腸内細菌叢は血液-脳脊髄液バリア機能とAβ病理を制御する

論文2023年7月10日
腸内細菌叢は血液-脳脊髄液バリア機能とAβ病理を制御する

https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embj.2022111515

ジュンファ・シー [...] ロースマリアン・E・バンデンブルック
著者情報
EMBO Journal (2023)e111515https://doi.org/10.15252/embj.2022111515
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図と情報
要旨
腸内細菌叢の異常が血液脳関門（BBB）透過性の亢進と関連し、アルツハイマー病（AD）の発症に寄与していることを示す証拠が蓄積している。一方、腸内細菌叢が血液-脳脊髄液（CSF）関門に及ぼす影響については、まだ研究されていない。今回われわれは、腸内細菌叢を欠損させたマウスでは、タイトジャンクション（TJ）の乱れに伴う血液-脳脊髄液バリア透過性の亢進が認められたが、これは腸内細菌叢の再コロニー化や短鎖脂肪酸（SCFA）の補充によって回復することを報告した。我々のデータから、腸内細菌叢はタイトバリアの確立だけでなく、その維持にも重要であることが明らかになった。また、迷走神経がこのプロセスに重要な役割を果たしていること、SCFAが独立してバリアーを強化できることも報告した。AppNL-G-FマウスにSCFAを投与すると、血液-脳脊髄関門におけるTJの細胞内局在が改善し、β-アミロイド（Aβ）負荷が減少し、ミクログリアの表現型に影響を与えた。以上の結果から、微生物叢を調節しSCFAを投与することで、血液-CSFバリアが引き締まり、ミクログリアの活性とAβクリアランスが維持され、ADの治療効果が期待できることが示唆された。
あらすじ
腸内細菌叢は、腸-微生物叢-脳軸（gut-microbiota-brain axis）と呼ばれるように、脳に大きな影響を及ぼす可能性があることが、蓄積された証拠から示されている。ここでは、腸内細菌叢が血液-脳脊髄液（CSF）バリアの完全性とアルツハイマー病（AD）の病態を制御していることが示されている。
腸内細菌叢は血液-脳脊髄液関門の形成に必要であるだけでなく、その完全性を維持するためにも必要である。
腸内細菌叢は、主にタイトジャンクション（TJ）タンパク質の細胞内局在を調節することによって、血液-CSFバリア機能を制御している。
迷走神経は、腸内細菌叢が血液-CSFバリア機能に影響を与える重要な経路である。しかし、短鎖脂肪酸（SCFAs）は迷走神経を迂回し、血液-CSFバリアの稠度に直接影響を与えることができる。
SCFAを投与すると、ADマウスの血液-CSFバリアの完全性が改善し、β-アミロイド（Aβ）負荷の顕著な減少を伴うが、これはミクログリアの機能を調節することによって達成されるのかもしれない。
はじめに
腸内細菌叢とは、細菌、古細菌、ウイルス、真菌、原生動物などの微生物であり、消化管内で宿主と共生関係にある。過去10年間で、腸内細菌叢は広く研究され、腸の発達、バリアの完全性と機能（Hooper, 2004; Backhed et al, 2005）、代謝（Visconti et al, 2019; Agus et al, 2021）、末梢および中枢免疫応答の制御（Hooper et al, 2012; Sharon et al, 2016）など、体内の多くの生物学的機能に対する重要性が示されてきた。腸内細菌叢と中枢神経系との間の情報伝達のメカニズムは完全には解明されていないが、免疫経路、内分泌経路、神経経路、体液経路を含む4つの主要なシグナル伝達経路が提唱されている（Dalile et al, 2019）。これらの経路を介して、腸内細菌叢は、神経新生、髄鞘形成、ミクログリアの活性化、神経伝達物質や脳由来神経栄養因子や神経成長因子などの神経栄養因子の調節など、脳の生理学に（中略）直接影響を与えることができる（Diaz Heijtz et al, 2011; Sharon et al, 2016）。
CNSの発達には、親水性物質や親油性物質の細胞外拡散と細胞内拡散の両方を制限することによって、中枢神経系（CNS）の機能に最適な微小環境を確保する、緊密に閉じた血液脳界面の形成も含まれる（Strazielle & Ghersi-Egea, 2013）。重要な血液脳関門の一つが血液脳関門（BBB）であり、脳微小血管の内皮に位置し、タイトジャンクション（TJ）、アストロサイト、ペリサイトによって封鎖されている（Strazielle & Ghersi-Egea, 2013）。腸内細菌叢がBBBの完全性に影響を与えるという証拠が蓄積されつつあり、広域抗生物質投与（AB）マウスと無菌（GF）マウスの両方が、BBB透過性の有意な亢進と内皮細胞間TJの調節異常を示した（Braniste et al, 2014; Frohlich et al, 2016; Hoyles et al, 2018）。腸内微生物がBBB機能に影響を及ぼす機序は不明であるが、腸内細菌叢の変化によって誘導される脳生理学的変化は、免疫反応がなくても迷走神経経路や交感神経経路を介して独立して起こる可能性があり、可溶性微生物由来の代謝産物が少なくとも部分的に寄与していることを示している（Bercik et al, 2011）。食物繊維やレジスタントスターチの大腸発酵によって産生される主な代謝産物である短鎖脂肪酸（SCFA）は、in vitroおよびin vivoでTJ発現をアップレギュレートすることによってBBBの完全性を改善することが示されている（Parker et al, 2020）。例えば、酪酸の補給は、オクルディン（OCLN）とクローディン-5（CLDN-5；Braniste et al, 2014）の発現をアップレギュレートすることによって、GFマウスにおけるBBBの障害を回復させた。細胞培養モデルでは、プロピオン酸はCLDN-5とZona occludens-1（ZO-1）の発現をアップレギュレートすることにより、リポ多糖（LPS）誘発性のBBB障害を減弱させることが判明している（Hoyles et al, 2018）。SCFAは、血流を介してBBBにアクセスし、その完全性に直接影響を及ぼすか（Macfabe, 2012）、内皮細胞においてFFAR2やFFAR3などの遊離脂肪酸受容体（FFAR）ファミリーのメンバーを活性化することによって間接的にBBB機能に影響を及ぼす可能性がある（Alexander et al, 2015）。
もう一つの重要な、しかし軽視されがちな血液-脳界面は、脈絡叢上皮（CPE）細胞によって形成される血液-脳脊髄液（CSF）関門であり、TJの存在によって強固に相互結合している（Strazielle & Ghersi-Egea, 2013）。血液-CSF関門は、末梢から中枢神経系への炎症反応の広がりに重要な役割を果たし、様々な神経疾患の病因と進行に寄与していることを示す証拠が増えている（Baruch et al, 2015; Brkic et al, 2015; Gorle et al, 2018; Steeland et al, 2018; Rodriguez-Lorenzo et al, 2020; Van Hoecke et al, 2021; Xie et al, 2021）。
ここでは、野生型およびAppNL-G-Fアルツハイマー病（AD）マウスの血液-CSFバリア完全性に対する、AB治療およびGFマウスを介した腸内細菌叢枯渇の影響を評価し、これにより、血液-CSFバリアの形成を開始するだけでなく、その完全性を維持するためにも、微生物叢が必要であることが明らかになった。さらに、SCFAは迷走神経とは無関係に血液-CSFバリアの完全性を調節する上で重要な役割を果たしており、ADの主要な特徴の一つであるAβ蓄積を抑制する可能性がある。
研究結果
腸内細菌叢は脈絡叢の遺伝子プロファイルに影響する
血液-CSFバリアに対する腸内細菌叢の影響を調べるため、まず特定病原体フリーマウス（SPFマウス）に広域抗生物質（ABマウス）を2週間経口投与し、腸内細菌叢欠損マウスを作製した。ABマウスの糞便液を接種したBHIプレート上では細菌の増殖は検出されず（付録図S1A）、これには著しく肥大したカイコが伴っていた（付録図S1B）。正常なコロニーを形成したSPFマウスと脱コロニーしたABマウスの脈絡叢組織のRNA配列決定（RNA-seq）解析を行ったところ、79個の発現差遺伝子（DEGs；調整P値＜0.05かつ｜logFC｜＞1）が検出され、そのうち8個の遺伝子がABマウスで発現上昇し、71個の遺伝子が発現低下していた（図1A；データセットEV1）。脱コロニーしたABマウスの脈絡叢組織でダウンレギュレートされた遺伝子のうち、バリア機能に関連する13遺伝子を同定した（図1A）。この結果、Gene Set Enrichment Analysis（GSEA；図1B；データセットEV2）によると、細胞接合、細胞接着、膜構成要素（一体型および内在型）のGene Ontology（GO）カテゴリーが抑制され、ABマウスの腸内細菌叢の欠如によって脈絡叢のバリア機能が影響を受けていることが示唆された。さらに、脈絡叢における2つの比較（AB対SPF、再コロニー化ABマウス[ABR]対AB）の完全な遺伝子分布についてGSEAを行ったところ、AB対SPFの比較では、上記のGOカテゴリーに関連する遺伝子セットが高度に負に濃縮されていることが示された（図1C；データセットEV3）。驚くべきことに、正規化濃縮スコア（NES; AB対SPF: NES = -1.444 ~ -1.803; ABR対AB: NES = 1.500 ~ 1.781; Fig EV1; Dataset EV4）を比較すると、ABR対ABの比較でも同じGOカテゴリーが同程度にポジティブに濃縮されていた。無菌マウス（GF）対SPF、再コロニー化GFマウス（GFR）対GF（Dataset EV1）。4つの比較から得られたDEGを1つのヒートマップにまとめた（Appendix Fig S2）。RNA-seqの結果を確認するため、次にSPF、AB、ABR、GF、GFRの脈絡叢におけるRNA-seqで検出されたAB対SPFのDEGの発現をqPCRで解析し、バリア機能に関連する遺伝子に注目した。RNA-seqの結果と一致して、Cbln1遺伝子の発現は、SPFマウスと比較してABマウスで有意にダウンレギュレートされた。さらに、この発現低下は、腸内細菌叢の再構成（ABR；図EV2）によってある程度抑制されるようであった。GFマウスでは、Fat2、Tmem252、Slc13a3、Slc6a13、Aqp4がABマウスと同様のダウンレギュレーション傾向を示したが、腸内細菌叢の再構成（GFR; Fig.） このことから、脈絡叢バリア機能は腸内細菌叢の減少によって低下し、腸内細菌叢の再構成によって再び回復することが示唆される。
図1. 腸内細菌叢組成の異なるマウスにおける脈絡叢の遺伝子プロファイルの変化
A.ABマウスとSPFマウスの脈絡叢における全DE遺伝子のヒートマップ。ヒートマップのカラースケールは、log2正規化した遺伝子発現のスケールである。
B.有意にアップレギュレートおよびダウンレギュレートされたGOカテゴリートップ10（P値による）をgeneRatioに従って並べたドットプロット。P値と遺伝子セットの遺伝子数は、それぞれドットの色と大きさで表される。
C.ABとSPFの脈絡叢における比較の全遺伝子分布に対して行われた4つのGO用語のGSEAプロット。このプロットには、それぞれのGOタームに対する実行濃縮スコアとメンバー遺伝子の配置が示されており、全遺伝子分布のランク付けリストメトリックプロットも含まれている。
データ情報： AB、抗生物質処理、GO、Gene Ontology、GSEA、Gene Set Enrichment Analysis、SPF、specific pathogen-free；
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図EV1. 再コロニー化した抗生物質投与マウスと抗生物質投与マウスのバリア機能遺伝子のGSEA比較。
図EV2. SPF、AB、ABR、GF、GFRマウスの脈絡叢におけるバリア機能関連遺伝子のqPCR解析
腸内細菌叢の欠如は血液-脳脊髄液バリア透過性を増加させる
次に、腸内細菌叢組成の異なるマウス（GF、GFR、AB、ABRマウス）において、TJs免疫染色によりBBBの完全性を評価した。先行研究（Braniste et al, 2014; Sun et al, 2021）と一致するように、我々の免疫蛍光分析では、GFマウスとABマウスの脳血管では、SPFマウスと比較して、オクルジン（OCLN）とゾナオクルデンス-1（ZO-1）の発現が低く、細胞内局在が乱れていることが確認された（図EV3A-D）。GFマウスとABマウスで腸内細菌叢を再構成すると、OCLNとZO-1の発現と完全性の欠損がほぼ回復した（図EV3A-D）。4 kDa FITC-デキストラン漏出解析では、ABマウスではSPFマウスに比べてBBB透過性が増加したが、ABRマウスではそのようなことはなかった。しかし、GFマウスは4 kDa FITC-デキストランに対する明らかなBBB透過性反応を示さなかった（図EV3E）。これらの結果から、腸内細菌叢はBBBの発達だけでなく、BBBの完全性の維持にも重要であることが確認された。
図EV3. 腸内細菌叢組成の異なるマウスにおけるBBBの完全性
同様に、SPFマウス、GFマウス、GFRマウスの血液-CSF界面におけるTJの発現と細胞内局在を調べた（図2A-D）。SPFマウスでは、ZO-1、OCLN、E-カドヘリン（CDH1）、クローディン-1（CLDN1）の免疫反応性が、アピカル細胞境界にほぼ連続した染色として現れた（図2A）。注目すべきは、GFマウスでは境界が断片化され、ZO-1、OCLN、CDH1、CLDN-1タンパク質がびまん性に分布していたことである（図2A）。さらに、GFマウスではSPFマウスに比べて連続TJの長さが短く、TJ発現が低下していることも、定量化（連続TJの長さの分布、連続TJの最大長、TJ発現面積を含む；図2B-D）によって確認された。興味深いことに、GFRマウスはSPFマウスと比較して、このパターンを限定的に逆転させた（図2A-D）。それに伴い、バリア透過性状態のマーカーであるCSF免疫グロブリンG（IgG）レベル（Shrestha et al, 2014）、および4 kDa FITC-デキストラン漏出レベルは、GFマウスで増加し、再コロニー化後に回復した（図2E-G）。これらの所見は、腸内細菌叢がBBBの発達を調節するのに必要であることを示している。
図2. 腸内細菌叢組成の異なるマウスにおける血液-CSFバリアの完全性
A.SPF、AB、ABR、GF、GFRマウスの脈絡叢におけるZO-1、OCLN、CDH1、CLDN1の免疫染色の代表像。スケールバー： 50 μm。
B-D.（A）に示したTJ免疫染色の連続長（B）、最大長（C）、発現面積（D）の定量（n = 5、生物学的複製）。
E.SPF、AB、ABR、GF、GFRマウスのCSF中のIgGレベルを示す代表的なウェスタンブロット。
F.（E）のウェスタンブロットによるCSF中のIgGの定量分析（n = 4-6、生物学的複製）。
G.4kDaFITC-デキストランに対する血液-CSFバリア透過性の評価（n = 5-9、生物学的複製）。
データ情報： 棒グラフは平均値±SEMを表す。統計は、多重比較のための一元配置分散分析Bonferroniのポストホック検定で行った。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。AB、抗生物質処理；ABR、再コロニー化AB；CSF、脳脊髄液；GF、無菌；GFR、再コロニー化GF；SPF、特異的病原体フリー；TJ、タイトジャンクション。
この図のソースデータはオンラインで入手可能。
図2のソースデータ[EMBJ2022111515-sup-0009-SDataFig2.zip］
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次に、血液-CSFバリア形成後の腸内細菌叢の除去が、その完全性にも影響を及ぼすかどうかを調べた。注目すべきことに、ABマウスはSPFマウスと比較して、ZO-1、OCLN、CDH1タンパク質のTJの非局在化を示したが、CLDN-1は影響を受けなかった（図2A-D）。興味深いことに、ABRマウスではこのパターンが逆転し、SPFマウスと同様のTJs局在が観察された（図2A-D）。この観察と一致して、髄液中のIgGと4 kDa FITC-デキストランの漏出レベルはABマウスで増加したが、その程度はGFマウスのレベルより低かった。同様に、ABマウスと比較して、ABRマウスは髄液中のIgGレベルが有意に低かった（図2FおよびG）。これらのデータを総合すると、腸内細菌叢は血液-CSFバリア形成の最初の引き金となるだけでなく、バリアの完全性を維持するためには腸内細菌叢の継続的な寄与が重要であることが示唆される。
SCFAは腸内細菌叢の不在によって引き起こされる血液-CSFバリアの崩壊を抑制する
主に酢酸、プロピオン酸、酪酸を含む短鎖脂肪酸は、腸管内で食物繊維が細菌によって発酵される際に産生される代謝産物である（Dalile et al, 2019）。プロピオン酸と酪酸は、TJの発現と集合を促進することによってBBBの完全性を高めることが知られている（Braniste et al, 2014; Hoyles et al, 2018）。したがって、我々は、プロピオン酸と酪酸が血液-CSFバリア完全性の改善において同じ有益な効果を持つかどうかを研究した。最初に、ABマウスとSPFマウスの脈絡叢遺伝子発現を比較した全遺伝子分布において、プロピオン酸代謝（KEGGパスウェイ mmu00640）遺伝子セットの濃縮度を決定した（図3AおよびB；データセットEV5）。RNA-seqデータはqPCRを用いて検証され、Acss1、Acss3、Acat1、Acaca、Suclg2を含むいくつかのトップDEGに焦点が当てられた。RNA-seqデータと一致して、これらの遺伝子はSPFマウスと比較してABマウスでアップレギュレーションを示した。しかし、これはAcat1でのみ顕著であった（付録図S3）。興味深いことに、ABマウスではプロピオン酸代謝経路が活性化されているようで、これはSCFAsの枯渇による代償メカニズムである可能性がある。これに対応して、ABマウスおよびGFマウスの糞便中のプロピオン酸および酪酸の含量は、SPFマウスのそれよりも有意に低いことが検出されたが、ABマウスおよびGFマウスの再コロニー化は、程度の差こそあれ、プロピオン酸および酪酸の代謝を回復させることができた（図3CおよびD）。
図3. 腸および脈絡叢におけるSCFA代謝に対する腸内細菌叢の影響
A.脈絡叢におけるABマウスとSPFマウスのDEGsリストに存在するKEGGパスウェイmmu00640（プロパン酸代謝）にリンクした遺伝子のヒートマップ。ヒートマップのカラースケールは、log2正規化した遺伝子発現のスケールである（n = 5-6、生物学的複製）。
B.ABマウスとSPFマウスの脈絡叢における全遺伝子発現を比較したKEGGパスウェイの複合GSEAプロット。このプロットは、KEGGパスウェイの実行濃縮スコアとメンバー遺伝子の配置を特徴とし、全遺伝子分布（n = 5-6、生物学的複製）のランク付けリストメトリックプロットも含む。
C, D.マウスの糞便サンプル中のプロピオン酸（C）と酪酸（D）の相対量（n = 4-9、生物学的複製）。
データ情報： 棒グラフは平均値±SEMを表す。統計は、多重比較のための一元配置分散分析Bonferroniのポストホック検定で行った。**p < 0.01. AB、抗生物質処理；DEGs、差次発現遺伝子；SCFAs、短鎖脂肪酸；SPF、特定病原体フリー。
この図のソースデータはオンラインで入手可能。
図3のソースデータ [EMBJ2022111515-sup-0010-SDataFig3.zip］
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血液-CSFバリアの完全性に対するSCFAの直接的効果をさらに調べるため、一次CPE培養を0.1、1、10μMのプロピオン酸ナトリウムまたは酪酸ナトリウムで6時間処理した。CPE細胞をLPS（100ng/ml）に6時間暴露し、以前の研究（Xie et al, 2021）で示したように、血液-CSFバリアの破壊を誘導し、この後、プロピオン酸ナトリウムまたは酪酸ナトリウムでさらに6時間処理した（図4A；付録図S4A）。LPSによるCPE細胞死の可能性を回避するため、初代CPE細胞をLPS（それぞれ50、100、500ng/ml）で12時間処理し、MTTアッセイとTUNEL染色を行って細胞生存率を測定したところ、LPSの最高用量でも細胞死の有意な増加は見られなかった（付録図S5AおよびB）。経上皮電気抵抗（TEER；図4B；付録図S4B）と70kDa FITC標識デキストラントレーサーに対する細胞間透過性（図4C；付録図S4B）の両方を測定することにより、CPE細胞層のバリア稠度を調べた。一次CPE細胞をプロピオン酸（0.1、1、10μM）または酪酸（1μM）で6時間処理すると、LPSに誘導されたバリアー完全性の喪失が有意に抑制された（図4BとC；付録図S4B）。LPS刺激に対するCPE細胞の反応に対して、プロピオン酸では用量依存的な効果が観察されたが、酪酸では観察されず、酪酸の場合、1μMが最も優れたバリア回復効果を示したようである（付録図S4B）。プロピオン酸と酪酸の生理的循環濃度は、安静時でおよそ1μMであることが提唱されている（Hoyles et al, 2018）。細胞外透過性とTEERは、上皮間TJの完全性に大きく依存する（Redzic, 2011）。これを評価するために、プロピオン酸ナトリウムおよび/またはLPS処理後の主要なTJsであるOCLNとZO-1の細胞内分布を調べた。初代CPE細胞をLPSに曝すと、OCLNとZO-1の細胞内局在が著しく破壊され、膜周囲の免疫反応性が消失した（図4DとE）。注目すべきことに、このようなLPSの影響は、その後プロピオン酸ナトリウムまたは酪酸ナトリウムで処理することで大幅に減少したが、酪酸ナトリウム処理ではTJの局在を改善する力は弱かった（図4DとE）。しかしながら、これは異なるTJ遺伝子、すなわちOcln、Zo1、Cldn1、Cdh1の遺伝子発現レベルの変化には反映されなかった（付録図S6AおよびB）。さらに、約40％の酪酸ナトリウムがin vitro血液-CSF関門を基底側から先端側へ通過することがわかった（図EV4AおよびB）。残念ながら、プロピオン酸ナトリウムは、検出限界（LOD）が5-7μMと低いため、基底コンパートメントでも検出されなかった。
図4. in vitroおよびin vivoにおける血液-脳脊髄液関門の完全性に対するSCFAの影響
A.実験条件の模式図。
B,C.TEER（B）および（A）に示したように処理した初代CPE細胞の70 kDa FITC-デキストラン細胞間透過性（C）の評価（n = 3、技術的二重測定）。
D.100ng/mlのLPS刺激下、1μMのプロピオン酸ナトリウムまたは1μMの酪酸ナトリウムで6時間処理した初代CPE細胞におけるZO-1とOCLNの免疫染色の代表的な画像。スケールバー： 50 μm。
E.インタクトなTJ免疫染色を有する細胞のパーセンテージを表示（D）（n = 3、技術的重複）。
F.実験群の模式図。
G.プロピオン酸ナトリウムまたは酪酸ナトリウム処理マウスの脈絡叢におけるZO-1およびOCLNの免疫染色の代表像。スケールバー： 50 μm。
H-J.(G)のTJ免疫染色の連続長(H)、最大長(I)、発現面積(J)の定量化（n = 5、生物学的複製）。
K.4kDaFITC-デキストランに対する血液-CSFバリア透過性の評価（n = 5）。
L.抗生物質投与により腸内細菌叢が破壊されたプロピオン酸ナトリウムまたは酪酸ナトリウム投与マウスのCSF中のIgGレベルを示す代表的ウェスタンブロット。
M.（L）のウェスタンブロットによるCSF中のIgGの定量分析（n = 5-6、生物学的複製）。
データ情報： 棒グラフは平均値±SEMを表す。統計は、多重比較のための一元配置分散分析Bonferroniのポストホック検定で行った。*p < 0.05、***p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001。CPE、脈絡叢上皮；CSF、脳脊髄液；LPS、リポ多糖；SCFAs、短鎖脂肪酸；TEER、経上皮電気抵抗；TJ、タイトジャンクション。
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図4のソースデータ [EMBJ2022111515-sup-0011-SDataFig4.zip］
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図EV4. in vitroおよびin vivoにおけるSCFAの分布
初代CPE細胞培養で得られた知見の妥当性を確認するため、次にプロピオン酸または酪酸を3日間投与したABマウスを調べた（図4F）。プロピオン酸と酪酸を投与したABマウスのZO-1とOCLNの免疫染色では、PBSを投与したABマウスのTJの境界が断片的でTJの分布が拡散しているのに比べ、TJの発現が高く、TJの細胞内局在がより連続的であることから、血液-CSFバリアの完全性が改善されていることが示された（図4G-J）。in vitroの結果と一致して、プロピオン酸塩は酪酸塩よりも血液-CSFバリア完全性の改善をもたらした（図4G-J）。さらに、プロピオン酸および酪酸塩を投与したABマウスは、4 kDa FITC-デキストランおよび髄液中IgG測定に基づく血液-髄液バリア透過性の有意な減少を示し、プロピオン酸および酪酸塩投与後のバリア完全性の改善を確認した（図4K-M）。
これらのデータを総合すると、特にプロピオン酸塩がTJの再局在化を制御する上で重要な役割を果たしていることが示唆されるが、酪酸塩もその程度は低いものの、試験したTJ遺伝子のRNA発現に対するこれらのSCFAの影響を支持するデータはない。
SCFAは迷走神経を迂回し、in vivoで血液-CSFバリアーを強化することができる。
副交感神経系の主要な構成要素である迷走神経は、微生物叢（代謝産物）-腸-脳の相互作用において重要な役割を果たすことが示されている（Bonaz et al, 2018）。SCFAがin vivoで迷走神経を介して間接的に血液-CSF関門を仲介できるかどうかを同定するために、まず、迷走神経切断（Vx）マウスで血液-CSF関門の完全性を評価したところ、VxマウスはABマウスと比較して、血液-CSF関門でTJ発現の低下とTJの重篤な局在障害を示すことが観察された（図5A-D）。この観察と一致して、VxマウスのCSF IgGレベルも上昇し、このレベルはABマウスよりも高かった（図5EおよびF）。
図5. 血液-CSFバリア完全性の制御における迷走神経の役割
A.偽マウスと迷走神経切断マウスの脈絡叢におけるOCLN、CDH1、ZO-1の免疫染色の代表像。スケールバー： 50 μm。
B-D.（A）のTJ免疫染色の連続長（B）、最大長（C）、発現面積（D）の定量（n = 4、生物学的複製）。
E.シャムマウスと迷走神経切断マウスのCSF中のIgGレベルを示す代表的なウェスタンブロット。
F.（E）のウェスタンブロットによるCSF中のIgGの定量分析（n = 4、生物学的複製）。
G.実験群の模式図。
H.プロピオン酸ナトリウムまたは酪酸ナトリウム処理迷走神経切断マウスの脈絡叢におけるOCLN、CDH1およびZO-1の免疫染色の代表像。スケールバー： 50 μm。
I-K.（H）に表示したTJ免疫染色の連続長（I）、最大長（J）、発現面積（K）の定量（n = 4、生物学的複製）。
L.プロピオン酸ナトリウムまたは酪酸ナトリウムで処理した迷走神経切断マウスの髄液中のIgGレベルを示す代表的なウェスタンブロット。
M.（L）のウェスタンブロットによるCSF中のIgGの定量分析（n = 4、生物学的複製）。
データ情報： 棒グラフは平均値±SEMを表す。統計は、対応のない両側スチューデントのt検定（F）または多重比較のための一元配置ANOVAボンフェローニのポストホック検定（他のパネル）で行った。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。CSFは脳脊髄液、TJはタイトジャンクション。
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図5のソースデータ[EMBJ2022111515-sup-0012-SDataFig5.zip］
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次に、プロピオン酸ナトリウムまたは酪酸ナトリウムを3日間経口投与したVxマウスを評価した（図5G）。プロピオン酸または酪酸の投与は、迷走神経切断したSPFマウスにおいてTJの発現を増加させ、TJタンパク質の局在を改善した（図5H-K）。したがって、SCFAを投与したVxマウスのCSF IgGはVxコントロールマウスと比較して低値を示し、酪酸塩投与は有意な効果を示した（図5LおよびM）。次に、腸由来のSCFAが脳に運ばれ、血液-脳脊髄関門を通過できるかどうかを調べた。そこで、WTマウスに13C標識プロピオン酸ナトリウムまたは酪酸ナトリウムを経口投与した（図EV4C）。血漿中では、13C標識されたプロピオン酸ナトリウムと酪酸ナトリウムが、投与1時間後と2時間後に検出された（図EV4D）。CSFでは、13C標識プロピオン酸ナトリウムも酪酸ナトリウムも検出されなかった。これは、in vivoでの輸送がないためか、CSFの容量（マウス1匹あたり〜7μl）とLOD（プロピオン酸：5〜7μM、酪酸：0.05μM）が限られているためかもしれない。
これらの結果を総合すると、迷走神経は腸と脈絡叢間の情報伝達のための重要な経路の一つであり、それゆえ血液-脳脊髄液関門の完全性の維持に影響を及ぼすことが示唆され、SCFAが腸内細菌叢-脳関門相互作用を直接媒介する可能性を示している。
SCFAは、AppNL-G-Fマウスにおける血液-CSF関門の完全性の喪失とAD病態を軽減する。
脳関門の崩壊が、ADを含むいくつかの神経疾患の発症に関与している可能性が高いことは、数多くの研究から示唆されている（Ueno et al, 2016）。さらに、腸-脳相互作用の重要なメディエーターであるSCFAは、ADの発症と進行に関与しているが、ADにおいてどのSCFAメカニズムが重要であるかはよくわかっていない（Qian et al, 2022）。血液-脳脊髄液関門の完全性に対する腸内細菌叢の影響の主要なメディエーターとしてSCFAを認識した我々の結果に基づき、我々はSCFAが脳関門を引き締めることによってAD病態を回復させるかもしれないという仮説を立てた。ここでは、血液-脳脊髄液関門透過性の亢進が以前に観察され（Xie et al, 2021）、糞便中のSCFA生成細菌の比率の低下が報告されている（Kaur et al, 2020）ADマウスモデルであるAppNL-G-Fマウスを用いた。後者と一致するように、AppNL-G-Fマウスの糞便中では、野生型マウスと比較してプロピオン酸および酪酸のレベルが低いことが観察された（Appendix Fig S7）。次に、AppNL-G-Fマウスにプロピオン酸ナトリウムまたは酪酸ナトリウムを3日間経口投与し、BBBおよび血液-CSFバリアの変化を評価した（図6A）。AppNL-G-F対照マウスと比較して、プロピオン酸および酪酸塩を投与したAppNL-G-Fマウスは、OCLN、CDH1、ZO-1、CLDN1について、それぞれ免疫染色で「発現面積」と「連続TJタンパク質の長さの分布および連続TJタンパク質の最大長」を定量することにより、TJの発現が有意に増加し、TJの細胞内局在がわずかに改善した（図6B-E）。BBBの場合、TJの発現も局在もわずかに改善されたに過ぎなかった（付録図S8A-D）。さらに、酪酸およびプロピオン酸処理は、IgGおよび4 kDa FITC-デキストランの漏出に対して同様の効果を示し、血液-CSF関門では、どちらも有意な変化というよりはむしろ減少傾向を引き起こしただけであった（図6F-H）。しかしながら、BBBの4 kDa FITC-デキストラン漏出の減少傾向は、プロピオン酸処理でのみ観察された（付録図S8E）。
図6. AppNL-G-Fマウスにおける血液-CSF関門の完全性およびAβプラークに対するSCFAの効果
A.実験群の模式図。
B.プロピオン酸ナトリウムまたは酪酸ナトリウム処理したAppNL-G-Fマウスの脈絡叢におけるOCLN、CDH1、ZO-1、CLDN1の免疫染色の代表画像。スケールバー： 50 μm。
C-E.（B）に示したTJ免疫染色の連続長（C）、最大長（D）、発現面積（E）の定量（n = 5-6、生物学的複製）。
F.プロピオン酸ナトリウムまたは酪酸ナトリウム処理AppNL-G-FマウスのCSF中のIgGレベルを示す代表的なウェスタンブロット。
G.（F）に表示したウェスタンブロットによるCSF中のIgGの定量分析（n＝5〜6、生物学的複製）。
H.4kDaFITC-デキストランに対する血液-CSFバリア透過性の評価（n = 5、生物学的複製）。
I.プロピオン酸ナトリウムまたは酪酸ナトリウムで処理したAppNL-G-Fマウスの脳における6E10染色の代表的画像。スケールバー： 1 mm。
J.脳の全矢状断面におけるAβプラークの面積と数の定量（n = 3マウス；1マウスにつき1断面）。
データ情報： 棒グラフは平均値±SEM。統計は、多重比較のための一元配置分散分析Bonferroniのポストホック検定で行った。p < 0.05、***p < 0.01、***p < 0.001。CSFは脳脊髄液、SCFAは短鎖脂肪酸。
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ミクログリアはCNSの最も顕著な免疫細胞であり、BBBの機能とβアミロイド（Aβ）クリアランスにおいて重要な役割を果たすことが知られている（Haruwaka et al, 2019; Tejera et al, 2019）。まず、SCFAのバリア回復作用がAβ凝集を抑制できるかどうかを調べた。驚くべきことに、プロピオン酸塩および酪酸塩の両処理は、AppNL-G-Fマウスの脳におけるAβ蓄積の有意な減少をもたらし、これは総Aβプラーク面積およびAβプラーク数の両方に反映された（図6IおよびJ）。バリアの密度が低いと、末梢因子（サイトカインや免疫細胞など）の中枢神経系への浸潤が増加し、その結果、神経炎症が誘発および／または悪化する可能性がある（Takata et al, 2021）。次に、Aβを貪食するミクログリアの能力を高めるのに、SCFAのバリア回復作用が有益かどうかを評価した。プロピオン酸および酪酸で処理したAppNL-G-Fマウスの嗅球では、ミクログリアの数が有意に増加した。大脳皮質と線条体では、SCFAs処理後のミクログリア数に差は見られなかった（図7AとB、EV5AとB）。非Aβプラーク関連ミクログリアについて詳細なSholl解析を行ったところ、プロピオン酸処理したAppNL-G-Fマウスでは、交差点総和、ramification index、終末半径が有意に減少しており（図7CおよびD）、ミクログリアの表現型がより活性化していることが示された。同様に、酪酸ナトリウム処理でもミクログリアの増殖と活性化に同じ傾向が見られたが、その変化は有意ではなかった（図7A-D）。さらに、プロピオン酸および酪酸塩処理したAppNL-G-Fマウスの両方でミクログリアがAβを内在化する顕著な増加が観察されたが、AppNL-G-Fマウスでは酪酸塩処理のみが大きなプラーク（＞600μm2）に隣接するミクログリアの数の有意な増加を示した（図7EおよびF）。しかし、WTマウスに同用量のプロピオン酸と酪酸を投与した場合、ミクログリアの増殖や活性化に差は観察されなかった（付録図S9A-D）。これらの結果は、生理学的条件下では、SCFAの補充はミクログリアの活性化と増殖に顕著な影響を及ぼさないことを示している。しかし、病理学的条件下では、SCFA投与はミクログリアの数を増加させ、ミクログリアの活性化を誘導することにより、脳内のAβ負荷の軽減を促進する可能性がある。これらは、神経炎症を誘発する末梢因子の浸潤限界を高めるSCFAのバリア回復作用の恩恵を受け、ミクログリアの過活性化を防ぎ、機能的表現型へと移行する可能性がある。
図7. AppNL-G-Fマウスにおけるミクログリアの増殖と活性化に対するSCFAの効果
A.IBA1と6E10の免疫染色の代表的画像。スケールバー：200μm（上）、20μm（下）。
B.海馬におけるIBA1+ミクログリアの数（n = 5-6、生物学的複製）。
C.（A）のIBA1染色画像から、海馬における非Aβ関連ミクログリアのSholl解析のための代表画像。同心円の間隔は2μm。
D.免疫染色されたIBA1シグナルからのSholl解析による、要約された交差、ramification index、および終末半径の定量化（n = 5-6、生物学的複製）。
E.ミクログリアとAβプラークのオーバーレイ面積の割合の定量化（n = 5-6マウス；1マウスあたり5ミクログリア）。
F.プラークを小（＜250μm2）、中（250-600μm2）、大（＞600μm2）に分け、プラークあたりのミクログリア数を定量した（n = 5-6マウス；1匹あたり3-5プラーク）。
データ情報： 棒グラフは平均値±SEM。統計は一元配置分散分析Bonferroni's post hoc testによる多重比較で行った。SCFAs、短鎖脂肪酸。
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図EV5. AppNL-G-Fマウスにおけるミクログリア増殖に対するSCFAの効果
注目すべきは、ミクログリアの活性化は、安静アストロサイトの反応性アストロサイトへの転換と神経細胞の機能障害につながる可能性があることである（Leng & Edison, 2020）。まず、WTマウスとAppNL-G-Fマウスのアストロサイトの増殖と活性化に対するプロピオン酸と酪酸の影響を調べた（付録図S10AとB、S11AとB）。GFAP免疫染色は、WTおよびAppNL-G-Fマウスにおいて、プロピオン酸および酪酸処理後のアストロサイトの形態および数に有意な変化を示さなかった（付録図S10AおよびB、ならびにS11AおよびB）。次に、AppNL-G-Fマウスのシナプス特性に対するプロピオン酸と酪酸の影響を解析した（付録図S12A-D）。シナプス前タンパク質シナプフィジン（SYP）とシナプス後密度タンパク質95（PSD-95）の共免疫染色の高解像度画像から、SCFAを投与したAppNL-G-Fマウスの大脳皮質と海馬の領域では、AppNL-G-Fコントロールと比較して、同程度の数の二重陽性シナプス点状突起が認められた（付録図S12AおよびB）。さらに、IBA1とPSD-95の共免疫染色では、ミクログリアによる過剰なシナプス刈り込みは認められず、ダウンレギュレーション傾向さえ観察された（付録図S12CおよびD）。
考察
脳は、血液脳関門や血液CSF関門などの強固な関門によって、侵入物質から守られている。これらのバリアは、血液と脳実質の間の分子の通過を制御し、中枢神経系におけるバランスのとれたよく制御された微小環境を保証している（Kadry et al, 2020）。我々の研究では、無菌マウス（GF）または抗生物質投与（AB）によりモデル化されたマウスにおいて、正常な腸内細菌叢の欠如は、BBB透過性の亢進だけでなく、血液-CSFバリア透過性の亢進とも関連していることを発見した。驚くべきことに、BBBと血液-CSF関門の障害は、正常な糞便微生物叢の移植またはSCFAの補充によって回復する。
タイトジャンクションは血液-CSFバリアの維持に大きな役割を果たしている（Solar et al, 2020）。血液-CSFバリアは胚発生の初期にすでに形態的にも機能的にも成熟しているが（Johansson et al, 2006）、ABマウスでは血液-CSFバリアの透過性が上昇していることから、血液-CSFバリアの維持には複雑な微生物叢からの継続的な入力が必要であることがわかる。ここで、我々は、腸内細菌叢が存在しないマウス、すなわちABマウスとGFマウスにおいて、ZO-1、OCLN、CDH1タンパク質のTJタンパク質の非局在化を観察した。しかし、ABマウスではCLDN-1の局在は乱れていなかったことから、CLDN-1は完全成熟後の腸内細菌叢の変化には影響されない可能性が示された。TJの乱れは対応する遺伝子の発現には反映されなかったことから、腸内細菌叢は対応する遺伝子の発現を変化させるのではなく、TJの局在を直接制御することによって血液-脳脊髄バリアの完全性を調節していることが示された。血液-CSFバリアの完全性に対する同様の影響は、腸内細菌叢を構成的に枯渇させたGFマウスでも観察された。後者は、GFマウスと従来型マウスの血液-CSFバリアーを比較した最近の発表と一致しており、GFマウスではZO-1ネットワーク組織が減少していることが明らかになった（Knox et al, 2023）。以上のことから、血液-CSFバリアの成熟に複雑な微生物叢が重要な役割を果たしていることがわかる。
重要な疑問は、腸内常在微生物がこの血液-CSFバリアの形成と維持をどのように制御しているのかということである。これまでの研究で、腸内細菌叢の代謝産物、特に短鎖脂肪酸（SCFA）が、BBBの完全性と脳機能を調節する必須シグナル伝達機能を持つことが示されている（Parker et al, 2020）。最近の研究で、腸内細菌叢欠損マウスでは、糞便や血清のメタボロームシグネチャーに有意な変化があることが明らかになった（Theriot et al, 2014; Lai et al, 2021）。SCFAは、消化管における食物繊維の細菌発酵によって産生される主な代謝産物であり、TJの発現を増加させ、BBB透過性を低下させることによってBBBの成熟を制御することが示されている（Braniste et al, 2014; Hoyles et al, 2018）。我々の研究において、in vitroおよびin vivoでのSCFAであるプロピオン酸および酪酸塩による治療は、血液-CSF関門におけるTJの無秩序化と、炎症トリガーによって誘導される関門透過性の上昇の両方を阻止した。一般に、酪酸塩処理はプロピオン酸塩に比べてTJsの局在を改善する能力が弱かったが、これは特に、血液中の安定性、CPE細胞上の対応する受容体の発現、またはCPE細胞による取り込み効率の違いによるのかもしれない。しかし、どのSCFA受容体がCPE細胞上に発現しているかは不明であり、さらなる調査が必要である。一次CPE細胞培養をSCFAで処理した我々の実験から、これはTJ遺伝子発現の大きな変化によるものではなく、処理によって大きな影響を受けたTJの細胞内局在によるものであることが示唆される。
SCFAは、微生物叢-腸-脳の相互作用を直接的または間接的に仲介する上で重要な役割を果たしていることが示されている。メカニズム研究では、免疫、内分泌、神経、体液性経路を含む、この相互作用に関与する4つの主要なシグナル伝達経路が同定されている（Dalile et al, 2019）。Hoylesら（2018）は、循環を通じてBBB機能にSCFAが直接作用することを実証し、内皮の遊離脂肪酸受容体3（FFAR3）が保護作用を媒介するSCFAの優勢な受容体である可能性を同定した。しかし、脈絡叢では、成人ヒトではFFAR3遺伝子の発現が低く検出され（Rouillard et al, 2016）、マウスのRNA-seqデータではFFAR3の発現が認められなかったことから、血液-脳脊髄液関門に対するSCFAの直接的な作用が支配的なメカニズムではなく、他のメカニズムが関与している可能性が高い。迷走神経は80％の求心性線維と20％の遠心性線維を含み、消化管のほぼ全域を支配しているが、腸内細菌叢や管腔内容物と直接接触することはなく、細菌化合物や代謝産物の消化管バリア越しの拡散を通じて、管腔シグナルを間接的に感知することができる（Bonaz et al, 2018）。興味深いことに、Yangら（2018）は、迷走神経刺激がBBBの完全性に影響を及ぼす可能性があることを示している。したがって、迷走神経はSCFAによる血液-CSFバリアの完全性を調節する役割を果たすかもしれないという仮説を立てた。この仮説に沿って、腹腔迷走神経切断術はTJを破壊し、透過性を増加させることがわかった。これは、迷走神経が腸内細菌叢由来のシグナルを脈絡叢に伝達する重要な経路の一つであり、血液-CSFバリアの完全性を維持する上で重要であることを示している。迷走神経切断術が脳関門に及ぼす影響の一部は、腸内細菌叢に及ぼす影響によるものである可能性があることに注意することが重要である。しかし、VxマウスにSCFAを補充しても、TJの局在を改善することで血液-CSFバリア回復作用が誘導されたことから、SCFAは迷走神経を迂回し、他の経路で血液-CSFバリア機能に影響を与えることができる。これらの経路には、脳関門の直接横断や、BBB内皮上のFFARの活性化を介した神経炎症の間接的調節が含まれる可能性がある（Hoyles et al, 2018; Silva et al, 2020）。我々の研究では、SCFAは経口投与により血流に入ることがわかった。SCFAが血液-CSF関門も通過してCSFに入ることができるかどうかについては、現在の方法では判断できなかったが、我々のin vitroモデルでは、酪酸ナトリウムが緊密に連結したCPE細胞を基底側から先端側へ通過できることが示された。したがって、腸由来のSCFAは脳に到達し、血液-CSF関門を通過することができると推測される。しかし、SCFAがCSFに入るかどうかを確かめるためには、より感度の高い方法によるさらなる検証が必要である。さらに、血液-CSF関門の完全性に対するSCFAの効果を促進する迷走神経やその他の潜在的な経路の寄与を明らかにするための今後の研究が必要である。
BBBの機能不全がADやその他の神経変性疾患に関与している可能性を示唆する証拠が増えている（Varatharaj & Galea, 2017; Sweeney et al, 2018）。我々の最近の研究でも、ADマウスは野生型マウスと比較して血液-CSFバリア透過性が亢進し、TJが破壊されていることが示されている（Xie et al, 2021）。さらに、ADマウスはまた、糞便中のSCFA生成菌数の減少と血漿中のSCFAの減少を示し（Zhang et al, 2017; Kaur et al, 2020）、これはADマウスの糞便SCFAsレベルが有意に減少しているという我々の観察と一致している。AD病態に対するSCFAの作用機序は、代謝分布、特異的受容体、シグナル伝達経路などいくつか提唱されているが、ADにおいてどのSCFAs機序が重要であるかはほとんど不明である（Qian et al, 2022）。我々の研究では、プロピオン酸および酪酸SCFAによる治療が、AppNL-G-FマウスにおいてBBBおよび血液-CSFバリアの完全性を改善し、それらの透過性を低下させることが観察された。しかし、AppNL-G-FマウスではWTマウスに比べSCFAによるバリア機能の改善効果は弱く、これはAD病態（例えばAβプラーク）の存在に起因している可能性がある。しかし、SCFA投与によるAppNL-G-Fマウスのバリア完全性のわずかな改善は、脳内Aβ蓄積の有意な減少に関連していた。これは、酪酸ナトリウムの投与がADのトランスジェニックマウスモデルにおいて脳内Aβレベルを減少させ、認知記憶能力を改善することを示した過去の報告と一致している（Fernando et al, 2020）。とはいえ、SCFAが脳関門の引き締めとは別のメカニズムでミクログリアの表現型やAβ病態に影響を及ぼす可能性も否定できない。この点に関しては、プロピオン酸も酪酸もミクログリアの活性化を誘導し、Aβの貪食、クリアランス、分解を増加させることによって、Aβの蓄積を減少させることが示されている（Solito & Sastre, 2012）。重要なことは、試験管内でSCFAが血液-CSFバリアTJを直接強化することが示された一方で、ミクログリアに直接的な作用を及ぼすために必要な、投与されたSCFAが脳内に存在することが示されなかったことである。しかし、酪酸は強い抗炎症メディエーターである一方、プロピオン酸のような他のSCFAは炎症反応を増強するため、SCFAは炎症を媒介することでミクログリア機能に間接的に影響を与える可能性もある（Huuskonen et al, 2004）。SCFAの炎症作用は、ミクログリアの活性化、そしてミクログリアのAβ貪食にさらに影響を及ぼす可能性がある。本研究では、SCFA投与が、AppNL-G-FマウスにおいてミクログリアのAβ内在化と大きなAβ斑に隣接するミクログリアの数を増加させることを見いだした。注目すべきは、プロピオン酸は酪酸よりも高レベルのミクログリア活性化を誘導することであり、この活性化亢進状態は、われわれの以前の研究（Xie et al, 2021）で示したように、ミクログリアのAβ貪食能力を低下させる可能性がある。炎症作用に加えて、SCFAは、おそらくApoE-TREM2経路のアップレギュレーションとヒストンアセチル化の増加を通じて（Erny et al, 2015, 2021; Colombo et al, 2021; Bauer et al, 2022）、ミクログリアの成熟と機能を制御することもでき、それによってAβの内在化と分解におけるミクログリアの能力に影響を与える（Lee & Landreth, 2010）。これらの経路に影響を及ぼすプロピオン酸と酪酸の違いは、ミクログリアのAβ貪食能の違いにも寄与している可能性がある。われわれの結果とは対照的に、最近の研究では、SCFA混合物（酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム）による治療が、GF ADマウスのAβプラーク負荷を通常のSPFマウスのレベルまで増加させ、ADマウスのAβ負荷をさらに悪化させることが報告されている（Colombo et al, 2021）。さまざまな結果が得られたのは、マウスモデル、SCFA投与時の年齢、SCFAの投与量、投与経路などの実験設定が異なるためと考えられる。例えば、健康なヒトにおけるプロピオン酸の過剰摂取は、ADのリスクを高めることが報告されている（Killingsworth et al, 2020）。本研究では、SCFA投与により、AppNL-G-Fマウスの海馬ではミクログリアの数が増加し、ミクログリアの活性化が誘導されたが、WTマウスでは観察されなかったことから、生理的条件下では、SCFAの補充はミクログリアの増殖および活性化に顕著な影響を及ぼさないが、病的条件下では、SCFA投与はミクログリアの数を増加させ、ミクログリアの活性化を誘導することにより、脳内のAβ負荷の軽減を促進する可能性があることが示された。ミクログリアは、SCFAのバリア回復効果により、神経炎症を誘発する末梢因子の脳内への漏出を制限し、ミクログリアの過活性化を防ぎ、その機能を維持することができる。したがって、ADに対する個々のSCFAの有益な可能性を評価し、個別化された治療戦略の根拠を構築するためには、さらなる研究が必要である。さらに、ミクログリアの活性化は、静止アストロサイトの反応性アストロサイトへの転換や、過剰なシナプス刈り込みなどの神経細胞機能障害につながる可能性が先行研究で示されている（Azevedo et al, 2013; Litvinchuk et al, 2018; Leng & Edison, 2020）が、SCFAを投与したAppNL-G-Fマウスでは、アストロサイトの増殖や活性化、シナプス消失の変化は観察されなかった。これらの結果は、SCFAによるミクログリアの貪食活性の亢進と増殖は、アストロサイトの活性化とシナプス刈り込みには影響しないことを示している。
まとめると、我々の研究は、血液-脳脊髄液バリアの完全性に不可欠な上皮細胞に対する腸内細菌叢とその代謝産物、より具体的にはSCFAの調節効果という重要な新しい側面を明らかにした。さらに、ADマウスにおけるBBBと血液-CSFバリアの障害は、SCFAの補充によって回復し、この治療によってAβ病態を抑制することができる。今回得られた知見は、中枢神経系バリアの完全性とADなどの神経疾患の発症に対する腸内細菌叢とSCFAの寄与に関する知見を深めるものである。重要なことは、この知見は、腸内細菌叢やその代謝産物が脳関門構造に及ぼす影響や、神経疾患における治療介入の標的としての影響について、将来的な研究を行うための段階を設定するものであるということである。
材料と方法
動物
ジャームフリー（GF）および特異的病原体フリー（SPF）のC57BL/6J雌性マウス（7～9週齢）およびAppNL-G-Fマウス（56～58週齢）を用いた。GFマウスはゲント大学のGF施設の陽圧フレキシブルフィルムアイソレーター（North Kent Plastics社製）に収容した。マウスは、VIB-Ugent Center for Inflammation ResearchのSPF動物施設にある個別換気ケージに収容した。該当する場合、動物は無作為に異なる群に割り付けられた。すべての動物実験は、実験動物の世話と使用に関する政府およびEUのガイドラインに従って実施され、ベルギーのゲント大学理学部の倫理委員会の承認を得た。
微生物叢の枯渇と再コロニー化
微生物叢を実質的に枯渇させるため、SPFマウスに、0.2 mg/mlのシプロフロキサシン（Sigma-Aldrich）、1 mg/mlのアンピシリン（Sigma-Aldrich）、1 mg/mlのメトロニダゾール（Sigma-Aldrich）、および0.5 mg/mlのバンコマイシン（Duchefa Biochemie）を含む飲料水を、前述のように2週間自由摂取させた（O'Connor et al, 2021）。抗生物質は1日おきに更新した。0.05gの糞便（ペレット2～3個）を1mlのPBSに溶解し、得られた接種物をBHIプレートにプレーティングし、治療の成功を追跡した。再コロニー化のため、GFマウスおよび抗生物質投与マウスは、0日目と2日目の2回（1日1回）、SPFマウスの糞便を経口投与し、その後2週間放置した後、犠牲にした。対照として、SPFマウス群には滅菌PBSを投与した。
腹腔迷走神経切開
腹腔迷走神経切開を行うため、マウスの腹部中央部を切開して食道前壁を露出させ、左右の迷走神経幹を横隔膜下に切断した。迷走神経切開を行わない群（偽）は、迷走神経切開を行わずに腹部中央部を切開した。迷走神経背側運動核（DMV）の抗ChAT免疫染色により、迷走神経切開の成功を確認した。付録図S13に示すように、迷走神経切断術は、偽DMVと比較して、DMVの両側でChAT陽性ニューロンの数を有意に減少させた。迷走神経切断に失敗したマウスのサンプルは除外した。
SCFA処理
血液-CSF関門通過実験のマウスは、犠牲にする前に13C標識プロピオン酸ナトリウム（Cambridge Isotope Laboratories）と酪酸ナトリウム（Cambridge Isotope Laboratories；1日1g/kg体重[BW]）を3日間経口投与した。他の実験のマウスには、同じ用量のプロピオン酸ナトリウム（Sigma-Aldrich）または酪酸ナトリウム（Sigma-Aldrich）を投与した。対照群には滅菌PBSを経口投与した。
In vitro細胞培養は、バリア機能解析の前にプロピオン酸ナトリウムまたは酪酸ナトリウム（0.1、1、10μM）で6時間処理した。
バルクRNA-seqとダウンストリーム解析
脈絡叢組織からの全RNAは、Aurum total RNA kit（Bio-Rad）を用いて抽出した。RNA-seq解析は、Illumina NovaSeq 6000装置で行った。SPFRサンプルとGFRサンプルのシーケンシングは別々に行った。最初のシーケンスランの4つのグループ（SPF、GF、AB、ABR）それぞれの2つのテクニカルレプリケートを再シーケンスのために再度採取し、シーケンスラン間のテクニカルバッチの影響がないことを確認した。RNA-seqデータの前処理はTrimmomatic v0.39 (Bolger et al, 2014)で行い、品質管理はFastQC v0.11.8 (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)で行った。リファレンスマウスゲノムへのマッピングはSTAR v2.7.3aで行い、BAMファイルはSamtools v1.9で作成し、カウントにはHTSeqCount v0.11.2を使用した（Dobin et al, 2013; Anders et al, 2015）。データの正規化にはLimma v3.42.2を使用した（Ritchie et al, 2015）。少なくとも4サンプルでcount per million (cpm)の値が1より大きいという条件を満たさない遺伝子はフィルターで除外した。1つのGFRサンプルは、PCA楕円分析（2つのzスコア外）に基づいて外れ値であると判断され、下流の分析から除外された。この結果、脈絡叢データセットでは14,251遺伝子、30サンプルを含む発現表が得られた。EdgeRv3.28.1は、差次的発現（DE）解析を行うために利用された（Robinson et al, 2010）。Benjamini-Hochberg補正を用いて多重検定のP値を調整した。DE遺伝子としてラベル付けされるには、遺伝子は調整P値<0.05、log2比>1または<-1である必要があった。Rパッケージpheatmap v1.0.12 (https://CRAN.R-project.org/package=pheatmap)を用いて、ABマウスとSPFマウスの脈絡叢におけるすべてのDE遺伝子のヒートマップを作成した。表示された遺伝子発現はlog2正規化された。全サンプルにわたる遺伝子ごとの平均発現値を計算し、各サンプルの特定の遺伝子発現値から差し引いて発現値をスケーリングした。どの遺伝子が特定のGOカテゴリーに対するコアエンリッチメント遺伝子であるかを示すために、3つの追加アノテーションカラムがヒートマップに追加された。膜はGOカテゴリーintegral component of membrane (GO:0016021)とintrinsic component of membrane (GO:0031224)の組み合わせ。細胞接合は独自のカテゴリーであり（GO:0030054）、細胞接着は細胞膜接着分子を介した細胞間接着を指す（GO:0098742）。
遺伝子セット濃縮分析（GSEA）は、ClusterProfiler Rパッケージv3.14.3（Yu et al, 2012）で、事前にランク付けしたDE遺伝子リストと全遺伝子分布を用いて行った。3つのオントロジー（"Biological Pathway"、"Molecular Function"、"Cellular Compartment"）がすべて含まれ、0.05のP値カットオフが適用された。有意にアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた Gene Ontology (GO) カテゴリーの上位 10 項目（P 値による）をドットプロットで示した。その後、関連する上位GOカテゴリーがGSEAプロットでハイライトされる。Running Enrichment Score (RES)は、1つの遺伝子セット（緑線）または複数の遺伝子セット（異なる色）について、プロットの上半分のY軸にプロットされる。RES は、事前にランク付けされた遺伝子リストを実行し、遺伝子が遺伝子セットに入っているか（RES が増加）、入っていないか（RES が減少）に応じてランニングサム統計量を更新することによって計算されます。このスコアは、遺伝子セットが事前ランク付けされた遺伝子リストの上位または下位に過剰発現しているかどうかを示す。プロットの中央のバーコード線（1つの遺伝子セットでは黒、複数の遺伝子セットでは複数の色）は、遺伝子セット内の遺伝子が完全なランク前遺伝子リストのどこに位置しているかを示す。プロットの下部にあるランク付けされたリストの指標は、ランク付けされた遺伝子リストの下に移動するにつれて、ランク付けの指標（logFC）がどのように変化するかを表示する。これはGO用語がどの表現型／条件と相関しているかを示す。それぞれの遺伝子セットの正規化エンリッチメントスコア（NES）とP値は、GSEAプロット上の埋め込み表に示されている。
プロパノエート代謝遺伝子は、clusterProfilerパッケージのgseKEGG関数を実行して決定した。これは、CPにおける抗生物質条件とコントロール条件の間の完全な遺伝子分布に基づいて、KEGGパスウェイmmu00640（プロパン酸代謝）遺伝子セットの濃縮を示した。Rパッケージpheatmap v1.0.12を使用して、KEGGパスウェイにリンクした遺伝子のヒートマップを作成した。表示された遺伝子発現はlog2正規化された。全サンプルにわたる遺伝子ごとの平均発現値を計算し、各サンプルの特定の遺伝子発現値から差し引いて発現値をスケーリングした。
また、Rパッケージpheatmap v1.0.12を使用して、4つの関連する比較における脈絡叢のすべてのDEGのヒートマップを作成した： AB対SPFマウス（79）、ABR対ABマウス（0）、GF対SPFマウス（12）、GFR対GFマウス（191）。ヒートマップには259のユニークな遺伝子を表す282の行がある。各比較は空の行で区切られている。各比較において、遺伝子はlogFCに従って降順に並べられている。表示された遺伝子発現はlog2正規化された。全サンプルにわたる遺伝子ごとの平均発現値を計算し、各サンプルの特定の遺伝子発現値から差し引いて発現値をスケーリングした。
SCFA 測定
糞便代謝物の有機抽出は、リボライザーホモジナイザーを用いて行った。糞便に 500 μl の抽出バッファー（80% MeOH）を加えた。不溶物は遠心分離（20,000 g、15分、4℃）により除去した。糞便のQCサンプルは、各サンプルのアリコートを混合して作成した。各サンプル2マイクロリットルを、OrbiTRAP Fusion Lumos MSに接続したiHILIC搭載UPLCインラインに注入した。シーケンスの設定にはAcquireXオプションを使用し、MSレンジは70-750 m/zとした。同定には、品質管理（QC）の前に実行したブランクサンプル（80% MeOH）から得た除外リストと、QCから得た包含リストを使用した。各セットの全サンプルはスクランブルされた状態で実行された。フラグメンテーションは、衝突誘起解離（CID）および高衝突解離（HCD）により行われた。
培地、血漿およびCSFは、抽出バッファー（80/20 MeOH/水）を加えて抽出した。培地と血漿は抽出バッファーで100倍に希釈し、CSFは抽出バッファーで10倍に希釈した。これらの抽出液を-80℃で一晩放置した後、遠心分離（20,000 g、4℃で10分間）によって不溶物を除去した。各サンプル 10 マイクロリットルを、Q Exactive Orbitrap Focus 質量分析計 (Thermo Scientific) に加熱エレクトロスプレーイオン化を介して結合した Vanquish LC システム (Thermo Scientific) に接続した Poroshell 120 HILIC-Z PEEK カラム (Agilent InfinityLab) に注入しました。90％溶媒A（5μMメドロン酸含有アセトニトリル）および10％溶媒B（ミリQ水中10mM NH4-ギ酸、pH 3.8）から開始する直線グラジエントを行った。2～12分後、グラジエントは60%Bに変化した。60%Bを3分間維持した後、10%Bに減少させた。フローは0.25ml/分で一定に保った。カラム温度は25℃で一定に保った。質量分析計はフルスキャン（レンジ70.0000-1,050.0000）およびネガティブモードで、スプレー電圧2.8kV、キャピラリー温度320℃、シースガス45℃、補助ガス10℃、後者は260℃に加熱して使用した。AGCターゲットは70,000の分解能で3.0×106に設定した。データ収集はXcaliburソフトウェア（Thermo Scientific）を用いて行った。データ解析はピーク面積を積分することにより行った（El-Maven-Polly-Elucidata）。
BBBおよび血液-CSFバリア透過性の定量化
血液-脳関門および血液-CSF関門の漏出は、前述したように解析した（Vandenbroucke et al, 2012）。簡単に説明すると、4 kDaのFITC-デキストランを、脳槽穿刺による髄液分離の15分前に静脈内注射した。血液-CSFバリア解析のため、1μlのCSFを99μlのPBSで希釈し、FLUOstar Omegaリーダーを用いて蛍光を測定した（λex/λem = 485/520 nm）。BBBの完全性を解析するため、マウスをPBS/ヘパリンで経心的に灌流し、脳を単離した。次に、灌流した脳サンプルをホルムアミド中で一晩インキュベートし、サンプルを4℃で20,000 g、15分間遠心し、100 μlの上清をFLUOstar Omegaリーダーを用いた蛍光測定に用いた（λex/λem = 485/520 nm）。
マウスCPE初代細胞の単離
マウスCPE初代細胞は、以前に記載されたようにP2-P7仔から単離した（Balusu et al, 2016）。脈絡叢組織を側脳室および第四脳室から単離し、プールし、プロナーゼ（Sigma-Aldrich）で7分間消化した。単層培養では、細胞を24ウェルプレートまたはラミニン（Sigma-Aldrich）でコートしたトランスウェルポリエステルインサート（孔径0.4μm、表面積33.6mm2、Corning）にプレーティングした。細胞は、10%FBS、2mM L-グルタミン（Gibco）、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM/F12培地で、経上皮電気抵抗（TEER）値がプラトーに達するまで、37℃、5%CO2で1～2週間培養した。
In vitroバリア機能評価
100％コンフルエント培養で、細胞間透過性とTEERを測定した。70 kDa FITC-デキストラン（0.2 mg/ml）に対する上皮細胞単層の透過性は、以前に記載されたように測定された（Hoyles et al, 2018）；データは、トランスウェルを通過するFITC-デキストランの割合として示される。TEER測定はMillicell ERS-2 Voltohmmeter（Millipore, Watford, UK）を用いて行い、オームcm2として表した。
RNA抽出とRT-qPCR分析
細胞を回収し、氷冷PBSで1回洗浄した。TRIzol（Invitrogen）で5分間インキュベートした後、TRIzol/細胞溶解液を微量遠心機で20,000g、4℃で15分間遠心して3相に分離した。Aurum total RNA kit（Bio-Rad社製）を用い、上層の水相から製造者の指示に従い全RNAを抽出した。全RNAの濃度をNanodrop-1000（Thermo Scientific社製）で測定し、SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit（Bioline社製）を用いて全RNAをcDNAに逆転写した。 qPCRは、SensiFAST™ SYBR® No-ROX Kit（Bioline社製）を用いてRoche LightCycler 480 System（Applied Biosystems社製）で行った。結果は、GeNormを用いて決定した参照遺伝子の幾何平均値に対して正規化した相対発現値で示した。プライマーの配列は付録表S1に示されている。
IgGウェスタンブロッティング
5マイクロリットルのCSFを、完全プロテアーゼ阻害剤（Thermo Scientific）を含む15μlのPBSで希釈した。サンプルを5×Laemmli緩衝液で変性させ、SDS-PAGEゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロース膜に転写した。Odysseyブロッキングバッファー（LI-COR Biosciences）でブロッキングした後、メンブレンをまずビオチン化ヤギ抗マウスIgG（1:2,000; Thermo Scientific）とインキュベートし、次にHRP標識ストレプトアビジン（1:5,000; Thermo Scientific）とインキュベートした。タンパク質のバンドは、Amersham Imager 600（GE Healthcare）のWesternBright Quantum HRP基質（Advansta）により検出し、定量した。
免疫組織化学
脳切片の免疫染色のために、マウスをPBS中の氷冷4％PFAで経心的に灌流した。その後、脳を注意深く頭蓋骨から切り離し、2つに分割した（正中矢状）。右半球は直ちに凍結切片培地（Thermo Scientific社製）に包埋し、ドライアイスで凍結したクライオモールド（Sakura社製）に入れ、さらに使用するまで-80℃で保存した。左半球はPBS中4％PFAで4℃、一晩後固定した。脱水後、サンプルはクライオモールドでパラフィンに包埋し、さらに使用するまでRTで保存した。脳を5μmスライスのパラフィン切片（HM 340 E, Thermo Scientific）または20μmの凍結切片（CryoStar NX70, Thermo Scientific）に切り出した。これらの脳サンプルは矢状上洞から大脳半球の境界に向かって切り出した。脈絡叢が最初に存在する場合はTJ染色用に、海馬全体が最初に存在する場合はその他の染色用に、切片を連続的に採取した（付録図S14）。マウス1匹につき1切片を分析した。免疫蛍光染色では、切片を0.3-0.5% Triton X-100を含むPBSで透過処理した。GIM（5％ヤギ血清、0.1％BSA、PBS中0.3-0.5％Triton X-100）で1時間RTでブロックした後、切片をGIM中の一次Absと4℃で一晩インキュベートした。PBSで洗浄後、PBSまたは0.1% Triton X-100を含むPBS中、蛍光標識二次抗体で1～1.5時間染色した。一次抗体 Occludin (cat. no. 33-1500, Thermo Scientific); E-cadherin (cat. no. 610181, BD Biosciences); IBA1 (cat. no. 019-19741, Wako); GFAP (cat. no. ab53554, Abcam); Synaptophysin (cat. no. ab32127); PSD-95 (cat. no. MA1-045, Thermo Scientific); and 6E10 (cat. No. 803001、Biolegend）をパラフィン切片に、ZO-1（cat. no. 61-7300、Thermo Scientific）とClaudin-1（cat. no. 51-9000、Thermo Scientific）を凍結切片に、CD31（cat. no. DIA-310、Dianova）をパラフィン切片と凍結切片の両方に用いた。初代細胞の免疫染色では、細胞を氷上で20分間、2％PFAで固定した。次に、細胞をPBSで3回洗浄し、0.1% Triton X-100で10分間氷上で透過処理した。サンプルをブロッキングバッファー（PBS中1％BSA）で洗浄し、一次Abs（ブロッキングバッファーで希釈）と共に4℃で2時間RT/一晩インキュベートした。PBS で洗浄後、蛍光標識二次抗体で細胞を染色した。次に、サンプルをHoechstでカウンター染色し、切片をマウントした。イメージングにはZeiss LSM780共焦点顕微鏡またはZeiss Axioscan Z.1を用いた。
イメージングと定量化
TJ染色では、側脳室にある脈絡叢をすべての実験で評価した。撮像は、共焦点顕微鏡を用い、40×対物レンズで行った。画像はImageJを用いて処理し、連続したTJの長さはImageJのRidge Detectionプラグインを用いて定量化した。TJ発現面積の割合は、TJシグナルの面積を上皮核の面積で割って定量した。
Aβ斑の染色には、Axioscan Z.1を用い、20倍の対物レンズで全脳切片を撮影した。Aβ斑はImageJのAnalyze Particlesで最小斑面積100μm2カットオフで定量した。
シナプス点刻の共局在解析のために、脳パラフィン切片を抗SYP抗体と抗PSD-95抗体で共染色し、共焦点顕微鏡を用いて63×対物レンズで3倍ズームで撮影した。画像はImageJを用いて処理し、共焦点化した点刻の数はImageJ用のSynapse Counterプラグインを用いて定量化した（Dzyubenko et al, 2016）。
統計解析
すべてのデータは正規分布と仮定して統計解析を行った。統計的有意性は、2群を比較する場合は両側Studentのt検定、多重比較解析の場合は一元配置分散分析（one-way ANOVA）後にBonferroniのpost hoc検定（GraphPad Prism 8）を用いて決定した。p＜0.05を統計的に有意とみなした。値は平均値±SEMで表した。
EdgeR v3.28.1を使用して、Bulk RNAシーケンスデータの差次的発現（DE）解析を行った。Benjamini-Hochberg補正を適用して多重検定のP値を補正した。DE遺伝子は、調整P値<0.05、log2比>1または<-1の遺伝子である。
データの利用可能性
本研究で使用したデータセットは以下のデータベースで利用可能である： RNA-SeqデータはGene Expression Omnibus (GEO)にアクセッション番号GSE228655 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE228655)で寄託されている。免疫組織化学データはBioImage Archive (BIA)にアクセッション番号S-BIAD609 (https://www.ebi.ac.uk/biostudies/bioimages/studies/S-BIAD609)で寄託されている。本研究で得られた知見を裏付ける定量的データは、論文内およびソースデータで入手可能である。
謝辞
VIB BioImaging Coreのトレーニング、サポート、装置パークへのアクセスに感謝する。さらに、VIB Nucleomics CoreとVIB Metabolomics Coreの技術協力に感謝する。また、Vanessa Andries、Korneel Barbry、Lars VereeckeがコーディネートしたGhent Germ-Free and Gnotobiotic Mouse Facilityにも感謝する。本研究はResearch Foundation-Flanders (FWO; G055121N, 11M3322N)、China Scholarship Council (CSC; 201808360194)、Foundation for Alzheimer's Research Belgium (SAO-FRA; 20190028 and 20200032)、Baillet Latour Fundの支援を受けた。画像抄録の一部はBiorender.comで作成した。
著者の貢献
Junhua Xie：概念化、データキュレーション、形式分析、調査、可視化、方法論、執筆（原案）。Arnout Bruggeman： 概念化、調査、方法論、執筆-レビューおよび編集。Clint De Nolf: ソフトウェア、形式分析、方法論、執筆-レビューと編集。Charysse Vandendriessche： 調査。グリート・ヴァン・イムシュート 調査。Elien Van Wonterghem：調査： 調査、プロジェクト管理 ラース・ヴェレケ リソース Roosmarijn E Vandenbroucke： 概念化、リソース、データ管理、監督、資金獲得、方法論、プロジェクト管理、執筆-レビューおよび編集。
利益相反声明
著者らは利益相反がないことを宣言する。
参考情報
付録S1（PDF文書、2.2 MB）
拡大図PDF (PDF文書, 1.8 MB)
データセットEV1 (Excel 2007 スプレッドシート , 4.9 MB)
データセット EV2 (Excel 2007 スプレッドシート , 16.1 KB)
データセット EV3 (Excel 2007 スプレッドシート , 540 KB)
データセット EV4 (Excel 2007 スプレッドシート , 549.3 KB)
データセット EV5 (Excel 2007 スプレッドシート , 25.2 KB)
拡大図と付録のソースデータ (Zip アーカイブ, 209.5 KB)
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