ペプチド輸送体POTファミリーにおけるプロトンの移動とカップリング
Proceedings of the National Academy of Sciences 114:13182-13187.
https://doi.org/10.1073/pnas.1710727114
PubMed
Google Scholar
パーカー JL
ミンデルJA
ニューステッド S
(2014) POTペプチド輸送体における二重輸送機構の熱力学的証拠
eLife 3:e04273.
https://doi.org/10.7554/eLife.04273
Google Scholar
ポールセン IT
スカレー RA
(1994) 輸送タンパク質のPOTファミリー
Trends in Biochemical Sciences 19:404.
https://doi.org/10.1016/0968-0004(94)90087-6
PubMed
グーグル奨学生
プラバラBK
アドゥリNG
ジェンセンJM
エルンストHA
イラム N
ラーマン M
ミルザ O
(2014) pH感受性アッセイによる大腸菌由来プロトン結合オリゴペプチド輸送体の基質特異性に関する新たな知見
FEBS Letters 588:560-565.
https://doi.org/10.1016/j.febslet.2014.01.004
PubMed
Google Scholar
シェリーWB
ハーリーHJ
ニコルズAC
(1953) 腋臭：細菌，アポクリン汗およびデオドラントの役割に関する実験的研究
A.M.A. Archives of Dermatology and Syphilology 68:430-446.
https://doi.org/10.1001/archderm.1953.01540100070012
PubMed
Google Scholar
スリーSH
シーバーズPR
ウィルキンソンAJ
ラドベリーJE
テーム JR
(1999) OppAタンパク質へのペプチド結合の結晶学的および熱量測定的解析
Journal of Molecular Biology 291:393-415.
https://doi.org/10.1006/jmbi.1999.2929
PubMed
Google Scholar
スレイ SH
テームJR
ドッドソンEJ
ウィルキンソン AJ
(1997) OppAにおけるペプチド結合、ペリプラズムオリゴペプチド結合タンパク質の非リガンド型およびリシルリジンとの複合体の結晶構造
Biochemistry 36:9747-9758.
https://doi.org/10.1021/bi970457u
PubMed
グーグル奨学生
スミスDE
クレメンソンB
ヘディガー MA
(2013) プロトン結合オリゴペプチド輸送体ファミリーSLC15：生理学的、薬理学的、病理学的意義
Molecular Aspects of Medicine 34:323-336.
https://doi.org/10.1016/j.mam.2012.11.003
PubMed
Google Scholar
スミス MW
タイルマンDR
ペインGM
マーシャルNJ
ペイン JW
(1999) 大腸菌由来ペリプラスムジペプチド結合タンパク質の基質特異性：ペプチドプロドラッグ設計のための実験的基盤
Microbiology 145:2891-2901.
https://doi.org/10.1099/00221287-145-10-2891
PubMed
Google Scholar
ソルカン N
クオック J
ファウラーPW
キャメロンAD
ドリュー D
岩田 S
ニューステッド S
(2012) オリゴペプチド輸送体POTファミリーの交互アクセス機構
EMBO Journal 31:3411-3421.
https://doi.org/10.1038/emboj.2012.157
PubMed
Google Scholar
シュタルケンマン C
ニクラス Y
トロッカズM
クラーク AJ
(2005) ヒト腋窩汗の悪臭物質である(S)-3-メチル-3-スルファニルヘキサン-1-オールの前駆体の同定。
Chemistry & Biodiversity 2:705-716.
https://doi.org/10.1002/cbdv.200590048
PubMed
Google Scholar
書籍
ストッダートDM
(1990)
香りの猿： ヒトの匂いの生物学と文化
ケンブリッジ大学出版局
Google Scholar
テーム JR
ドッドソンEJ
ムルシュドフG
ヒギンズCF
ウィルキンソン AJ
(1995) オリゴペプチド結合タンパク質OppAとトリペプチドおよびテトラペプチドリガンドとの複合体の結晶構造
Structure 3:1395-1406.
https://doi.org/10.1016/S0969-2126(01)00276-3
PubMed
グーグル奨学生
テイラー D
ドールビーA
グリムショーS
ジェームズ G
マーサー J
バジリ S
(2003) ヒト腋窩の微生物叢の特性化
International Journal of Cosmetic Science 25:137-145.
https://doi.org/10.1046/j.1467-2494.2003.00181.x
PubMed
グーグル奨学生
寺田 毅
乾 健司
(2012) ペプチドトランスポーターの構造生物学の最近の進歩
Current Topics in Membranes 70:257-274.
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-394316-3.00008-9
PubMed
Google Scholar
桑原邦彦
ガイヤ
ベックッチS
シュレンツェル J
カイユー I
シュタルケンマン C
ラザレビッチ V
(2015) 培養非依存的アプローチを用いた体臭の原因となる腋窩微生物叢のマッピング
Microbiome 3:1-15.
https://doi.org/10.1186/s40168-014-0064-3
PubMed
Google Scholar
トロッカズ M
シュタルケンマンC
ニクラスY
ファン・デ・ワールM
クラーク AJ
(2004) 3-メチル-3-スルファニルヘキサン-1-オールによるヒト腋窩汗臭プロフィールの主要記述子
Chemistry & Biodiversity 1:1022-1035.
https://doi.org/10.1002/cbdv.200490077
PubMed
グーグル
ウェブサイト
ヴァン・ホーン JD
(2003) 遊離チオールの定量プロトコール
http://v.web.umkc.edu/vanhornj/freethiol.htm
ヴァイツ D
ハーダーD
カサグランデ F
フォティアディスD
オブドリクP
ケレティ B
ダニエル・H
(2007) 哺乳類PEPT1に類似した特徴を持つ原核生物ペプチドトランスポーターの機能的および構造的特徴づけ
Journal of Biological Chemistry 282:2832-2839.
https://doi.org/10.1074/jbc.M604866200
PubMed
Google Scholar
書籍
ワイアット TD
(2003)
フェロモンと動物行動： 嗅覚と味覚によるコミュニケーション
ケンブリッジ大学出版局
Google Scholar
Zdych E
ペイストR
Reidl J
ブース W
(1995) 大腸菌のMalYはβC-Sリアーゼ（シスタチオナーゼ）活性を持つ酵素である。
Journal of Bacteriology 177:5035-5039.
https://doi.org/10.1128/jb.177.17.5035-5039.1995
PubMed
Google Scholar
決定書
オルガ・ブードカー
査読編集者、ワイル・コーネル・メディスン、米国
リチャード・アルドリッチ
シニアエディター、テキサス大学オースティン校、米国
透明性を保つため、eLifeには編集決定通知書と付随する著者の回答が掲載されている。査読後に著者に送られたレターを軽く編集したものを示しており、最も実質的な懸念事項を示している。
論文「Structural basis of malodour precursor transport in the human axilla（ヒト腋窩における悪臭前駆体輸送の構造的基盤）」を eLife にご投稿いただき、ありがとうございます。あなたの論文は3名の査読者（うち1名は査読編集委員会メンバー）によって査読され、シニアエディターであるRichard Aldrichによって評価が監督されました。査読者は匿名を選択しました。
査読者は互いに査読について議論し、査読編集委員はあなたが修正投稿を準備するのを助けるために、この決定を起草した。
本原稿は、Staphylococcus hominisにおけるS-Cys-Gly-3M3SHのトランスポータータンパク質の同定と結晶構造決定について報告している。このタンパク質は、ヒトの腋臭として放出される3M3SHに処理するために、化合物を細菌内に取り込むことが提案されている。結晶学的研究は、全細胞大腸菌とプロテオリポソームでの輸送と機能アッセイを伴っている。基質結合部位のアミノ酸側鎖の柔軟性が、トランスポーターが多種類のペプチド誘導体を認識する主な要因であると提唱されている。トランスポーターを同定するために、著者らは、関連する生化学的プロセスを大腸菌に移し、その後、よく特徴付けられた機能アノテーションとノックアウトライブラリーの両方を利用して、ヒト由来タンパク質と大腸菌タンパク質の間を行き来しながら経路を解剖することで、ブドウ球菌属の遺伝学的難解さを回避した。
査読者は、この研究が重要であり、eLifeの幅広い読者に見てもらうべきであるという点で同意した。しかしながら、S. hominisにおいて、同定されたトランスポーターがS-Cys-Gly-3M3SHの唯一のトランスポーターなのか、あるいは主要なトランスポーターなのかは、提示された実験からは明らかでないという点で、査読者全員が同意した。この結論を出すには、著者らはノックアウト実験を行う必要があると考えた。対応する遺伝子ツールは存在する（例：PMID:27531908; PMID:25104751; PMCID: PMC3709823）。
その他の具体的なコメント
修飾ペプチドに対する親和性は、高μMの範囲では比較的低いようである。この親和性は、生理学的条件下で遭遇しそうなペプチドのレベルに適合しているか？
S-Cys-Gly-3M3SHを輸送するStaph. 変異した結合部位のためにペプチドを輸送できないと思われるPepTShホモログは存在するか？もしそうなら、これらの種はまだペプチドを取り込むことができるのか？
著者は、この解析の主要な構成要素が皮膚以外のコロニー形成生物から推定されたものであるため、この研究の限界についてもっと透明性を持たせた方がよいかもしれない。例えば、ゲノム検索は対象を絞ったものであり、代替経路を再生する追加タンパク質を排除することはできなかった。
大腸菌ΔdtpB細胞におけるモデル基質5BLCGの50％減少は、もう1つのインポーターの存在を示唆しているのだろうか？そのようなインポーターがあれば、プロテオリポソームと全細胞の間に見られるいくつかの変異体活性の不一致を説明するのに役立つであろう。そのようなインポーターはStaphylococcus hominisにホモログがあるのだろうか？
構造の平均Bファクターは57.0であり、これはかなり低く、タンパク質の剛性を示している。著者らが示唆するように、基質結合部位の残基が柔軟であれば、より高いBファクター値を示すのでしょうか？
示されたデータから、トランスポーターのターンオーバー速度を推定することは可能か？
[編集者注：受理される前に、以下のようにさらなる修正が要求された。］
この度は、「Structural basis of malodour precursor transport in the human axilla（ヒト腋窩における悪臭前駆体輸送の構造的基盤）」と題するご著作を、eLife での更なる検討のために再提出していただき、誠にありがとうございます。あなたの修正論文は、Richard Aldrich（シニアエディター）と査読エディターによって好意的に評価されました。
残された問題は1つだけです。査読者の一人が、トランスポーターのターンオーバー速度を推定するよう求めています。あなたはその値をnmol/min/mgで回答している。その査読者は、mol/mol/minでの数値を見たかったのだと思います。この数値は、私が算術的なミスをしない限り、野生型トランスポーター（MW約50 kDaと仮定）の場合、約1 mol/mol/minになると思われます。これは少し遅いようです。ターンオーバー速度を検証し、原稿にコメントを入れていただけないでしょうか。
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.027
著者からの回答
本原稿は、Staphylococcus hominisにおけるS-Cys-Gly-3M3SHのトランスポータータンパク質の同定と結晶構造決定を報告している。このタンパク質は、ヒトの腋臭として放出される3M3SHに処理するために、化合物を細菌内に取り込むことが提案されている。結晶学的研究は、全細胞大腸菌とプロテオリポソームでの輸送と機能アッセイを伴っている。基質結合部位のアミノ酸側鎖の柔軟性が、トランスポーターが多種類のペプチド誘導体を認識する主な要因であると提唱されている。トランスポーターを同定するために、著者らは、関連する生化学的プロセスを大腸菌に移植することによって、ブドウ球菌属の遺伝学的難解さを回避し、その後、よく特徴付けられた機能アノテーションとノックアウトライブラリーの両方を利用して、ヒト由来タンパク質と大腸菌タンパク質の間を行き来しながら、経路を解剖した。
査読者は、この研究が重要であり、eLifeの幅広い読者に見てもらうべきであるという点で同意した。しかしながら、S. hominisにおいて、同定されたトランスポーターがS-Cys-Gly-3M3SHの唯一のトランスポーターなのか、あるいは主要なトランスポーターなのかは、提示された実験からは明らかでないという点で、査読者全員が同意した。この結論を出すには、著者らはノックアウト実験を行う必要があると考えた。対応する遺伝子ツールは存在する（例：PMID:27531908; PMID:25104751; PMCID: PMC3709823）。
これらの文献はすべて、黄色ブドウ球菌を操作するための遺伝子ツールである。この重要な病原体は何十年もの間研究されてきたが、RN4220のような制限／修飾（RM）欠損株の作製により、遺伝学的な扱いやすさが促進され、様々な供給源からDNAを受け入れるようになった。それでも、このようなDNAはしばしば、黄色ブドウ球菌に形質転換されたときに直ちに分解されないように、正しい修飾パターンを与えるように改変された特別な大腸菌株を通過させる必要がある。黄色ブドウ球菌のコアグラーゼ陰性種には、優勢な皮膚細菌である表皮ブドウ球菌が含まれ、黄色ブドウ球菌用に開発されたツールのいくつかは機能する。我々はこの研究のためにS.ホミニスの遺伝子操作を広範囲にわたって試みた。しかし、この株には複数のRM系が存在するため（我々のインシリコ解析では少なくとも4つのRM系が存在する）、遺伝子操作に不可欠な初期段階である外来DNAの導入に対して極めて抵抗性が強い。この種の遺伝子をノックアウトした例は文献にひとつもなく、そのためのツールを開発すること自体が大きなプロジェクトである。
しかしながら、我々は、同定されたトランスポーターが「S. hominisにおけるS-Cys-Gly-3M3SHの唯一の、あるいは主要なトランスポーターである」という証拠に対する査読者の懸念を十分に理解し、これを実証するために重要な追加実験を行った。
我々の戦略は、3M3SHを産生できる全細胞系に対するペプチドの阻害プロファイルを調べることである。最初の提出書類では、S. hominisと他のStaphylcocciが単一のPOTトランスポーターしか持っていないことを明確に説明していなかった（図2-図4）。1つのPOTに加えて、OppファミリーのABCトランスポーターを1〜4個含んでいる。S. aureusにおけるこれらのペプチドトランスポーターの相対的機能に関する重要な実験的研究により、ABCトランスポーターのうち1つ（Opp-3）のみがオリゴペプチド（3から8アミノ酸）の使用に重要である一方、POTトランスポーターはすべてのジペプチドといくつかのトリペプチドでの増殖に必須であることが示された（Hiron et al. (Hironら、2007）。従って、もしジペプチドやトリペプチドが3M3SHの産生を阻害するのに対して、遊離アミノ酸や長いペプチドは阻害しないのであれば、この研究で特徴づけられたPOTトランスポーターを介して3M3SHが侵入していることを生化学的に強く裏付けることになると考えた。
全細胞系を使って、さまざまなペプチドが3M3SHの産生を阻害する能力を測定した。S.ホミニスのPOTタンパク質SH1446の発現が3M3SH産生を観察するのに必須である我々の大腸菌系では、このプロセスはジ-およびトリ-ペプチドの両方で阻害されたが、L-Alaやテトラ-Alaでは阻害されなかった（図2-図4で新しいデータとして示されている）。同じ4分子を、ペプチド結合したチオアルコールを3M3SHに切断する細胞質酵素である精製TnaAに対して同じ濃度で試験したところ、何の効果もなく（図2-図5）、観察された阻害は輸送レベルであることが示された。
次に、S. hominisで直接これらの実験を繰り返したところ、同様のパターンが観察された。これは特にジペプチドで顕著で、ABCトランスポーターではなくPOTトランスポーターを特異的に阻害する。テトラ-Alaの最高濃度で観察された阻害は、化学物質を溶液に保つのに必要なpHが低く、それがS.ホミニスの細胞に悪影響を与えているためである。
これらのデータから、我々はSH1446タンパク質がS. hominisにおけるCysGly-3M3SHの主要な取り込み経路であることを確信した。
さらに具体的なコメントは以下の通りである：修飾ペプチドに対する親和性は、高μMの範囲では比較的低いようである。この親和性は、生理的条件下で遭遇すると思われるペプチドのレベルに適合するか？
腋窩におけるS-Cys-Gly-3M3SHの生理的濃度は不明であり、これについてコメントすることは困難である。グルタチオニル3M3SHからS-Cys-Gly-3M3SHを産生する酵素、ヒトGGT1酵素は、部分的に生化学的に特徴づけられ（Baumann et al. SH1446が生物がジペプチドといくつかのトリペプチドを獲得する主な経路であろうことを考えると、トランスポーターの親和性が特に高いとは予想されないが、S-Cys-Gly-3M3SHを細胞内に移動させ、その生体内変換に必要な小さなフラックスを生じさせるのに十分な高さであると推測される。S-Cys-Gly-3M3SHを輸送するStaph. 変異した結合部位のためにペプチドを輸送できないと思われるPepTShホモログは存在するか？もしそうなら、これらの種はまだペプチドを取り込むことができるのか？
S.ホミニスに存在する単一のPOTトランスポーターは、ほとんどのブドウ球菌に存在するので、他のほとんどのブドウ球菌は前駆体をトランスポーターできると推測される。関連する研究において、我々は悪臭を発生するブドウ球菌種に特異的なCSリアーゼ酵素を発見しており、この酵素が細菌が3M3SHを作るかどうかに影響していると推測している。POTトランスポーターの系統学的解析では、ほとんどのブドウ球菌種がオルソログのPepTShシステムを持ち、CoNS染色体の中には2つのタンパク質を持つものもあることを示した。これらのタンパク質は全て、プロトン化とペプチド結合に必須な保存モチーフExxERF/YYを含んでいる(1)。論文で概説したように、PepTShの保存された特徴により、典型的なPOTファミリー・トランスポーターに分類される。生理学的に関連する基質を特異的に収容するユニークな疎水性ポケットにより、このジ-トリペプチド（DtpT）パーミアーゼは修飾されたジペプチドを輸送することができる。詳細な構造情報がなければ、このPepTShを近縁生物と比較することはできない。著者は、この解析の主要な構成要素が皮膚以外のコロニー形成生物から推定されたものであるため、この研究の限界をもっと明確にした方がよい。例えば、ゲノム検索は対象を絞ったものであり、代替経路を再生する追加タンパク質を排除することはできなかった。
この研究の大きな限界の一つは、ホミニスを遺伝子操作して機能的ノックアウトを作れないことだと認識している。我々は今回、大腸菌モデルにおいて、PepTShin S-Cys-Gly-3M3SH輸送がPepTShを選択的に阻害するという点で、PepTShin S-Cys-Gly-3M3SH輸送の役割についてより多くの証拠を得た。 この新しいデータは、野生型S. hominisとPepTShを過剰発現した大腸菌の両方で見られた阻害をさらに支持するものである。我々は、インシリコ解析において、S. hominisには単一のDtpT POTシステムが存在し、これがS-CysGly-3M3SH輸送に必要なペプチド輸送システムであると確信している。
4）大腸菌ΔdtpB細胞におけるモデル基質5BLCGの50％減少は、もう1つのインポーターの存在を示唆しているのだろうか？そのようなインポーターがあれば、プロテオリポソームと全細胞の間に見られるいくつかの変異体活性の不一致を説明するのに役立つであろう。そのようなインポーターは、スタフィロコッカス・ホミニスにホモログがあるのだろうか？
大腸菌-ΔdtpB株における活性の50％低下（完全な喪失ではない）は、大腸菌にはDtpA-Dと名付けられた4つのPOTトランスポーターがあり、それぞれがジ-およびトリ-ペプチドの取り込みに関与する基質特異性を持ち（図2B）(2)、したがって残存する活性は、ほぼ間違いなくこれらのシステムのいずれかの活性によるものであることを考えれば、驚くべきことではない。我々はこれら4つのトランスポーターの生理学的機能に関して、別の出版物を準備中であり、4つ全てが欠失した株は3M3SHを産生する能力を完全に失ったことを報告できる（Bawdonら、準備中）。このデータは、POTトランスポーターがCys-Gly-3M3SHの菌体内への唯一の侵入経路であるという我々の仮説をさらに支持するものであり、S. hominisには単一のPOTシステム（S. hominisのSH1446）しかなく、大腸菌のように複数のホモログが存在しないことを想起させる。構造の平均Bファクターは57.0であり、これはかなり低く、タンパク質の剛性を示している。著者らが示唆するように、基質結合部位の残基が柔軟であれば、Bファクターは高くなるのでしょうか？
原稿で言及した柔軟性とは、相同なトランスポーターであるPepTSt(5)で実証されたように、異なる結合様式とコンフォメーションでリガンドを認識する結合部位の能力に関するものである。我々は、この構造において側鎖が構造的に柔軟であると推論するつもりはなかったし、実際、他の関連するPOTファミリートランスポーターよりも柔軟であると推論するつもりもなかった。実際、S-CG-3M3SHは結合部位でよく配位しており、周囲の側鎖と同様のB因子（80対54Å2）を持っている。我々は原稿の表現を修正した。
「今回のデータを総合すると、POTファミリーは化学的に多様なペプチドやその誘導体に対応することができ、保存された残基との側鎖相互作用と水を介した相互作用の両方を利用し、異なる化学的側鎖に対応するために異なる特異性ポケットを持つという我々のモデルをさらに裏付けている。発表されたデータから、トランスポーターのターンオーバー速度を推定することは可能ですか？
我々はトランスポーターのターンオーバー数を以下のように計算した：
野生型：189±37nmol/min/mg
y41a: 7.2 ± 0.58
y41f 6.5 ± 0.40
n347a 42.9 ± 0.30
y411w 34.0 ± 3.45
著者回答画像1
アセットをダウンロード アセットを開く
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.024
私たちがメカニズム情報を推論した変異体はすべて機能的であるが、明らかにいくつかの変化は他の変異体よりもマイナスの影響が大きい。本研究におけるY41A/Fのような、機能的に影響を受ける変異体のアッセイを行う際には、可能な限りKM値の変化を考慮するようにしている。
参考文献
(1) Newstead S. 2017. POT ファミリーを介したプロトン結合ペプチド輸送の理解における最近の進歩。Curr Opin Struct Biol 45:17-24.
(2) Harder D, Stolz J, Casagrande F, Obrdlik P, Weitz D, Fotiadis D, Daniel H. 2008. DtpB（YhiP）とDtpA（TppB、YdgR）は、大腸菌のプロトン依存性ペプチド輸送体の原型である。febs j 275:3290-3298.
(3) Yu D, Pi B, Yu M, Wang Y, Ruan Z, Feng Y, Yu Y. 2014. Staphylococcal speciesにおけるオリゴペプチドパーミアーゼ系の多様性と進化。Genomics 104:8-13. (4) Hiron A, Borezée-Durant E, Piard J-C, Juillard V. 2007. 黄色ブドウ球菌の窒素栄養を仲介するのは、4つのオリゴペプチド輸送系のうち1つだけである。J Bacteriol 189:5119-5129.
(5). Lyons J.A, Parker, J. et al. プロトン結合オリゴペプチド輸送体POTファミリーにおける多特異性の構造的基盤。EMBO Reports 15:886-893
[編集者注：受理される前に、以下のようにさらなる修正を求められた。］
原稿は改善されたが、受理前に対処すべき問題がいくつか残っている：
残された問題は1つだけである。査読者の一人から、トランスポーターのターンオーバー率を推定するよう要請があった。あなたは回答の中でnmol/min/mgの値を提示している。その査読者は、mol/mol/minでの数値を見たかったのだと思います。この数値は、私が算術的なミスをしない限り、野生型トランスポーター（MW約50 kDaと仮定）の場合、約1 mol/mol/minになると思われます。これは少し遅いようです。ターンオーバー速度を検証し、原稿にコメントを入れていただけないでしょうか。
ヒト腋窩における悪臭物質前駆体輸送の構造的基盤」と題した修正原稿を提出する機会を与えていただき、ありがとうございます。我々の計算では、ターンオーバー数は10であった。WTの輸送速度は、基質として50uMのジ-アラニンを用いて、〜189nmol/min/mgと決定された。PepTShの分子量は55361Daで、1mg中18.06nmolである。つまり、189/18=10.5である。IC50のデータの後に、この論文を掲載した：
「天然ペプチドと比較したS-Cys-Gly-3M3SHの認識を理解するために、3H-ジ-アラニンとの競合を用いてIC50値を決定した。トリ-アラニン、ジアラニン、Cys-GlyのIC50値はそれぞれ23.7±3.4、72.2±9.7、115±22.2μMであり（図3B）、PepTShはジ-アラニンよりもトリ-アラニンを認識することができた。 しかし、S-Cys- Gly-3M3SHのIC50値は362±21.8μMで、Cys-Glyペプチドよりも3倍高かった。ジペプチド輸送のためのPepTShのターンオーバー数は、1分間に約10と計算された。したがって、我々のデータは、PepTShが修飾ペプチドを輸送できる一方で、システイン側鎖にチオアルコール基を付加することによって、天然ペプチドに対する認識と輸送が大幅に損なわれていることを示している"
毎分10ターンオーバーは、我々が扱ってきた細菌ペプチドトランスポーターの活性の下限である。これに対してPepTSoは、例えば100回転／分で10倍速い。もしレフェリーが、このことがコンペティションの結果の解釈に影響を与えるとお考えであれば、喜んでコメントさせていただきます。正直なところ、アッセイ結果を解釈する際、10倍が異常に遅いとは考えていませんでした。
https://doi.org/10.7554/eLife.34995.028
論文および著者情報
著者詳細
ガーディープ・S・ミンハス
オックスフォード大学生化学科、オックスフォード、英国
貢献
リソース、データキュレーション、形式分析、検証、調査、可視化、方法論、執筆-校閲-編集
共同研究者
Daniel Bawdon
競合利益
競合利益なし "このORCID iDは、この記事の著者を識別する："0000-0003-4320-1243
ダニエル・ボードン
英国、ヨーク、ヨーク大学、生物学科
貢献
リソース、データキュレーション、形式分析、検証、調査、視覚化、方法論
共同研究者
Gurdeep S Minhas
競合利益
競合利益なし
レイミー・ハーマン
英国、ヨーク、ヨーク大学、生物学部
貢献
リソース、データキュレーション、形式分析、検証、調査、可視化、方法論、執筆-校閲-編集
競合利益
このORCID iDは、この論文の著者を特定するものである。
ミシェル・ラデン
英国、ヨーク、ヨーク大学、生物学部
貢献
リソース、データキュレーション、形式分析、検証、調査、視覚化、方法論、執筆-校閲-編集
競合利益
このORCID iDは、この論文の著者を特定するものです。
アンドリュー・P・ストーン
英国、ヨーク、ヨーク大学、生物学部
貢献
調査、方法論
競合利益
このORCID iDは、この論文の著者を特定するものです: "0000-0002-1087-9923
ゴードン・ジェームズ
ユニリーバ・ディスカバー, ベッドフォード, イギリス
貢献
概念化, 資料, 形式分析, 監修, 資金獲得, 調査, 視覚化, 方法論, 原稿執筆, プロジェクト管理, 査読と編集
利害関係
ユニリーバ・ディスカバーに所属。著者に申告すべき金銭的利害関係はない。
ギャビン・H・トーマス
英国、ヨーク、ヨーク大学、生物学科
貢献
概念化、資源、データキュレーション、形式分析、監修、資金獲得、検証、調査、視覚化、方法論、原案執筆、プロジェクト管理、執筆-校閲-編集
お問い合わせ先
gavin.thomas@york.ac.uk
競合利益
このORCID iDは、この論文の著者を特定するものです: "0000-0002-9763-1313
サイモン・ニューステッド
オックスフォード大学生化学科、オックスフォード、イギリス
貢献
概念化、リソース、データキュレーション、形式分析、監修、資金獲得、検証、調査、視覚化、方法論、原案執筆、プロジェクト管理、執筆-校閲-編集
お問い合わせ先
simon.newstead@bioch.ox.ac.uk
競合利益
このORCID iDは、この論文の著者を特定するものである。
資金提供
ウェルカム (102890/Z/13/Z)
サイモン・ニューステッド
バイオテクノロジー・生物科学研究評議会 (BB/N006615/1)
ギャビン・H・トーマス
生物工学・生物科学研究会議(BB/L013703/1)
ギャビン・H・トーマス
サイモン・ニューステッド
生物工学・生物科学研究会議(BB/H016201/1)
ダニエル・ボードン
ゴードン・ジェームズ
Gavin H Thomas
資金提供者は、研究デザイン、データ収集、解釈、論文投稿の決定には関与していない。
謝辞
European Synchrotron Radiation Facility（ESRF）のビームラインI24 Diamond Light Source（英国）およびID23eh2のスタッフの協力に感謝する。この研究は、SNへのWellcome award (102890/Z/13/Z)とGHTへのBBSRC LINK funding (BB/N006615/1)の支援を受けており、GHTとSNへのCBMNnet proof of concept funding (BB/L013703/1)によって開始された。DBはBBSRCのCASE学生研究費（BB/H016201/1）の支援を受けた。
シニアエディター
リチャード・アルドリッチ（テキサス大学オースティン校、米国
査読編集者
Olga Boudker、ワイル・コーネル・メディスン、米国
出版履歴
受領 2018年1月11日
受理された 2018年6月23日
アクセプト原稿公開 2018年7月3日（バージョン1）
記録版公開 2018年7月25日（第2版）
著作権
© 2018, Minhas et al.
この論文は、原著者および出典のクレジットを条件として、無制限の使用と再配布を許可するクリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの条件の下で配布されています。
メトリクス
10,791
ページビュー
1,193
ダウンロード数
26
引用
(Monthly)Page Views02040608010001/2302/2303/2304/2305/2306/2307/23
トグルチャート
毎日
月間
Downloads(Monthly)02468101201/2302/2303/2304/2305/2306/2307/23
トグルチャート
毎日
月間
以下のソースの中で最も多い引用数をポーリングして作成された論文引用数： Crossref, Scopus, PubMed Central.
リンクのダウンロード
カテゴリーとタグ
研究論文
微生物学・感染症学
構造生物学・分子生物物理学
ペプチド輸送
構造生物学
細菌輸送
膜タンパク質
研究生物
大腸菌
さらに読む
微生物学と感染症
ヒトに寄生する線虫における分泌産物と駆虫応答の起源を単一細胞レベルで解明する
Clair R Henthorn, Paul M Airs ... モスタファ・ザマニアン
研究論文 2023年7月4日更新
微生物学・感染症学
種間相互作用文献のコミュニティキュレーションのためのフレームワーク
アレイン・キュージック, ジェームズ・シーガー ... キム・E・ハモンド＝コサック
研究論文 2023年7月4日
微生物学と感染症
黄色ブドウ球菌菌血症の発症過程における細胞壁の広範なリモデリング
エドワード・JA・ダグラス, ナサナエル・パルク ... ルース・C・マッセイ
研究論文 2023年7月4日
eLifeの新着記事をいち早く読む
アラートメールに登録する
プライバシーポリシー
eLifeについて
求人情報
提携企業
アラート
連絡先
契約条件
プライバシーポリシー
インサイド・ライフ
月刊アーカイブ
プレス向け
リソース
XMLとデータ
githubで検索
eLifeは、研究資金提供者に触発され、科学者が率いる非営利団体です。eLife Sciences Publications, Ltdは、米国デラウェア州で設立された有限責任非営利非株式会社で、会社番号は5030732、英国では会社番号FC030576、支店番号BR015634で登録されています：
イーライフサイエンスパブリケーションズ
ウェストブルックセンター、ミルトン・ロード
ケンブリッジ CB4 1YG
英国
© 2023 eLife Sciences Publications Ltd. 特に断りのない限り、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンスに従う。ISBN: 2050-084x