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電気シグナル伝達によるバイオフィルムへの種非依存的誘引

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論文|2017年1月12日、168巻、1-2号、p200-209.e12

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電気シグナル伝達によるバイオフィルムへの種非依存的誘引



ジャクリーン・ハンフリーズ
リヤン・シオン
ジンタオ・リュウ
ハイディ・A・アルジェス
レフ・ツィムリング
ギュロル M. スエル 8
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脚注を表示するオープンアーカイブDOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.12.014
PlumXメトリクス

ハイライト

バイオフィルム内の電気シグナルが遠くの運動性細胞を引き寄せる

誘引は膜電位に依存したタンブリング周波数の変調によって引き起こされる

電気シグナル伝達は一般的であり、種に依存しない誘引をもたらす。

誘引により、多様な種が既存のバイオフィルムに組み込まれる。
まとめ
バイオフィルム・コミュニティー内に存在する細菌は、細胞間シグナル伝達によってその行動を調整することができる。しかし、これらのシグナルが、群集に属さない遠くの細胞の行動にも影響を与えることができるかどうかは不明である。われわれは、マイクロ流体法を用いて、枯草菌バイオフィルムから発生するカリウムイオンチャネルを介した電気シグナルが、遠くの細胞を引き寄せることを発見した。実験と数理モデリングの統合により、バイオフィルムから放出される細胞外カリウムが遠くの細胞の膜電位を変化させ、それによって細胞の運動性を誘導することが示された。緑膿菌の細胞も枯草菌のバイオフィルムから放出される電気シグナルに引き寄せられるため、この電気的媒介による誘引は、種を超えた相互作用を可能にする一般的なメカニズムであるようだ。このように、バイオフィルム・コミュニティ内の細胞は、自らの行動を調整するだけでなく、長距離の電気的シグナル伝達を通じて、離れた場所にいる多様な細菌の行動にも影響を与えることができる。
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キーワード
バイオフィルム
電気信号伝達
運動性
多種
膜電位
イオンチャネル
細菌群集
長距離シグナル伝達
タンブリング頻度
単一細胞の軌跡
はじめに
バイオフィルム内の細菌は、異なる形態のコミュニケーションを通じて行動を調整することができる（Shapiro, 1998, Waters and Bassler, 2005, Brameyer et al.） 細菌の細胞間シグナル伝達プロセスで最もよく知られているのは、クォーラムセンシングである（Miller and Bassler, 2001）。最近、イオンチャネルを介した電気的シグナル伝達に基づく別の細胞間コミュニケーション機構も報告された（Prindle et al.） この電気シグナル伝達は、バイオフィルム・コミュニティ内でのコミュニケーションを促進することが示されている（Liu et al.） 具体的には、枯草菌バイオフィルム内の細胞は細胞外カリウムシグナルを積極的に中継し、バイオフィルム内を伝播する電気波を生成して代謝状態を調整し、それによって集団のフィットネスを向上させることができる（Prindle et al.） これらの知見は、このような細胞外シグナルがバイオフィルムを超えて伝播し、バイオフィルムの一部ではない遠くの細菌に影響を与える長距離相互作用をもたらす可能性があるかという疑問を引き起こす。そこで我々は、マイクロ流体法を用いて、バイオフィルム内で発生した電気信号が、同じ水環境を共有する他のバクテリアの行動に影響を与えるかどうかを調べた。特に、電気シグナルは膜電位を変化させることでバクテリアの運動性に影響を与える可能性があるという仮説を立てた。このような長距離シグナル伝達は、細菌群集が離れた細胞の運動行動を制御する一般的なメカニズムを提供する可能性がある。
研究結果
電気的に振動するバイオフィルムへの遠方運動性細胞の周期的誘引
まず、バイオフィルムと運動性細胞との相互作用ダイナミクスを、大きなマイクロ流体チャンバー（3 mm × 3 mm × 6 μm）で測定した（図S1）。具体的には、マイクロ流体チャンバー内でバイオフィルムを、振動が出現するサイズ（100万個以上）になるまで成長させた（Liu et al.） その後、運動性の細胞をチャンバー内に導入したところ、電気振動するバイオフィルムに周期的に引き寄せられることに気づいた（動画S1）。バイオフィルムと運動性細胞を正確に識別するために、蛍光標識した運動性細胞（蛍光タンパク質を構成的に発現）を、再びバイオフィルム形成後に増殖チャンバーに導入した（図1A）。運動性細胞の吸引とバイオフィルム内の電気振動の関係を明らかにするため（Prindle et al., 2015）、先に特徴づけられた蛍光カチオン色素チオフラビンT（ThT）を用いてバイオフィルム細胞の膜電位を定量した（図1A）（Prindle et al.） この荷電レポーター色素は、膜電位に従って膜を横切って拡散し、それによって細菌の膜電位のネルンスト的電圧インジケーターとして機能する（Plásek and Sigler, 1996）。このアプローチにより、バイオフィルム端における運動性細胞密度の周期的な増加が、バイオフィルム膜電位の振動を正確に追跡することが明らかになった（図1Bと1C；動画S2）。特に、バイオフィルム端における運動性細胞の集積のピークは、バイオフィルム内の電気シグナルのピークから26±9分わずかに遅れている（平均±SD、n＝44パルス；図1Cと1D）。さらに、バイオフィルム端への運動性細胞誘引の周期は、バイオフィルム内の電気的シグナル伝達の周期の自然変動に追従した（図1E）。電気振動を開始していないバイオフィルムへの運動性細胞の誘引は観察されなかったことから（図S2）、電気シグナルが運動性細胞の誘引に重要な役割を果たしていることが示唆された。さらに、フラジェリン遺伝子hagを欠損した非運動性細胞は、電気振動バイオフィルムへの誘引を示さなかったことから（図1F）、遠くの細胞における機能的な運動機構も必要である。これらの結果を総合すると、バイオフィルムが発生させる電気振動は、遠くの運動性細胞がバイオフィルムに周期的に引き寄せられることと時間的に相関していることがわかる。
サムネイル図1
図S1図1関連
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サムネイルgr1
図1電気的に振動するバイオフィルムに周期的に引き寄せられる遠くの運動性細胞
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図サムネイルfigs2
図S2図1との関連
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細胞の運動性を方向づける細胞外カリウムの充足性
次に、観察された運動性細胞の誘引が、バイオフィルム振動（Prindle et al.） マイクロ流体デバイスを利用して、カリウムシグナルが運動性細胞に影響を与えるのに十分かどうかを直接テストした。具体的には、細胞外カリウムの代替的かつ強力な供給源を提供することで、運動性細胞をバイオフィルムから遠ざけることができるかどうかを調べた。そこで、バイオフィルムから最も離れた領域に、カリウムを添加した培地を一過的に流した（図2A）。この代替カリウム源は、バイオフィルムの電気的活性のピーク（最大運動性細胞誘引）時に導入した（図2B）。その結果、運動性細胞はバイオフィルムに引き寄せられる代わりに、競合するカリウム源に集積するようになった（図2Bと2C）。この代替カリウム源を除去すると、その後の電気活動のパルスにおいて、バイオフィルムへの運動性細胞の誘引が回復した（図2B）。これらの結果は、細胞外カリウム勾配の変化が運動性細胞の行動を方向づけるのに十分であることを示している。
図サムネイルgr2
図2細胞外カリウムは運動性を指示するのに十分である
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次に、バイオフィルムから放出される細胞外カリウムの波が、遠くの細胞の運動性に影響を与える可能性のあるメカニズムを調べ始めた。細胞外カリウムの変化は、細胞の膜電位とプロトン運動力の変化につながることが知られている（Bakker and Mangerich, 1981, Booth, 1985, Abee et al.） プロトン運動力は、濃度勾配に沿った偏ったランダムウォークを可能にするタンブリング現象の頻度を制御することにより、細菌の運動性に影響を与える（Berg and Brown, 1972, De Jong et al., 1976, Manson et al., 1977, Miller and Koshland, 1980）。細胞外カリウム、膜電位、運動性細胞のタンブリング頻度の関係は、観察された運動性細胞がバイオフィルムに引き寄せられるメカニズムの可能性を示唆している。
運動性細胞誘引におけるカリウムイオンチャネルの役割
運動性細胞誘引のメカニズムを明らかにするために、まずバイオフィルム中のカリウムイオンチャネル活性が、運動性細胞誘引をもたらす細胞外カリウムシグナルを生成することを確認した。カリウムイオンチャネルYugOを完全に欠失させると、枯草菌のバイオフィルム形成が阻害される（Lundbergら、2013、Prindleら、2015）。そこで我々は、YugOカリウムイオンチャネルのTrkAゲーティングドメインのみを欠損し、電気シグナル伝達の低下を示す（Prindleら、2015）、以前に特徴付けられた変異株（ΔtrkA）に注目した（図3B）。この変異株によって形成されたバイオフィルムは、野生型バイオフィルムと比較して、電気シグナルの振幅が75％±4％（平均±SD、各遺伝子型についてn＝3実験）低いことがわかった（図3Aおよび3B）。それに応じて、ΔtrkAバイオフィルムへの運動性細胞の吸引力は70％±9％（平均±SD、各遺伝子型についてn＝3実験）減少した（図3D）。したがって、ΔtrkAバイオフィルムによって生成される電気信号の弱さと、それに対応する運動性細胞誘引の減少との間に直接的な相関関係があることがわかった。これらの結果は、バイオフィルム細胞のカリウムイオンチャネルが、運動性細胞を引き寄せる電気信号の生成に重要な役割を果たしていることを示している。
図サムネイルgr3
図3運動性細胞の誘引は、バイオフィルム電気シグナルの強さと、これらのシグナルに対する運動性細胞の感受性の両方に依存する。
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運動性細胞の膜電位がバイオフィルムへの誘引に影響する
我々は、運動性細胞の誘引はバイオフィルムが発するシグナルだけでなく、カリウムシグナルに対する運動性細胞の感受性にも依存すると推測した。具体的には、細胞外カリウムの変化に対する感受性は、細胞の静止膜電位に依存する（Hille, 2001）。静止膜電位がよりマイナスの運動細胞は、バイオフィルムが発するカリウムシグナルに対してより感受性が高いだろうと予想した。そこで、運動細胞における枯草菌の主要なカリウムポンプ（KtrA）を欠失させた。カリウムポンプはカリウムイオンの細胞内濃度を高く維持する役割を担っているため、静止膜電位の確立に重要な役割を果たしている（Castañeda-García et al.） その結果、ΔktrA運動細胞は正電荷を帯びたカリウムイオンを送り込む能力が低下し、相対的にマイナスの膜電位になると考えられる。実際、ΔktrA株の膜電位は、野生型と比較して57％±6％（平均±SD、n＝2実験）より陰性であった（図S3）。ほぼ同じ電気振動振幅を持つ野生型バイオフィルムに暴露すると、ΔktrA運動性細胞の誘引は野生型運動性細胞と比較して2倍以上（239％±25％、平均±SD、n＝8実験）増加することが観察された（図3A、3C、3D）。これらの結果は、バイオフィルムによって生成されるカリウムシグナルに対する運動性細胞の膜電位を介した感受性にも誘引が依存することを示している。
サムネイル図3
図S3図3関連
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遠方細胞の膜電位と転倒頻度はバイオフィルムの振動に依存する
次に、バイオフィルム内の電気的活性が遠くの細胞の膜電位を変化させることを明らかにした。カリウム特異的蛍光色素アサンテポタシウムグリーン4（APG-4）によって報告されたように、電気的に活性なバイオフィルムが動的なカリウム勾配を生成することを確認した（図4AおよびS4）。次に、偶然マイクロ流体チャンバーに付着した遠くの細胞を利用し、細胞の動きを追跡することなく、個々の細胞の膜電位を経時的に測定した（図4B）。これにより、バイオフィルム内の電気的シグナル伝達の全期間において、離れた細胞の膜電位ダイナミクスを正確に測定することができた。その結果、バイオフィルム内の電気振動のピーク時に、これらの静止細胞の膜電位がより負になることがわかった（図4Cと4D）。これらのデータを総合すると、バイオフィルムが発生させるカリウム波が、離れた細胞の膜電位の変化を誘導できることがわかる。
図のサムネイルgr4
図4細胞外カリウムは長距離シグナルであり、運動性細胞の膜電位と転倒頻度に影響を与える。
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サムネイル図4
図S4図4の関連図
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次に、個々の運動性細胞の転倒頻度がバイオフィルムの電気的活性にも依存するかどうかを調べた。10ミリ秒ごとの位相差イメージングを用いて、バイオフィルムの電気振動のピーク時または谷間に特異的に得られた合計2,668個の運動性細胞の軌跡を比較した（図4E；動画S3）。このアプローチにより、運動性細胞の転倒頻度とバイオフィルムが生成する電気シグナルの関係を明らかにすることができた。バイオフィルムの電気的活動のピーク時、運動性細胞の転倒頻度はバイオフィルムからの距離に反比例することが観察された（図4F）。言い換えれば、遠くの運動性細胞は方向性のある遊泳を示したが、電気的に活性化されたバイオフィルムの端にすでに近い細胞はタンブリングし、その結果バイオフィルムの端にとどまった。対照的に、バイオフィルムの電気活動の谷間では、タンブリング頻度のこのような空間的組織は見られなかった（図4F）。これらの結果は、運動性細胞のタンブリング頻度が、バイオフィルムによって生成される時空間的な細胞外カリウム勾配によって変化することを示唆している。
エージェントベースの数理モデリングにより、細胞外カリウムが運動性を制御することが確認された。
上述した複数の実験的証拠を首尾一貫した現象論的枠組みに統合するために、我々は数理モデリングに注目した。細胞外カリウムに応答した膜電位の変化を予測するために、1952年にHodgkinとHuxleyによって開発された数学的枠組みに基づく電気生理学的モデルを利用した（Prindle et al. このモデルは、離れた定常細胞で観察された膜電位ダイナミクスの測定によって制約を受けた（図4D）。この電気生理学的モデルをエージェントベースの物理モデル（Mather et al. 簡単に言えば、細胞は柔らかい球状シリンダーとしてモデル化され、自身の運動性と他の細胞との接触によって生じる力とトルクの下で、ニュートンの法則に従って動く。以前のモデル（Prindle et al., 2015, Mather et al., 2010, Volfson et al., 2008）とは異なり、各細胞はその電気生理学的状態と運動性を結びつける常微分方程式を与えられた（図5A; STAR Methods）。このモデルを用いて、細胞外カリウムの変化が細胞の膜電位をどのように変化させるか、そしてそれが各運動性細胞の転倒確率にどのように影響するかを計算した（図5AおよびS5）（De Jong et al.） さらに、このシミュレーションには非運動性のバイオフィルム細胞も含まれ、カリウムの供給源または吸収源として交互に作用すると仮定した（それぞれ電気的活性のピークと谷）（図5B、それぞれシアン色と黒色の細胞）。培地を介した細胞外カリウムの拡散は、標準的な拡散方程式で記述した（詳細はSTAR Methodsを参照）。実験結果と一致して、シミュレーションでは電気振動するバイオフィルムに遠くの運動性細胞が周期的に引き寄せられることが示された（図5B; 動画S4）。これらのモデリング結果は、振動する細胞外カリウム源（バイオフィルム）が、その膜電位を変化させることで運動性細胞を周期的に引き寄せることができることを示している。
図のサムネイルgr5
図5バイオフィルムからの電気シグナルによって駆動される運動性細胞誘引のエージェントに基づくモデリング
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図サムネイルfigs5
図S5図5の関連図
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我々のモデルは主に静止細胞での測定から得られたものであるため、運動性細胞の追加測定によってモデル化予測を独自に検証する機会を提供した。特に、空間的なカリウム勾配に沿って移動する運動細胞は、カリウムの時間的変化に反応する静止細胞と同様の膜電位プロファイルを持つと予想されるというモデル予測を検証した（図5C）。言い換えれば、バイオフィルムの電気的活性がピークの時の運動細胞は、平均してより負の膜電位を持つはずである。この予測を検証するため、バイオフィルムの電気振動の誘引期（ピーク）と非誘引期（トラフ）に特異的に運動細胞の膜電位分布を測定した。我々のモデルが予測した通り、運動性細胞は誘引期において平均してより負の膜電位を持つことがわかった（図5D）。これらのデータは、定常細胞と同様に、運動性細胞の膜電位もバイオフィルムの電気的活性に依存していることを示している。さらに、時間とバイオフィルムからの距離の関数としての運動性細胞密度プロファイルは、モデル予測と一致していることがわかった（図5Eと5F）。これらの結果は、数理モデルをさらに検証し、実験結果を解釈するための首尾一貫した枠組みを確立することを可能にする。
電気的媒介による誘引は、異なる細菌種間で適用される
膜電位は細菌の運動性において一般的な役割を果たしており（Mansonら、1977、Meisterら、1987、Loら、2007）、したがって膜電位の変化を誘導することに基づく誘引のメカニズムは、他の細菌種にも適用できる可能性がある。この仮説を検証するため、我々は緑膿菌と既存の枯草菌バイオフィルムとの相互作用を研究した。緑膿菌を選んだのは、グラム陽性菌である枯草菌とは進化的に遠いグラム陰性菌だからである。予想通り、緑膿菌の運動細胞も電気振動の間、枯草菌バイオフィルムに周期的に引き寄せられることがわかった（図6A、6B、S6）。枯草菌の観察と一致して、緑膿菌の運動性細胞がバイオフィルム端に集積するピークは、バイオフィルムの電気的活性のピークから22±13分（平均±SD、n＝30パルス）遅れることがわかった（図6C）。さらに、バイオフィルム内の電気シグナルの周期の変動は、緑膿菌がバイオフィルム端に引き寄せられる周期と直接一致した（図6D）。これらの結果は、電気的媒介による誘引のメカニズムが枯草菌細胞に限定されず、したがって種を超えた相互作用が可能であることを示している。
図のサムネイルgr6
図6バイオフィルムの電気シグナルは他の細菌種も引き寄せることができる
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図サムネイルfigs6
図S6図6の関連図
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電気的吸引力の強さがバイオフィルムへの新メンバーの取り込みを調節する
遠くの細胞がバイオフィルムの端に引き寄せられると、その細胞がバイオフィルムに組み込まれる可能性があり、電気的吸引力の強さを定量化する新たな機会が得られた（図7A）。我々はまず、運動性細胞の蛍光標識を利用して、運動性枯草菌細胞が既存の枯草菌バイオフィルムに恒久的に取り込まれることを確認した（図7B）。次に、電気的吸引力が低下したΔtrkA変異バイオフィルムを用いて、電気的吸引力の低下によって遠くの細胞のバイオフィルムへの取り込みが減少するかどうかを調べた。予想通り、ΔtrkA変異体バイオフィルムへの枯草菌細胞の永続的な取り込みは少なかった（図7C）。重要なことは、緑膿菌細胞も枯草菌バイオフィルムに永久的に取り込まれる可能性があることである。枯草菌の運動性細胞の結果と一致して、ΔtrkA枯草菌バイオフィルムへの緑膿菌運動性細胞の取り込みは少ないことがわかった（図7Dと7E）。両種について、運動性細胞の吸引力と永久的な取り込みの間に強い相関があることから、取り込みは運動性細胞の吸引力の強さを正確に反映していることが確認された（図7Fおよび7G）。これらのデータは、既存のバイオフィルムへの新しいメンバーの永続的な組み込みのレベルは、電気的吸引力の強さに依存することを示している。
図のサムネイルgr7
図7吸引力の強さによって運動性細胞のバイオフィルムへの取り込みが起こりうる
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考察
我々の研究は、カリウムイオンチャネルを介した電気シグナル伝達がバイオフィルムの境界を越えて広がり、遠くの細胞を引き寄せることができることを示している。この誘引はカリウムイオンの動的勾配によって駆動され、離れた細胞の膜電位を変化させ、それによって細胞の運動行動に影響を与えることができる。このように我々の研究は、細菌の運動性における膜電位の重要性を強調した先行研究を基に、さらに発展させたものである（Miller and Koshland, 1977, Miller and Koshland, 1980, Manson et al., 1977, Shioi et al., 1978, Shioi et al., 1980, Matsuura et al., 1979, Meister et al., 1987, Meister et al., 1989, Lo et al., 2007）。カリウムイオンを介した長距離シグナル伝達は、生化学的合成や複雑なシグナル伝達ネットワークを必要としないため、細胞の運動性に迅速な反応を生じさせることができる。われわれの実験条件では、細菌群集はカリウムイオンチャネルを介した電気シグナルによって、離れた細胞の運動性を効果的に調節することができる。これらの結果は、細菌のバイオフィルムが、コミュニティ内に存在する細胞の行動を制御するだけでなく、コミュニティの一部ではない遠くの細胞に対しても制御を及ぼしていることを示している。
我々の発見は、バイオフィルムと遠くの細胞との間の相互作用メカニズムが、進化的に離れた細菌にも適用され、したがって単一種の細胞に限定されないことを示している。特に、膜電位に対する細胞外カリウムの影響は、相互作用が物理的な性質のものであるため、すべての細胞で共有される。このことは、特定のレセプターやシグナル伝達経路を必要としない、汎用的な長距離異種間シグナル伝達の新しいパラダイムを示唆している。興味深いことに、異種間アトラクションの結果、異なる種の細菌が既存のバイオフィルムに取り込まれることもある。したがって、我々の研究は、バイオフィルム群集とその周囲の細胞の複雑な共存に関する、多くの新たな興味をそそる問題を提起している。これらの疑問の追求は、基礎的な洞察だけでなく、単一細胞と群集の相互作用を制御する合成生物学的アプローチに活用できるツールを提供する可能性が高い。
STAR★メソッド
主要リソース表
試薬またはリソースのソース識別子
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
塩化カリウム Sigma-Aldrich Cat #: P3911, CAS: 7447-40-7
L-グルタミン酸ナトリウム塩水和物 Sigma-Aldrich Cat #: G5889, CAS: 142-47-2 (無水)
グリセロール Sigma-Aldrich Cat #: G5516, CAS: 56-81-5
塩化マグネシウム六水和物 Fisher Scientific Cat #: BP214, CAS: 7786-30-3
一塩基性リン酸カリウム Fisher Scientific Cat #: BP362, CAS: 7778-77-0
二塩基性リン酸カリウム Fisher Scientific Cat #: BP363, CAS: 7758-11-4
チアミン塩酸塩 Fisher Scientific 社のカタログ番号: BP892, CAS: 67-03-8
塩化マンガン Acros Organics 社の Cat #: AC193451000, CAS: 13446-34-9
塩化カルシウム Fisher Scientific Cat #: BP510, CAS: 10035-04-8
塩化鉄（III） Acros OrganicsのCat #: AC217090025, CAS10025-77-1
塩化亜鉛 Sigma-Aldrich Cat #: Z0152, CAS: 7646-85-7
チオフラビン T Acros Organics 社の Cat #: AC211761000, CAS: 2390-54-7
イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド Sigma-Aldrich Cat #: IPTG-RO, CAS: 367-93-1
アサンテカリウムグリーン（AM） TEFLabs Cat #: 3602
MOPS シグマ・アルドリッチ Cat #: M3183, CAS: 1132-61-2
実験モデル 生物／株
枯草菌 NCIB 3610 Bacillus Genetic Stock Center BGSCID: 3A1
枯草菌 NCIB 3610 AmyE::Phyp-mKate2, sinI::neo (運動細胞) 本研究 N/A
枯草菌 NCIB 3610 AmyE::Phyp-YFP, hag::cat （非運動性細胞） 本試験 N/A
枯草菌 NCIB 3610 trkA::neo (ΔtrkA) Prindle et al., 2015 N/A
B. subtilis NCIB 3610 AmyE::Phyp-mKate2, ktrA::mls (ΔktrA) 本研究 N/A
緑膿菌 PA01/pJA06-miniRK2 PSpac-tdTomato::kan 本研究 N/A
ソフトウェアとアルゴリズム
MATLAB and Image Processing Toolkit MathWorks, 2012 https://www.mathworks.com/products/matlab/html
Python (Anaconda) Continuum Analytics, 2016
Trackpy Trackpy Authors, 2016 http://soft-matter.github.io/trackpy/v0.3.2/#
FIJI および Stitching Plugin Schindelin et al., 2012, Preibisch et al., 2009 https://fiji.sc/
Oufti Paintdakhiら、2016 http://oufti.org/
その他
CellASIC Y04D マイクロ流体プレート EMD Millipore Cat #: Y04D-02-5PK
CellASIC ONIX マイクロ流体プラットフォーム EMD Millipore Cat #: EV262
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試薬およびリソースの共有に関するお問い合わせ
菌株および詳細情報のリクエストは、リードコンタクトの Gürol M. Süel (gsuel@ucsd.edu) までお願いします。
実験モデルと被験者の詳細
細菌株
実験はすべて枯草菌NCIB 3610株と緑膿菌PA01株を用いて行った。B. subtilis 3610株は、W. Winkler（University of Maryland）から親切にいただいた（Irnov and Winkler, 2010）。緑膿菌PA01株は、K. Pogliano（University of California, San Diego）からいただいたもので、J. Aguilar（University of California, San Diego）が作成したtd-Tomato蛍光レポータープラスミドを含んでいた。本研究で使用した菌株はすべてTable S1に記載されており、枯草菌3610または緑膿菌PA01に由来する。枯草菌の運動性細胞には、誘導性Phypプロモーターの制御下にあるmKate2レポーターが含まれていた（誘導には1 mM IPTGを使用）。さらに、装置内の目詰まりを軽減するため、運動性細胞ではsinI遺伝子（バイオフィルム形成制御因子）を欠失させた。mKate2コンストラクトはR. Losickから親切にいただいた。ΔtrkA株とΔhag株は、欠失させる遺伝子の上流と下流の1kbの領域をPCRで増幅し、抗生物質耐性カセットを挟んだpER449ベクター（W. Winklerからの寄贈）にクローニングすることで作製した。構築物は配列を確認し、標準的な一段階形質転換手順（Jarmerら、2002年）を用いて染色体に組み込んだ。ΔktrA株は、Bacillus Genetic Stock CenterからKtrA欠失株BKE31090を入手し、これをドナーとして、SPP1を介したファージ導入により3610株にΔktrA::mlsコンストラクトを3610バックグラウンドに導入することにより作製した（Yasbin and Young, 1974）。ΔktrAおよびΔhag細胞については、次に構成的レポーターをワンステップ形質転換法を用いて染色体に組み込んだ。組み込みはコロニーPCRで確認した。
増殖条件と色素濃度
バイオフィルムはMSgg培地（5mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）、100mM MOPS緩衝液（pH7.0、NaOHで調整）、2mM MgCl2、700μM CaCl2、50μM MnCl2、100μM FeCl3、1μM ZnCl2、2μM チアミンHCl、0.5%（v/v）グリセロール、および0.5%（w/v）グルタミン酸ナトリウム）で増殖させた。MSgg培地は、実験当日にストックから作り直した。グルタミン酸と鉄のストックは毎週作り直した。ThT（Sigma-Aldrich）は最終濃度10μMで、APG-4（TEFLabs）は2μMで使用した。運動性細胞で用いられるPhypレポーターは、1 mM IPTGを用いて誘導した。バイオフィルムは、運動細胞を添加する前に、実験で使用した色素や誘導剤に少なくとも1時間馴化させた。
方法の詳細
マイクロフルイディクスと運動細胞培養
枯草菌バイオフィルムを成熟状態（生育約20時間）まで生育させた後、別途生育させた枯草菌または緑膿菌の浮遊性細胞培養をバイオフィルムとともに生育チャンバーに導入した。
バイオフィルム増殖
マイクロ流体培養には、CellASIC ONIX Microfluidic PlatformとY04Dマイクロ流体プレート（EMD Millipore）を用いた。バイオフィルム培養の前日、使用する菌株を-80℃のグリセロールストックからLB寒天プレートにストリークした。翌日、バイオフィルム株プレートからコロニー1個を摘出し、3mLのライソジニー・ブロス（LB）に接種した。37℃で3時間振とう培養した後、細胞を2100rcfで1分間スピンダウンし、新鮮なMSggに再懸濁し、マイクロ流体チャンバーにロードした。ローディング後、細胞は32.5℃で一晩インキュベートされ、その後30℃で残りの実験が行われた。運動性細胞を添加する前に、1つのウェルから1.5psiで供給された培地でバイオフィルムを増殖させた。
運動性細胞の増殖
使用する運動性細胞株は、-80℃のグリセロールストックからLB寒天プレートにストリークした。バイオフィルムが最初に担持され増殖したのと同じ夜、使用する枯草菌運動性細胞株の単一コロニーを、3 mLのMSgg＋1 mM IPTGと、ThTやAPG-4など実験に使用する任意の蛍光リポーターに接種した。この培養液を、15 mL の培養チューブ中で一晩（10-14 時間）37℃で振盪培養した。朝、この培養液を新鮮なMSggに再懸濁し、直ちにマイクロ流体チャンバーにロードした。非運動性Δhag枯草菌細胞を培養し、運動性枯草菌細胞と同様の方法でマイクロ流体デバイスに導入した。緑膿菌運動性細胞は枯草菌と同じ方法で培養したが、一晩培養した後、培養液を新鮮なMSggで1:30に希釈し、37℃で2時間振盪培養した後、新鮮なMSggに再懸濁し、マイクロ流体チャンバーにロードした。
成熟バイオフィルムの振動が始まった後、運動細胞をマイクロ流体チャンバーに導入した。運動性細胞のODを測定し、枯草菌では1、緑膿菌では0.5に正規化した。運動細胞は5μmのフィルターに通して凝集塊を除去し、2100rcfで1分間スピンダウンした後、新鮮なMSgg+1mM IPTG+蛍光色素に再懸濁した。運動性のある細胞は、専用の培地流入ウェルからチャンバーに流入させた。流速（12μm/sec）は、増殖チャンバーに新鮮培地を供給するのに十分な低速度であるが、運動性細胞が流れに逆らって上流に泳ぐことができないほど高速ではない。
図2に示すカリウム添加実験は、増殖チャンバーの片側で単一のバイオフィルムを増殖させ、チャンバーのもう片側に人工カリウム源を導入して行った。運動性細胞懸濁液の流入口に加え、バイオフィルムから最も遠い流入口から300mM KClを添加したMSggを流すことで、カリウム濃度勾配を作り出すことができた。
タイムラプス顕微鏡観察
バイオフィルムの成長は位相差顕微鏡で追跡し、運動性細胞の行動はPhyp-mKate2レポーター（運動性細胞のみに存在）の蛍光顕微鏡で追跡した。使用したイメージングシステムは、Lumen Dynamics社のX-Cite LED光源を搭載したOlympus IX83と、Sutter Instruments社のLambda XL光源を搭載したOlympus IX81である。誘引実験は10倍の対物レンズを用いて取得し、図4C、4D、5Dに示した実験では、運動性細胞のThT強度を評価するために40倍の対物レンズを用いた。タイムラプス実験では、位相画像と蛍光画像を10分間隔で撮影した。
電気的引力に関する計算モデル
我々のエージェント・ベースのモデルは、各運動性細胞は互いに独立に、細胞外カリウムの変化にのみ反応して電気生理学的状態と運動性を変化させると仮定している。我々は以前の論文（Prindle et al., 2015）で紹介した電気生理学的モデルの一般化を用いて、各細胞内の細胞内カリウム駆動ダイナミクスを記述する。膜電位は標準的なHodgkin-Huxley型のコンダクタンス方程式によって支配される
�
�
�
�
�
�

�
�
�
4
(
�

�
�
)

�
�
(
�

�
�
)
(1)

ここでCは細胞膜のキャパシタンスである。右辺の第一項は、カリウムイオンチャンネルを通して細胞から 逃げていくカリウムイオンによる膜電位の変化を表し、第二項 はリーク電流を表す。標準的なHodgkin-Huxleyモデルでは、膜電位ダイナミクスは非常に速く（ミリ秒）、細胞外カリウムのゆっくりとした変化や、それに対応する細菌の運動性の変化（数時間）よりもはるかに速い。このようにタイムスケールが大きく異なるプロセスを一緒にシミュレーションするのは非常に難しいので、細胞内の電気生理学的ダイナミクスを遅くするためにスケーリングファクターηを導入した。このスケーリングファクターは式3と式4にも適用される。電気生理学的プロセ スがモデルの遅い部分よりずっと速いままである限り、細胞集団の遅い ダイナミクスに大きな影響を与えることはない。我々はη=300を使用し、この係数を150に変更してもシミュレー ション結果に大きな影響を与えないことを確認した。
静止電位
�
�
と
�
�
はイオンポンプによって設定され、一般に細胞内と細胞外のカリウムレベルに依存する、
�
�

�
�
0
+
�
�
(
�
�
+
�
�
)
;
�
�

�
�
0
+
�
�
(
�
�
+
�
�
)
.
(2)

(1)の第1項の4乗は、細菌のカリウムチャネルは4つのサブユニットで形成され、平均して時間nの何分の一かの間開いており、その動態は以下の速度式で与えられるという事実(Doyle et al., 1998)に由来する：
�
�
�
�
�

�
(
�
)
(
1

�
)

�
�
(3)

ここで、第一項はチャネルの開口率を表し、第二項はチャネルの閉口率を表す。Prindleら, 2015と同様に、カリウムチャネルの開口率αは、Hill関数に従って代謝ストレスSに依存すると仮定される。
�
(
�
)

�
0
�
�
/
(
�
�
ℎ
�
+
�
�
)
. この代謝ストレス変数は、過剰NAD+ (Roosild et al., 2002, Schlösser et al., 1993)のようなストレス関連代謝産物(Cao et al., 2013)の濃度を表し、それ自身は次式に従って膜電位によって制御される。
�
�
�
�
�

�
�
(
�
�
ℎ

�
)
exp
(
�
�
ℎ

�
�
)

1

�
�
�
.
(4)

高密度のバイオフィルム環境における細胞外カリウムの時間依存的ダイナミクスを記述した我々の以前のモデル（Prindle et al. その代わりに、細胞内カリウム濃度
�
�
,
�
�
�
�
�

�
�
�
�
4
(
�

�
�
)
+
�
�
(
�
0

�
)
(5)

ここで、第一項はイオンチャネルを介したカリウムのフラックスを表し、 第二項は膜電位を静止値に維持するカリウムポンプの作用を表す。
�
0
. 第2項は
�
0

�
のときのみ現れ、それ以外はゼロである。なぜな ら、イオンポンプはカリウムを細胞外から細胞内に送り出すことしかでき ないからである。
式5で表される細胞内カリウムの制御は、細菌の走化性の他のメカニズムと同様 に、積分フィードバック制御ループの役割を果たすことが示される（Yi et al.） 実際、ストレスがない場合
(
�
≈
0
)
イオンチャネルは閉じている
(
�
≈
0
)
で平衡化し、膜電位は
�

�
0
で平衡化する（完全順応）。しかし、細胞外カリウムレベルの変化は、膜電位に複雑 な一過性の変化を引き起こす可能性がある。細胞外カリウム濃度が上昇すると、式1に従っ て細胞がわずかに脱分極する（Vが上昇する）。脱分極はイオンチャネル
(
�

0
)
になると、式5に従って細胞内カリウムが流出し、細胞は強 く過分極状態になる。次にチャネルが閉じ、イオンポンプが膜電位を静止値に戻す。細胞外カリウム濃度が上昇し続ければ、このプロセスが繰り返され、周期的な脱分極パルスが続く（図S5参照）。細胞外カリウム濃度が徐々に低下すると、細胞はわずかに過分極するが、チャネルは閉じたままであり、イオンポンプは膜電位を静止値に近い状態に維持する。このような膜電位の一過性の変化は、細胞内のエネルギーレベル（このエネルギーをPMFまたはATPと考えることができる）の変化につながり、ひいては細菌の運動性の変化につながる。エネルギーダイナミクスを単純な緩和方程式で表すと、次のようになる。
�
�
�
�

�
�
�

�
�
�
(6)

となり、タンブリング確率はエネルギーによって減少すると仮定する：
�

�
�
�
(
�

�
0
)
�
+
�
�
�
.
(7)

細胞外カリウムの増加と減少に対する膜電位のダイナミクスの強い異方性 は、カリウムの空間勾配に対する運動性細菌の走化性反応につながる。実際、細胞が勾配を泳ぎ上がると、カリウムのレベルが上昇し、強く過分極するため、平均プロトン運動力と細胞内のエネルギーレベルが上昇する。したがって、転倒確率は減少し、細胞は同じ方向に泳ぎ続ける。しかし、細胞がカリウム勾配を泳ぎ下るときには、過分極は起こらず、転倒確率は高いままである。
バクテリアの運動をシミュレートするために、私たちは以前の研究（Volfson et al.） 各細胞は、軸に沿って直線的に成長し、臨界長�に達すると均等に分裂する、単位直径の球状円柱としてモデル化される。
�
�

4
. また、他の細胞との相互作用や自身の鞭毛を介した運動によって生 じる力とトルクによって、平面に沿って移動することもできる（ただし、 鞭毛のダイナミクスは明示的にモデル化していない）。わずかに非弾性的な細胞-細胞の法線方向の接触力は標準的なバネ-ダッシュポットモデルによって計算され、接線方向の力は速度依存の摩擦として計算される。有向運動の期間中、細胞はその軸に沿った自走力を経験する。タンブリングの期間中、自走力はオフになり、細胞は強いランダムトルクを経験し、ランダムな新しい方向に素早く回転する。各セルが指向性運動からタンブリングに切り替わる確率は変数
�
によって制御される。バイオフィルムに結合した細胞は非運動性であると仮定した（自走力なし、タンブリングトルクなし）。
細胞外カリウムイオン場のダイナミクスは、バイオフィルム細胞が周期的にカリウムのソースとシンクの役割を果たす反応拡散モデルによって実装された、
�
�
�
(
�
)
�
�

∑
�
�
(
�
)
�
(
�

�
�
)
+
�
�
∇
2
�
�
(
�
)
.
(8)

ここで
�
�
は細胞外カリウム濃度であり
�
�
はj番目の細胞の位置である、
�
(
�
)
は周期的な排泄を記述する周期関数である。
�
�
)と吸収(速度

�
�
�
�
) バイオフィルム細胞による細胞外カリウムのサイクル、および
�
�
はカリウム拡散定数である（Fell and Hutchison, 1971）。
それぞれの運動性「細胞」は、局所的な細胞外カリウム濃度 に反応する膜電位ダイナミクスを記述する式1、2、3、 4、5、6、7のセットをシミュレートした。細胞外カリウム濃度に対する運動性細胞の影響は無視した。モデルのパラメータを表S1に示す。
長さ100、幅20の狭いチャネルで複数のシミュレーションを行った（図5B）。約200個の細胞からなるバイオフィルムは、最初に開いたチャネルの後方（100×20μm2）で増殖させ、その後100個の運動性細胞をチャネルの開いた空間に導入した。もちろん、この計算領域は、実験的研究で使用したマイクロ流体チャンバーのごく一部に過ぎない。したがって、この計算結果は、カリウム駆動型走化性の根本的な生物物理学的メカニズムを明らかにし、探求する方法として、半定量的なレベルでしか解釈できない。簡単のため、運動性細胞については成長と分裂を無視し、外部カリウム変化に応答した運動のみを考慮した。運動性細胞の側壁には周期的な境界条件を用いた：運動性細胞が左側の壁に触れると、その細胞は消えて右側に再び現れ、逆もまた同様である。運動性のないバイオフィルム細胞は、カリウムの産生と吸収を周期的に切り替えた。
典型的なシミュレーションを動画S4に示す。各時間ステップで、カリウムの平均濃度とバイオフィルム端付近の運動性細胞密度を計算した。細胞密度の周期的な振動がはっきりと見られ、カリウムの振動に対するバクテリアの走化性反応を示している。プロトン起電力の分布はピークと谷の間でシフトしており（図5C）、実験結果と一致している（図5D）。
モデルのパラメータ
計算モデルの目的は、観察された現象を半定量的に再現することである。細菌細胞の電気生理は、哺乳類細胞の電気生理に比べて研究が少ないため、電気生理方程式のパラメータは、古典的文献（Hodgkin and Huxley, 1952）か、細菌におけるカリウムシグナル伝達を記述した我々の以前のモデル（Prindle et al.） いくつかのパラメータ（静止膜電位など）は、直接測定から推測した。電気生理学と運動性をつなぐ他のモデルパラメータ（「フィッティング」と表示）は、生理学的に関連する範囲内でランダムなパラメータ検索によって選択され、実験観察との一致を最大化するために手動による変動によってさらに改善された。
定量化と統計解析
画像解析にはFIJI/ImageJ (Schindelin et al., 2012, Preibisch et al., 2009)とMATLAB (MathWorks., 2012)を使用した。バイオフィルムの成長、バイオフィルム端の運動性細胞密度、ThT/APG-4強度は、MATLAB画像解析ツールボックスを用いて求めた。
統計解析
統計解析はMATLABを用いて行った。p値＜0.05は統計的に有意であるとみなした。データが使用した統計検定の仮定を満たしているかどうかを判断するために、MATLABの歪度関数と尖度関数が使用された。データセットには過度の歪度や尖度はなかったため、正規分布していると仮定した。
運動性細胞およびバイオフィルムのThT測定
位相差画像を用いてバイオフィルム端の座標を決定した。バイオフィルム端の座標に基づいて、バイオフィルム端から内側（バイオフィルム内部に向かって）と外側の両方に100μm幅の領域を設定した（図1Aの図を参照）。バイオフィルム内部の100μm領域は、バイオフィルム内のThT強度を測定するために使用され、バイオフィルム外部の100μm領域は、バイオフィルムのすぐ周囲の領域における運動性細胞蛍光レポーター強度を測定するために使用された。これらの領域から得られた平均強度は、バイオフィルムのThTおよびバイオフィルム時間痕跡近傍の運動細胞密度として報告された。運動性細胞密度の値は、装置に導入した細胞懸濁液の密度に対して正規化した。ThTトレースは、MATLABの "detrend "関数を用いてトレンド除去した。具体的には、この関数はデータに最小二乗直線を当てはめ、データからこの直線傾向を差し引く。
図3Dで報告されている運動性細胞応答は、単一の運動性細胞応答測定値を得るために、複数の実験から得られた運動性細胞誘引ピークの強度を平均することによって得られた。図3Dで報告されたバイオフィルム信号平均は、複数の実験のThTピークの強度を平均して単一の最大バイオフィルムThT測定値を得ることにより、同様の方法で得られた。図7Fと7Gについても同様の解析を行ったが、引き寄せられた運動性細胞のピーク強度を独立したバイオフィルムごとに平均し、そのバイオフィルムの引き寄せられた細胞の恒久的取り込みと比較できるようにした。これらすべての測定について、nの正確な値は対応する図の凡例に示されており、使用した各遺伝的背景の独立した実験数を表している。
運動性細胞密度のラグと振動周期の測定
図1Dと図6Cで報告されている運動性細胞密度のラグ測定は、運動性細胞誘引のピークとバイオフィルムThTを用いて得られた。ラグとは、バイオフィルムThTのピークと、それに対応する運動細胞誘引のピークとの間の時間と定義した。ラグ時間が正であれば、バイオフィルムThTのピークの後に運動性細胞誘引のピークが生じたことを示す。図1Dと図6Cでは、nの正確な値は対応する図の凡例に示されており、ヒストグラムに示されたThTと対応する誘引のピークの数を表している。図1Eと6Dで報告されている周期の比較は、バイオフィルムThTと運動性細胞誘引の振動のピークからピークまでの周期を決定することによって得られた。次に運動性細胞誘引の周期を、バイオフィルムThTの対応するパルスの周期に対してプロットした。図1Eと図6Dでは、nの正確な値は対応する図の凡例に示されており、プロットに含まれる振動と対応する誘引のピーク間周期の数を表している。
引き寄せられた細胞の永久的取り込み
図7Fおよび7Gで報告されている誘引細胞の永久的取り込みは、バイオフィルムの端からすぐ内側（バイオフィルム内部に向かって）の100μm領域におけるmKate2（運動性細胞にのみ存在するレポーター）の平均蛍光強度を測定し、評価領域の面積と装置に流入した運動性細胞懸濁液の密度で正規化することによって得られた。取り込み測定は、各実験の終了時に行った。nの正確な値は対応する図の凡例に示されており、各プロットに含まれる独立した実験の数を表している。
運動細胞における膜電位
図5Dのデータは、Ouftiソフトウェア（Paintdakhi et al.、2016）とMATLABを用いて、運動性細胞をセグメント化し、各細胞のThT蛍光強度を求めることにより得られた。
運動細胞追跡
運動性細胞のタンブリング頻度を評価するための単一細胞の軌跡は、40倍の倍率で10ミリ秒間隔で撮影したタイムラプス位相差画像スタックを解析することで得た。Pythonベースの細胞追跡ソフトウェアTrackPyとAnaconda Pythonプラットフォーム（Trackpy Authors, 2016, Continuum Analytics, 2016）を用いて、単一細胞の動きを経時的に追跡し、この動きを追跡した各細胞の軌跡にまとめた。図4Eと4Fには、500ミリ秒以上追跡された細胞の軌跡が含まれている。nの正確な値は対応する図の凡例に示されており、電気活動のピークと谷の間に得られた運動性細胞の軌跡の数を表している。TrackPyで得られた軌跡は、MATLABを用いてさらに解析された。タンブリング事象は、軌跡の各時点間の回転角度を求め、この回転角度が60度より大きければタンブリング事象と呼んだ。タンブリング頻度は、1秒あたりのタンブリングイベント数として報告されている。
著者貢献
G.M.S.、J.H.、J.L.が研究の構想を練った。J.H.とG.M.S.が実験をデザインした。J.H.、A.P.、F.Y.が実験を行った。J.H.とJ.L.がデータ解析を行った。L.X.とL.T.が数学的モデリングを行った。J.H.とH.A.A.は菌株を作成した。原稿はG.M.S.、J.H.、A.P.、L.T.が執筆した。著者全員が原稿について議論した。
謝辞
原稿執筆中にコメントをいただいたS. Lockless、T. Cagatay、M. Asally、K. Süel、J. Garcia-Ojalvo、菌株構築に協力していただいたSan Ly、菌株を提供していただいたK. Pogliano、R. Losick、有益な議論をいただいたD.Y. Lee、J. Larkin、L. Baumgartに感謝する。この研究は、San Diego Center for Systems Biology (NIH P50 GM085764)およびNational Science Foundation (MCB-1616755)から一部支援を受けた。G.M.S.には、NIH, National Institute of General Medical Sciences (R01 GM121888), National Science Foundation (MCB-1450867 50867), Defense Advanced Research Projects Agency (HR0011-16-2-0035), Howard Hughes Medical Institute-Simons Foundation Faculty Scholars programの助成を受けた。J.H.は、National Institute of General Medicine (T32 GM007240)からの機関助成金によるUCSD細胞分子遺伝学トレーニングプログラムの支援を受けた。A.P.はHelen Hay Whitney財団のSimons Foundation Fellowshipの支援を受け、Burroughs Wellcome FundからCareer Award at the Scientific Interfaceを授与されている。L.X.とL.T.は、ONR助成金N00014-16-1-2093の一部を受けた。
補足情報
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表S1. 図4に関連する数学モデルのパラメータ

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動画 S1. 図1関連
枯草菌バイオフィルムのあるマイクロ流体成長チャンバーに導入された枯草菌運動性細胞の位相差タイムラプスムービーで、運動性細胞がバイオフィルムに周期的に引き寄せられる様子を示している。バイオフィルムは上から下に向かって成長している。画像は40倍の倍率で2分間隔で撮影。

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動画S2. 図1関連
枯草菌バイオフィルムの振動とそれに伴う枯草菌運動性細胞の誘引のタイムラプス動画。位相差は電気シグナルの蛍光レポーター（シアン、ThT）および運動細胞のみで発現する構成的な赤色蛍光レポーター（赤、Phyp-mKate2）と合成されている。これらの追加レポーターは、電気振動と運動性細胞の誘引との間に時間的相関があることを示している。バイオフィルムは上から下に向かって成長している。画像は10倍の倍率で10分間隔で撮影。

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動画S3. 図4関連
バイオフィルムの電気シグナル伝達中の異なる時点における細胞の運動行動を比較した位相差ムービーを並べて示す。(左）バイオフィルム内の電気活動のピーク時にバイオフィルム近傍で運動する細胞。(右）バイオフィルム内の電気活動の谷間におけるバイオフィルム近傍の運動性細胞。高フレームレート（10ミリ秒間隔）のイメージングにより、単一細胞の追跡と転倒頻度の評価が可能になった。これらの動画の長いバージョンは、図4に示す単一細胞の軌跡を作成するために使用された。動画の上のラベルは、動画が撮影された時点を示す。タイムスタンプとスケールバーは両方の動画に適用され、バイオフィルムは各動画のフレームの上部にある。画像は40倍の倍率で撮影。

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動画S4. 図5関連
振動するバイオフィルムへの運動性細胞誘引の数理モデリング・エージェントベースのシミュレーション（詳細はSTAR Methodsを参照）。バイオフィルムは上から下に向かって成長している。バイオフィルム細胞は各時点での膜電位に基づいて色付けされており、シアン色はより負の膜電位を示す。運動性の細胞は赤で着色されている。

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グーグル奨学生
論文情報
出版履歴
掲載 2017年1月12日
受理済み 2016年12月9日
改訂版を受領 2016年10月17日
受理：2016年10月17日 2016年8月9日
身分証明書
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.12.014

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図S1図1関連
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図1電気的に振動するバイオフィルムに周期的に引き寄せられる遠くの運動性細胞
図のサムネイルfigs2
図S2図1との関連
図サムネイルgr2
図2細胞外カリウムは運動性を指示するのに十分である
図サムネイルgr3
図3運動性細胞の誘引は、バイオフィルムの電気的シグナルの強さと、これらのシグナルに対する運動性細胞の感受性の両方に依存する。
図サムネイルfigs3
図S3図3との関連
図サムネイルgr4
図4細胞外カリウムは運動性細胞の膜電位と転倒頻度に影響を与える長距離シグナルである。
図サムネイルfigs4
図S4図4との関連
図サムネイルgr5
図5バイオフィルムからの電気シグナルによって駆動される運動性細胞誘引の遺伝子に基づくモデリング
図のサムネイルfigs5
図S5図5との関連
図6バイオフィルムの電気的シグナル
図6バイオフィルムの電気シグナルは他の細菌種も引き寄せることができる
図6バイオフィルムの電気信号は他の細菌種も引き寄せる
図S6図6に関連
図サムネイルgr7
図7誘引の強さによっては運動性細胞がバイオフィルムに取り込まれる。
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