腸内マイクロバイオームは女性ホルモンの状態変化に応答し、代謝機能障害を悪化させる

2023年12月29日 11:41

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腸内微生物
第16巻 2024年 - 第1号
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研究論文
腸内マイクロバイオームは女性ホルモンの状態変化に応答し、代謝機能障害を悪化させる

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19490976.2023.2295429

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38153260/

Tzu-Wen L. Cross,Abigayle M. R. Simpson,Ching-Yen Lin,Natasha M. Hottmann,Aadra P. Bhatt,Samuel J. Pellock, すべて表示
論文 2295429｜2023年7月20日受理、2023年12月12日受理、オンライン公開：2023年12月28日
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https://doi.org/10.1080/19490976.2023.2295429
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要旨
女性は閉経後に代謝機能障害のリスクが著しく高くなり、その後多くの慢性疾患につながる。腸内細菌叢は肥満や代謝機能障害と関連しているが、女性ホルモンの状態との相互作用や、その結果として生じる宿主の代謝への影響については不明な点が多い。ここでは、卵巣摘出および高脂肪食摂取に関連する炎症および代謝の表現型ならびに腸内細菌叢を、性腺無傷および低脂肪食対照と比較して特徴付けた。次に、同胞性マウスを用いて糞便微生物叢移植（FMT）を行い、卵巣摘出に関連する腸内細菌叢が炎症および代謝の転帰に及ぼす影響を明らかにした。その結果、卵巣摘出により消化管透過性が高まり、腸および代謝臓器の炎症が起こり、高脂肪食がこれらの表現型を悪化させることが示された。卵巣摘出術はまた、糞便中のβ-グルクロニダーゼ活性の上昇など、腸内細菌叢の変化にもつながった。しかし、腸内細菌叢の差のある変化は、高脂肪食ではなく低脂肪食を与えた場合にのみ生じた。低脂肪食を与えた卵巣摘出マウスの腸内細菌叢を摂取したグノトビオティックマウスは、偽コントローラー由来の腸内細菌叢を摂取したマウスに比べ、体重増加および代謝機能障害と炎症に関連する肝遺伝子の発現が大きかった。これらの結果は、腸内細菌叢が女性ホルモンの状態の変化に応答し、代謝機能障害に寄与することを示している。性ホルモンを制御する腸内細菌叢標的モジュレーターを同定・開発することは、更年期関連疾患の改善に治療的に有用である可能性がある。

キーワード：腸内細菌叢エストロゲン卵巣欠乏症更年期障害代謝健康
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はじめに
性ホルモンは疾患感受性と予後に影響を与える主要な決定因子の一つである。女性は、卵巣ホルモンであるエストロゲンとプロゲステロンの濃度が低下することを特徴とする、加齢に伴う性ホルモンの産生低下である閉経を経験した後、代謝機能不全に陥る危険性が著しく高い。閉経後の代謝機能障害は、その後、心血管疾患やがんなど、多くの慢性疾患につながる可能性がある。一般に、ホルモン補充療法によるエストロゲンの補充は、更年期に関連した症状を予防するために推奨されており、更年期に起こる心代謝や生理学的変化を予防または抑制すると考えられている。しかし、ホルモン補充療法は、ホルモンの種類や組み合わせ、使用期間、既往歴などによって、心疾患、冠動脈性心疾患、静脈血栓塞栓症、認知症、乳がんなどのリスクが高いという矛盾したエビデンスも示されている。引用1-4 このような矛盾と複雑性は、性ホルモンの喪失による代謝機能障害の病因が多面的である可能性が高いことを示唆している。引用5 現在までのところ、加齢に伴う性ホルモンの産生喪失が代謝機能障害につながる正確なメカニズムは不明のままであり、これが女性のための新規治療薬の開発を妨げている。

腸内細菌叢は性ステロイド代謝に関与しており、宿主の性ホルモンの恒常性に影響を与え、疾患の発症や予後を変化させる。腸内細菌叢の組成における性差は、思春期が始まった後の成体マウスにおいてのみ明らかであり、オスからメスへの腸内細菌叢の移植は、テストステロンの全身的な増加を引き起こし、自己免疫疾患に対する感受性を変化させた。引用6 ヒトでは、循環エストラジオール濃度が高いほど、腸内微生物の多様性が高く、フェーカリバクテリウムの相対的存在量が多く、スラッキア、ブチリシモナス、プレボテラ科の存在量が低いことが関連している。引用7-9 性ステロイドは哺乳類の細胞でデノボ合成されるが、細菌は生物圏におけるステロイドの主要な消費者であり、宿主の性ホルモンの恒常性を調節している可能性がある。この宿主と微生物の相互作用は、いくつかのメカニズムによって証明されている：（1）β-グルクロニダーゼという酵素を持つ微生物がステロイド代謝物を脱共役させ、腸肝循環を通じて宿主に再吸収させることができる；引用11,引用12（2）ステロールの腸内細菌変換がエストロゲン代謝に影響を与える；引用13,引用14あるいは（3）微生物がステロイドを異化し、性ホルモンの状態に全身的な変化をもたらすことがある。引用15 一般的な大腸細菌であるBacteroides fragilisは、嫌気的にエストロンをエストラジオールに変換するだけでなく、エストリオール生合成の中間代謝物である16α-ヒドロキシエストロンに変換することができる。引用13 興味深いことに、Denitratisoma sp.のDHT3株で発見された遺伝子クラスターは、アンドロゲンからエストロゲンへの変換を逆転させることができる。引用14 ステロイドの異化に関しては、閉経前の女性から分離されたKlebsiella aerogenesという細菌が3β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを持っていることが最近確認された。この細菌はエストラジオールを分解することができ、マウスに定着させるとエストロゲンの全身的な減少を引き起こし、うつ病のような行動を誘発する。

Citation18,Citation19卵巣摘出に伴う腸内細菌叢の群集レベルの差異が、特定の細菌分類群の変化とともに報告されている（例：Turicibacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter、Anaeribacter）、 Turicibacter、Anaeroplasma、Clostridiaceae、Lachnospiraceae、Turicibacter、S24-7、Akkermansiaなど）Citation16,Citation20,Citation21 しかし、これらの卵巣摘出が誘発する腸内微生物の摂動が肥満や代謝機能障害に関与しているかどうかは依然として不明である。最近の研究では、卵巣摘出マウスを無傷マウスと同居させることによって腸内細菌叢を共有しても、卵巣摘出マウスの代謝表現型は改善しないことが示された。そこで本明細書では、生殖腺非内在性のgnotobioticマウスモデルを用いて、腸内細菌叢が性ホルモンの卵巣産生の変化に反応し、代謝機能不全を悪化させるかどうかを検討した。まず、半精製高脂肪食（HFD）とコントロール良好な低脂肪食（LFD）を与えた卵巣摘出マウスの代謝表現型、炎症、縦断的な腸内細菌叢プロファイルを特徴付け、糞便微生物叢移植のためにこれらの「ドナーマウス」から糞便サンプルを採取した。次に、これらの糞便サンプルを無胚葉マウス（すなわち「レシピエントマウス」）に移植し、卵巣摘出術に関連した微生物叢が、体重増加や、様々な組織における代謝および炎症関連の転帰に及ぼす影響を調べた。重要なことは、エストロゲンによる影響を分離するために、オスの無胚葉マウスをレシピエントとして利用したことである。

結果
卵巣摘出は代謝機能障害を引き起こし、それはHFDによって悪化する
10週齢の通常飼育雌性C57BL/6マウスを購入し、対照として卵巣摘出術（OVX）または偽手術（SHM）を受ける前に、HFDまたはLFDのいずれかを2週間摂取するように無作為に割り付けた。この試験で用いたHFDは、ラードやコーン油などの食餌性脂肪源を用いてカロリーの60％を摂取できるように調製された半精製食であった。LFDは、食餌性脂肪からのカロリーの割合が10％であることと、マウスのカロリー必要量のバランスをとるために炭水化物の割合を多くする必要があることを除けば、あらゆる点でHFDと適切に一致するように、同じ半精製成分を用いて調製された。手術後の12週間、体重と摂餌量を毎週評価し、手術による食事が代謝結果に及ぼす影響を評価した。12週間の介入期間終了後、マウスは安楽死させた。両食餌の詳細な食餌組成をSupplemental Table S1に示す。エネルギー摂取量は、食餌の代謝エネルギーと記録された食餌摂取量に基づいて計算した。卵巣の外科的摘出により卵巣ホルモン産生が失われると、体重および脂肪量が増加したが、HFDを与えた群ではLFDを与えた群よりもその程度が大きかった（図1a-c）。手術直後から、OVX-HFDマウスはSHM-HFDマウスより多くの（p < 0.05）カロリーを消費し始めた（図1d）。しかし、時間の経過とともに、SHM-HFD群のカロリー摂取量がOVX-HFD群と同程度まで増加すると、この差はなくなった。試験終了時には、卵巣ホルモンの状態はエネルギー摂取量に影響を与えなかったが、HFDを与えたマウスはLFDを与えたマウスより多くのカロリーを摂取するという主食効果が観察された（図1d,e）。

図1. 卵巣摘出（OVX）または偽手術（SHM）を受け、低脂肪食（LFD）または高脂肪食（HFD）を与えた従来飼育C57BL/6Jマウスの動物特性。12週間の試験期間終了時の最終体重（a）とエネルギー摂取量（b）、および試験期間中の体重（c）とエネルギー摂取量（d）をプロットした。試験終了時に、EchoMRIを用いて評価した総体脂肪（e）、血清リポ多糖結合蛋白（LPSBP）濃度（f）、肝脂肪症（g）、脂肪細胞サイズ（H）を評価した。*交互作用は箱ひげ図では上付き文字で、折れ線グラフでは#記号で示す。

図1. 卵巣摘出（OVX）または偽手術（SHM）を受け、低脂肪食（LFD）または高脂肪食（HFD）を与えた従来飼育のC57BL/6Jマウスの動物特性。12週間の試験期間終了時の最終体重（a）とエネルギー摂取量（b）、および試験期間中の体重（c）とエネルギー摂取量（d）をプロットした。試験終了時に、EchoMRIを用いて評価した総体脂肪（e）、血清リポ多糖結合蛋白（LPSBP）濃度（f）、肝脂肪症（g）、脂肪細胞サイズ（H）を評価した。*交互作用は箱ひげ図では上付き文字で、折れ線グラフでは#記号で示す。
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(1)肝トリグリセリド濃度を測定する生化学的アッセイ、(2)病理学者による盲検評価、(3)周囲トレースから得られた断面積を用いた脂肪細胞体積の算出。その結果、OVX-HFDマウスの肝臓中のトリグリセリド濃度は、他のすべての処置群よりも有意に（p＜0.05）高いことが観察された（図1g）。しかしながら、盲検下での病理組織学的評価から、食餌にかかわらず、OVXはSHMよりも大きな肝脂肪症を引き起こし、一方HFDは脂肪症の重症度を悪化させないことが示唆された（補足表S2）。脂肪組織脂肪炎は、LFDを与えたマウスと比較して、HFDを与えたマウスでより大きく（p < .05）観察された（補足表S2）。同様の食餌効果が脂肪細胞の大きさにも観察され、HFD給餌が脂肪細胞の肥大を促進し、細胞死と脂肪組織マクロファージの浸潤および炎症に関連することが示唆された（図1h）。さらに、手術効果も観察され、OVXマウスはSHMマウスよりも生殖腺脂肪沈着部の脂肪細胞サイズが大きかった。

代謝機能障害に関連する血中バイオマーカーを、手術介入後12週目の安楽死時に評価した。有意な（p＜0.05）食餌効果が観察されたが、手術の効果は観察されず、HFDを与えたマウスは卵巣摘出後12週目の空腹時循環グルコース濃度が高く、アルカリホスファターゼ濃度がLFDよりも低かった（データは示さず）。空腹時循環トリグリセリド、非エステル化脂肪酸、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼは投与群間で差はなかった（データは示さず）。

高脂肪食と卵巣切除はともに脂肪と肝の炎症を促進する。
炎症、マクロファージ、酸化ストレス、低酸素症、およびエネルギー、脂質、グルコース代謝に関連する遺伝子マーカーを、これらのマウスの脂肪組織デポット、肝臓、および腸で評価した（Supplemental Table S3で評価したすべての遺伝子を参照）。生殖腺脂肪組織(GDAT)における遺伝子発現パターンの階層的クラスタリングにより、処置群間で実質的な違いが明らかになった（図2a）。HFDマウスは、LFDを与えたマウスと比較して、GDATにおけるIL1B、IL6、およびIFNGの相対発現が大きかった（p＜0.05）（図2a,b）。さらに、OVXマウスはSHMマウスよりもIL1BとIL6の相対発現が高かった（p < .05）。OVX-HFDマウスは、GDATにおいて、炎症性マーカーおよびマクロファージマーカーに関連する遺伝子の発現が増加し、ミトコンドリア生合成、グルコース取り込み、脂肪分解、およびアディポカイン［アディポネクチン（ADIPOQ）およびレチノール結合タンパク質4（RBP4）］に関連する遺伝子の発現が減少した。OVX-HFD群では、他のすべての治療群と比較して、炎症性・マクロファージマーカーであるTNFα、CCL2（MCP1）、CCL3、Adgre1（F4/80）、ITGAM（CD11B）、ITGAX（CD11C）、CD68、TLR2のGDAT相対発現が大きかった（p < .05）（図2a,c）。

図2. 卵巣摘出（OVX）または偽手術（SHM）を受け、低脂肪食（LFD）または高脂肪食（HFD）を与えた従来飼育のC57BL/6Jマウスから採取した組織の遺伝子発現プロファイル。生殖腺脂肪組織（GDAT）遺伝子発現の類似性に基づく階層的クラスタリング（a）およびGDAT、皮下脂肪組織（SQAT）、肝臓、盲腸における炎症およびタイトジャンクションタンパク質関連遺伝子の相対発現（b-i）。ヒートマップの各行は特定の注目遺伝子を表し、各列は1サンプルを表し、カラーコードは処置群（SHM-LFD：青；OVX-LFD：赤；SHM-HFD：黄；OVX-HFD：緑）を表す。*は主食効果；＋は主手術効果；交互作用は上付き文字で示し、p＜0.05。
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GDATと同様に、皮下脂肪組織（SQAT、補足図S1）においても、治療群間で遺伝子発現の実質的な調節が観察された。しかし、HFDを与えたマウスの反応は、LFDを与えたマウスよりも変動が大きいようである。SQATでは、Adgre1 (F4/80)、IL1B、IL6、ITGAM (CD11B)、MRC1、NOS2、TLR2、TNF、CCL3およびIKBKBの発現は、LFDを与えたマウスよりもHFDを与えたマウスの方が大きかった(p < 0.05)。一方、OVXマウスでは、ARG1とNFKBIAの相対発現が低く（p < 0.05）、NOS2、TNF、CCL3の発現が大きかった（p < .05）ことから、卵巣摘出がSQATにおいてマクロファージのM1キラー表現型と炎症を促進することが示唆された。いくつかの遺伝子で相互作用が観察され、OVX/HFD群は治療群の中でSQATにおけるCD68、CCL2、ITGAX（CD11C）の発現が最大（p < .05）であった（図2d,e）。

対照的に、肝臓の遺伝子発現データの階層的クラスタリングでは、明確なパターンやクラスタリングは見られず、OVXおよび/またはHFDが肝臓に与える代謝過程は、脂肪組織ほど一貫していないことが示唆された（補足図S2）。しかしながら、卵巣ホルモンの喪失に関連した肝炎は、SHMマウスと比較して、炎症マーカーCCL2の発現が大きく（p < .05）、抗炎症メーカーおよびその受容体であるIL10およびIL10RAの発現が低く（p < .05）なる卵巣摘出によって観察された（図2f,g）。

卵巣摘出術は腸のタイトジャンクションタンパク質の発現を破壊するが、透過性の変化は食事と卵巣ホルモンの状態の両方に依存する可能性がある。
腸のバリア機能とリポ多糖結合タンパク質（LPSBP）の存在量に関連する主要遺伝子の遺伝子発現を用いて、マウスの消化管の完全性を評価した（Supplemental Table S4で評価したすべての遺伝子を参照）。タイトジャンクションタンパク質、クローディン3（CLDN3）およびオクルディン（OCLN）をコードする遺伝子の発現は、SHM群と比較してOVX群の盲腸で低かった（p＜0.05）（図2h,i）。HFDを与えたマウスはLFDを与えたマウスに比べて、CLDN3、クローディン5（CLDN5）、クローディン8（CLDN8）の盲腸での発現が低かった（p < .05）（図2hおよび補足図S3）。タイトジャンクションタンパク質関連遺伝子の発現は、卵巣ホルモンの喪失や高脂肪食により腸管バリア機能が低下している可能性を示唆している。肥満や代謝機能障害では消化管の完全性が損なわれ、全身循環に入ると炎症を促進し宿主の健康に影響を及ぼす腸内細菌叢由来の内毒素である血漿リポ多糖（LPS）の上昇につながる。引用22 この研究では、LPSの測定は感度に欠けるため、慢性内毒素血症を評価する代用としてLPSBPを用いた。引用23 血清中のLPSBP濃度は、高脂血症、肥満、慢性疾患と関連している。引用24-27 OVX-HFD群では、OVX-LFD群に比べて循環LPSBP濃度が高いことが観察されたが、SHM群のいずれと比べても差はなかった（図1f）。タイトジャンクションタンパク質関連遺伝子のセカル発現とともに、我々のデータは、卵巣ホルモン産生が失われると腸管バリアが損なわれる可能性を示唆している。しかし、このエビデンスは、今後、フルオレセインイソチオシアネート-デキストラン透過性試験などの機能的試験を含めることで裏付けられる可能性がある。

卵巣摘出による腸内細菌叢と糞便β-グルクロニダーゼ活性の違いは、LFDを与えたマウスでのみ観察された。
腸内細菌叢のプロファイルを評価するため、安楽死時にマウスから睾丸内容物を採取した。加重および非加重UniFrac距離の主座標分析（PCoA）により、介入終了時のHFD-およびLFD-給餌マウスの間で、糞便微生物叢が明確に分離（p < .05）していることが明らかになった（図3a）。興味深いことに、LFD食を与えた場合のみ、SHM動物とOVX動物の間でクラスタリングの差（p < .05）が観察されたが、HFD食群では観察されなかった。このデータは、食餌が腸内細菌叢に強い影響を及ぼし、性ホルモンの状態による腸内微生物の違いはHFDによってマスクされる可能性があることを示唆している。種の豊かさのアルファ多様性測定では、HFDはLFDよりも系統的多様性が低い（p < .05）ことが示唆された（図3b）。しかし、種の豊富さはOVX群とSHM群の間で性ホルモンの状態による差はなかった。これらのマウスのケカでは、7系統、25科、35属が同定された。最も豊富な門は、ファーミキューテス（配列の平均79.8％）、バクテロイデーテス（17.3％）、放線菌（2.2％）、およびVerrucomicrobia（0.6％）であった。Citation28また、OVX-LFD群の微生物プロファイルは、他の治療群に比べて明瞭であった（図3d,e）。これらのマウスは、ビフィズス菌科のビフィドバクテリウム属に牽引された放線菌の割合が有意に高い（p < .05、補足表S5）。OVX-LFDマウスの腸内細菌叢で観察されたビフィズス菌の増加は、定量的PCR評価で確認された（補足図S4）。HFDを与えたSHMマウスとOVXマウスの間で観察された表現型の有意差にもかかわらず、腸内細菌叢はこれら2つの処置群間で差はなかった。対照的に、LFDを与えた場合、SHMマウスとOVXマウスの間で腸内細菌叢のクラスタリングに差が観察された。

図3. 低脂肪食（LFD）または高脂肪食（HFD）を与えた卵巣摘出（OVX）または偽手術（SHM）C57BL/6Jマウスの糞便中β-グルクロニダーゼ活性。重み付けUniFrac主座標分析（PCoA）プロット（a）、系統的多様性（b）、ファーミキューテス：バクテロイデーテス比（c）、糞便微生物叢の門（d）および科（e）レベルでの分類学的分類、および糞便β-グルクロニダーゼ活性（f）卵巣摘出介入12週後（n=8-10/群）。*主食効果を示す、p < 0.05。
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卵巣ホルモン産生の喪失による縦断的な微生物叢の変化を評価し、性ホルモンの卵巣産生除去後に微生物叢の変化が起こる時点を同定するために、4週間ごとに糞便サンプルを採取した（補足図S5）。糞便微生物叢の加重および非加重UniFrac距離のPCoAでは、各時点でHFD飼育マウスとLFD飼育マウスの間に明瞭な分離（p < 0.05）が認められ、食餌は糞便微生物叢に有意な影響を及ぼした。この研究期間を通じて、HFDを与えたマウスの糞便微生物叢は卵巣ホルモンの状態によって異なるクラスターを形成しなかった。一方、卵巣ホルモンの喪失は、LFDを与えたマウスの糞便微生物叢をシフトさせた。SHM-LFDとOVX-LFD間の糞便微生物叢のシフトは、卵巣摘出後4週目頃から始まり、12週目に最も明瞭にクラスター化するように進化し続けたようである。

前述したように、β-グルクロニダーゼをコードする細菌は、エストロゲンを含むステロイド代謝産物を脱共役し、再吸収することができる。その結果、β-グルクロニダーゼ活性はLFD-OVX群でLFD-SHM群よりも高かった（図3f）。腸内細菌叢における観察結果と同様に、卵巣ホルモンの喪失による糞便β-グルクロニダーゼ活性の違いは、LFDを与えたマウスでのみ観察され、HFDを与えたマウスでは観察されなかった。

卵巣摘出関連微生物叢の糞便微生物叢移植により、体重増加と炎症徴候が大きくなった
HFD飼育マウスの腸内細菌叢には卵巣ホルモンに関連した差異が認められなかったため、LFD飼育マウスの糞便サンプルを糞便微生物叢移植試験に用いた（以下、「ドナー」マウスと呼ぶ、図4a）。LFDを与えたSHMおよびOVXドナーマウスの糞便サンプルを用いて、無菌C57BL/6マウスに移植し、腸内細菌叢によって誘導される代謝表現型を評価した。通常飼育のドナーマウスから術後8週目に採取した糞便サンプルを嫌気チャンバー内のリッチ培地に懸濁し、接種に用いた。ジャームフリーレシピエントマウスには、従来飼育のドナーマウスと同じ飼料処方の照射LFDを与え、8週齢で接種した。コロニー形成から4週間後、SHM関連微生物叢（SHM-R）を投与された無菌レシピエントマウスの糞便微生物叢は、OVX関連微生物叢（OVX-R）を投与されたレシピエントマウスの糞便微生物叢と異なるクラスターを形成していた（p < 0.05）（図4b）。門レベルでは、OVX-RマウスはSHM-Rマウスと比較して、TenericutesとProteobacteriaの相対存在量が低かった（図4c、補足表S6）。科レベルでは、OVX-Rマウスは、Erysipelotrichaceae、Coriobacteriaceae、Clostridiaceaeの相対存在量が有意に高く（p < .05）、Streptococcaceae、Enterobacteriaceae、Dehalobacteriaceae、Bifidobacteriaceaeの相対存在量が低かった（図4d、Supplemental Table S6）。属レベルでは、アロバクラムはOVX-Rマウスで有意に多く、ビフィドバクテリウムとコプロコッカスはSHM-Rマウスに比べて有意に少なかった。

図4. 低脂肪食を与えた卵巣摘出（OVX）または偽手術（SHM）ドナーC57BL/6Jマウスの糞便サンプルでコロニー形成したgnotobioticマウス（R）の腸内細菌叢と体重増加。糞便微生物叢移植（FMT）は、低脂肪食を与えた従来飼育のOVXまたはSHM C57BL/6J（B6）マウスの腸内細菌叢を無菌（GF）レシピエントに移植することで行った（a）。HFDを与えたドナーから得られた腸内細菌叢サンプルは、処理群に基づく腸内細菌叢の明確なクラスタリングが見られなかったため、FMT試験には用いなかった。加重UniFrac主座標分析（PCoA）プロット（b）、糞便微生物叢の門（c）および科（d）レベルでの分類学的分類、体重増加（e）およびコロニー形成4週間後の安楽死時の糞便β-グルクロニダーゼ活性（f）（n=11-13/群）。
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コロニー形成から4週間後、OVX関連微生物叢をコロニー形成したマウスは、SHM関連微生物叢を投与したマウスよりも体重が増加した（p < 0.05）（図4e）。ドナーマウスとは異なり、FMTでは移植4週後のOVX-RマウスとSHM-Rマウスの間で糞便β-グルクロニダーゼ活性に差は見られなかった（図4f）。しかし、OVX-Rマウスの糞便β-グルクロニダーゼ活性は、統計学的に有意ではなかったものの、数値的にはOVX-Rマウスの方が高かった。注目すべきは、レシピエントマウスで検出された全体的な活性レベルはドナーマウスより著しく低かったことである。ドナーマウスと同様に、レシピエントマウスの肝臓と腸においても、炎症、マクロファージ、酸化ストレス、低酸素に関連する遺伝子マーカーが評価された。階層的クラスタリング戦略により、特に肝臓において、各処置群内での明確なパターンの類似性と、受けた微生物叢に基づく群間の非類似性が明らかになった（図5a）。SHM-Rと比較して、OVX関連微生物叢を投与されたマウスは、炎症マーカーCCL2（MCP1）と血管細胞接着分子-1（VCAM1）の肝発現がより大きかった（p < .05）（図5b,c）。肝アルギナーゼI（ARG1）の発現上昇（p＜0.05）もSHM-Rと比較してOVX-R群で観察された（図5d）。興味深いことに、OVX-RマウスはSHM-Rマウスと比較して、肥満、2型糖尿病、メタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪性肝疾患に関連するマーカーである肝フェツインAの発現が高い（p < .05）ことが示された（図5e）。OVX-Rマウスは、SHM-Rマウスと比較して、近位結腸ではTNFαおよびtoll様受容体4（TLR4）、盲腸ではCCL2の炎症性マーカーの発現が大きかった（p < 0.05）（図5f-h）。OVX-Rマウスでは、タイトジャンクションタンパク質をコードする遺伝子CLDN8の発現が低い（p < .05）ことが観察され、これはOVXに伴う微生物叢移植に反応して腸管バリア機能が低下する可能性を示唆していると考えられる（図5i）。

図5. 低脂肪食を与えた卵巣摘出（OVX）または偽手術（SHM）ドナーC57BL/6Jマウスの微生物叢をコロニー形成させた4週間後の同胞性レシピエントマウス（R）の遺伝子発現。gnotobioticマウスの肝遺伝子発現の類似性（a）および肝臓、近位結腸（P. Colon）、盲腸（b-i）における炎症およびタイトジャンクションタンパク質関連遺伝子の相対発現（b-i）に基づく階層的クラスタリング。ヒートマップの各行は特定の遺伝子を表し、各列は1サンプルを表し、カラーコードは治療群（SHM-R：青、OVX-R：赤）を示す。*p < .05, **p < .01, ****p < .0001。

図5. 低脂肪食を与えた卵巣摘出（OVX）または偽手術（SHM）ドナーC57BL/6Jマウスの微生物叢をコロニー形成させた4週間後の同腹仔マウス（R）の遺伝子発現。gnotobioticマウスの肝遺伝子発現の類似性（a）および肝臓、近位結腸（P. Colon）、盲腸（b-i）における炎症およびタイトジャンクションタンパク質関連遺伝子の相対発現（b-i）に基づく階層的クラスタリング。ヒートマップの各行は特定の遺伝子を表し、各列は1サンプルを表し、カラーコードは治療群（SHM-R：青、OVX-R：赤）を示す。*p < .05, **p < .01, ****p < .0001。
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考察
更年期に関連した卵巣ホルモン産生の喪失は、肥満および代謝機能不全のリスク増大と関連している。肥満は、消化管バリア機能の破綻および腸内細菌叢のシフトと関連しており、一方、肥満に関連した微生物叢は、それだけで代謝機能不全を促進するのに十分である。Citation30,Citation31しかしながら、閉経は加齢に伴う機能低下であるため、ヒトの腸内細菌叢に対する閉経の影響を検討する際には、年齢が必然的に交絡因子となる。年齢を一致させた男性との比較では年齢による変動が考慮されるが、性差や性別に基づく固有の生物学的差異は、注意を要する他の困難な交絡因子となる。それにもかかわらず、最近の報告では、閉経前女性と年齢をマッチさせた男性との間の腸内細菌叢の差異は、閉経後女性と年齢をマッチさせた男性との間で観察された差異よりも大きいことが示され、閉経に伴う女性ホルモンの減少と腸内細菌叢との間に関連性が存在することが示唆された。これまでの研究では、げっ歯類モデルにおいて、卵巣摘出による卵巣ホルモンの喪失に反応して腸内細菌叢に変化が生じることが示されている。ここではまず、卵巣摘出メスマウスの食事誘発性肥満モデルを用いて、卵巣摘出に伴う代謝および炎症の変化と腸内細菌叢（存在する細菌数と酵素活性）を調べた。さらに、半精製LFDを与えた無傷マウスと卵巣摘出マウスの腸内細菌叢を無菌マウスに移植し、代謝表現型に対する卵巣摘出関連腸内細菌叢の寄与を検討した。その結果、卵巣摘出により消化管透過性が高まり、腸および代謝器官の炎症が起こり、肥満を促進するHFDがこれらの状態を悪化させることが示された。卵巣摘出により腸内細菌叢も変化し、糞便中のβ-グルクロニダーゼ活性も上昇した。しかし、腸内細菌叢のこのような差のある変化は、マウスにHFDではなくLFDを与えた場合にのみ明らかであった。したがって、HFDを与えたマウスでは代謝表現型がより深刻であったにもかかわらず、LFDを与えたOVXおよびSHMドナーマウスから採取したサンプルを糞便微生物叢移植実験に利用した。糞便微生物叢移植により、OVX関連腸内細菌叢のレシピエントは、SHM関連腸内細菌叢のレシピエントと比較して、体重増加および炎症、肥満、アテローム性動脈硬化に関連する肝遺伝子発現が大きいことが示された。これらの結果は、腸内細菌叢が女性ホルモンの状態の変化に反応し、代謝機能障害を悪化させることを示している。

本研究では、エストロゲンシグナル伝達に影響を及ぼす可能性のあるこの交絡因子を除去するために、植物性エストロゲンを含まない半精製食をドナーマウスとレシピエントマウスの両方に与えた。興味深いことに、高ショ糖半精製HFDを与えたマウスでは、卵巣摘出による腸内細菌叢の群集レベルの影響は観察されなかった。しかし、半精製LFDを与えたマウスでは、卵巣摘出によるクラスター形成の差がより明確であった。この観察結果は、Sprague-Dawleyラットおよび2系統のマウス（C57BL/6JおよびDBA/2J）において、高ショ糖半精製HFDを与えた場合、無傷の対照群と比較して卵巣摘出により腸内細菌叢の組成が異なるというこれまでの知見と矛盾するものであった。引用16,引用17 食餌に含まれる脂肪のレベルと供給源は、我々の研究とこれまでの報告で異なっており、我々の研究では食餌脂肪の割合が高く、主な供給源としてラードを使用している（Orgらが使用した乳脂肪と比較して）引用16。このことは、食餌成分が雌性ホルモンの変化によって引き起こされる腸内細菌叢の変化をマスクしている可能性を示唆している。天然成分の穀物ベースのげっ歯類用飼料を用いた他の研究では、卵巣摘出による群集レベルの変化がないことが報告されており、これには我々の報告も含まれている。一方、Cox-Yorkらは、異なる天然成分ベースの飼料を与えた44週齢の低能力走（LCR）ラットにおいて、卵巣摘出による門レベルの腸内微生物の変化を観察した。 Citation16,Citation18-20,Citation33性ホルモンの卵巣産生の喪失が腸内細菌叢に及ぼす影響は、給餌した飼料、ベースラインの微生物叢、年齢、宿主の種や株などの様々な要因に非常に敏感であると考えられる。天然成分飼料は、製造ロットによって大豆粕の配合量が異なるため、植物性エストロゲンの濃度にばらつきがあり、消化管内のエストロゲン受容体に結合してエストロゲン様作用を誘発する可能性がある。従って、女性ホルモンと腸内細菌叢の関連性を解明する際には、食事の成分や組成を注意深く考慮する必要がある。

女性ホルモンは、消化管の完全性を高め、消化管通過時間を変化させ、腸管傷害、代謝機能障害、炎症から保護することが示されているCitation34-36。したがって、閉経期に卵巣から女性ホルモンが分泌されなくなると、消化管機能が損なわれ、女性における炎症および代謝機能障害のリスクが著しく高まる可能性がある。本研究では、卵巣摘出ドナーマウスの腸内細菌叢を摂取したグノトビオティックマウス（すなわちOVX-R群）は、偽ドナーマウスの腸内細菌叢を摂取したマウス（すなわちSHM-R群）とは異なる細菌叢プロフィールを示した。OVX-Rマウスでは、SHM-Rマウスと比較して、体重増加、肝および腸の炎症性遺伝子発現、ならびに腸のタイトジャンクションタンパク質関連遺伝子発現の低下が観察された。これまでの研究で、食事誘導性および遺伝子誘導性の肥満関連微生物叢が、gnotobioticレシピエントマウスにおいてエネルギー収穫および体脂肪増加を増加させることが示されている37。しかし、極端な代謝表現型を持たないドナーの卵巣摘出による肥満に関連した微生物叢が、宿主の代謝表現型に影響を与えるかどうかは実証されていない。最近の共同飼育研究では、卵巣摘出マウスに、痩せた偽手術対照マウスの「健康な」微生物叢を曝露しても、卵巣ホルモン産生が消失したマウスの代謝表現型を救済することはできなかったCitation20。これらの著者らは、腸内細菌叢は卵巣摘出に伴う代謝異常には寄与しない可能性が高いと結論づけた。しかし、卵巣の外科的摘出は、性ホルモン濃度に劇的かつ強力な変化をもたらし、代謝に重大な変化をもたらす。腸内細菌叢が宿主生理に及ぼす影響は、性ホルモンの外科的停止そのものほど強くないかもしれないが、未変化マウスをレシピエントとして用いた我々の研究によれば、その影響を無視すべきではない。糞便β-グルクロニダーゼ活性は、エストロゲンの腸肝リサイクルを通じて性ホルモンのホメオスタシスを維持する上で重要であることから、本研究で評価された。引用38 ヒトでは、糞便β-グルクロニダーゼ活性は糞便エストロゲンと逆相関している。引用39 今回の研究では、卵巣ホルモンの喪失はドナーマウスの糞便β-グルクロニダーゼの増加をもたらした。ドナーマウスと同様に、OVX-Rマウスは糞便中のβ-グルクロニダーゼ活性が数値的には大きかったが、統計学的には有意ではなかった。特に、レシピエントマウスの糞便中のβ-グルクロニダーゼ活性の検出レベルは、ドナーマウスのそれよりもはるかに低かった。出生時のコロニー形成期間あるいはプライミングウィンドウが、腸内微生物のβ-グルクロニダーゼ活性レベルに影響を及ぼしている可能性がある。

本研究では、卵巣からの雌性ホルモン分泌の喪失とHFD給餌の両方が、ドナーマウスのタイトジャンクションタンパク質関連遺伝子の発現を低下させた。腸内細菌叢をgnotobioticレシピエントマウスに移植すると、OVX-RマウスではSHM-R群と比較してタイトジャンクションタンパク質関連遺伝子CLDN8の発現が有意に低下した。また、OVX-RマウスはSHM-Rマウスに比べ、肝臓のARG1発現量が多いことも観察された。ARG1遺伝子は酵素アルギナーゼをコードしており、L-アルギニンを一酸化窒素合成酵素と競合させることにより一酸化窒素の産生とバイオアベイラビリティを低下させ、酸化ストレスを増大させる。アルギナーゼ活性のアップレギュレーションは、アテローム性動脈硬化症や高血圧を含む複数の心血管機能障害と関連している。引用42 OVX-Rマウスでは、SHM-Rマウスと比較して、肝フェツイン-Aおよび大腸TLR4の発現量が多いことも観察され、性ホルモンの状態の変化に伴う腸内細菌叢とフェツイン-Aの発現との相互作用が示唆された。フェツイン-Aはα-2-HS糖タンパク質（AHSG）としても知られ、成人では主に肝細胞で合成される血漿糖タンパク質で、骨ミネラル化を促進する。引用45,47 HFD摂食は、げっ歯類において肝フェツイン-Aタンパク質レベルと循環フェツイン-Aタンパク質濃度を増加させることが示されている。引用48,引用49 フェツイン-Aは、炎症とインスリン抵抗性を誘導する下流のNFκB経路を媒介することができるTLR4の内因性リガンドであると考えられている。引用50,引用51 ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）の食事補充は、2型糖尿病患者の循環フェツイン-A濃度を低下させ、血糖応答を改善することが示されている。引用52 HepG2肝がん細胞に乳酸産生プロバイオティクスを投与すると、フェツイン-A/TLR4-JNK-NF-κB経路の調節を介して、脂肪酸誘導性インスリン抵抗性が改善する。本研究で同定された心血管機能障害、インスリンシグナル伝達、肥満に関連する遺伝子マーカーもまた、腸内細菌叢によって制御されている可能性がある。これらの遺伝子を制御する腸内細菌モジュレーターを決定することは、女性ホルモンの卵巣ホルモン産生の喪失に関連する代謝障害の管理に有用であろう。

まとめ
卵巣摘出により腸内細菌叢が変化し、糞便中のβ-グルクロニダーゼ活性が大きくなったが、このような差のある変化はマウスに低脂肪食を与えた場合にのみ明らかであった。卵巣摘出関連マイクロバイオームの糞便微生物叢移植は、偽の関連マイクロバイオームを投与されたマウスと比較して、レシピエントであるgnotobioticマウスの体重増加と代謝機能障害および炎症に関連する遺伝子発現をより大きくした。まとめると、本研究により、腸内細菌叢が宿主の女性ホルモンの変化に応答し、代謝機能障害を悪化させる可能性が示された。

材料と方法
従来の方法で飼育された特定病原体フリー（SPF）マウスの飼育法
10週齢の雌性SPF C57BL/6Jマウス40匹をJackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から購入し、HFD（脂肪由来60％kcal；大豆油をコーン油に置き換えた以外はD12492製剤、Research Diets, Inc. これら2種類の飼料の配合および分析された化学組成をSupplemental Table S1に示す。12週齢で、マウスはOVXまたはSHM手術を受けた。卵巣を露出させるために、両側の卵巣脂肪パッドの上の皮膚を垂直に切開し、続いて筋肉層を水平に切開した。卵巣は焼灼器を用いて摘出されるか（OVX群）、腹腔内に戻された（SHM群）。ベースライン時（0週目、手術前）、術後4週目、8週目、12週目に糞便サンプルを採取した。術後8週目に採取した糞便サンプルをドナーのマイクロバイオームとして使用した。術後12週目のマウスは、4時間の絶食後、CO2吸入により安楽死させた。マウスは、12時間明期：12時間暗期のサイクルで温度制御された部屋で個別に飼育された。動物飼育および研究プロトコルは、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校のInstitutional Animal Care and Use Committeeの承認を得た。

無菌マウスの飼育
6週齢の無菌C57BL/6マウス20匹をレシピエント動物として使用し、上記の従来飼育のドナーマウスと同じ処方の照射LFDを与えた。LFDを与えた従来飼育のOVXマウスおよびSHMマウス（n = 7-9）から術後8週目に採取した糞便サンプルを嫌気チャンバー内でリッチ培地に懸濁し、無菌レシピエントマウスへの接種に使用した。8週齢で、糞便微生物叢移植（FMT）により、無菌レシピエントにこれらの糞便接種物をコロニー形成させた。糞便植菌は、5mlのあらかじめ還元したメガ培地で糞便サンプルをホモジナイズし、嫌気チャンバー内で行った。各レシピエントマウスは、200ulの糞便接種剤を経口投与された。レシピエント動物はAllentown Sentry SPP密閉陽圧ケージシステム（Allentown Inc. マウスは12時間明：12時間暗のサイクルで温度制御された部屋に収容された。コロニー形成4週間後に組織を採取した。動物飼育および研究プロトコルは、ウィスコンシン大学マディソン校動物飼育・使用委員会（University of Wisconsin-Madison Animal Care and Use Committee）の承認を得た。

血清化学
ドナーマウスの血清は、トリグリセリド、非エステル化脂肪酸、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼを測定してプロファイリングした（Comparative Clinical Pathology Services; Columbia, MO）。

肝脂肪症
ドナーマウスの肝脂肪症は、病理組織学および肝トリグリセリド分析によって決定した。ホルマリン固定、パラフィン包埋した肝臓切片を切り出し、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）で染色し、肝脂肪症の重症度をイリノイ大学の獣医病理学者が盲検で評価した。肝トリグリセリド濃度は、以前に記載されたように決定した。Citation54 簡単に言えば、肝臓サンプルを、1:2vol/volのメタノール-クロロホルムからなる脂質抽出溶媒1mL中でホモジナイズし、4℃で一晩穏やかに撹拌した。等量の4mM MgClを加え、ボルテックスし、4℃で1,000×gで1時間遠心した。有機相を蒸発させ、3:2vol/volブタノール-トリトンX-114ミックス（Sigma, St.）その後、肝臓トリグリセリド濃度を、分光光度計（Synergy HT, BioTek, Winooski, VT）を用いて、市販のキット（Sigma, St.）

脂肪細胞のサイズ決定
ドナーマウスのホルマリン固定、パラフィン包埋皮下脂肪組織および性腺脂肪組織（それぞれSQATおよびGDAT）を切片化し、H&Eで染色した。画像はナノゾーマー（C9600、浜松ホトニクス、日本）を用いて撮影した。脂肪組織脂肪症の重症度は、イリノイ大学の病理学者が盲検で評価した。脂肪細胞体積は、ImageJソフトウェア（http://imagej.nih.gov/ij/）を用いて、周囲軌跡から得られた断面積を用いて算出した。

腸管透過性測定
腸管バリア機能は、改良型Ussingチャンバーシステムを用いて生体外で評価した。ウッシングチャンバーは、他の潜在的な交絡変数に影響を与えることなく、腸の生理的な腸管透過性を正確に評価し、比較することができる。平衡に達するまで10-20分置いた後、経粘膜抵抗（Ohm x cm2）を測定した。

リポ多糖結合タンパク質（LPSBP）アッセイ
市販のキット（HK205-02 Mouse LBP ELISA Kit, Hycult Biotech Inc.）

遺伝子発現
ドナーマウスについては、RNeasy Lipid Tissueキット（Qiagen, Valencia, CA, USA）を用いてSQATおよびGDATから全RNAを単離した。ドナーとレシピエントの両マウスについて、肝臓と腸からの全RNAをRNeasyキット（Qiagen, Valencia, CA, USA）を用いて単離した。DNase消化はRNase-Free DNase Set（Qiagen, Valencia, CA, USA）を用いて行った。RNA濃度はND-1000分光光度計（Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA）を用いて測定した。cDNAはSuperScript III逆転写酵素（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて合成した。特定の遺伝子発現のアッセイは、イリノイ大学のRoy J. Carver Biotechnology CenterのFunctional Genomic Unitで、Fluidigm Microfluidics Dynamic Arrays（Fluidigm Corporation, South San Francisco, CA）を用いて解析した。評価した遺伝子と使用したプライマーのリストを補足表S3およびS4に示す。ハウスキーピング遺伝子としてACTB、RPS13、PPIAを用いた。簡単に説明すると、Fluidigm Deltagene Assays社によって設計され、そこから購入したプライマーを、Taqman PreAmp Master Mix（Thermo Fisher, San Jose, CA）を用いて特異的標的増幅のために1アッセイあたり1uLずつプールした。このステップの熱プロトコルは、95℃で10分間の初期変性、95℃で15秒間、60℃で4分間の増幅サイクルを13-14回繰り返した。その後、Exonuclease I（New England BioLabs, Beverly, MA）を用いて、過剰なプライマーを除去するためにExonuclease処理を行った。Evagreen Supermix (BioRad Laboratories, Hercules, CA)をリアルタイム増幅と検出に用い、以下の熱プロトコルで行った： 70℃で40分、60℃で30秒、95℃で1分、続いて96℃で5秒、60℃で20秒の増幅サイクルを30回繰り返した。各プライマーの解離曲線は、60～95℃の温度上昇を2分間でプログラムして作成し、そこから融解温度（Tm）を算出した。解析はFluidigm Real-Time PCR analysis Software 4.1.3を用いて行った。

塩基配列決定法を用いた細菌群集の特性解析
Mo-Bio PowerSoilキット（MO BIO Laboratories, Inc. 抽出したゲノムDNAの濃度は、Qubit® 3.0 Fluorometer（Life Technologies, Grand Island, NY）を用いて定量した。16S rRNA遺伝子のアンプリコンは、Fluidigm Access Array（Fluidigm Corporation, South San Francisco, CA）とRoche High Fidelity Fast Start Kit（Roche, Indianapolis, IN）を組み合わせて作成した。プライマー515F（5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3'）および806 R

(5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')を増幅に使用した（プライマーはIDT Corp. 個々のサンプルを区別するために、各 DNA アンプリコンにバーコードを付加した。アンプリコンの品質は、Fragment Analyzer（Advanced Analytics, Ames, IA）を用いて評価し、アンプリコンの領域とサイズを確認した。各サンプルから等モル量のアンプリコンを組み合わせてDNAプールを作成した。プールしたサンプルを2%アガロースE-ゲル（Life technologies, Grand Island, NY）でサイズ選択し、Qiagenゲル精製キット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて抽出した。洗浄したサイズ選択プール産物をAgilent Bioanalyzerで実行し、適切なプロファイルと平均サイズを確認した。イルミナシーケンスは、2×300v3試薬（Illumina Inc.）ライブラリーの調製とシーケンシングは、イリノイ大学のRoy J. Carver Biotechnology Centerで行った。FASTX-Toolkit（バージョン0.0.13）を用いてフォワードリードをトリミングし、qiime2-2021.4を用いて得られた配列データを処理した。引用57 簡単に言うと、EMPプロトコルを用いて配列をインポートし、DADA2Citation58を用いてノイズ除去を行い、アンプリコン配列バリアント（ASV）テーブルを得た。シングルトン（観察された回数が2回未満のASV）およびサンプルの10％未満に存在するASVは破棄された。Greengenes 13_8参照データベースを用いて、ナイーブベイズ分類法を99%の類似度閾値で学習させた。Citation59 この分類法を用いて、ASVに分類法を割り当てた。Citation60 ドナーとレシピエントの糞便サンプルについて：アルファ多様性とベータ多様性の評価には、サンプルあたり19,482配列の均等なサンプリング深度を用いた。術後0週目、4週目、8週目、12週目に採取したドナーの経時的糞便サンプルについては、サンプルあたり11,376塩基配列の均等なサンプリング深度を用いて、αおよびβ多様性の指標を評価した。

定量的PCRを用いた特定細菌分類群の評価
Bio-Rad CFX384リアルタイムPCR検出システム（Bio-Rad Laboratories, Inc. 全細菌（ユニバーサルプライマー）、特定の門（バクテロイデーテス目およびファーミキューテス目）、特定の科（Ruminococcaceae）、特定の属（Lactobacillus、Bifidobacterium、Blautia、Faecalibacterium、Fusobacterium、Turicibacter、Streptococcus、Enterococcus）を標的としたプライマーの配列をSupplemental Table S5に示す。

糞便β-グルクロニダーゼ活性
術後12週間のドナーから採取した凍結糞便サンプルをまず秤量し、15×重量/容量アッセイバッファー（100mM HEPES、250mM NaCl、pH 7.4）で再水和した。Tissuelyzer II（Qiagen, Valencia, CA, USA）を用いて、30 Hzで2分間、細菌細胞を溶解した。ホモジネートを3分間超音波処理した後、室温で13,000×g、5分間の遠心分離により清澄化した。酵素動態は、合成基質であるp-ニトロフェニルグルクロニド（PNPG）の吸光度の変化をモニターすることにより決定した。反応は、96ウェルクリアボトムアッセイプレート（Corning Costar®, Thermo Fisher, San Jose, CA）で4重反復で行った。50μLの反応量は、10μLの清澄化糞便ホモジネート、10μLのアッセイバッファー、30μLのPNPG（最終濃度1mM）から成る。適切なブランクとコントロールが含まれた。この時点までのすべての実験操作は4℃で行われた。酵素活性は、PHERAstar Plusマイクロプレートリーダー（BMG Labtech, Cary, NC）を用いて37℃で1時間測定した。各サンプルの初速度は、カスタムMATLABスクリプトを用いて計算し、それを糞便サンプルの元の重量に対して正規化し、PNPの消衰係数とアッセイウェルの経路長を用いて、糞便1グラムあたり1秒間に触媒されるPNPのnmolとして表した。

統計解析
表現型データはSAS 9.3（SAS Institute, Cary, NC）のMIXEDプロシージャを用い、パラメトリック解析が適切な場合には、食餌および手術を固定効果、動物をランダム効果として解析した。主効果が有意であった場合は、Tukeyの多重比較検定を用いて、一対比較の事後検定を行った。データの正規性はUNIVARIATE法とShapiro-Wilk統計量を用いてチェックした。データは平均値±SEMで報告し、統計的有意性はp < .05、p < .10をトレンドとみなした。GDAT、SQAT、および肝臓内で評価された遺伝子の変化を評価するために、Rのgplotsパッケージを使用してヒートマップを作成した。各データポイントの相対濃度は、各遺伝子について作成された希釈曲線に基づいて計算され、その後すべてのデータポイントはLog2変換を受けた。遺伝子発現はハウスキーピング遺伝子（ACTB、PPIA、RPS13）の平均値を用いて正規化した。微生物叢データについては、ANCOMBC（v 2.2.0）を用いて、検出されたASVと分類群の存在量の差を解析した。簡単に説明すると、QIIME2から得られたデータは、qiime2R（v 0.99.6）およびphyloseq（v 1.44.0）パッケージを用いてR（v 2023.06.0 + 421）にインポートした。 2.0）Citation66を用い、多重検定補正をBenjamini-Hochberg法を用いて行った以外は、デフォルトのパラメータを用いた。

ハイライト
女性ホルモンの卵巣産生が失われると、特に高脂肪食を与えた場合に腸の完全性が損なわれる

卵巣ホルモンによる腸内細菌叢の変化は、低脂肪食を与えた場合にのみ起こる。

腸内細菌叢は卵巣摘出に反応し、代謝機能障害を悪化させる。

著者貢献
T.-W. L.C.、K.S.S.、F.E.R.がプロジェクトを発案、T.-W. L.C.、C.-Y. L.、E.R.N.、A.P.B.、S.J.P.、B.R.L.、M.A.W.が研究を実施、T.-W. L.C.、A.P.B.、M.A.W.、M.R.R.、F.E.R.、K.S.S.が結果を解釈した。L.C.とA.P.B.は図を作成し、T.-W. L.C.、K.S.S.、F.E.R.が原稿を執筆した。著者全員が最終原稿を読み、編集し、承認した。

補足資料
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謝辞
イリノイ大学Roy J. Carver Biotechnology CenterのDNA ServicesのAlvaro Hernandez, PhDとChris Wrightには、Mi-Seqイルミナシーケンスに関する専門知識と協力をいただいた。イリノイ大学Roy J. Carver Biotechnology CenterのFunctional Genomics UnitのMark Band, PhDには、Fluidigm Access ArrayおよびExpression Arrayアッセイに関する専門知識と協力をいただいた。George Fahey, Jr, PhD, Maria Godoy, PhD, Michael Miller, PhD, Victoria Vieira-Potter, PhDには、データ解析と解釈について助言をいただいた。

情報開示
著者による潜在的な利益相反は報告されていない。

データ利用声明
本研究の結果を裏付ける生配列は、NCBI sequences read archive（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/、参照番号BioProject ID PRJNA994490）で入手可能である。

補足資料
本論文の補足データは、https://doi.org/10.1080/19490976.2023.2295429。

追加情報
資金提供
本研究は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）より、国立心肺血液研究所（National Heart Lung and Blood Institute）からウィスコンシン大学マディソン心臓血管研究センター（University of Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center）に対するRuth L. Kirschstein National Research Service Award T32 HL 007936（T.-W.L.C.へ）、および助成金HL144651（F.E.R.へ）、HL148577（F.E.R.へ）の助成を受けた。
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(注1)この論文では、「食中毒の予防と治療」、「食中毒の予防と治療」、「食中毒の予防と治療」、「食中毒の予防と治療」、「食中毒の予防と治療」、「食中毒の予防と治療」、「食中毒の予防と治療」、「食中毒の予防と治療」をテーマとしています。マウスの腸内細菌叢組成における性差とホルモンの影響。Gut Microbes. 2016;7(4):313–22. doi:10.1080/19490976.2016.1203502.
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