A 型インフルエンザウイルス感染マウスにおける呼吸器官および腸内細菌叢のトポグラフィー

2023年3月2日 10:12

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ORIGINAL RESEARCH（オリジナル研究）論文
Front. Microbiol.、2023年2月22日
Sec. Infectious Agents and Disease（感染症と疾患
第14巻 - 2023年｜https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1129690
この記事は、Research Topicの一部です。
宿主、環境、マイクロバイオーム間の三者間相互作用。ワンヘルスにおける微生物学の重要性

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A 型インフルエンザウイルス感染マウスにおける呼吸器官および腸内細菌叢のトポグラフィー
Qichao Chen1,2†, Manjiao Liu3,4†, Yanfeng Lin1,2, Kaiying Wang2, Jinhui Li2, Peihan Li2, Lang Yang2, Leili Jia2, Bei Zhang3,4, Hao Guo3,4*, Peng Li2* and Hongbin Song1,2* （※は、インフルエンザウイルス感染マウスにおける呼吸器と腸内細菌叢のトポグラフィー
1中国軍事科学院軍事医学研究所
2中国PLA疾病管理・予防センター（中国・北京市
3江蘇省シムセア診断有限公司トランスレーショナル医学・革新的医薬品開発国家重点実験室、中国江蘇省南京市
4南京シムセア医学実験科学有限公司、江蘇省南京市、中国
はじめに A型インフルエンザウイルス（IAV）により誘発される生体内環境の異常は、重篤な細菌性スーパーインフェクションの素因となる可能性がある。多くの研究は、単一の粘膜表面の微生物叢に焦点を当てている。その結果、IAV感染マウスにおける異なる解剖学的部位の微生物叢間の関係は、十分に研究されていない。

方法我々は、Nanoporeシークエンサーによる完全長16S rRNA遺伝子シーケンスを用いて呼吸器および腸内細菌叢を特徴付け、健康なマウスとIAV感染マウスの鼻咽頭、口腔咽頭、肺および腸の微生物叢を比較検討した。

結果健常マウスの中咽頭、肺、腸内細菌叢はLactobacillus属が優占し、鼻咽頭細菌叢はStreptococcus属が主であった。しかし、IAV感染マウスの中咽頭、鼻咽頭、肺、腸内細菌叢はそれぞれPseudomonas、 Escherichia、 Streptococcus、 Muribaculum属で占められていた。バイオマーカーとしてLactobacillus murinusが同定され、IAV感染マウスのすべての部位で減少していた。肺の微生物叢組成は、健常マウスの中咽頭よりも鼻咽頭の微生物叢に類似していた。

考察これらの結果から，マウスの肺の微生物叢の主体は，成体とは異なることが示唆された．さらに、IAV感染マウスでは、鼻咽頭と肺の微生物叢の類似性が高まった。IAV感染により、腸内細菌叢と口腔咽頭細菌叢の類似性が低下することを明らかにした。L. murinusはIAV感染のバイオマーカーとして同定され、インフルエンザ菌スーパーインフェクション後の介入に重要なターゲットとなる可能性がある。

はじめに
新型インフルエンザAウイルス（IAV）パンデミックのリスクは、主要な世界的公衆衛生上の脅威として迫っている（Iulianoら、2018）。インフルエンザに続く二次的な細菌感染は、重症肺炎および死亡の一般的な原因である（McCullers, 2014）。正常な宿主マイクロバイオームは、ニッチ競争と宿主免疫制御によって病原体によるコロニー形成に抵抗し、インフルエンザ後の細菌スーパーインフェクションにおいて重要な役割を果たします（Dominguez-Bello et al.，2019）。

腸内マイクロバイオームには1000種を代表する1014の細菌が含まれ、宿主の代謝、免疫、精神衛生に密接に関係している（Lynch and Pedersen, 2016）。IAV感染患者は、門レベルで放線菌とファーミキューテス、科レベルで嫌気性酪酸産生菌（RacinobacteriaceaeとRuminococcaceae）の相対量が有意に減少するなど、腸内細菌叢の多様性と存在感が著しく低下しました（Gu et al.、2020年）。腸内細菌の異常は、宿主のCD4+およびCD8+T細胞の生成と抗体反応を調節し、IAVによる肺病理を悪化させる（Ichinohe et al.、2011）。腸内細菌叢に加えて、呼吸器系細菌叢もIAV感染に重要な役割を果たします。解剖学的構造と発達の違いから、ヒトの呼吸器は上気道と下気道（それぞれURTとLRT）に分けることができます。IAV感染は、口腔咽頭や鼻咽頭の微生物叢を含むURTの微生物叢を大きく変化させる可能性があります。例えば、IAV感染児は、健常児と比較して、鼻咽頭ではモラクセラ属、ブドウ球菌属、クロストリジウム属、デュシャン属の存在度が低く、口腔咽頭ではストレプトコックス属、ナイセリア属、ヘモフィルス属の存在度が低かった（Wenら、2018年）。健康な成人では、肺の微生物叢は主に粘膜の直接分散と微小吸引によって中咽頭から由来する（Bassisら、2015年）。マウスモデルでは、IAV感染により、アルファプロテオバクテリアからガンマプロテオバクテリアへの明確なシフトと、StreptococcusおよびStaphylococcus属の相対存在度の著しい増加を特徴とする長期のLRTディスバイオシスが引き起こされることが示された（Gu et al.、2019年）。複数の研究がIAV感染後の気道および腸内細菌叢の変化を特徴づけているが、そのほとんどは特定の解剖学的部位に焦点を当てたものである。IAV感染時のURT、LRTおよび腸内細菌叢の相関は十分に研究されていない。また、第二世代シーケンサーのリード長の制限から、IAV感染時の宿主のディスバイオーシスについて、種レベルでの研究はほとんど行われていない。

そこで、IAV感染時のURT、LRTおよび腸内細菌叢の変化と相関をさらに理解するために、マウスモデルを用いて、鼻咽頭、口腔咽頭、肺および腸内細菌叢の全長16sRNA遺伝子シーケンスを実施した。その結果、IAV感染により、URT、LRT、腸の微生物叢の構造が変化することを見出した。健康なマウスでは、肺の微生物叢は中咽頭の微生物叢よりも上咽頭の微生物叢に類似していた。しかし、IAV感染時には鼻咽頭と肺の微生物叢の類似性は低下した。また、IAV感染により腸内細菌叢と口腔咽頭細菌叢の類似性が低下することが確認された。さらに、IAV感染に対する代表的な生物種の反応も見いだした。例えば、IAV感染により、気道および腸管におけるLactobacillus murinusの相対量が減少した。

材料と方法
動物モデルおよび試料採取
C57BL/6 N雌マウス（6週齢）20匹をBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. (中国)から購入し、特定の病原体のない条件下で1週間順応させた(5匹/ケージ)。マウスは、PBS模擬感染（Mock）群とIAV感染（IAV）群の2群（n = 10）に無作為に分けられた。IAV感染マウスモデルを確立するために、IAV群のマウスを0.3％ペントバルビタールナトリウムで麻酔し（腹腔内注射、50mg/kg）、A/プエルトリコ/8/34株（60PFU）を含む25μl滅菌PBSで経鼻的に感染させた。対照マウスは25μlの滅菌PBSで模擬感染させた。各マウスに1回の点鼻実験。IAV群およびMock群の全マウスを同日に感染させた。すべてのマウスは12時間の厳密な明暗サイクルのもとで水と餌を摂取することができた。動物の飼育および取り扱いに関するすべての動物手順は、中国PLA疾病管理予防センターの動物管理使用委員会の承認を得た。すべての動物は感染後4日目に0.3%ペントバルビタールナトリウム（腹腔内注射、150 mg/kg）を用いて安楽死させた。新鮮な肺の重量を測定した後，左肺は80℃で保存し，右肺はヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色用に4％パラフォルムアルデヒドで固定した．肺指数は、式：肺指数＝［（肺重量／g）／（体重／g）］×100％で算出した（Gaoら、2020）。鼻咽頭洗浄液（NLF）は、以前に報告されたように収集した（Puchta et al.、2014）。中咽頭サンプルはスワブを用いて採取し、1mlの滅菌PBSに入れ、4℃とした。気管支肺胞洗浄液（BALF）は、1mlの滅菌PBSを用いて気管支肺胞樹を3回洗浄することにより採取した。糞便サンプルを採取し、さらなる実験のために80℃で保存した。

ヘマトキシリン・エオジン染色
新鮮な右肺組織を4％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。調製した埋込肺組織を3-5μm厚の切片に切り出し、H&Eで染色した。病理学的スコアは、以前に報告されたように評価した（Renneら、2009）。

核酸抽出および qPCR
新鮮なNLF、BALFおよび口腔咽頭スワブの細菌ゲノムDNAは、QIAamp DNA Microbiome Kit（QIAGEN、ドイツ）を使用して抽出した。新鮮なNLF、BALFおよび口腔咽頭拭い液の総RNAは、QIAamp® MinElute® Virus Spin（QIAGEN、ドイツ）を用いて抽出した。糞便サンプルのゲノムDNAとtotal RNAはAllPrep® PowerFecal® DNA/RNA Kit (QIAGEN, Germany)を用いて抽出された。各キットについて，サンプルを含まない対照抽出を行った．NLF，BALF，口腔咽頭ぬぐい液および糞便サンプルのIAV力価はLuna® Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit（NEB, United States）を用いて測定した．以下のプライマーを使用した。5'-GACCRATCCTGTCACCTGAC-3′ (Forward primer), 5'-GGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3′ (Reverse primer) and 5'-FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGCACG-BHQ1-3′ (Probe) を使用した．IAVのコピー数は、標準曲線法で算出した。

16S rRNA遺伝子全長配列決定とバイオインフォマティクスパイプライン
NLF、BALF、口腔咽頭スワブ、糞便サンプルのゲノムDNAを用い、16S rRNA遺伝子配列の全長解析を行った。サンプルに加え、ライブラリ調製にはネガティブコントロール（サンプル無しのControl抽出）とポジティブコントロール（モックコミュニティ）が含まれていた。PCR反応は、KAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPA Biosystems, United States)と0. 5μMのUniversal-27F（5′- TTTCTGTTGTGCT GATTGCAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′）およびUniversal-1492R（5′- ACTTGCC TGTCGCTCTATTCTACGACTTAACCCCAATCGC-3′）を使用した。サイクリング条件は、95℃ 3分、98℃ 30秒、55℃ 1分、72℃ 1分の10サイクル、72℃ 5分とした。増幅産物は 0.8 × AgencourtAMPure XP Beads (Beckman, United States) を用いて精製した。PCR Barcoding Expansion Pack 1-96 (EXP-PBC096; Oxford Nanopore Technologies, United Kingdom) を用いて、洗浄したDNAをバーコード化し、プーリングした。Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK109; Oxford Nanopore Technologies, United Kingdom) を用いてシーケンス用ライブラリーを調製し、MinION Mk1B (Oxford Nanopore Technologies, United Kingdom) とR10フローセル (Oxford Nanopore Technologies, United Kingdom) でシーケンスした。Guppy (V 5.0.11+) を用いてベースコールを行い、min_score = 8の高品質リードを取得しました。各サンプルのリード数およびマッピング率をSupplement Table S1に示す。Emuソフトウェアを用いて、Emu v3.0 + database (Curry et al., 2022)に基づいて種組成分布を推定した。アルファ多様性（Shannon and Chao1 indices）およびBray Curtis DistanceはRパッケージvegan（v2.5.7）により算出した。主座標分析（PCoA）はRパッケージape（v5.6.2）により形成した。微生物相の機能組成とKEGGパスウェイの存在比は、PICRUST2ソフトウェア（Douglasら、2022年）を用いて予測した。LEfse分析を用いて、グループ間の存在量を比較し、バイオマーカーを特定した（Wilcoxon test p < 0.01 and |log10(LDA)| >3）。

統計情報
体重、IAV力価、組織学的スコアリングは、対応のないt検定で解析した。群間のShannon index，Chao1 indexおよび細菌分類群の存在比は，Mann-Whitney検定により解析した．***p ≦ 0.001、**p ≦ 0.01、*p ≦ 0.05。

結果
IAVによる重症呼吸器感染症および肺傷害の誘発
マウス感染モデルの検証として、モック群とIAV群間で体重、IAV力価、肺病理を比較検討した。IAV群では模擬群に比べ、肺指数が有意に増加し、体重が有意に減少した（図1A）。また、IAV群の口腔咽頭、鼻咽頭、肺および糞便サンプルにおいて有意なIAV力価の上昇が認められ、肺で最も高いIAV力価を確認した（図1B）。H&E染色により、IAV感染により肺障害が誘発され、肺胞壁の肥厚（黄矢印）、単核球浸潤（黒矢印）、気管支上皮細胞障害（赤矢印）を特徴とすることが示された。IAV感染群の組織学的平均スコアは、模擬感染群に比べ有意に高かった（図1C）。

図1
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図1. モックとIAV感染マウスの病理学的差異。(A)体重および肺活量(各群n=10)。(B）口腔咽頭、鼻咽頭、肺および糞便サンプルのIAV力価（各群n = 10）。(C）右肺のH&E染色と組織学的スコアリング（各群n = 5）。体重、IAV力価、組織学的スコアリングは、対応のないt検定を用いて比較した *p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.001.

IAV感染により呼吸器系微生物群集の構成が変化した
口腔咽頭、鼻咽頭、肺の微生物相の多様性（Shannon diversity index）と豊かさ（Chao1 index）は、両群間で同様であった（図2A）。PCoA解析では、IAV群の口腔咽頭および鼻咽頭微生物叢は模擬群と比較して明らかに異なっていた。しかし、肺の微生物叢構造は有意な差はなかった（図2B；補足図S1A,B,C）。

図2
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図2. IAV感染時の呼吸器系ディスバイオーシス。(A) 口咽頭、鼻咽頭、肺の微生物叢のシャノン多様性とChao1指標。(B) 口咽頭、鼻咽頭、肺の微生物叢の2D-PCoAプロット。上位10菌の門・属レベルでの相対的存在量(C)。Shannon指数とChao1指数はMann-Whitney検定で解析した。*p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.001. n = 10/グループ。

さらに、異なる分類レベルで分類学的プロフィールを調べた。モック群では全サンプルでProteobacteriaとFirmicutesが最も多く、IAV群では口腔咽頭と鼻咽頭でFirmicutesが比較的減少しProteobacteriaが多くなった。しかし、肺ではこのような変化は観察されなかった。属レベルでは、口腔咽頭と肺ではLactobacillusが最も多く、模擬群では鼻咽頭でStreptococcusが優勢であった。しかし、IAV群ではすべての部位で異なる属が優勢であった。中咽頭ではPseudomonasが優勢であったが、鼻咽頭ではEscherichiaが最も多く、肺ではStreptococcusが優勢であった（図2C）。また、IAV感染時の呼吸器系微生物叢の種レベルの変化についても検討した。モック群では、L. murinusが口腔咽頭と肺で優勢であり、Streptococcus respiraculiが鼻咽頭で最も優勢であった。IAV群では、口腔咽頭でPseudomonas fluorescensが、鼻咽頭でEscherichia coliが、肺でStreptococcus respiraculiが最も多く見られた（Figure 3A）。微生物叢の代謝機能予測では、IAV感染により口腔咽頭ではD-グルタミン、D-グルタミン酸、D-アラニン代謝が低下し、鼻咽頭ではペプチドグリカンの生合成が減少し、肺ではパントテン酸、CoA生合成が増加した（Figure 3B）。

図3
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図3. IAV感染時の呼吸器系微生物叢の種レベルの細菌および機能組成の特性評価。(A) 模擬群およびIAV群における口腔咽頭、鼻咽頭および肺の微生物叢の上位10菌種の相対的存在量。(B)モック群とIAV群の口腔咽頭、鼻咽頭、肺微生物叢の代謝パスウェイで有意に変化した上位10種。PICRUSt2によるパスウェイ存在量予測。x軸の相対的存在量は、予測されたすべての機能的存在量に対する対応する機能的存在量の比率を表す。

IAV感染時の呼吸器系部位の微生物相構造の比較
模擬群では、肺の微生物叢は中咽頭の微生物叢よりも鼻咽頭の微生物叢に類似していることがわかった。さらに、IAV群では模擬群に比べ、肺と鼻咽頭の微生物叢の類似性が高まっていた（図4A）。これらの結果は、IAV感染により鼻咽頭微生物叢が肺微生物叢に与える影響が増大したことを示唆している。IAV群と模擬群の間で有意差のある菌種をMann-Whitney検定でスクリーニングし、各位置での変化をヒートマップ上に示した。模擬群との比較では、口腔咽頭で18種、鼻咽頭で7種、肺で13種の有意な差が認められた。また、IAV感染に伴い、複数の気道部位で同調的に変化する種が確認された。例えば、IAV感染群では模擬群に比べ、口腔咽頭、鼻咽頭、肺でLactobacillus animalis、Lactobacillus johnsonii、L. murinusの相対量が減少し、Enterococcus faecalisの相対量が増加した。さらに、URTとLRTのいくつかの種はIAV感染に対して異なる反応を示すことがわかった。例えば、S. danieliae、S. respiraculi、Streptococcus suisの相対量は、IAV群ではURTで減少し、LRTで増加した（図4B）。

図4
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図4. IAV感染時の口腔咽頭、鼻咽頭および肺の微生物叢の比較。(A）IAV群とモック群における異なる部位の微生物叢の類似性解析。(B)模擬とIAV群のサンプリング位置の違いによる有意差のある種の分布。異なるサンプリング地点間のShannon指数とChao1指数はMann-Whitney検定で解析した。異なる地点の微生物相の類似性はANOSIMで解析した。また、模擬菌とIAV群との間の細菌分類群の存在量もMann-Whitney検定で解析した。***n = 10/群。

IAV感染により口腔咽頭と腸内細菌叢の類似性が低下した
IAV感染は、腸内細菌叢の多様性（Shannon diversity index）と豊かさ（Chao1 index）を有意に増加させた（図5A）。ベータ多様性は、モック群とIAV群の結果が互いに離れてクラスター化することから、IAV感染が腸内細菌叢に強く影響していることが示された（図5B；補足図S1D）。IAV感染群、模擬感染群ともに腸内細菌はファーミキューテスとバクテロイデーテスが優勢であった。しかし、IAV感染により腸内細菌はBacteroidetesの相対量が増加し、Firmicutesの相対量は減少した。属レベルでは、IAV感染によりLactobacillusの相対量が減少し、MuribaculumとParasutterellaの相対量が増加した（図5C）。IAV感染に関連する種レベルの細菌を同定するためのLEfSe解析では、模擬群とIAV群の間で存在量の差があった7種が同定された。Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus reuteri, L. animalis, L. johnsonii, Helicobacter japonicus, L. murinusはモック群に濃縮されていたが、Parasutterella excrementihominisはIAV群で有意により多く存在した(図5D)。微生物相の代謝機能予測では、IAV感染により腸内のD-グルタミンおよびD-グルタミン酸代謝が低下することが示された（図5E）。マウスの習慣的な共食いを考慮し、模擬群およびIAV群における腸内細菌叢と中咽頭細菌叢の相関を解析したところ、IAV群および模擬群ともに腸内細菌叢の多様性と豊富さは中咽頭のそれよりも有意に高いことが分かった（図6A）。また、中咽頭の微生物叢は、IAV群よりもモック群の方が腸内細菌叢に類似していた（図6B）。IAV感染後、腸および口腔咽頭におけるいくつかの種の相対存在量に同様の変化が観察された。例えば、L. murinus、L. reuteri、L. animalis、L. johnsoniiの相対量が減少し、Phocaeicola sartoriiの相対量がIAV群では腸と口腔咽頭の両方で増加した(図6C)。

図5
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図5. IAV感染時の腸内細菌叢の特徴および腸管と口腔咽頭の細菌叢の相関性。(A) IAV群とモック群における腸内細菌叢のシャノン多様性とChao1指数。(B) モック群とIAV群の腸内細菌叢の2D-PCoAプロット (C) モック群とIAV群の腸内細菌叢の門・属レベルの上位10菌の相対的存在量 (D) 模擬グループとIAVグループの腸内細菌叢の種レベルでのLEfSe解析。(E) 模擬グループとIAVグループ間で有意に変化した腸内細菌叢の代謝パスウェイのトップ10。PICRUSt2によるパスウェイの存在量予測。Shannon index、Chao1 index、細菌分類群の存在量の統計解析は、Mann-Whitney検定を用いて行った。*p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.001.

図6
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図6. IAV感染時の口腔咽頭および腸内細菌叢の比較 (A) IAV群と模擬群における腸内細菌叢と口腔咽頭細菌叢のシャノン多様性とChao1指数の比較。(B）IAV感染群とモック群における腸内細菌叢と口腔咽頭細菌叢の類似性解析。(C)Lefse解析でスクリーニングした模擬群とIAV群の腸内・口腔咽頭の鑑別種の分布。Shannon index、Chao1 index、細菌分類群の存在比の統計解析はMann-Whitney検定を用いて行った。*p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.001。

考察
IAV感染は、気道および腸内細菌叢を変化させることができる（Lvら、2021年；Rattanaburiら、2022年）。マウスモデルはインフルエンザ研究において最も一般的に使用されるin vivoシステムであるため、多くの実験がIAV感染マウスの長期または短期的なdysbiosisを説明している（Yildizら、2018; Sencioら、2021）。しかし、ほとんどの研究が単一の粘膜面に着目しており、複数の部位間の微生物相の関連を系統的に研究したことはほとんどない。そこで、正常マウスとIAV感染マウスの呼吸器・腸内細菌叢を16srRNA遺伝子全長配列解析で比較し、正常マウスと感染マウスの異なる解剖学的部位間の細菌叢の相関を解析しました。

予想通り、我々はマウスIAV感染モデルの確立に成功した。これまでのマウス研究では、インフルエンザ感染が体重を減少させ、肺指数を増加させることが報告されています（An et al.、2018；Ling et al.、2020）。私たちの実験でも同様の結果が観察されました。また、呼吸器だけでなく、IAV感染群の糞便からもIAVが検出されました。我々の結果と一致して、IAV/IBV感染者の糞便サンプルからもウイルスが確認されました（Hirose et al.） IAV感染肺組織における強固な白血球浸潤と浮腫という我々の病理組織学的所見は、以前の研究でも観察され、プロテアーゼ活性化受容体4と関連していた（Kimら、2021年）。

呼吸器は複雑であり、各区画にはそれぞれ固有の微生物叢が存在し、IAV感染に対して類似または異なる反応を示す。本研究では、IAV感染マウスの口腔咽頭、鼻咽頭および肺の微生物叢の種の多様性と豊かさは、正常マウスのそれと同様であった。我々の知見と一致して、いくつかの研究は、IAV感染マウスのURTおよびLRTにおける微生物の多様性および富裕性に有意な変化がないことを示している（Planetら、2016；Yildizら、2018）。しかし、異なる部位の微生物叢の組成は、IAV感染に対して異なる反応を示した。

3つの呼吸器部位すべてにおけるL. murinusの相対存在量の減少は、宿主の免疫反応を変化させ、口腔咽頭および鼻咽頭P. fluorescensの相対存在量の増加によって証明されるように、コロニー形成抵抗性も低下させた可能性がある。L. murinusは、Th17およびRORγt+制御性T細胞を誘導し、結核の肺の炎症を抑制するLactobacillus属に属する（Bernard-Laichon et al, 2021）。さらに、L. murinusは、呼吸器系ディスバイオシスモデルにおいて、肺炎球菌のコロニー形成に対するバリアを提供する（Yildizら、2020年）。P. fluorescensはPseudomonadalesに属し、通常、様々な身体部位の常在微生物叢に低レベルで生息しているが、嚢胞性線維症、慢性気道疾患、喘息、非嚢胞性線維症関連気管支拡張症に関連している（Scalesら、2014年）。また、IAV感染患者のURTではPseudomonadalesの相対量が増加した（Kaulら、2020年）。

興味深いことに、S. danieliaeの相対量がURTで増加し、LRTで減少することを見出した。S. danieliaeは健常マウスのURTマイクロバイオームの主要成分であり、口腔内マイクロバイオータの成立に関与している（Joseph et al.、2021）。しかし、黄色ブドウ球菌とS. danieliaeの経口投与は、マウスモデルにおける実験的乾癬を悪化させた（Okada et al.、2020）。その他、S. danieliaeの報告はこれまでほとんどない。我々の研究では、肺の微生物叢は中咽頭よりも上咽頭の微生物叢に近いことがわかり、上咽頭がマウスの肺の微生物叢の主要なリザーバーとして機能している可能性が示唆された。一方、ヒト成人では中咽頭が肺微生物叢の起源となっている（Bassis et al., 2015）。健康な牛では、鼻咽頭微生物叢が肺微生物叢と最も類似している（McMullen et al.、2020）。さらに、本研究ではIAV感染により、鼻咽頭微生物叢と肺微生物叢の類似性が高まった。これは、IAVに対する宿主の自然免疫反応および適応免疫反応と関連している可能性がある（Liongら、2020年；Wangら、2021年）。

IAV感染は、H7N9感染ヒトの腸内細菌叢の種多様性を低下させる可能性がある（Qin et al.、2015）。しかし、我々の結果は、IAV感染がマウスの腸内種多様性を増加させることを示しました。これは、ウイルス株、宿主の反応、あるいは試料採取方法の違いによるものと考えられる。IAV感染マウスでは、Lactobacillus属（L. intestinalis, L. reuteri, L. animalis, L. johnsonii, L. murinus）の相対量が減少していた。絶対量はシークエンスカウントから推定できることを考慮し（Yang et al., 2022）、IAV群とMock群の間でLactobacillusの属・種レベルの絶対量も評価したところ、Lactobacillusの変化は絶対量・相対量ともに一致していた（補足表S2）。一般に、Lactobacillus属の存在量の減少は、IAV感染の重要な現象であると思われる。乳酸菌は抗ウイルス免疫に重要な役割を担っている。例えば、以前の研究では、Lactobacillus johnsoniiの補充が免疫細胞の調節を介して呼吸器ウイルス感染を減弱させることが示された（Fonseca et al.、2017）。さらに、L. murinusの相対存在量は、腸だけでなく、呼吸器の3区分（口腔咽頭、鼻咽頭、肺）すべてで減少していました。L. murinusの相対量がすべての解剖学的部位で減少していることは、コロニー形成抵抗性を低下させている可能性がある。L. murinusは、マウスモデルにおいて腸管免疫恒常性を維持し、抗炎症効果を媒介した（Tangら、2015年；Panら、2018年）。L. murinusのプロバイオティクス投与は、マウスのTH17細胞を調節することによって食塩感受性高血圧を予防した（Wilckら、2017）。Parasutterella excrementihominisは、IAV感染マウスの腸内細菌叢に有意に多く存在し、高齢者ではより高い相対量で見出された（Fart et al.、2020年）。P. excrementihominisの相対存在量の増加は、脂肪性肝疾患、慢性腸炎、過敏性腸症候群と関連しています（Blasco-Baqueら、2017年；Chenら、2018年）。さらに、IAV感染により口腔咽頭と腸内細菌叢の類似性が低下しました。マウスの口腔咽頭と腸内細菌叢の相関は、コプロファジーによるものと考えられる（Bogatyrev et al.、2020）。IAV感染によりマウスの摂食が減少するため（Bartleyら、2017）、糞便摂食の減少により、我々の感染マウスの口腔咽頭と腸内細菌叢の類似性が低下している可能性がある。共食いとその後の腸内細菌叢による呼吸器コロニー化というマウスの行動は、ウイルス後細菌スーパーインフェクションのマウスモデルの有用性に疑問を投げかけるものである。

結論
正常マウスとIAV感染マウスの口腔咽頭、鼻咽頭、肺、腸の微生物叢を特徴づけ、異なる粘膜表面の微生物叢構造を比較した。さらに、健康なマウスでは、鼻咽頭が肺の微生物叢の主要なリザーバーであることを突き止めた。IAV感染により、肺と鼻咽頭の微生物叢の類似性が高まった。しかし、IAV感染により中咽頭と腸の微生物叢の類似性は低下した。L. murinusの相対量はすべての場所で減少しており、IAV感染のバイオマーカーとして機能する可能性がある。

データの利用可能性に関する声明
本研究で発表したデータは、NCBI Bio-projectリポジトリ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/）、アクセッション番号PRJNA910300に寄託されている。

倫理に関する声明
この動物実験は、中国PLA疾病管理予防センターの動物管理使用委員会の審査と承認を受けた。

著者による貢献
PenLとHSが実験の構想・設計を行った。QC、KW、LJ、YL、JLは実験を実施した。ML、HG、BZ、PeiL、LYは16 s rRNA遺伝子全長配列の解析にあたった。QCとPenLは原稿を執筆した。すべての著者が論文に貢献し、提出された原稿を承認した。

資金提供
本研究は、中国国家重点研究開発計画（2021YFC2301000）、国家科学技術主要プロジェクト（2018ZX10201001および2018ZX10305410）の支援を受けた。

利益相反について
ML、BZ、HGは、Jiangsu Simcere Diagnostics Co, Ltd.とNanjing Simcere Medical Laboratory Science Co, Ltd.という会社に雇用されていた。

残りの著者は、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

出版社からのコメント
本論文で述べられたすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。本論文で評価される可能性のある製品，あるいはそのメーカーが行う可能性のある主張は，出版社によって保証または承認されたものではない．

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1129690/full#supplementary-material に掲載されています。

参考文献
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キーワード：A型インフルエンザウイルス感染症、気道微生物叢、腸内細菌叢、口腔咽頭、鼻咽頭、肺

引用 Chen Q, Liu M, Lin Y, Wang K, Li J, Li P, Yang L, Jia L, Zhang B, Guo H, Li P and Song H (2023) Influenza A virus infection mouseにおけるrespiratory tract and gut microbiotaのトポグラフィーを示した。Front. Microbiol. 14:1129690。doi: 10.3389/fmicb.2023.1129690

Received: 2022年12月22日; Accepted: 2023年1月30日。
公開：2023年2月22日

編集者

袁暁、上海交通大学、中国
査読者

Xuhui Zheng, University of Washington, United States（ワシントン大学、米国
Sunil Banskar, University of Arizona, United States（アリゾナ大学、米国
Copyright © 2023 Chen, Liu, Lin, Wang, Li, Yang, Jia, Zhang, Guo, Li and Song. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。原著者および著作権者のクレジットを表示し、本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製が許可されます（一般的な学術慣行に従っています）。本規定に従わない使用・配布・複製は認めない。

*連絡先 Hongbin Song, ✉ hongbinsong@263.net; Peng Li, ✉ jiekenlee@126.com; Hao Guo, ✉ h.guo@foxmail.com

これらの著者は、この研究に等しく貢献している。

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は，あくまでも著者のものであり，必ずしも所属機関のもの，あるいは出版社，編集者，査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはそのメーカーが行う可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。

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