コレラ菌におけるストレス依存的暴走反応をシグナルするD-アミノ酸

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公開：2023年6月26日
コレラ菌におけるストレス依存的暴走反応をシグナルするD-アミノ酸

https://www.nature.com/articles/s41564-023-01419-6

オイハネ・イラゾキ
ジョシー・テル・ビーク
...
フェリペ・カバ
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ネイチャー微生物学 (2023)この記事を引用する
19 Altmetric
指標詳細
概要
脅威を回避しながら好都合なニッチを探索するために、多くの細菌は走化性ナビゲーションシステムを利用している。走化性については数十年にわたる研究がなされているが、ほとんどのシグナルや感覚タンパク質はまだ解明されていない。多くの細菌種がD-アミノ酸を環境に放出しているが、その機能はほとんど解明されていない。我々は、D-アルギニンとD-リジンがコレラ菌の走化性忌避シグナルであることを明らかにした。これらのD-アミノ酸は、ストレス応答シグマ因子RpoSの制御の下、それらを合成するラセマーゼ酵素と共転写した単一の化学受容体MCPDRKによって感知される。D-アルギニンまたはD-リジンと結合したこの化学受容体の構造解析により、その特異性を規定する残基を突き止めることができた。興味深いことに、これらのD-アミノ酸に対する特異性は、ラセマーゼと転写的に結合しているMCPDRKオルソログに限定されているようである。この結果は、D-アミノ酸が悪条件下における複雑な微生物群集の生物多様性と構造を形成することを示唆している。
メイン
ほとんどの細菌は、変化する環境の中で繁栄するために、様々なシグナルを感知し、それに応答することができる。そのような適応反応のひとつが走化性であり、運動する細菌が特定の物質の局所的な濃度の変化をモニターし、シグナル伝達カスケードを開始することで、時間の経過とともに、細菌の動きを好ましい条件（例えば、栄養素）へ、あるいは有毒化合物から遠ざける方向に偏らせる1。
種特異的な構成要素は存在するものの、走化性シグナル伝達経路の中核は、メチル受容性走化性タンパク質（MCP）として知られる化学受容体、アダプタータンパク質CheW、ヒスチジンキナーゼCheA、応答制御因子CheYで構成されている。大腸菌のようないくつかの生物種では、MCPsはCheWとCheAと安定した三元感覚複合体を形成し、通常細胞極に集まる。リガンド結合やその他の環境変化により、MCPはコンフォメーションを変化させ、CheWの助けを借りてCheAのキナーゼ活性を調節する。CheAはCheYをリン酸化し、それによってCheYが鞭毛モーターに結合して時計回りの回転を引き起こし、ひいては細胞の転倒を誘導する2,3。走化性刺激に対する迅速な反応を確実にするため、CheYのリン酸化は特定のホスファターゼによって制御される4。走化性シグナルの核となる成分は細菌や古細菌の間で高度に保存されているが、化学受容体の数や種類は生物種によって大きく異なり、その特異性もほとんど解明されていない5,6,7。
単一の化学感覚システムと5つのMCPを持つ大腸菌に比べ、通性病原体であるビブリオコレラは、3組の化学感覚経路（CheシステムI/F9、II/F6、III/F7）と少なくとも45個の化学受容体に組織化された非常に高度な走化性システムを持つ8。これまでのところ、II/F6系のみが運動性を制御していることが証明されているが9、その他の系についてはその機能は不明である。MCPの数が多いのは、コレラのライフサイクルの複雑さを反映していると考えられている10。しかし、入力シグナルの一握り（例えば、L-アミノ酸11、タウリン12、酸素13）を除いて、ほとんどのMCPのリガンド特異性に関する情報はほとんどない。
コレラ菌は、ミリモル濃度の多様なD-アミノ酸（DAA）を環境中に放出する14,15（図1a）。DAAは、多くの細菌種で保存されている広域スペクトルラセマーゼBsrVによって、L-アミノ酸（LAA）から生成される14。これらの分子は、多様な細胞プロセス（例えば、細胞壁の生合成16,17、バイオフィルムの完全性18,19,20,21、胞子の発芽22、あるいは細菌間相互作用15）を制御するが、全体として、細胞外DAAの生理学的役割は、主に特定のD-アミノ酸の種類と細菌種に依存する。V.コレラ菌では、D-MetとD-Leuが細胞壁の生合成を調節することが知られているが、その他のDAAの機能は不明である。
図1：D-ArgとD-Lysは、推定MCP VC1313を介してV. choleraeの化学撥水反応をシグナルする。
a, DAAラセミ化の模式図。最も多く生成されるアミノ酸を示す（開丸はL-アミノ酸、塗りつぶし丸はD-アミノ酸）。OMは外膜、IMは内膜、CYTは細胞質。 b, 0.3％軟寒天培地中で増殖するV. コレラ菌野生型（wt）とΔbsrV変異体の代表的な画像。灰色のバーは、wtまたはΔbsrVノックアウト変異株、触媒部位変異株（BsrV K95A）、およびaTc誘導性プロモーター下でbsrVを保有する相補株（pbsrV）と比較した相対運動性を示し、緑色の点は分泌されたD-アミノ酸の量を示す。エラーバーは生物学的に独立した3反復の平均±s.d.を表す。有意差（paired t-test）はP < 0.01またはP < 0.001で示す。 d, 5 mMのD-アミノ酸で化学的に補完したソフトアガー・プレートにおけるΔbsrV変異体の運動性を野生型株との相対値で示す。エラーバーは、2回の独立した実験で調べた生物学的に独立した6反復の平均±s.d.を表す。有意差（一元配置分散分析(ANOVA)）はP < 0.0001で示した。 e, キャピラリーアッセイにおける0.1 mM D-アミノ酸に対する走化性反応。走化性比(CR)は、刺激を含まない対照キャピラリーに対する相対値として計算した。CR＞1は誘引剤、CR＜1は忌避剤、CR＝1は無反応。黒い菱形は3つの独立した生物学的複製の平均を表す。f,D-Argに暴露したコレラ菌細胞抽出物の熱プロテオームプロファイリング解析。D-Arg存在下で安定化したタンパク質と不安定化したタンパク質をそれぞれ赤と緑で強調表示した。V.コレラのゲノムで見つかった45のMCP（黒）から、3つだけがD-Argと相互作用した： VC2161、VC1313、VC1406。g, 選択したMCP候補のD-Argに対する走化性応答。二重変異体（ΔbsrV Δmcp）を構築し、キャピラリーアッセイでD-Argに反応する能力を試験した。ΔbsrV株はバックグラウンドとして用いた。LAAはL-アミノ酸、DAAはD-アミノ酸。黒い菱形は3回の独立した生物学的複製の平均を表す。有意差（対応のないt検定）はP < 0.001で示す。
出典データ
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結果
D-アルギニンとD-リジンは化学撥水シグナルである
DAAに特異的な表現型をスクリーニングしていたところ、D-アミノ酸産生を欠損したV. cholerae株（ΔbsrV）は、軟寒天培地において野生型細胞に比べて40％の運動性低下を示すことがわかった。この減少は、bsrVラセマーゼで異所性遺伝子相補を行うと完全に回復した（図1b,c）。ΔbsrVの運動性欠損は、触媒的に不活性な変異体（BsrV K95A、参考文献23）によって再現されたことから、この表現型はBsrVのD-アミノ酸産生活性に直接関連していることが示唆された。分泌されたD-アミノ酸の欠乏が、われわれが発見した運動性欠損の原因であることを確認するため、われわれはソフトアガー・プレートに無害な濃度の個々のDAAを補充することによって、ΔbsrV変異体を化学的に相補した。対応するL-エナンチオマーをコントロールとして用いた（Extended Data Fig.1）。その結果、D-アルギニン（D-Arg）とD-リジン（D-Lys）のみがΔbsrV変異体の運動性を野生型レベルまで回復させることがわかった（図1d）。これは、これらの特定のDAAがV. choleraeの軟寒天培地での拡散能力に特定の役割を果たしていることを示唆している。
V.コレラの運動性におけるD-ArgとD-Lysの役割を絞り込むために、まず鞭毛の完全性を評価した。しかしΔbsrV細胞は、鞭毛の構成や構造に野生型と比較して有意な差を示さなかった（補足図1）。運動性は走化性と機能的に関連していることから、D-ArgとD-LysがV. choleraeの走化性反応を調節していると考えられた。そこで、キャピラリーアッセイで多様なDAAの活性を調べた。アッセイ中にBsrVによるアミノ酸のラセミ化を防ぐため、ΔbsrV遺伝的背景（以下コントロール）を用いた。重要なことに、この株はこれまでに特徴づけられた刺激（例えば、L-アルギニン、α-アミノイソ酪酸、γ-アミノ酪酸、コハク酸）に対して、野生型の走化性と遊泳能を有している（Extended Data Fig.2）。興味深いことに、V. cholerae ΔbsrVではD-ArgとD-Lysの両方が反発性の走化性反応を促進し、他のDAAは菌に影響を及ぼさないことがわかった（図1e）。V. cholerae ΔbsrVの運動性欠損が、V. choleraeの遊泳能力の変化によるものではなく、もっぱら走化性シグナルに関連するものであることを確認するため、恒常的に活性を持つリン酸化模倣型cheY3D16K,Y109K変異体（以下、CheY3と呼ぶ）を用いた。既述のように24,25、CheY3細胞はタンブリングモードに固定されているためケモタクティックではないが、遊泳能力は維持されている。この結果から、CheY3で相補されたΔcheY3株の軟寒天培地上での拡散は、D-Argの影響を受けなかった（Extended Data Fig. これらの結果を総合すると、D-ArgとD-Lysの感知はコレラ菌の忌避性走化性反応を誘導することが示された。
VC1313はD-ArgとD-Lysの化学受容体である。
V.コレラ菌の走化性機構は、少なくとも45のMCPと推定されるもの8で構成されているが、その一部は機能的に冗長であることが知られている（例えば、複数のLAAを感知するMlp24とMlp37など）11,12。そこで、D-ArgとD-Lysを感知するMCP候補をスクリーニングするために、突然変異誘発法ではなく、二次元熱プロテオームプロファイリング（2D-TPP）を選択した（参考文献26,27）。TPPは、タンパク質の熱安定性がリガンドとの相互作用によって影響を受けるという原理に基づいている28。我々のTPP実験では、V. cholerae細胞を異なる濃度のD-アミノ酸で処理し、その結果生じるタンパク質の熱安定性の変化を質量分析法で定量した（Extended Data Fig.） D-ArgとD-Lysの構造的類似性と同等の走化性応答を考慮し、我々はD-Argに焦点を当てて研究を行った。その結果、223のタンパク質がD-Argによって熱安定性（偽発見率、FDR <0.01）に影響を受けることが明らかになった（図1f、拡張データ図3b、補足表1および2）。185のタンパク質は熱安定性が低下し、38のタンパク質は熱安定性が上昇した： VC2161、VC1406、VC1313である。これらの化学受容体のどれかがD-Argに反応するかどうかをさらに調べるため、ΔbsrVバックグラウンドで個々のMCPノックアウト体を作製し、D-Argに対する走化性反応を調べた。驚くべきことに、Δvc2161株とΔvc1406株のD-Arg反応はコントロールと同等であったが、Δvc1313変異体はD-Argに反応しなかった。注目すべきことに、この変異体のD-Arg応答は、vc1313との遺伝的相補性によって完全に回復した（図1g）。また、ΔbsrV Δvc1313細胞はD-Lysにも反応しなかったことから（Extended Data Fig. さらにキャピラリーやマイクロ流体ベースのアッセイ29 で、より広い範囲のアミノ酸濃度を用いたところ、VC1313のD-Arg濃度に対する反発反応は0.01 mMから1 mMの範囲に絞られた（Extended Data Fig.） 興味深いことに、1 mMのD-ArgはΔbsrV Δvc1313細胞でわずかに正の走化性反応を示した。このことは、代替的な低親和性化学受容体がD-Argを誘引物質として感知していることを示唆している。したがって、このタンパク質をD-Arg（R）とD-Lys（K）を感知するMCPとしてMCPDRKと命名した。
MCPDRKを制御するRpoSシグマ因子
mcpDRK遺伝子座は、D-ArgとD-Lysを生産する広域スペクトルラセマーゼBsrVをコードするvc1312の近傍に局在している（Extended Data Fig.） V. choleraeのさまざまな公開RNAseqデータセットにおける発現プロファイルの解析から、これら2つの遺伝子は共制御されており、オペロンを形成している可能性が強く示唆された（Extended Data 図5b）。プロモーター・プローブ・プラスミドを用いると、vc1313（Pvc1313）の上流にプロモーター領域が見つかったが、vc1312には見つからなかった（Extended Data 図5c）。さらに、Pvc1313活性は定常期に増加し、同じ条件下でBsrVがRpoS依存的に誘導されることを示した以前の研究と一致した30 (Extended Data Fig. 5d)。
この結果を確認するため、V. choleraeの増殖期間中、スーパーフォールディンググリーン蛍光タンパク質（sfGFP-MCPDRK）で標識したMCPDRKの発現と局在をモニターすることにした。予想通り、定常期細胞を接種した培養では、ほぼ90％の細胞に極性MCPDRKの局在が見られた。この割合は、細胞が成長し始めると急速に低下し、指数関数的成長の開始時には病巣が検出されなくなった（図2a）。培養が停滞すると、極性病巣が再び出現し、開始時のレベルに達した。ウェスタンブロットにより、異なる光学密度におけるsfGFP-MCPDRK病巣とタンパク質レベルの間に直接的な相関があることがわかった（図2b）。このことは、コレラ菌におけるMCPDRKの発現が、実際に定常期に連動していることを示している。RpoSはグルコース飢餓時に高度に誘導されるので、V. コレラをグルコースとコハク酸の混合液で培養し、MCPDRKの発現と局在をモニターした。他の細菌と同様に、V. コレラ菌の細胞は異化抑制による二重成長をたどる。細胞はまずD-グルコースを消費し、その後しばらく休止した後、コハク酸を代謝して成長を再開する（図2c）。また、植え付け細胞から得られた定常期細胞は、基本的にすべての細胞で極性のsfGFP-MCPDRK病巣を示したが、成長が始まると消失した。興味深いことに、細胞がグルコース欠乏による最初の成長停止に入ると、病巣は急速に最大レベルまで増加した。細胞がコハク酸で成長を再開すると、病巣は60％程度まで減少し、コハク酸が消費されると再び増加した。これらの結果は、MCPDRKの誘導と極性局在化が、高集団密度よりもむしろ成長停止に反応することを示している。
図2：D-Arg産生と走化性反応はRpoSによって調整される。
a, 左：指数期と定常期における、本来の遺伝子座とプロモーターから発現したsfGFP-MCPDRKの局在。3つの独立した複製による代表的な顕微鏡写真を示す；各タイムポイントにつき少なくとも3枚の画像を取得した。スケールバーは2μm。右：細胞長に対するsfGFP-MCPDRKの蛍光強度の人口統計学的解析（n＞500細胞）。b, 下：sfGFP-MCPDRKの細胞内局在の成長段階依存性。灰色の塗りつぶし円は、結核菌で増殖したコレラのOD600；青色の開窓円は、sfGFP-MCPDRK極性病巣を有する細胞の割合。上：抗GFP特異的抗体を用いたsfGFP-MCPDRKに対するウェスタンブロット。c,0.04%w/vのD-グルコースと0.4%w/vのコハク酸を添加したMSR6最小培地で増殖したV.コレラの増殖曲線（灰色線）。また、sfGFP-MCPDRK病巣（青丸印）を持つ細胞の割合も示した。赤（グルコース枯渇）と紫（コハク酸枯渇）の矢印は炭素飢餓を示す。d,左：ΔrpoS変異体バックグラウンドにおけるsfGFP-MCPDRKの発現を示す顕微鏡写真。3つの独立した複製の代表的な顕微鏡写真を示す；各タイムポイントにつき少なくとも3つの画像を取得した：スケールバー、2μm。右：細胞長に対するsfGFP-MCPDRKの蛍光強度のデモグラフィック解析。e,ΔrpoS変異体のD-Argに対する走化性応答。黒い菱形は3つの独立した生物学的複製の平均を表す。エラーバーは生物学的に独立した3反復の平均±s.d.を表す。有意差(unpaired t-test)はP < 0.001で示した。 f, 各菌株によるDAA産生。有意差（unpaired t-test）はP < 0.01またはP < 0.001で示す。
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MCPDRKの発現がRpoSに依存していることを確認するため、sfGFP-MCPDRKレポーターをΔrpoS変異体バックグラウンドにクローニングした。ほとんどの細胞がフォーサイトを示した野生型定常期培養とは対照的に、ΔrpoS細胞はMCPの極性局在を示さなかった（図2d）。また、ΔrpoSは、ΔbsrV変異体およびΔmcpDRK変異体のD-Argに対するDAA産生およびタキシ応答の欠如をそれぞれ表現した（図2e,f）。これらの結果から、V. choleraeは、成長停止につながる栄養欠乏ストレスの際に、RpoS依存的なDAA産生とMCPDRKによるケモタクシス応答を同調的に示すことが示された。
MCPDRKは走化性システムII/F6の一部を形成している。
V. choleraeの化学感覚クラスターIII/F7タンパク質30と同様に、MCPDRKも定常期に極性病巣を形成し、その発現はRpoS依存性である。しかし、ドメインの長さと配列の保存性から、MCPDRKは化学受容体の40H（ヘプタッド）クラスに属する31。これらは細胞膜に結合し、極性に局在するMCPであり、化学走性システムII/F6を介してシグナルを伝達すると予測されている。MCPDRKシグナルを伝達する走化性システムを実験的に決定するために、I/F9、II/F6、III/F7走化性システムを完全に欠損させた変異体を作り、D-Argに対する反応を解析した。I/F9とIII/F7の欠失はいずれも、D-Argに対するコレラの負の走化性反応を減少させなかったことから、MCPDRKがII/F6化学感覚系に結合していることが強く示唆された（Extended Data Fig.） これらの変異体におけるMCPDRK化学受容体の局在を調べることで、さらなる証拠が得られた。MCPDRKの病巣は、化学走性クラスターIIのCheY3の病巣と重なり（拡張データ図6b）、II/F6では消失しているが、III/F7やI/F9変異体では消失していないことから、MCPDRKは化学走性系II/F6に属することが確認された（拡張データ図6c）。
MCPDRKの感覚モジュールの構造
MCPDRKは59.1 kDaのタンパク質（Uniprot: Q9KSE4）で、典型的な膜貫通ケモレセプタードメイン構造を持つと予測されている。MCPDRKは、感覚モジュールとして4HB_MCPタンパク質ファミリー（Pfam PF12729）に属すると予測されるリガンド結合ドメイン（LBD）、膜貫通HAMPドメイン（Pfam PF00672）、出力モジュールとして細胞質MCPシグナルドメイン（Pfam PF00015）を含む（図3a）。MCPDRKによるリガンド認識の分子メカニズムを解明するために、我々はMCPDRKのLBDドメイン（20 kDa）を、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）の最終段階の前に切断されたグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）タグで精製した。この精製LBDは、多角度レーザー光散乱法（SEC-MALS、補足図2参照）によって決定されたように、D-Argリガンドの非存在下でも存在下でも、溶液中で単量体であった。我々はMCPDRKのLBDとD-ArgまたはD-Lysとの複合体の2つのX線結晶構造を1.8Åの分解能で決定した（PDB 8BSAと8BSB、補足表3）。この結晶は空間群P1に属し、2つのLBD分子が非対称ユニットに頭から尻尾まで配列していた。片方のサブユニットの膜近位サブドメインはもう片方のサブユニットの膜遠位サブドメインと対になっているため、結晶中のこの構造は生理学的に適切なアセンブリーである可能性は極めて低い。非対称ユニットのモノマーは実質的に同一であり、両方ともリガンド結合していたので、ここではそれぞれの構造のA鎖のみを示し、議論する。最終的な構造モデルは、D-Arg結合構造では32-187残基、D-Lys結合構造では32-189残基に対応する。
図3：D-ArgとD-Lysを結合するMCPDRK化学受容体の構造基盤。
a, alphafold40,41,42によって作成されたMCPDRKタンパク質のドメイン構造。N末端を青、C末端を赤として、1つのサブユニットを虹色で示す。全長のMCPDRK膜貫通型化学受容体には、リガンド結合ドメイン（LBD）、膜貫通ドメイン（TM）、シグナル伝達ドメインが含まれる。 b, D-Arg（紫色の球）またはD-Lys（オレンジ色の球）と結合したMCPDRK-LBDモノマーを、N末端（青）からC末端（赤）まで虹色に着色した。c, D-Arg（紫）とD-Lys（オレンジ）で結晶化したMCPDRKのLBDドメインとE. 大腸菌由来のアスパラギン酸結合Tar受容体（PDB ID: 4z9i、緑色）81、C. testosterone由来のクエン酸結合MCP2201化学受容体（PDB ID: 5XUB、青色）34、P. putida由来のキネート結合PcaY_PP化学受容体（PDB ID: 6S38、黄色）35。d, D-Argと結合したMCPDRK-LBDの結合部位（紫色） e, D-Lysと結合したMCPDRK-LBDの結合部位（オレンジ色） f, Asn43、Asp47、Thr48、Thr105、W107、Glu111、Asn176残基をアラニンに置換することにより、D-Arg結合ポケットの機能解析を行った。次に、D-Argに対する走化性反応を、野生型または変異型MCPDRKをネイティブプロモーター下で発現するΔmcpDKR細胞について解析した。ΔbsrV株をバックグラウンドとして用いた。-は相補的でないΔmcpDRK。黒い菱形は3つの独立した生物学的複製の平均を表す。有意差（対応のないt検定）はP < 0.05またはP < 0.01で示す。
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全体として、MCPDRK-LBDは反平行4-αヘリックスバンドル構造（4HB）を形成している（図3b）。このフォールドは、L-アミノ酸に反応するコレラ菌の他の化学受容体（Mlp24, Mlp37）に見られるdCACHE LBDタイプのフォールドとは異なるが（参考文献11,12）、他のグラム陰性菌の様々なLBDに見られる。DALIサーバーによる構造ベースの相同性検索33では、MCPDRK-LBDはComamonas testosteroneのクエン酸結合性化学受容体MCP2201（PDB ID: 5XUB、RMSD 1.7Å）に構造的に最も類似していることが示された（ref. 34）や、Pseudomonas putida 由来のよりプロミスキャスなPcaY_PPケモレセプター（PDB ID: 6S38、RMSD 2.1Å）（参考文献35）だけでなく、大腸菌由来のよく知られたアスパラギン酸結合Tarレセプター（PDB ID: 4Z9I、RMSD 2.5Å）（参考文献36）とも類似性を示した。これらのLBDは全体的に同じようなフォールドを共有しているが、リガンド結合部位は全く異なる場所にある（図3c）。例えば、モデルレセプターであるTarとTsrは、負の協同性をもって二量体界面でリガンドと結合する37,38,39が、MCPDRKはD-ArgとD-Lysを中心に結合し、単量体のままである（図3cと補足図3）。MCPDRKに関しては、C. testosterone由来の化学受容体MCP2201もリガンドを一本のタンパク質鎖に結合するが、その位置は異なる（図3c）34。
MCPDRK-LBD構造では、D-ArgとD-Lysの両方が同じ部位、2番目と3番目のヘリックスの下部に結合する（図3b）。リガンドと結合するために、Asp47は両方のDAAの正電荷を帯びたα-アミン基とイオン結合を形成する。さらに、Glu111とAsp47は、D-Argのグアニジノ基の非局在化した正電荷と相互作用する。同様に、D-Lysの正電荷を帯びた側鎖アミンは、Glu111と塩橋を形成する。リガンドは、すべてのらせんの残基、すなわちAsn43、Thr48、Thr105、Glu111、Asn176との水素結合によってさらに安定化される（図3d,e）。ヘリックス2と3の間の短いループにあるTrp107は、結合部位を閉鎖する蓋を形成し、リガンドとスタッキング相互作用を持つ。
リガンド特異性の正確なメカニズムをさらに明らかにするために、結晶構造に従ってリガンドと相互作用する各アミノ酸残基をアラニンに置換した7つの変異体を作製した（N43A, D47A, T48A, T105A, W107A, E111A, N176A）。これらの変異対立遺伝子を、ΔmcpDRK株のlacZ遺伝子座を中断するmcpDRKネイティブプロモーターの制御下に導入することにより、相補アッセイを行った。走化性アッセイでは、V. choleraeのD-Argに対する反発反応を促進するために、試験した7つのMCPDRK-LBD残基のうち5つ（N43、T48、W107、E111、N176）が必須であることが示された（図3f）。D-Argを介したタキシングはN43AとT105Aの変異では影響を受けなかったことから、これらの残基がD-ArgとD-Lysの安定化に果たす役割はそれほど重要ではないことが示唆された。これらのin vivoアッセイによって、結晶構造で見つかったリガンド結合部位の位置が確認された。
MCPDRKの保存性
MCPDRKの保存性を解析するため、配列の類似性に基づいて系統樹を作成した（図4a）。その結果、このケモレセプターは、水生環境に多く生息する極性鞭毛細菌として知られるガンマ-プロテオバクテリア目Aeromonadales、Alteromonadales、Vibrionalesに広く保存されていることがわかった。MCPDRK様タンパク質は、BsrVラセマーゼとの相同性の割合とゲノム上の関連性に基づいて、3つのグループに分類された（Extended Data Fig.7）。タンパク質の同一性が最も高い（50％以上）MCPDRKオルソログは、BsrV様ラセマーゼ（例えば、多くのビブリオ属やモリテラ属）と共にクラスター形成しており、D-アミノ酸産生と走化性認識の共進化が示唆される。これらのオルソログでは、D-Arg/D-Lys結合部位残基は完全に保存されているか、微妙な変化しかない（例えば、V. metschnikovii、V. cincinnatiensis、V. anguillarum；拡張データ図7参照）。MCPDRKオルソログの同一性がやや低い（48-51%）種（例えば、AeromonasとAliivibrio）は1つのクレードを形成しており、典型的には2つの重要な結合部位残基で大幅な変化を示している： 47位のD>Sはリガンドとの塩橋が失われ、107位のW>Gはリガンドとのスタッキング相互作用がなくなる。驚くべきことに、これらの種では、BsrV様ラセマーゼは化学受容体とオペロンを形成せず、ゲノムの別の場所にコードされている。最後に、同一性の低い（45％未満）MCPDRKホモログをコードする種（例えば、V. owensii）には、D-Arg/D-Lys結合残基もBsrV様遺伝子座も存在しない。
図4：MCPDRKの特異性と保存性。
a,MCPDRKオルソログのツリー。クラドグラムはMCPDRKの配列相同性に基づいて構築された。b, 左：MCPDRKオルソログの代表の選択とD-Arg結合残基の保存。参照タンパク質（VC1313、すなわちV. cholerae El Tor株N16961由来のMCPDRK、枠で囲んだ）と異なる残基のみにラベルを付けた。色の丸はアミノ酸の種類を示す（N, アスパラギン; D, アスパラギン酸; T, スレオニン; W, トリプトファン; E, グルタミン酸; S, セリン; A, アラニン; G, グリシン）。右：いくつかの種における化学受容体の遺伝的背景。MCPとラセマーゼの両方が強調表示されている。c, D-Argに対するMCPDRKオルソログタンパク質の走化性応答。D-Argに対する走化性応答は、mcpDKRネイティブプロモーター下で発現させたいくつかのオルソログMCPで相補化したΔmcpDKR細胞で試験した。ΔbsrV株をバックグラウンドとして用いた。-VC, V. cholerae; VV, V. vulnificus; VPA, V. parahaemolyticus; VFU, V. furnissii; VA, V. anguillarum; AF, Aliivibrio fischeri; AH, Aeromonas hydrophyla; VO, V. owensii。黒菱形は独立した4生物学的複製の平均値。有意差（対応のないt検定）はP < 0.01で示す。
出典データ
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MCPDRK chemoreceptorの種を超えた機能的分岐の可能性を評価するために、系統樹の構築に用いた代表的ゲノムのプールから3つのオルソログを選択した。これらはV. anguillarum VAA_1440とV. parahaemolyticus VPA_1000で、BsrV様ラセマーゼとクラスターを形成し、保存された結合部位を示した。また、ラセマーゼとオペロンを形成せず、部分的に保存された結合部位を持つA. fischeri VF_A1069も選択した（図4b）。alphafold40,41,42で作成したモデルのLBDモデル解析から、VF_A1069結合部位の変化によるD-Arg安定化の欠陥が、標準的なもの（すなわちV. cholerae）と比較して予測された（補足図3）。これを調べるため、mcpDRKネイティブプロモーター下で発現させた選択したオルソログで相補したΔmcpDRK変異株のD-Argに対する反応をキャピラリーアッセイでモニターした。予想通り、VAA_1440（68.6%の同一性、100%の保存結合部位）とVPA_1000（65.7%の同一性、100%の保存結合部位）を発現させると、ΔmcpDRK変異株のD-Arg感知能力が回復することがわかった。VF_A1069（48.1%の同一性、71%の保存結合部位）の発現は、D-Argに対する走化性反応を補完しなかった（図4c）。おそらくこのオルソログは、D-Arg結合に必須であることが判明したD47とW107残基（補足図3）を保存していないからであろう（図3）。これらの結果から、D-ArgとD-Lysに特異的なMCPDRK様タンパク質は、bsr遺伝子座の近くにコードされていることが示唆された。
考察
細菌の走化性は何十年にもわたって研究されてきた。シグナル伝達成分は広く研究されてきたが、細菌が周囲の環境を感知するために用いる化学受容体の正体と特異性についてはあまり知られていない43。MCPと細菌の生活様式が密接に関連していることを考えると、これらの化学受容体は一般に数が多く特異的であり、多くのMCP-リガンド対が未解明であることが示唆される6。
我々は以前、多くの細菌が高濃度の様々なD-アミノ酸を環境中に放出していることを報告した。D-アミノ酸は、その化学的性質によって異なる生物学的機能を示す。例えば、定常期のV. コレラ菌細胞はD-Metを産生し、細胞壁の生合成を成長停止モードに適応させる一方17、D-Argを用いて近傍の競合菌の成長を阻害する15。D-Argは多くの生物種にとって致死的であるが、V. コレラの生理機能はこのD-アミノ酸の影響を受けないようである15。D-アミノ酸の産生が欠損した変異体を用いて、我々はD-Argがこれまで認識されていなかったMCPによって感知され、V. cholerae集団をストレス環境から遠ざけることを報告する。
V.コレラが産生するすべてのD-アミノ酸の中で、毒性のあるD-Arg（およびD-Lys）だけが負の走化性を誘導することは興味深い。このことは、D-Argが、潜在的な競争相手を排除すると同時に、より好都合なニッチに向かって群集を移動させることで、栄養が乏しいときの微生物群集の生物多様性と構造を形成する上で、多面的な役割を果たしていることを意味している。この「闘争と逃走」戦略のために、コレラはD-Argを感知するMCP（MCPDRK）と広域スペクトルラセマーゼ（BsrV）をコードする遺伝子を、ストレスシグマ因子RpoSによって発現が制御される1つのオペロンにまとめて配置するように進化した。D-Argの産生とMCPの産生を同期させることで、V. choleraeは効率的なストレス依存性応答を構築すると同時に、好ましい条件下での無駄な活性化を防いでいる（図5）。実際、MCPDRKが発現していない場合、D-Argは穏やかな走化性惹起を刺激するが、これはこのリガンドに対する親和性が低い他のMCPの存在を示唆している。実際、われわれのTPP実験では、VC2161（Mlp24）やVC1406など、D-Argによって安定性が影響を受けるMCP候補が同定された（図1f）。D-Argに対する走化性は、栄養学的な目的があるのかもしれない。この考えは、栄養価の低いある種の化合物が走化性誘引物質になりうるという大腸菌の結果44 や、異化D-アミノ酸デヒドロゲナーゼ酵素45 の存在によって支持されている。
図5：D-アミノ酸に対するMCPDRK依存的走化性応答のモデル。
ある種の環境ストレス（すなわち飢餓）下では、RpoS応答は広域ラセマーゼBsrVと、専用のD-Arg/D-Lys化学受容体MCPDRKの両方の発現を誘導する。BsrVが産生するD-アミノ酸（DAA）のうち、D-ArgとD-Lysは、コレラ菌や他のMCPDRKをコードする種が感知する警告シグナルとして際立っている。これらのD-アミノ酸に対する走化性化学反応により、これらの細菌群集は、より好ましいニッチを探索するために移動することができる。
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MCPDRKのLBDの結晶構造から、様々な受容体で保存されている典型的な逆平行4HB構造を持つことがわかった46。興味深いことに、この比較的単純なフォールドは、異なる結合部位を用いることで様々な基質を認識するように進化してきた。Tar、Tsr、PcaY_PP受容体の結合部位は二量体界面にあるが、MCPDRKとMCP2201は4HB内の中心にリガンドを結合する（図3c）。MCPDRKのD-Arg結合ポケットは2番目と3番目のヘリックスの下部にあり、このD-アミノ酸とD-Lysのような類似化合物を認識するのに必須な残基は5つしかない。4HBを含むモデルレセプター、すなわちTarやTsrとは対照的に、我々の精製したMCPDRK-LBDコンストラクトはリガンド存在下ではオリゴマー化しない。これはまたMCP2201とは対照的で、リガンドがモノマー内部に結合すると、LBDの二量体化を妨げる構造再配列が起こり、代わりに三量体化が促進される34。
興味深いことに、MCPDRKは3つのガンマ-プロテオバクテリア目の種の間で広く保存されているが、D-Arg/Lysに対する特異性は、BsrVのような広域スペクトルラセマーゼと転写的に結合するレセプターに進化的に限定されているようである。これらの種のいくつかはD-Arg毒性に耐性があり15、水生生息域に生息しているため、これらの種の1つが産生するD-Arg/D-Lysは、同じニッチに生息する多くの生物の走化性反応を同時に調整する可能性がある。逆に、Bsrのホモログを持たないか、ゲノム上の別の場所にBsrをコードしている種は、リガンド結合ドメインに変化を示し、D-Arg/D-Lysに対する走化性反応を無効にしている可能性が高い（図4および拡張データ図7）。これらの変化のいくつかは、結合部位の決定的な構造変化を意味するが（補足図3）、より微妙な変化は、代わりにD-Argと化学的に関連する代替シグナルを認識する可能性がある。実際、ヒトや動物のL-ホモアルギニン47、ある種の植物が産生するL-カナバニンやL-インドスピシン48など、複数のアルギニン類似体が天然に産生されることが知られている。興味深いことに、カナバニンは微生物のBsr酵素によってラセミ化されることから、アルギニンアナログのL-およびD-エナンチオマーの両方を自然環境で見つけることが可能であることが示唆されている49。今後の研究では、同じMCPに対する種間および領域間の競合シグナルが、走化性制御、ひいては複雑な多細菌環境における細菌のストレス応答能力にどのような影響を与えるかを調べる必要がある。
D-アミノ酸の走化性忌避シグナルとしての役割は、これまで報告されてきた定常期適応におけるこれらの分子の役割に加えられる。D-Argの暴走反応が有益な生態学的シナリオは、使用済みの環境を放棄することである。V.コレラは生活環の水生期と腸管期にバイオフィルムを形成することが知られている50。宿主環境では、RpoSに依存した走化性と運動性の活性化が粘膜脱出につながる。この反応は病原性遺伝子の発現低下と一致していることから、コレラ菌がライフサイクルの次の段階に進むための準備であると考えられている52。近年、バイオフィルムの解体に寄与するいくつかの分解タンパク質が報告されているが（例えばビブリオ25）、バイオフィルムの分散を促進するシグナルは依然として謎のままである。したがって、D-Argが持つ広域毒素と化学走性警告シグナルとしての二重の機能が、バイオフィルムの破壊と分散に関与しているのかどうかが、今後の興味深い課題である。この関連で最近、MCPDRK-BsrVオペロン（vc1313-1312）がバイオフィルム内リプレッソームの一部であり、これらの遺伝子の一部の構成的発現がバイオフィルム形成を阻害するという研究が報告された53。しかし、MCPDRKの欠損は、V. コレラの感染や播種における体力に影響を与えないことが報告されている54。D-Arg走化性が病原性や伝播に及ぼす影響についてはまだ研究が必要であるが、他の海洋非病原性細菌にこの化学受容体が広く存在することから、この反応は細菌がニッチな生息環境を評価する能力において、重要かつ見過ごされてきた側面である可能性が示唆される。
方法
細菌の増殖条件
菌株は補足表4にまとめた。V.コレラ菌はすべて、塩基配列が解読されたエル・トー臨床分離株N16961の派生株である55。
菌は標準的な実験室条件で増殖させた。培養菌は、抗生物質またはアミノ酸（下記参照）を添加したLBプレート（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、15％バクトアガー）上にストリークし、単一コロニーを選択し、トリプトン・ブロス（TB）（1％トリプトン、0.5％NaCl）中で30℃で一晩培養した。抗生物質は必要に応じて以下の濃度で添加した： 200μg ml-1 ストレプトマイシン（Sm, Duchefa Biochem, S0148）、100μg ml-1 カルベニシリン（Cb, Duchefa Biochem, C0109）、50μg ml-1 カナマイシン（Kn, Duchefa Biochem, K0126）。ソフトアガー・プレートには5 mMのアミノ酸（Sigma）を添加した。光学密度（OD）は、Ultrospec 7000 spectrophotometer（GE Healthcare）を用いてキュベットで測定した。最小培地での実験のために、V. コレラは、1 μg ml-1 チアミンを添加した M9 最小培地、または MSR6（50 mM KH2PO4、50 mM Na2HPO4、7.5 mM (NH4)2SO4、2 mM MgSO4、0.1 mM CaCl2、25 μM FeSO4、0.04% w/v D-グルコース、0.4% w/v コハク酸）のいずれかで増殖させた。
増殖曲線は、定常期培養をOD 0.04に標準化し、20μlを180μlの新鮮培地を含む96ウェルプレートへの接種に用いた。2回の独立した実験で、株と条件ごとに少なくとも3つの複製を接種した。光学濃度は、Eon Biotekプレートリーダー（Biotek社製）のBiotek Gen5 (v.08)を用い、30℃で5分間隔でモニターした。
変異体とプラスミドの構築
すべての変異体は、以前に記載された56のように、in vivo対立遺伝子交換によって作製された。簡単に言えば、1Kbのフランキング領域をXbaI消化したpCVD442にクローニングし、組換え自殺ベクターを作製した。コレラ菌に結合させるために、定常期のレシピエント株とSm10 λpir ドナー株を抗生物質で洗浄し、等しい比率で混合し、選択せずにLB上にスポットした。37℃で4-6時間培養後、細胞をCb/Sm添加LBプレートにストリークし、トランスコンジュガントを選択した。最後に、塩を含まない10%スクロースプレート上でカウンターセレクションラウンドを行い、細胞を硬化させた。染色体蛍光sfGFP-vc1313レポーターは、vc1313のインフレーム上流にsfGFPを直接挿入し、同様の方法で構築した。
使用したプラスミドとオリゴヌクレオチドをそれぞれ補足表5と6にまとめた。bsrVは、強いリボソーム結合部位（RBS）を含む適切なプライマーを用いてPCR増幅し、等温アセンブリーによって制限消化pXB300にクローニングし、プラスミドpbsrVを得た。同様に、リン酸化模倣型非ケモタクティック変異体の生成のために、cheY3を所望の置換（CheY3D16K、Y109K）を有するプライマーでPCR増幅し、その断片を制限消化pXB300に等温的にアセンブルしてpcheY3を生成した。プラスミドpbsrVとpcheY3をそれぞれΔbsrVとΔcheY3にエレクトロポレーションで導入した。
vc1313のペリプラスミドメイン（残基Ser32-Ser191）全体をコードするDNA断片（本明細書ではvc1313-LBDと呼ぶ）をPCR増幅し、BamHI/EcoRI消化した発現ベクターpGEX-6P-2に等温アセンブリーによりサブクローニングし、N末端のGSTコード配列をインフレームで融合させてpGEX-vc1313-LBDを得た。マルチクローニング領域の下流に位置する停止コドンを使用したため、得られたタンパク質はさらにC末端の12アミノ酸のアルギニンに富んだ尾部を含んでいた。
Δvc1313の相補化は、中性遺伝子座lacZに導入されたvc1313のネイティブプロモーターの制御下でvc1313のコピーを発現させることによって達成された。vc1313断片はPCR増幅され（プロモーター領域の上流500bpを含む）、V. cholerae lacZ57への対立遺伝子の挿入を可能にする自殺プラスミドである制限消化pJL1に等温アセンブルされた。組み込みの成功は、まず5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-d-ガラクトピラノシド（X-Gal、40μg ml-1、Sigma、B4252）を含むプレート上での青白いスクリーニングによって確認され、その後PCRによって確認された。vc1313遺伝子の部位特異的変異誘発は、pJL1::vc1313プラスミドを鋳型として、Q5部位特異的変異誘発プロトコル（NEB）に従って行った。
作製した全ての変異体およびプラスミドの忠実性はDNA配列決定により確認した。
ソフトアガー運動性アッセイ
V.コレラ菌のシングルコロニーをLBブロス中、30℃で一晩振盪培養した後、新鮮なブロスで1:100に再培養し、指数期まで増殖させた。正常化した培養液2 μlを0.3%ソフトアガー・プレートにスポットし、室温で乾燥させた。指示された場合、プレートに5 mMのアミノ酸を補充した。接種後、プレートを30℃で8時間インキュベートし、LAS-3000イメージング・システム（Fuji）で画像化した。画像解析と処理はFiji/ImageJ58を用いて行い、結果はGraphPad Prism (v.8.0)を用いてプロットした。
D-アミノ酸の定量
総D-アミノ酸濃度は、前述14,15のように、96ウェルプレートフォーマットに適合させた比色D-アミノ酸オキシダーゼ（DAAO）アッセイによって測定した。簡単に説明すると、20μlのサンプルを60μlの反応バッファー（リン酸ナトリウムバッファー33mM、pH7.5、Trigonopsis variabilis DAAO（文献59）0.04mg ml-1、西洋ワサビペルオキシダーゼ0.04mg ml-1、o-フェニレンジアミン83ng ml-1、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）8.3ng ml-1）と混合し、37℃で1時間インキュベートした。160μlの2M HClを加えて反応を不活性化し、Eon Biotekプレートリーダー（Biotek社製）を用いて292nmで測定した。
キャピラリーアッセイ
化学走性能は、以前に記載されたキャピラリーアッセイ60を用い、若干の修正を加えて調べた。一晩培養したコレラ菌を新鮮なM9最小培地で1:200に希釈し、30℃で振盪しながら指数期後期まで培養した。細胞を低速遠心分離で回収し、運動性緩衝液（MB）（50 mM HEPES（pH 7.4）、300 mM NaCl、10 mM グルコース、5 mM MgCl2）で2回洗浄し、最後にMBで最終ODが0.1になるように再懸濁した。細胞の接着を避けるため、Tween20を最終濃度0.01%まで添加した。細胞を1時間r.t.でプレインキュベートした後、目的のアミノ酸（特に指定のない限り500μM）を含む1μlのマイクロキャピラリーチューブ（Sigma, P1421）を細胞懸濁液に接触させ、懸濁液をさらに2時間r.t.でインキュベートした。最後に、LB寒天培地に連続希釈液をプレーティングすることにより、各キャピラリー中の細菌数（コロニー形成単位/ml）を数え、コントロールキャピラリーに対する走化性比を算出した。
マイクロ流体による走化性実験
マイクロ流体チャンバーは既述の方法で作製した29。簡単に説明すると、マイクロ流体デバイスのSU8ベースのネガ型マスターモールドは、標準的なフォトリソグラフィ技術によって作製した。マイクロ流体デバイスは、ポリジメチルシロキサン（架橋剤／ベース比1：10、65℃で一晩熱硬化）を用いて鋳型から作製し、これを形状に合わせて切断し、酸素プラズマ処理によってスライドガラスに結合させた。製造後、デバイスは滅菌脱イオン水中で短期保存し、親水性を保持した。V.コレラ株は、グリセロールストックから30℃の結核菌槽で一晩培養し、10mlのM9培地で1:100に希釈し、30℃で4.5時間、ODが～0.3になるまで振盪培養した。その日の培養液を運動性緩衝液で3回洗浄し、最終ODが0.1になるまで希釈した。マイクロ流体デバイスは、小さな直線流路（長さ＝2 mm、幅＝1 mm、高さ＝70 µm）で連結された2つの大きなチャンバーで構成されている。OD=0.1の細胞懸濁液を一方のチャンバーに導入し、もう一方のチャンバーには指示量の試験化合物を添加したMBを満たした。その後、蒸発流を防ぐため、装置の入力部を顕微鏡用グリースで密閉した。連通流路には化合物の勾配が急速に形成された（～1時間）。その結果生じる細胞の走化性運動を、デバイスに負荷してから1時間後、2時間後、3時間後にチャンネルの中心で測定した。この目的のため、試料を位相差顕微鏡で倍率10倍（NA 0.3）で観察し、視野717 × 717 µm²（512 × 512 px²）のMikrotron Eosens 4CXP CMOSカメラを用い、毎秒200フレームの速度で10,000フレームの動画を記録した。同じ細胞懸濁液を用い、MBのみを第2チャンバーに入れたコン トロールも常に同時に行った。
遊泳速度実験
V.コレラ株は、グリセロールストックから30℃のTB（指示されていれば500μM D-Arg添加）中で一晩増殖させ、20mlのTB（指示されていれば＋500μM D-Arg）で1:200に希釈し、30℃で3時間、ODが～0.6になるまで振盪しながら増殖させた。その後、細胞を新鮮なTBで洗浄した。少量（3 µl）の細胞懸濁液を、顕微鏡用グリースで100-200 µm離した2枚のカバースリップの間に挟んだ。細胞の動きは、上述したのと同じ顕微鏡観察プロトコルを用いて、カバースリップ間の高さの中間で記録した。
遊泳速度と走化性バイアスの測定
泳動速度61と走化性ドリフト62をそれぞれ測定するため、ImageJ（https://github.com/croelmiyn/FourierImageAnalysis）のプラグインとして実装されている微分動的顕微鏡法（DDM）と位相差顕微鏡法（PhiDM）を用いて、動画をオフラインで解析した。DDMアルゴリズムは、画像の空間的なフーリエ成分の時間的な自己相関を計算し、それを、細胞の一部は非運動性で拡散しており、もう一部は運動性で、遊泳速度は平均値の周りにシュルツ分布していると仮定したモデルでフィッティングする。異なるフーリエ成分で一貫したフィットを行うことで、遊泳細胞の分率⸜と平均遊泳速度⸜が得られる。PhiDMでは、同じフーリエ成分の位相の時間シフトをフィッティングして、視野内の細胞の集団平均ドリフト速度を測定する。外部からの流れがない場合、非運動性細胞は平均してドリフトしないので、このドリフトは運動性細胞の走化性運動のみによるものである。従って、運動性細胞の走化性ドリフト速度は({v}_{mathrm{ch}}={v}_{d}/Phi})として計算された。走化性ドリフト速度は細胞の遊泳速度に比例すると予想されるので、走化性バイアスも計算した。
熱プロテオームプロファイリング
V.コレラ菌細胞をLB中37℃で一晩培養し、100倍希釈して新鮮なLB100mlに入れた。細胞を4,000×gで5分間ペレット化し、10mlのPBSで洗浄後、1.2mlの溶解バッファー（最終濃度： 50 μg ml-1 リゾチーム、250 U ml-1 ベンゾナーゼ、1 mM MgCl2 in PBS）。凍結融解（液体窒素中で凍結し、その後25℃で5分間、完全に融解するまで振盪する）を5サイクル繰り返して細胞を溶解した。その後、D-Argを4種類の濃度（0、0.05、0.4、3.2mM）で加え、20μlをPCRプレートに分注し、直ちにPCR装置（Agilent SureCycler 8800）で3分間の温度勾配を行い、その後室温で3分間行った。その後、NP40を最終濃度0.8%になるように全条件に添加した。その後、プレートを2,000×gで5分間遠心して細胞残屑を除去し、上清を0.45μmの96ウェルフィルタープレート（ミリポア、MSHVN4550）を通して500×gで5分間濾過し、タンパク質の凝集物を除去した。フロースルーを2×サンプルバッファー（180 mM Tris (pH 6.8)、4% SDS、20%グリセロール、0.1 gブロモフェノールブルー）と1:1で混合し、分析まで-20℃で保存した。その後、質量分析ベースのプロテオミクス（タンデムマスタグを使用）を用いて、既述のように各条件におけるタンパク質量を定量した63。データは、タンパク質の熱安定性の用量依存的変化を検出する方法で解析した27。
ウェスタンブロッティングによるvc1313の存在判定
コレラ菌sfGFP-vc1313の一晩培養を、新鮮なLB最小培地に1:100で希釈し、37℃で振盪培養した。OD600を測定し、時間の関数としてサンプルを採取した。その後、サンプルを総タンパク質量に正規化し、SDS-PAGEで分析した。GFPタグに対する特異的抗体（1:500, Thermo Fisher, A-11122）を用いてウェスタンブロッティングを行った。GFPシグナルはAmersham Imager 600 (GE)を用いて検出し、Fiji/ImageJ (v.1.53f51) (ref.58)を用いて解析した。
タイムラプス顕微鏡
細菌細胞を顕微鏡スライド上のアガロースパッド（1% agarose w/v, 20% v/v PBS and 20% v/v LB）に固定化した。位相差顕微鏡観察は、Plan-Apochromat ×63位相差対物レンズとORCA-Flash 4.0 LTデジタルCMOSカメラ（浜松ホトニクス）を装備したZeiss Axio Imager.Z2顕微鏡（Zeiss社製）を用い、Zeiss Zen 2 Blue edition（v2.0.0.0）ソフトウェアを用いて行った。画像解析と処理は、Fiji/ImageJ（v.1.53）（ref.58）とMicrobeJプラグイン（v.5.13）（ref.64）を用いて行った。
増殖中のsfGFP-MCPDRKの詳細な局在を追跡するために、細胞を50 mlのTB培地に添加し、光学密度を測定することで増殖を追跡した。各データポイントについて、サンプルを蛍光顕微鏡で分析し、sfGFP-MCPDRK病巣を持つ細胞の割合を数えた。炭素異化抑制アッセイでは、0.04% w/v D-グルコースと0.4% w/v コハク酸を添加したMSR6培地で細胞を増殖させ、同様の手順を踏んだ。
顕微鏡データの人口統計学的解析
人口統計学的解析はいくつかのステップで行った。sfGFP-VC1313細胞の蛍光強度プロファイルは、まずFiji/ImageJ（v.1.53f51）（参考文献58）を用いて測定した。次に、RStudio（v.1.4.1106; www.rstudio.com）のcellProfilesパッケージ（v.3.0.1; Todd Cameronによって開発された）を用いて、生成されたデータを処理し、細胞を長さでソートし、生成された強度プロファイルを各細胞の蛍光の平均として正規化した。最後に、ggplot2パッケージを用いて、人口統計学的プロット（v.3.3.5）を行った（文献65）。
MCPDRK-LBDの発現と精製
pGEX-vc1313-LBDを持つ大腸菌BL21 (DE3) (Novagen)を、50μg ml-1カルベニシリンを含むTerrific Broth (24 g l-1 酵母エキス、20 g l-1 トリプトン、4 ml l-1 グリセロール、0.017 M KH2PO4, 0.072 M K2HPO4)中で細胞密度がOD600〜1になるまで30℃で培養した。その後、イソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド（シグマ社、I6758）を最終濃度0.1 mMになるように加えてタンパク質発現を誘導し、培養を18℃でさらに16時間行った。細胞を遠心分離で回収し、1x PBS（140 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4、pH 7.3）に懸濁し、加圧セルホモジナイザー FC600（Julabo）を用いて破砕した後、70,000 × g、4℃で1時間遠心分離した。細胞残屑を除去した後、あらかじめPBSで平衡化したGlutathione Sepharose 4B樹脂（Cytiva）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、可溶性画分からVC1313-LBDを精製した。切断バッファー（50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM ジチオスレイトール（pH 7））で3回洗浄した後、GST-VC1313を10 mM 還元グルタチオンを含む50 mM Tris-HCl（pH8.0）バッファーで溶出した。開裂緩衝液を最終濃度1xになるように加え、PreScission Protease（Cytiva社製）を用いて、製造元の指示に従ってN末端GSTタグを開裂した（4℃で16時間）。得られたサンプルを、Slide-A-Lyzer透析カセット（7K MWCO、ThermoFisher,66370）を用いて、2lの透析バッファー（50mM Tris-HCl（pH 7.0）、150mM NaCl、1mM ジチオスレイトール、1mM EDTA）中、4℃で16時間透析した。その後、タンパク質混合物をGlutathione Sepharose 4B樹脂とインキュベートし、切断されたGST、PreScissionプロテアーゼ、残りのGSTタグ付きVC1313を除去した。フロースルーを10 mM Tris-HClと150 mM NaCl (pH7.4)中のSuperdex 200 Increase 10/300 GLカラム（Cytiva）にロードした。MCPDRK-LBDの純度はSDS-PAGEで分析した。
結晶化と構造決定
精製したMCPDRK-LBDを10 mM Trisと150 mM NaCl (pH7.4)で平衡化したSuperdex 200 Increase 10/300 GL (Cytiva)にロードした。タンパク質ピーク画分を10 kDaカットオフAmicon Ultra遠心フィルター（Merck-Millipore）で20-30 mg ml-1に濃縮した。
滴下前に、13 mg ml-1 MCPDRK-LBDを10 mM D-アルギニンまたは10 mM D-リジンと混合した。タンパク質とリガンドの混合物をリザーバー溶液と3:1の割合で混合した。結晶はすべて、0.1Mトリス（塩基）ビシン（pH8.6-8.8）、17-21％v/vポリ（エチレングリコール）メチルエーテル500（PEG 500 MME）、8-10％w/v PEG 20000を含む条件下で、20℃で静置滴下蒸気拡散法により成長させた。結晶を液体窒素中で瞬間凍結する前に、PEG濃度を23% v/v PEG 500 MMEと12% w/v PEG 20000に上げた。
異なる結晶のX線回折データは、フランスのグルノーブルにあるEuropean Synchrotron Radiation FacilityのビームラインID30BとID23-2で収集した66。データはXDS67を用いて処理した。D-リジンとD-アルギニンの結晶は両方ともP1空間群に属し、非対称単位に2分子を含んでいた。D-アルギニンに結合したMCPDRK-LBDの結晶学的位相問題は、Arcimboldo68によって14残基からなる8つのらせんを探索モデルとして用いて解かれた。D-リジンに結合したMCPDRK-LBDの構造は、分子置換モデルとしてMCPDRK-LBD:D-Arg構造を用いてPHASER69によって解かれた。モデルの構築にはCoot (0.9.5) (ref. 70)を使用し、Refmac5 (v.5.8.0267) (ref. 71)とPHENIX refine (v.1.13) (ref. 72)を用いて構造を精密化した。完全なデータ収集と精緻化の統計については、補足表3を参照。MCPDRK-LBD構造の最終モデルはMolProbity73を用いて検証した。MCPDRK-LBD結晶構造（D-ArgまたはD-Lysとの複合体）の原子座標と構造因子はProtein Data Bankに寄託されている（それぞれPDBコード8BSAと8BSB）。
系統解析
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、National Center for Biotechnology Information (NCBI)74およびBiocycデータベース75から入手した。MCPDRKのホモログは、非冗長タンパク質データベースに対してBlastPアルゴリズム76を用い、E値の閾値を10-10とし、V. cholerae VC1313を参照配列として同定した。MUSCLEアルゴリズム77を用いて多重配列アライメントを作成した。得られたアライメントは、90％の冗長性を除去することでフィルタリングされ、ユニークな代表種がさらなる解析のために選択された。Jalview（v.2.11.2.0）ツールキット78を使用して、すべてのアラインメントを視覚化し、関心のある残基の保存性を分析した。系統樹はClustalW2 (ref. 79)を用いて作成し、Interactive Tree of Life (iTOL, v.5) (ref. 80)を用いて系統樹をさらにカスタマイズし、追加情報を加えた。遺伝的背景の解析は、選択された代表者の上流／下流領域を比較することで行った。
報告概要
研究デザインに関する詳しい情報は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryに掲載されている。
データの利用可能性
質量分析プロテオミクスデータは、PRIDEパートナーリポジトリを通じてProteomeXchange Consortiumにデータセット識別子PXD038312で寄託されている。
MCPDRK-LBD結晶構造（D-Arg (PDB: 8BSA)およびD-Lys (PDB:8BSB)との複合体）の原子座標と構造因子はProtein Data Bankに寄託されている。ソースデータは本論文に掲載されている。
参考文献
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参考文献のダウンロード
謝辞
菌株とプラスミド構築に協力してくれたE. Bouvet、洞察に満ちた議論をしてくれたA. Espaillat、サポートとフィードバックをしてくれたCava研究室の全メンバーに感謝する。また、UCEM-NMIのSEM施設、特にN. Leeの技術サポートと指導に感謝する。Cava labの研究は、Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0184, F.C.)、Laboratory of Molecular Infection Medicine Sweden (MIMS)、Kempestiftelserna、Swedish Research Council (2018-02823 and 2018-05882, F.C.)の助成を受けている。Berntsson研究室の研究は、スウェーデン研究評議会（2016-03599、R.P.-A.B.）、Knut and Alice Wallenberg財団、Kempestiftelserna（SMK-1869、R.P.-A.B.）から助成を受けている。R.C.とV.S.はMax Planck Societyの支援を受けた。R.C.はDeutsche Forschungsgemeinschaft（CO 1813/2-1、R.C.）の支援に感謝する。
資金提供
ウメオ大学によるオープンアクセス資金提供。
著者情報
著者および所属
スウェーデン分子感染医学研究所（MIMS）、ウメオ微生物研究センター（UCMR）、生命科学研究所（SciLifeLab）、ウメオ大学分子生物学科、ウメオ、スウェーデン
オイハネ・イラゾキ、ラウラ・アルバレス、フェリペ・カバ
スウェーデン、ウメオ大学、医化学・生物物理学科
ヨージー・ター・ビーク & ロニー・P.-A. ベルントソン
ウメオ大学ワレンベルグ分子医学センター／スウェーデン・ウメオ
ヨージー・ター・ビーク＆ロニー・P.-A. ベルントソン
ドイツ、ハイデルベルク、ヨーロッパ分子生物学研究所、ゲノム生物学ユニット
アンドレ・マテウス、アタナシオス・タイパス、ミハイル・M・サヴィツキー
マックス・プランク陸上微生物学研究所、合成微生物学センター（SYNMIKRO）、マールブルク、ドイツ
レミー・コラン & ヴィクトル・スールジク
貢献
O.I.とF.C.は本研究を発案した。O.I.、J.t.B.、L.A.、A.M.およびR.C.は、A.T.、M.M.S.、V.S.、R.P.-A.B.およびF.C.の指導のもと、実験を計画・実施した。原稿はO.I.とF.C.が執筆し、全著者から意見を得た。
筆者
Felipe Cavaまで。
倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。
査読
査読情報
Nature Microbiology誌は、Tino Krell、Joseph Dillard、Jing Yanの査読に感謝する。
その他の情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
拡張データ
Extended Data 図1 運動性におけるD-アミノ酸の効果。
a,L-およびD-アミノ酸存在下での軟寒天培地におけるV. choleraeの運動性解析。灰色のバーは、5 mMのアミノ酸存在下および非存在下における、野生型（wt）と比較したBsrVノックアウト変異体の相対運動性を示す。生存率は、非補足培養を基準として、定常期後期の相対最大増殖率として計算した。c,V.コレラ菌のスポットアッセイ。細胞を定常期まで結核菌で培養し、連続希釈した後、5 mMのDAAを添加したLB寒天培地プレート上にスポットした。aおよびbのエラーバーは、生物学的に独立した6反復および3反復の平均値±SDを示す。有意差（一元配置分散分析、p値はBonferroni-Dunn法で多重比較補正）は****（p < 0.0001）で示した。
出典データ
Extended Data Fig. 2 V. cholerae野生株とΔbsrV株の走化性の比較。
a, ΔbsrV変異株の走化性。野生型(wt)とΔbsrV変異体細胞の挙動を比較するために、いくつかの既知の化学作用因子の存在下で走化性バイアスと遊泳速度の両方を分析した。走化性はマイクロ流体デバイスで測定され、運動性バッファー中の細胞で満たされたリザーバーから、運動性バッファー中の標記化合物100μMのみで満たされたリザーバーへの細胞の動きをモニターした。L-ArgはL-アルギニン、AiBuはα-アミノイソ酪酸、GABAはγ-アミノ酪酸、Succはコハク酸。各データ点は、与えられた実験（n = 4）の3時点の平均を表し、線は平均を表す。有意差（対応のないt 検定）は**（p < 0.001）で示され、与えられた菌株のブランクに対する相対値で評価された。細胞はTB（±500μM D-Arg）中で増殖させ、遊泳速度測定のために新鮮なTBに移した。c,D-Arg存在下および非存在下での非ケモタクティックV.コレラ菌細胞の運動性解析。5mMのD-Argを添加または非添加のソフトアガー・プレート上での相対運動性を野生型（wt）と比較した。ΔbsrV株とΔcheY3株はコントロールとして含まれる。cのエラーバーは生物学的に独立した3反復の平均値±SDを表す。有意差は*** (p < 0.001)。出典データを参照。
ソースデータ
Extended Data 図3 熱プロテオームプロファイリング。
a, 熱プロテオームプロファイリング（2D-TPP）実験設定の概略図。0、0.05、0.4、3.2 mM D-Argの4つの異なる条件をテストした。細胞抽出液を調製し、様々なD-Arg濃度で処理した(1)；サンプルを様々な温度に加熱した(2)；次に可溶性タンパク質画分を抽出し、質量分析で分析するために消化した(3)；最後に、各温度について、各リガンド濃度における残りの可溶性画分を未処理のコントロールと比較することにより、各タンパク質の熱安定性に対するリガンドの効果を評価した(4)。凡例は、ある温度とD-Arg濃度における、D-Arg無添加のコントロールに対する、log2変換したタンパク質存在量である。
Extended Data Fig. 4 V. cholerae vc1313変異体のArgに対する走化性。
a, V. choleraeにおけるD-ArgとD-Lysの走化性応答の比較。 b, V. cholerae ΔbsrVおよびΔbsrV Δvc1313二重変異体のL-およびD-Arg濃度増加に対する走化性応答。c,マイクロ流体デバイスで測定したV. コレラ菌ΔbsrVとΔbsrV Δvc1313の走化性偏向は、デバイス調製後1,2,3時間後に、500μMのD-Argを含む運動性培地、または運動性培地のみ（ブランクコントロール）を含むリザーバーに向かって変化した。d, D-Argに対する走化性バイアス（すなわち、細胞の遊泳速度v0に対する走化性ドリフト速度vchの比vch/v0、Methods参照）と(b)の実験の対応するコントロールとの差を、マイクロ流体デバイスの準備からの時間の関数として示したもの。 e, (b, c)の実験で測定された集団平均遊泳速度。c、d、eの各データポイントは、生物学的に独立したn = 6反復の平均とエラーバー±SEMを表す。有意差（対応のないt検定）は、ns（有意ではない）、（p<0.05）（p<0.01）または（p<0.001）で示す。ソースデータを参照。
ソースデータ
Extended Data 図5 MCPDRKの遺伝的背景とプロモーター転写活性。
a,vc1313の遺伝的背景。 b,307件のV. cholerae RNAseq実験におけるvc1313-vc1312および隣接遺伝子の相対発現。 c,野生型（wt）およびΔbsrV変異体バックグラウンドにおけるオペロンを形成する遺伝子（vc1313、vc1312、vc1311）の推定プロモーター領域の転写活性。β-ガラクトシダーゼアッセイは、LB中37℃で8時間培養したpCB192N-誘導体を持つ培養で行った。β-ガラクトシダーゼアッセイは、pCB192N-Pvc1313を導入した野生型（wt）およびΔbsrV変異体バックグラウンドの培養物を、LB中37℃で指示された時間増殖させて行った。β-ガラクトシダーゼ活性はミラー単位で測定。cとdのエラーバーは、生物学的に独立した3サンプルの平均値±SDを表す。
Extended Data Fig. 6 MCPDRKは走化性F6システムの一部を形成している。
a, 化学走性系変異体のD-Argに対する化学走性反応。ΔI/F9とΔIII/F7はD-Argに対して対照株と同様の応答を示した。ΔII/F6系変異体では応答は観察されなかった。ΔbsrV株はバックグラウンドとして用いた。黒菱形は独立した3生物学的複製の平均を示す。b, 定常期におけるsfGFP-MCPDRKとCheY3-dTtomato（走化性II/F6系）蛍光レポーターの共局在化。すべての実験の代表顕微鏡写真を示す。bとcには3つの独立した複製の代表顕微鏡写真を示し、各条件につき少なくとも3枚の画像を取得した：スケールバー、2μm。
出典データ
Extended Data 図7 MCPDRKオルソログのツリー。
クラドグラムはMCPDRKの配列相同性に基づいて構築された。代表的な生物種と菌株はBiocycデータベースからダウンロードした。大腸菌Tarケモレセプターは、ツリーの根付きを良くするために、非関連種を含めた（薄い灰色）。最初の列では、Bsrオルソログの存在を完全な円（存在）と空の円（不在）で表している。ラセマーゼと一緒にクラスター化したBsrオルソログの存在も、2番目の列で同様に表している。D-Arg結合に関与するLBD残基の保存性も示した（残基アラインメント）。棒グラフは完全なタンパク質の同一性パーセンテージ(%)を表す。細菌はBsrとMCPDRKオルソログの有無によって3つの異なるグループ（クラスターI、II、III）に分類された。
補足情報
補足情報
補足図1-3、方法とソースデータ。
報告概要
補足表1-6
補足表1. 熱タンパク質プロファイリング結果。完全な熱タンパク質プロファイリングデータセットは、ProteomeXchange Consortiumの識別子PXD038312で入手可能。表2. 熱タンパク質プロファイリングの統計解析。表3. 結晶化データの収集と精密化の統計。表4. 菌株リスト。表5. プラスミドのリスト。表6. オリゴヌクレオチドのリスト。
ソースデータ
ソースデータ Fig.
統計的ソースデータ。
ソースデータ Fig.
図2bの未処理のウェスタンブロット。
出典データ Fig.
統計的ソースデータ。
ソースデータ Fig.
統計的ソースデータ。
ソースデータ Fig.
統計的ソースデータ。
ソースデータ 拡張データ 図1
統計的ソースデータ。
ソースデータ 拡張データ 図2
統計的ソースデータ。
ソースデータ拡張データ Fig.
統計的ソースデータ。
ソースデータ拡張データ Fig.
統計ソースデータ
権利と許可
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伊良曾岐、O., ter Beek, J., Alvarez, L. et al. Vibrio choleraeにおけるD-アミノ酸シグナルは、ストレス依存的な暴走反応である。Nat Microbiol (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01419-6
引用文献のダウンロード
2023年1月3日受領
受理2023年5月31日
2023年6月26日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41564-023-01419-6
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Nature Microbiology (Nat Microbiol) ISSN 2058-5276 (オンライン)
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