土壌接種とBlocker-Mediated Sequencingにより、抗菌剤T6SSのアグロバクテリアの腫瘍形成とガロビオームへの影響が示される
6 2023年3月
土壌接種とBlocker-Mediated Sequencingにより、抗菌剤T6SSのアグロバクテリアの腫瘍形成とガロビオームへの影響が示される
著者紹介 Si-Chong Wang https://orcid.org/0000-0002-6192-8844, Ai-Ping Chen, Shu-Jen Chou, Chih-Horng Kuo https://orcid.org/0000-0002-2857-0529 chk@gate.sinica.edu.tw, Erh-Min Lai https://orcid.org/0000-0003-3630-8683 emlai@gate.sinica.edu.twAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/mbio.00177-23
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ABSTRACT
イントロダクション
結果
ディスカション
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謝辞
フットノート
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参考文献
ABSTRACT
VI型分泌システム（T6SS）は、多くのプロテオバクテリアが、競合する細菌にエフェクタータンパク質を分泌して競争させたり、真核細胞に病原体を分泌させるために展開している。アグロバクテリアは、様々な植物種に冠状動脈瘤病を引き起こす土壌伝染性植物病原体のグループであり、試験管内および植物体内で近縁および遠縁の細菌種を攻撃するためにT6SSを展開している。しかし、T6SSが自然病害の発生やクラウンゴール内の微生物群集（ガロビオーム）に影響を与えるかどうかは、まだわかっていない。これら2つの重要な疑問を解決するため、我々は自然感染を模倣した傷ついたトマト苗への土壌接種法を確立し、細菌16S rRNA遺伝子アンプリコン濃縮配列決定プラットフォームを開発しました。アグロバクテリウム野生株C58と2種類のT6SS変異体を比較することで、T6SSが病気の発生とガロビオーム組成の両方に影響を及ぼすことを実証しました。季節をまたいだ複数回の接種試験に基づき、3株すべてが腫瘍を誘発したが、変異体は発病率が著しく低かった。ガロビオームの形成には、T6SSよりも接種の季節が重要な役割を果たした。T6SSの影響は夏場に顕著であり、この時期には変異株によって誘導されたガロビオームにおいて、2種のSphingomonadaceaeとBurkholderiaceaeが濃縮されていた。さらに、in vitroの競合試験とコロニー形成試験により、本研究でトマトの根圏から分離したSphingomonas sp. R1株に対するT6SSを介した拮抗作用が実証された。結論として、本研究は、アグロバクテリウムT6SSが感染プロセスにおいて腫瘍形成を促進し、胆汁性微生物相において競争上の優位性を提供することを実証している。
重要性 T6SSはプロテオバクテリアに広く存在し、土壌に生息するアグロバクテリアや、様々な植物に冠鱗病を引き起こす日和見菌病原体による細菌間競争に利用されている。現在のところ、アグロバクテリアを植物の創傷部位に直接接種した場合、T6SSはガールの形成に必要ないことが示されている。しかし、自然環境では、アグロバクテリアが植物の傷口にアクセスし、クラウンゴール内の微生物群集に影響を与えるためには、バルク土壌中の他の細菌と競合する必要があるかもしれない。このような病害生態の重要な側面におけるT6SSの役割は、これまでほとんど知られていませんでした。本研究では、これらの2つの重要な疑問を解決するために、ブロッカーを介した細菌16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスの濃縮と組み合わせた土壌接種法（SI-BBacSeqと命名）の開発に成功しました。その結果、T6SSが病気の発生を促進し、細菌間競争によってクラウンギャルの微生物相組成に影響を与えることを示す証拠を得ることができた。
はじめに
病原体や常在菌を含む多くのプロテオバクテリアは、タイプVI分泌システム（T6SS）を拮抗や病原性のために展開している（1、2）。T6SSは、主に接触依存的にエフェクターを標的細胞に注入するために用いられるタンパク質移動装置である。既知のエフェクターの行き先と生物学的機能（3）に基づき、T6SSは主に細菌が競合する細菌種を抑制または死滅させるために使用する抗菌兵器として機能し、これにより競争上の優位性をもたらし、生態的ニッチにおける微生物相を形成する（4）。
動物の腸や植物に関連するマイクロバイオームに関するこれまでの研究では、これらのコミュニティでT6SS遺伝子が濃縮されていることが示され、T6SSがニッチ競争に重要である可能性が示唆されています（5-8）。ヒトの腸内細菌叢のメタゲノム解析により、T6SSがin vitroおよびin vivoで微生物叢の他のメンバーを標的として腸内共生生物Bacteroides fragilisを支配する役割を果たすことが明らかになった（6、7）。最近の研究では、ネズミの病原体であるCitrobacter rodentiumと常在菌のEnterobacteriaceaeが、ネズミの消化管内でニッチ競争をするためにT6SSを利用し、同じ戦略を共有していることがさらに示された（9）。また、T6SSは、植物病原菌も植物体内での成長優位性を得るために利用し、有益な細菌も競合する病原菌による疾病症状を予防または軽減するために利用しています（10-12）。また、T6SS+菌種とT6SS-菌種の微生物相の比較メタゲノム解析も行われた。害虫を侵すことができる植物性有用細菌であるPseudomonas protegensに感染した害虫の腸内細菌叢を調べたところ、T6SSは門/クラスレベルの微生物叢の多様性に大きな影響を及ぼさないが、腸内細菌科の存在量には影響を与えることがわかった（13）。これらの研究から、T6SSは、侵入してきた病原体や常在菌が、それぞれの生態系ニッチで競争優位に立つために用いる強力な抗菌武器であることが示唆された。しかし、T6SSが微生物相を形成する程度や、複雑な微生物群集における細菌間競争の分子機構に関する知見は限られている。
アグロバクテリアは、いくつかの属のメンバーを含む多様な細菌群である(14)。これらの植物病原菌は、IV型分泌系（T4SS）を介して細菌から植物にトランスファーDNA（T-DNA）と名付けられたDNAの一部を移すことにより、植物にクラウンゴール病や毛状根病を誘発することができる（15）。もう一つの分泌系であるT6SSは、いくつかのアグロバクテリウム種で高度に保存されており、細菌間競争の役割を担っている(16-18)。これらのアグロバクテリウム種の中で、T6SSは、T6SSの主要な構成要素をコードするimpオペロンと、穿刺装置とエフェクターをコードするhcpオペロンからなる遺伝子クラスターによってコードされている（10、18、19）。一般にA. tumefaciensの仲間として知られているが、最近A. fabrumに再分類された(20)、主要なアグロバクテリウムの参照株C58を使い、in vitroおよびin plantaで競争的成長優位性を得るためにT6SS DNaseエフェクターを使うことを我々は以前に発見した(10). 興味深いことに、エフェクター-免疫（EI）ペアが適合しない農作物では、種間では強い拮抗作用を示すが、種内では弱いか検出できない程度の効果しかない（16）。さらに、T6SSを介した殺傷結果は、栄養が豊富な条件とは対照的に、栄養が不足している場合に高い結果が観察された（21）。このように、EIペア以外の遺伝的・環境的要因も細菌間競争に寄与している。
これまで、農業用細菌T6SSは、抗菌兵器としてしか実証されていない（16-18）。無菌状態で腫瘍アッセイを行った場合や、トマト植物を含む様々な植物種の茎に直接接種した場合、病原性を促進する役割を示す証拠はない（19）。アグロバクテリアがクラウンガールを引き起こすために植物の傷口にアクセスするためには、バルク土壌や根圏で他の細菌と競合する必要があることを考慮すると、アグロバクテリアT6SSはより自然な環境下で微生物群集や病原性に影響を与える可能性があると推論した。このような疑問を解決するため、我々は、季節を問わずトマトの傷口に自然感染を模倣する土壌接種プロトコルを開発し、農業用細菌T6SSが病気の発生やクラウンガールの微生物相（ガロビオームと呼ばれる）に与える影響を評価しました。さらに、植物関連微生物群の研究において宿主器官の干渉という課題を克服するため、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスにおいて真の細菌リードを濃縮するブロッカーを用いた方法を最適化しました。感染アッセイ、ガロビオーム組成解析、in vitro競合・コロニー形成アッセイの結果から、本研究は、農業用細菌T6SSが植物表面で競合優位性を発揮して効果的に感染し、より高い病害発生率につながる可能性を示しています。
研究成果
環境因子とT6SSがクラウンゴール病の発生率に影響する。
野生型（WT）株C58と、T6SS必須遺伝子ΔtssLおよびΔtssBを欠失させたC58由来の2つのT6SS変異体を用い、土壌接種法を用いて農薬T6SSの腫瘍形成への影響を検討した。本研究では、異なる季節にわたる9つのバッチの接種実験を実施した（表1）。WTで誘導された70個、ΔtssLで誘導された41個、ΔtssBで誘導された28個の合計139個のクラウンガールが採取された。その結果、3株とも腫瘍を誘導する能力があるが、ΔtssLとΔtssBの発病率はWTに比べて有意に低いことがわかった（表1、図1A）。また、異なる菌株によって誘導されたクラウンガールの間には、有意な重量差はなかった（Fig. 1B）。注目すべきは、年間を通じて3系統とも、季節をまたいで発病率と気温に逆相関があることである（図1CおよびD）。これらの結果は、機能的なT6SSの存在と接種月の両方が、土壌接種条件下での発病率に影響を与えることを示していた。
図1
図1 アグロバクテリアC58株およびそのT6SS-deficienct変異体の腫瘍形成アッセイ。各実験について、14～20本の傷ついたトマト苗を、試験した菌株（すなわち、C58 WT、ΔtssL、およびΔtssB）のいずれかを含む土壌で育て、接種後60日（dpi）に回収した。(A) 病気の発生率を株ごとにプロットし、接種月によって色分けした（薄黄色、6月；オレンジ色、7月；水色、10月；濃紺、11月）。線とエラーバーは、平均値±SDを示す。統計的有意性は、二元配置分散分析の後にTukeyの多重比較を用いて検定した；野生型とΔtssLおよびΔtssBをそれぞれ比較した場合、P = 0.025および0.027である。(B) 収集したガレの重量分布（詳細は表S5参照）。3系統間で有意差はない（P = 0.15, Kruskal-Wallis test）。(C) 病害発生率と日平均気温の相関図。(D) 土壌接種により発生した冠癭果；2018年11月15日に接種した場合の例。N、接種した植物の一部でガールが形成されなかった。
表1
表1 土壌接種による傷ついたトマト茎のクラウンゴール病の発生率
バッチ接種日（年/月/日）発病率（発病/全接種苗）aC58 WTΔtssLΔtssB12018/11/150.86 (12/14)0.86 (12/14)NDb22018/12/200.30 (6/20)0.45 (9/20)ND32019/06/100.10 (2/20)0.05 (1/20)0.05 (1/20)42019/07/040.35 (7/20)0. 35 (7/20)0.26 (5/19)52019/07/220.30 (6/20)0.00 (0/20)0.10 (2/20)62019/07/290.27 (4/15)0.27 (4/15)0.14 (2/14)72019/10/050. 35 (7/20)0.25 (5/20)0.30 (6/20)82019/10/300.50 (8/16)0.25 (4/16)0.38 (6/16)92020/11/110.94 (15/16)0.56 (9/16)0.50 (8/16)
a
二元配置分散分析とTukeyの多重比較検定により、ΔtssLとΔtssBの発病率は、Agrobacterium C58 WTの発病率より有意に低かった（それぞれP = 0.0225 と 0.0227,)．
b
ND, not determined.
補足資料
TABLE S5
収穫されたクラウンガールのメタデータ。表S5をダウンロード、DOCXファイル、0.03 MB。
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16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスのラウンドI：初期試験。
ガロビオーム組成を決定するため、季節を問わず同様の重さのクラウンガールを選択し、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスを行った。ラウンドIでは、WTによって3つ、ΔtssLによって3つ誘導された6つのクラウンゴールDNAサンプルを、2つの一般的に使用される16S rRNA遺伝子プライマーセット、V3からV4およびV5からV7で増幅した（補足資料の表S1A参照）。イルミナシーケンスでは、V3からV4およびV5からV7セットからそれぞれ140,830および601,299のリードが得られた。しかし、これらのリードの大部分（V3からV4では99.1%、V5からV7では93.6%）が植物の葉緑体およびミトコンドリア由来であった。これらの宿主のコンタミを除去した後、1,230と38,320の細菌リードだけが残った（表2）。
表2
表2 プロトコル試験のアンプリコンシーケンスラウンドIから非細菌性リードをフィルタリングする前と後の6つの腫瘍サンプルのリードカウントの総和
16S rRNA領域リード数非細菌リードの割合(%)フィルタリング前フィルタリング後V3-V4140、8301、23099.1V5-V7601、29938、32093.6
補足資料
TABLE S1
A. 本研究で使用した16S rRNA遺伝子プライマーセット B. 対応するブロッカー（C3スペーサー付き3′修飾オリゴヌクレオチド）。表S1、DOCXファイル、0.02 MBをダウンロードする。
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16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスのラウンドII：最適化。
ユニバーサル16S rRNA遺伝子プライマーを使用したラウンドIで観察された深刻な宿主汚染のため、トマト葉緑体およびミトコンドリアrRNA遺伝子の増幅を防止できるブロッカー（C3スペーサーを有する3′修飾オリゴヌクレオチド）を有する異なる16S rRNA遺伝子プライマーの性能を評価した（22〜24）。
細菌、トマト葉緑体、ミトコンドリアの16S rRNA遺伝子配列のアラインメント（図S1）に基づき、16S rRNA遺伝子の異なる可変領域に対するプライマーセットと同族ブロッカーを設計した（表S1AおよびB）。新しいプライマーセットとブロッカーは、ラウンドIの3つのWT誘導クラウンゴールDNAサンプルを用いてテストした。配列決定とデータ処理の結果、ブロッカーは宿主汚染を低減する効果が様々であることが示された（表3、図2A）。V3〜V4およびV5〜V7プライマーセットでは、ブロッカーを添加すると、バクテリアのリードが全リードの5.3〜41.5%に増加したが、ブロッカーなしのサンプルあたりバクテリアのリードはわずか0.2〜1.9%だった。V1～V3およびV6～V8プライマーセットでは、ブロッカーを添加すると、バクテリアのリードはサンプルあたりの総リードのわずか1.6～5.6%に増加しました。リードは、99%の配列同一性を持つ種レベルの運用分類単位（OTU）にグループ化された。OTUカウントに基づくアルファ希薄化曲線は、それらのクラウンギャル・サンプルについて、シーケンスの深さがサンプルあたり約10,000リードを超えたときに曲線が飽和に近づくことを示した（図2B）。ファミリーレベルでの細菌組成の棒グラフによると、ブロッカーを添加することで増幅された同じクラウンガールから同定されるファミリー数がより多くなることが観察された（図3A）。主座標分析（PCoA）の結果、ブロッカーを添加しても、推定される微生物相組成に大きな偏りは生じないことが示された（図3B）。しかし、異なるプライマーセットを使用した場合、推定される微生物相組成に有意な差が生じました（図3BおよびC）。これは、以前に報告されています（25）。
図2
図2 PCRブロッカーを使用した16S rRNA遺伝子増幅の最適化。C58野生型によって誘導された3つのクラウンゴール試料（21W、22W、25Wと命名）を解析に使用した。V1〜V3、V3〜V4、V5〜V7、V6〜V8は、16S rRNA遺伝子上の異なる可変領域を標的とする異なるプライマーペアを表す。(A）非細菌性OTUをフィルタリングした後の16rRNA遺伝子アンプリコンのOTU数である。(ns、統計的に有意ではない; *、P < 0.05, Student's t test). バーは、OTUの平均±SDを示す。(B）アンプリコンシーケンスラウンドIIからのデータセットに基づく、観察された細菌性OTUのアルファ希薄化曲線。X軸のサンプルサイズは、各データセットの異なるサブサンプリング深度を示す。
図3
図3 ブロッカーの有無にかかわらず増幅された異なるプライマーを使用した場合のガロビオーム組成。(A）C58野生型によって誘導された3つの冠胆汁サンプル（21W、22W、25W；詳細は表S6参照）を分析するための異なるプライマーセット（V1〜V3、V3〜V4、V5〜V7、およびV6〜V8）を示す。観察された上位10ファミリーを示す。-はブロッカーなしの増幅、＋はブロッカーありの増幅。(B〜D）データセットの細菌組成の原理座標分析（PCoA）プロットを重み付けUniFracマトリックスに基づいて作成し、（B）ブロッカー使用（P = 0.068, R2 = 0.026, ADONIS）、（C）異なるプライマーセット（P = 0.001, R2 = 0.524, ADONIS）、（D）異なるクラウンギャルのサンプル（P = 0.001, R2 = 0.238, ADONIS）でカラーコード化した。
表3
表3 WTアグロバクテリウムC58で誘導した3つのクラウンゴールDNAサンプル（W21、W22、W25と命名）から非細菌ASVをろ過する前と後の読み取り数
サンプルIDデータセットIDフィルタリング前のリード数フィルタリング後のリード数葉緑体およびミトコンドリアDNAP非ホストリードの割合（%）1115-21WT21-v1-3-B176，5449，9145，61115-22WT22-v1-3-B183，4755，6083 1115-25WT25-b1-3-B152，3872，4041. 61115-21WT21-v1-3-A185,1078530.51115-22WT22-v1-3-A247,2403790.21115-25WT25-v1-3-A178,9802200.11115-21WT21-v3-4-B239,24338,46216. 11115-22WT22-v3-4-B246,06319,2187.81115-25WT25-v3-4-B209,99111,1855.31115-21WT21-v3-4-A200,1859790. 51115-22WT22-v3-4-A205,9667960.41115-25WT25-v3-4-A193,3504260.21115-21WT21-v5-7-B129,42253,71541.51115-22WT22-v5-7-B140,01229,07820. 81115-25WT25-v5-7-B135,69218,05213.31115-21WT21-v5-7-A150,0152,7921.91115-22WT22-v5-7-A139,9741,5071. 11115-25WT25-v5-7-A133,0357860.61115-21WT21-v6-8-B92,1673,6914.01115-22WT22-v6-8-B92,0533,1973.51115-25WT25-v6-8-B82,3612,0772. 51115-21WT21-v6-8-A121,1451,6041.31115-22WT22-v6-8-A138,1861,2730.91115-25WT25-v6-8-A121,8207080.6 NC-v3-4-B1,01297996.7
補足資料
図 S1
選択した細菌株の16S rRNA遺伝子とトマトKnown-You 301の葉緑体およびミトコンドリアのDNA配列アライメント。Solanum lycopersicum（トマト）栽培品種Known-You 301の葉緑体およびミトコンドリアの16S rRNA遺伝子配列は、本研究で得られたものである。細菌の16S rRNA遺伝子配列はすべて、National Center of Biotechnology Information (NCBI) のReference Sequence (RefSeq) データベースからアクセスした。16S rRNA遺伝子の種、菌株名、アクセッション番号は、各配列の左側に記載されている。上記の配列は、MEGAXでClustalWマルチプルアライメントにより、ギャップオープニングペナルティを15.00、ギャップエクステンションペナルティを6.66（デフォルト）としてアライメントした。青色の斜線のレベルは、同一性の度合いを反映している。各プライマーとブロッカーの領域には下線が引かれている。赤、黒、黄、緑で強調した配列は、それぞれ16S rRNA遺伝子のV1〜V3、V3〜V4、V5〜V7、V6〜V8のプライマーセットのアニーリング領域である。トマトの葉緑体およびミトコンドリア16S rRNA遺伝子の灰色枠の配列は、同族プライマーのブロッカーである。図S1、PDFファイル、1.5 MBをダウンロードする。
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補足資料
TABLE S6
アンプリコンシーケンスラウンドIIIの解析に使用したCrown gallのメタデータ。表S6をダウンロード、DOCXファイル、0.02 MB。
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全体として、PCRステップでブロッカーを加えることで、細菌のリードカウントとガロビオームの解像度が向上した。V5からV7のプライマーと同種のブロッカーを使用することで、バクテリアのリード数と割合が最も高くなったため、WTおよびT6SS変異体が誘導したクラウンガールの16rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスにはブロッカー付きのV5からV7セットアップを選択しました。
16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスのラウンドIII：T6SSがガロビオームに与える影響。
採取した全139個のクラウンガールのうち、0.06～0.56gの範囲にある53個の腫瘍（WTで24個、ΔtssLで16個、ΔtssBで13個誘導）を解析に使用した。サンプルあたり平均69,980±26,452（平均±標準偏差[SD]）のリードが得られ、サンプルあたり9,814～116,072リードの範囲にあった。解析の前に、アンプリコン配列変異体（ASV）を種レベルのOTUにクラスタリングし、シングルトンを除去した。アルファ希薄化曲線とサンプルの最小リード数（図S2）に基づき、1サンプルあたり9,800リードでデータセットをサブサンプリングして多様性解析を実施した。PCoAの結果、WT株と2つのT6SS変異株によって誘導されたガロビオームに有意な差は見られなかった（図4A）。サンプル間のばらつきのほとんどは、季節の違い（7月と10月/11月）が寄与していた（図4B）。接種月に基づいてデータセットを分割して再分析した結果、7月にWT株と2種類のT6SS変異株に関連するガロビオームの違いが観察された（図4C）。一方、10月または11月に誘導されたガロビオームでは、差は検出されなかった（図4DおよびE）。
図4
図4 C58 WTおよびT6SS変異体によって誘導された53個のクラウンガールの細菌組成の主座標分析（PCoA）。プロットは、細菌群集の重み付けUniFracマトリックスに基づいて描かれた。(AおよびB）異なる株（C58 WT、ΔtssB、ΔtssL）（A）または異なる月に接種した（B）によって誘導された冠珠は、各パネルで異なる色でラベル付けしている。(C to E) データセットを接種月に基づいてさらに分割し、(C) 7月、(D) 10月、(E) 11月のガロビオームのPCoAプロットを示している。クラスタリングの統計的な違いはADONIS permutation testにより評価し、対応するPとR2値を示した。
補足資料
図 S2
シーケンシングラウンドIIIの53の胆汁サンプルのアンプリコンシーケンスに基づき、観測された細菌OTUのアルファ希薄化曲線。DADA2出力ASVを99%OTUにクラスタリングした後、希薄化曲線をプロットした。X軸のサンプルサイズは各データセットの異なるサブサンプリング深度を示し、Y軸はあるサブサンプリング深度の下で観測されたOTUの数を示す。各曲線のラベルは、メタデータのサンプルIDを示す。図S2をダウンロード（PDFファイル、0.7 MB）。
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観察されたOTUを含むα多様性指標、Shannon指数、Pielouの均等性指数は、WTとT6SS変異体に関連するガロビオームの間に大きな違いは見られなかった（図5A〜C）。興味深いことに、7月に発生したガロビオームでは、WTガロビオームはΔtssLガロビオームよりも有意に高いFaithの系統的多様性を示し、11月に発生したガロビオームではΔtssLガロビオームはWTガロビオームよりも高い多様性を示した（図5D）。また、ΔtssBに関連するガロビオームもWTガロビオームより高い多様性を示したが、その差は統計的に有意ではなかった。
図5
図5 C58 WTおよびT6SS変異体が異なる月に生成したクラウンガールのα多様性と組成。(A〜D）異なる月に発生した各サンプルの（A）観察OTU、（B）シャノン指数、（C）均等性、（D）フェイスの系統的多様性を示したもの。線とエラーバーは、平均値±SDを示す。二元配置分散分析とTukeyの多重比較検定を行い、アスタリスクは2系統間の統計的に有意な差（P < 0.05）を示している。(E) 53個のクラウンガールの細菌組成。各菌株について、接種月ごとに試料をグループ分けした。最も多く存在する上位10ファミリーをリストアップして色を変え、残りのものは "その他 "にまとめている。(F) 異なる月と菌株で接種したガールに含まれるリゾビ科の相対的存在量。(G)冠元重量におけるアグロバクテリアOTUの相対存在量の散布図である。カラスムギの重量とアグロバクテリウムC58の相対存在量の間に正の相関が認められた（Spearman r = 0.333, P = 0.01）。
クラウンガールの細菌組成にはばらつきがあったが、ガロビオーム中の上位10細菌科は非常に一貫していた。すなわち、Rhizobiaceae, Comamonadaceae, Chitinophagaceae, Methylophilaceae, Caulobacteraceae, Sphingomonadaceae, Microbacteriaceae, Xanthobacteraceae, Oxalobacteraceae, Pseudomonadaceaeである（図5E.） アグロバクテリウムが属するリゾビ科の細菌は、変動が激しく、全体の5〜85%を占めることがわかった。このRhizobiaceaeのデータセットで最も多いOTUは、C58の16S rRNA遺伝子と100％一致したことから、このOTUの多さは、クラウンガールのWTまたは変異体接種量の相対量に言及できる可能性がある。また、ガロビオーム中のこのOTUの相対存在量に対してクラウンガールの重量をプロットしたところ、7月のリゾビアの存在量は10月と11月のそれよりも劇的に低かった（図5F）が、系統間で有意差は認められなかった。さらに、クラウンガールの重量とこの農菌OTUの相対存在量との間に正の相関が認められた（図5G）。
7月にT6SS変異体が誘導したガロビオームでは、SphingomonadaceaeとBurkholderiaceaeがより豊富であった。
次に、7月にWTとT6SS変異体に関連するガロビオーム間で存在量に差（DA）がある種レベルのOTUとファミリーを分析した。スフィンゴモナド科に属する2つのOTU（ここではSphinOTU1とSphinOTU2と命名）およびBurkholderiaceaeファミリーが、T6SS変異体が誘導するガロビオームにおいて有意に濃縮されていた（図6A）。SphinOTU1は7月のみガロビオーム中に存在し、10月/11月には存在せず、SpinOTU2は7月と10月の両方に存在したが11月には存在しなかった（図6B）。7月にWTで誘導したガロビオームにはSpinOTU1もSpinOTU2も確認されなかった。7月にT6SS変異体が誘導したガロビオームではBurkholderiaceaeが濃縮されていたが、10月と11月には一貫した濃縮は見られなかった（図6C）。SphinOTU1とSphinOTU2は7月にT6SS変異体が誘導したガロビオームにのみ存在したが、ファミリーレベルでは、スフィンゴモナド科はどの月においてもT6SS依存的に濃縮されていなかった（図6C）。
図6
図6 7月のガロビオームに関するマイクロバイオーム組成の解析（ANCOM）。(A) OTUまたは細菌ファミリーの中心-対数比変換された存在量に基づいてANCOMボルケーノプロットを作成した。C58 WTおよびT6SS変異体によって誘導されたガロビオームの間で存在量の差（DA）を示す分類群を赤い矢印で示す。スフィンゴモナド科に属する2つのDA OTUはSphinOTU1およびSphinOTU2と命名された。(BおよびC)焦点となる分類群の相対的存在量。線とエラーバーは平均値±SDを示す。
アグロバクテリアとSphingomonas sp.分離株のT6SS依存的な拮抗関係。
ガロビオーム中の2つのスフィンゴモナスOTUのT6SS依存的な存在量の差から、C58がスフィンゴモナスに対してT6SS抗菌活性を示すかどうかを調べることにした。1回の土壌接種実験でトマトの根圏から分離されたSphingomonas sp.株R1を用いて、in plantaおよびin vitroでの菌間競争アッセイを行った。各農薬菌株をSphingomonas sp.R1と1：1の割合で混合し、接種菌として、傷ついたトマト苗に土壌接種を行った。それらの菌株のコロニー形成効率は、接種後10日目（dpi）に傷ついた茎葉から回収したCFUをカウントすることで判断した。その結果、Sphingomonas sp. R1をWTと共培養した場合、ΔtssLとΔtssB、またはR1のみを接種した場合と比較して、CFUが約0.5log減少していた（図7A）。また，アグロバクテリウムWTとT6SS変異体を単独またはSphingomonas sp. R1と一緒に接種した場合の回収CFUは，Sphingomonas sp. R1より1～1.5 log高かったが，アグロバクテリウムWTとT6SS変異体は単独またはSphingomonas sp. R1との接種では差がなかった．これらの結果から、アグロバクテリアはSphingomonas sp. R1よりも高い競争的コロニー形成効率を有しており、その一部はT6SSの機能に依存していることが示唆された。したがって、寒天平板を用いた細菌間競争アッセイでも、Sphingomonas sp. R1に対するT6SS依存的な抗菌活性が確認された（図7B）。しかし、寒天平板上でin vitroの菌間競争を行ったところ、1:1の比率では弱い抗菌活性しか認められなかったが、アグロバクテリアとSphingomonas sp. R1の比率を10:1にして競争を行ったところ、Sphingomonas sp. R1のCFUが〜0.5log減少することが検知された。この結果から、T6SSは、植物の創傷部位において、Sphingomonas sp. R1に対して、in vitroよりも高い競争優位性をアグロバクテリアに与えることがわかった。さらに、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンスに用いた土壌接種法により、T6SS変異体が誘導したクラウンガールに、WTが誘導したものと比較してSphingomonas sp. R1のCFU数が濃縮されているかどうかを評価しました。驚くべきことに、Sphingomonas sp. R1は28dpiの時点で常にクラウンガールに存在していたわけではなく、トマト茎にクラウンガールを直接誘導した3つの独立した実験のうち1つだけからR1が回収された（図S3）。C58の存在量は胆汁あたり104〜107CFUであり、WTとT6SS変異体の間で一貫した差は観察されなかった。これらの結果から、C58はSphingomonas sp. R1のin vitroでの増殖と植物のコロニー形成を阻害する抗菌活性を示すことが示唆された。T6SSは、アグロバクテリアが植物表面で他の競合する根粒菌に対して、効果的に感染するための競争力を獲得し、病気の発生率を高めることにつながると考えられる。
図7
図7 インビトロおよびトマト茎の創傷部位におけるアグロバクテリウムとSphingomonas sp. R1との競合。3つのアグロバクテリウム株（すなわち、C58 WT、ΔtssL、およびΔtssB）のそれぞれについて、トマトの根圏から分離したSphingomonas sp. R1に対する競合について個別に試験した。 (A) 10 dpiで傷ついた茎節の表面から、土壌中で1：1の比でアグロバクテリウムのみまたはSphingomonas sp. R1とコインフェクションしたものを回収し、アグロバクテリウム、Sphingomonas sp. R1 のCFUをプロットした。Sphingomonas属R1の単独接種またはT6SS変異体との共培養のCFUの違いを、WTと比較してt検定で示し、P値を表示した。データは、各菌株について5本の苗を接種した3回の独立実験の平均値±SDである。ANOVAテストでは、平均値の間に有意な差は認められなかった（アグロバクテリウムおよびスフィンゴモナス sp. R1 CFUについて、それぞれP = 0.0945および0.0551）。(B）アグロバクテリウムに基づくin vitroでの競争結果である。スフィンゴモナスR1の生存率をプロットした。線とエラーバーは、2つの独立した実験から得られた4つの生物学的複製の平均±SDを示す。ANOVAに続くTukeyの多重比較検定に基づき、C58 WTは、10:1の比率で混合した場合（P = 0.0153）、Sphingomonas sp. R1 CFUを有意に減少したが、1:1の比率では減少しなかった（P = 0.2753）。
補足資料
図 S3
28dpiにおける茎のトマト胆汁におけるアグロバクテリウムとSphingomonas sp. R1の競合。3種類のアグロバクテリウム株（すなわち、C58 WT、ΔtssL、およびΔtssB）とR1のそれぞれを1：1の割合で混合し、傷ついたトマトの茎に接種した。28dpiで胆汁を収穫し、プレーティングのためにホモジナイズした。アグロバクテリウム株とスフィンゴモナス属R1は、適切な抗生物質を含む523培地プレートで回収した。アグロバクテリウムのCFUデータは、各菌株について5本の苗を接種した3つの独立した実験/バッチの平均±SDである。R1はバッチ3ではガレからしか回収できなかった。各バッチのC58のCFU数に対するANOVAのP値は0.786、0.0023、0.230であり、R1のCFU数に対するANOVAのP値は0.6413である。第2バッチにおけるC58のCFU数の有意性は、ΔtssL単一接種グループのCFU数が低かったためであり、他の2バッチで再現することは不可能であった。図S3をダウンロード（PDFファイル、0.3 MB）。
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考察
本研究では、T6SSが農菌の発病やガロビオーム組成に影響を与えるかどうかを明らかにするために実験を計画した。土壌接種プラットフォームを確立し、季節をまたいで傷ついたトマト苗の発病率を評価することで、機能的なT6SSは発病率と正の相関があるが、胆汁重量とは相関がないことを明らかにした。さらに、宿主の汚染を防ぐブロッカーを利用して細菌の16S rRNA遺伝子を濃縮する効果的なプロトコルを開発することで、ガロビオーム組成を形成する主要因は季節や環境要因であり、T6SSはより特異的に微生物相に影響を与える可能性もあることを明らかにしました。
農園菌のT6SSは土壌接種では腫瘍形成を促進するが（表1、図1）、直接接種では促進しないという証拠（19）は、T6SSが病原性に直接関与していないことを示唆している。むしろ、アグロバクテリアは、根圏の比較的複雑な微生物群集（表S2）の存在下で、感染の発生を高めるために、この抗菌性武器を展開するのかもしれない（26）。いったんガールが誘導されると、WTとT6SS変異体の間で重量に有意な差が観察されなかったため、T6SSはガールの発生に必要ない（図1B）。機能的なT6SSの存在は、アグロバクテリアの集団サイズに影響を与えない。このことは、クラウンガールのトランスポゾン挿入配列決定（Tn-seq）スクリーニングによってT6SS遺伝子がフィットネス遺伝子として同定されなかったという最近の知見（27）とも一致する。また、C58のT6SSはガロビオーム組成を形成する重要な因子ではないようであり、農業細菌は胆汁中のニッチ競争において他の方法も用いている可能性が示唆された。一般に、クラウンガールを引き起こし、後に居住者となるアグロバクテリアは、アグロバクテリアのT-DNAを含む形質転換植物細胞によって合成された特異的オピンにアクセスする特権を持っていると考えられている（28）。このオピンの概念は実験的に検証されていないが、オピンを捕捉するアグロバクテリアの能力が、オピンを利用できない兄弟に対して競争上有利になりうることを示す研究によって支持されている(29)。したがって、T6SSがニッチ占有を相乗的に高める可能性のあるクラウンギャルの微生物相に、オピン合成やその他のフィットネス遺伝子が影響を与えるかどうかを調べることは、興味深いことである。
補足資料
TABLE S2
トマトの根圏から分離された細菌の同定。表S2、DOCXファイル、0.01 MBをダウンロードする。
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病気の発生率とクラウンギャルの重量が温度と逆相関するという知見（図1C）は予想通りである。初期の研究では、宿主植物に28〜30℃で接種した場合、クラウンガールのサイズが劇的に減少し、31℃以上ではガールの形成が見られないことが示された（30、31）。さらに、T4SS複合体とそれに関連するT-pilusは28℃よりも19℃の方が安定であるか、より高いレベルで生産されるが、T4SSを介したプラスミド結合は28℃で欠損する（32-36）。また、秋冬に接種した場合の腫瘍重量の増加は、農菌OTUの相対存在量の増加と相関しており（図5G）、クラウンゴール内の農菌集団が活発に増殖していることが示唆された。さらに、我々のデータは、夏に生産されたクラウンガールは、秋冬に生産されたものと比べて明確な微生物相を持つことを示し（図4B）、これは、ブドウのクラウンガールの微生物相が夏に有意に異なることを示したAllorhizobium vitisの先行研究（37）と共鳴する。興味深いことに、秋冬に接種したWTまたはT6SS変異体によって誘導されるガロビオームにグローバルな違いは見られないが、2つのSphingomonadaceae OTUとBurkholderiaceae科は、夏にT6SS変異体によって誘導されるガロビオームにのみ存在するか著しく豊富になることがわかった（図6）。生菌数をカウントすることにより、C58はin vitroおよび根圏でSphingomonas sp. R1に対してT6SSを介した抗菌活性を示すことが示されたが（図7AおよびB）、C58 WTまたはT6SS変異体を共培養したガロビームの間でR1存在量に有意差は見られなかった（図S3）。興味深いことに、これらのT6SS変異体のコロニー形成効率は、複合データセットからWTのそれと比較してより変化していることに気づいた（図S4）。このことから、WTのガロビオームとT6SS変異体のガロビオームにおいて、スフィンゴモナド科の2つのOTUとバークホルデリアが存在しない、あるいは存在量が減少したことが、T6SSが付与する抗菌活性に直接起因するかどうかはまだ明らかにされていない。しかし、現在のところ、アグロバクテリアはT6SSを利用して、土壌や根圏に存在する他の細菌種に対する抗菌活性によって競争上の優位性を獲得し、その結果、感染植物に腫瘍を誘発する成功率を高めることができると考えられています。
補足資料
図 S4
傷害を受けた茎のコロニー形成。土壌接種後に傷ついた茎の表面から回収したアグロバクテリウム株C58 WT、ΔtssL、ΔtssBのコロニーをプロットした。異なる記号は、コロニー形成アッセイの異なるバッチからの結果を示す。F検定は、ΔtssLおよびΔtssBの分散が、C58 WTと比較して有意に異なることを示す（p［F≦f］＝0.00028および1.77826E-05、それぞれ）。Brown-Forsythe and Welch ANOVAテストでは、平均値の間に有意な差は見られなかった（P = 0.4847）。線は中央値を示す。図S4、PDFファイル、0.2 MBをダウンロードする。
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アグロバクテリアが属するリゾビ科以外にも、土壌や水中でよく見られるコマツナ科や、シロイヌナズナの根の成長に重要であることが示された植物関連細菌Variovoraxのような細菌がクラウンガールの微生物相にかなりの割合を占めている（38、39）。また、病原菌や常在菌として植物との関わりが深いXanthobacteraceaeとPseudomonadaceaeに属する細菌も、クラウンガールに高い相対濃度で含まれていた。P.fluorescensやP.putidaなどのPseudomonasの中にはオピンを利用できる種があり（40, 41）、農薬接種菌以外の細菌種もクラウンガールの中で相対的に多くコロニー形成し増殖することが説明できるかもしれない。
我々は、クラウンゴール試料中の植物DNAが優勢であるため、葉緑体およびミトコンドリア配列の共増殖により、標準的な16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスによるエンドファイト細菌微生物相の解像度が低くなることを見出した。植物の葉緑体やミトコンドリアの16S rRNA遺伝子とのミスマッチを含む16S rRNA遺伝子プライマーを使用することで、内生細菌叢研究における宿主の汚染を低減できる可能性があるが（25、26）、細菌特異的プライマーは、我々の最初の試み（ラウンドI）で90%以上のホストリードをもたらし（表2）、これは以前の研究（22）の結果と同様であった。葉緑体またはミトコンドリアDNAに特異的にアニールし、PCR中にDNAポリメラーゼによって伸長されないブロッカーを追加すると、宿主の汚染を減らすことに成功し、この研究に十分な配列決定深度を得ることができました。この結果は、ブロッカーがエンドファイト群集のバクテリアリードを増やすのに有効であることを支持するものである（22-24）。今回開発した土壌接種法とブロッカーを介したガロビオーム用16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンス（SI-BBacSeq）の濃縮プロトコルは、ブロッカーの配列を変更すれば、トマトや他の植物に関連する微生物相にも適用できるかもしれない。
これまで、植物微生物相の集団研究は、微生物相におけるニッチ競争の形質として、微生物相におけるT6SS遺伝子の濃縮を示唆している（5, 8）。しかし、植物と微生物叢の文脈が異なれば、T6SSの役割や影響も異なる可能性があります。本研究では、T6SSは感染の初期段階ではアグロバクテリアに競争上の優位性を与えるかもしれないが、クラウンガールの内部でニッチを確立した後は増殖に重要でない可能性が高いことが示唆された。今後、冠鱗茎や植物の創傷部位における農菌細胞やその他のエンドファイトの空間分布を調べる研究は、T6SS活性の時間的・空間的可視化とともに、農菌病生態におけるT6SSの役割を解き明かすために重要であると思われる。
材料と方法
細菌株と生育条件
本研究で使用した細菌株とプラスミドを表S3Aに示す。アグロバクテリウム株C58野生型および2つのT6SS変異体（すなわち、ΔtssBおよびΔtssL）（42）を、まず523培地寒天プレート（43）上にストリークし、25℃で48時間インキュベートした。 スフィンゴモナス属R1は、可溶性デンプンとピルベート（44）を含まないR2A培地で増殖した。Escherichia coliは、37℃のリソジェニーブロス（LB）培地で培養した。生育したばかりのコロニーを対応するブロスに接種し、一晩培養した。使用した濃度および抗生物質は、大腸菌には10μg/mLゲンタマイシン、アグロバクテリウムには50μg/mLゲンタマイシン、スフィンゴモナス属R1には20μg/mLカナマイシンと50μg/mLゲンタマイシン。
補足資料
TABLE S3
A. 本研究で使用した細菌株とプラスミド B. プラスミド構築のために使用したプライマー。表S3、DOCXファイル、0.02MBをダウンロードする。
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菌株の構築により、抗生物質の選択が可能になる。
構築に使用したプライマーを表S3Bに示す。ゲンタマイシン耐性（GmR）遺伝子と緑色蛍光タンパク質gfp（S65T）を含むDNA断片を、プライマー対BclI-GFP-GmR-F-25およびBclI-GFP-GmR-R-25を用いてpRL662::GFP（S65T）から増幅し、XbaI消化したpJQ-COMにクローニングした。新たに構築したプラスミドをpJQ-com-GmR-GFPと命名し、アグロバクテリウムゲノムのactC（atu5330）の上流にGmR遺伝子とgfp（S65T）をノックインしたものをダブルクロスオーバー後に作成することができた。ノックイン株は、アグロバクテリウムC58、ΔtssB、ΔtssLバックグラウンドで作製した。ノックイン現象およびpJQ200ksバックボーンの切除は、緑色蛍光タンパク質（GFP）シグナル、ゲンタマイシン耐性、およびpJQ200ks上のsacBとGmR遺伝子の間の断片を標的とするプライマー対3´sacB-5´GmR pJQ200 F および 3′sacB-5′GmR pJQ200 RによるPCRで確認した。カナマイシン耐性を付与するプラスミドpRL662::GFP(S65T)とpBBR::mCherryをそれぞれエレクトロポレーションによりSphingomonas sp. R1へ形質転換した。エレクトロポレーションとpJQ200ksを介したダブルクロスオーバーの手順は、先に述べたように実施した（45）。
植物材料と生育条件
ソラナム・リコペルシカム（トマト）品種Known-You 301の種子をKnown-You Seed Co. (台湾、高雄)を発芽させ、温室EL329 (N25.043047890856812, E121.61135464167913, Academia Sinica, Taipei, Taiwan) の未滅菌ポッティング混合物 (Jiffy premium fine peat substrate, perlite, and vermiculite, mix in a 4:1:1 ratio [vol/vol/vol]) 中で栽培した。
土壌接種を行った。
土壌接種方法は、エンドウおよびクルミの農菌感染に使用された方法（46、47）に基づき、最適化した。12mLの523で一晩（14〜16時間）培養した農菌株を、6,000×gで10分間遠心分離を行った。ペレットを10 mLの滅菌生理食塩水（H2O中0.9%NaCl）を用いて1回洗浄した。洗浄したペレットを遠心分離し、600nmの光学密度（OD600）を1に調整した滅菌生理食塩水に再懸濁した。細菌懸濁液を未滅菌土壌（土壌100gあたり1mL懸濁液）に混合し、これにより、冠毛を誘発し得る最適化濃度である〜107CFU/g土壌と予想するが100%ではない。本葉2枚のトマト苗（2〜3週齢）を、火滅菌した縫い針を用いて主根と子葉の間の部位で傷つけ、接種した土壌に植え、温室内で栽培した。各菌株にトマト苗を14〜20本接種し、生理食塩水を接種したものをネガティブコントロールとした。
クラウンゴール試料の収穫、表面殺菌、保存。
接種から2ヶ月後にトマト苗を収穫し、創傷部位に形成された胆汁を調査した。病害発生率は、目に見えるギャル形成のある植物の数を、接種した植物の総数で割ることによって計算した。クラウンガールのある切片を切り出し、35 mLの滅菌液（3% NaOCl, 0.01% Tween 20）で30秒間滅菌した後、35 mLの70%エタノールに移し、35 mLの滅菌H2Oで3度洗浄した（48）。滅菌の評価は、3回目の洗浄の液100μLを523寒天プレートに広げ、2日間観察し、細菌の増殖がないことを確認することで行った。滅菌後、クラウンガールを各植物セグメントから切り離し、滅菌シャーレに入れ、滅菌アルミホイルで包み、液体窒素で凍結し、DNA抽出前に-80℃で保存した。
クラウンガールからのDNA抽出
クラウンガールのサンプルを、液体窒素を用いた乳棒と乳鉢でホモジナイズした。次に、ホモジナイズした組織の0.25gを、製造者の指示に従ってDNeasy PowerSoilキット（Qiagen、ドイツ）のビートチューブに移した。抽出したDNAの濃度は、NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, USA) とQubit double-stranded DNA (dsDNA) high-sensitivity (HS) (Invitrogen, USA) システムを用いて測定した。
16S rRNA遺伝子の増幅とシークエンス。
本研究では、3ラウンドのアンプリコンシークエンシングを実施した。ラウンドIは、16S rRNA遺伝子可変領域を用いた土壌微生物相研究の確立されたプロトコルに従って実施した（25）。部分的なアダプター配列を持つ各プライマーは、Illumina TruSeqコンビナトリアルデュアルインデックスシステムに対応した。最初のPCR増幅は、以下の25μLの反応で実施した。5 ng DNAテンプレート、2×KAPA HiFi HotStart DNA polymerase ReadyMix（Roche、スイス）、フォワードおよびリバースプライマー各0.2 μM。V3〜V4およびV5〜V7の最初のPCRプログラムおよび反応の詳細を表S4に示す。PCR産物は、Ampure XPビーズ（Thermo Fisher Scientific, Inc.、スウェーデン）を用いて精製した。V5～V7 PCR産物は、BluePippin（Sage Science社）のサイズセレクションを行い、トマトアンプリコンを除去した。デュアルインデックスおよび全長イルミナシーケンスアダプターを取り付けるために、精製またはサイズ選択したPCR産物、2×KAPA HiFi HotStart DNA polymerase ReadyMix（Roche）、フォワードおよびリバースプライマー各0.5μMを用いた50μL反応において、第2ラウンドのPCR増幅を採用した。2回目のPCRのライブラリー産物を全て精製し、プールした。プールしたライブラリーをIllumina MiSeq V3フローセル（Illumina、米国）にロードし、2×300-bpペアエンドシーケンスを行った。
補足資料
表S4
16S rRNA遺伝子増幅の条件。表S4、DOCXファイル、0.2MBをダウンロードする。
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アンプリコン配列決定のラウンドIIは、植物の葉緑体およびミトコンドリア配列の減少に対するPCRブロッカーの添加の効果を検証するために実施された。3つの胆汁サンプル（1115-W21、1115-W22、および1115-W25）をDNAテンプレートとして使用し、生物学的複製を提供した。各DNAサンプルについて、16S rRNA遺伝子の異なる可変領域を標的とする4つのプライマーペアを使用した。V1〜V3、V3〜V4、V5〜V7、V6〜V8である（表S1A）。各プライマーは、Illumina TruSeq combinatorial dual index systemの部分アダプター配列を含んでいた。トマト葉緑体およびミトコンドリア16S rRNA遺伝子の増幅を阻害するコグネート3′C3スペーサー修飾オリゴヌクレオチド（ブロッカー）は、以前の研究（22）に従って設計し、各サンプル-プライマーの組み合わせについて2つのPCRのうちの1つに適用した（テーブルS1B）。PCRおよびイルミナシーケンスの手順はラウンドIに使用したものに基づくが、PCRサイクル時間を短縮するためにDNAテンプレートの量を25ngに増やし、ブロッカー用にアニーリング温度を調整した。より詳細な技術情報は、表S4に記載されている。
最初の2ラウンドのアンプリコン配列決定の結果に基づき、ブロッカーを利用し、V5からV7領域を対象とする最適化されたプロトコルをラウンドIIIに使用した。この最終ラウンドには、53のクラウンギャル・サンプルがすべて含まれた。
生リード処理と微生物叢の解析
FASTQ形式のイルミナ生リードをQIIME 2 release 2020.8 (49)にインポートした。インポートした配列のプライマー領域は、DADA2 (50)を用いてトリミングした。ノイズ除去およびマージされたペアエンドリードは、異なるサンプルにおけるアンプリコン配列バリアント（ASVs）IDとカウントを含む出力特徴テーブルを構築するために使用された。アンプリコンシーケンスラウンドIIIでは、ASVsをqiime vsearch cluster-features-de-novo function (51) を用いて99%の配列同一性に基づいて種レベルのOTUにクラスタリングし、ダウンストリーム解析の前にqiime feature-table filter-features functionを用いてシングルトンを除去した。代表的なOTU配列については、SILVA version 138 nonredundant small subunit rRNA reference sequences dataset (SSU Ref NR 99) (53)に基づき、事前学習のq2-feature classifier (52) とclassify-sklearn naive Bayes classifierにより分類情報を推論した。葉緑体、ミトコンドリア、真核生物、古細菌、不明とされた配列は削除された。フィルタリング後、SILVA 128 SATé-Enabled Phylogenetic Placement (SEPP) 参照データベースに基づき、q2-fragment-insertion plugin (54-57) を用いて真正細菌配列の系統樹を推論した。ラウンドIIIでは、qiime diversity core-metrics-phylogeneticを用いて系統・多様性解析を行い、サブサンプリング深度を9,800 reads/sampleに設定した。
OTUの存在量差分解析。
QIIME 2の関数qiime composition ancomを用いて、C58 WTおよびT6SS変異体に関連するガロバイオームにおいて相対存在量が有意に異なるOTUを特定するために、マイクロバイオームの組成解析（ANCOM）を適用し、ファミリーレベルに折り畳んだ特徴表を取り込んで中心対数比変換により変換した。ANCOMの帰無仮説は、あるOTUの存在量が2つの研究グループ間で異ならないというものである。2つの研究グループの各OTU間のすべての比較を行った後、帰無仮説が棄却された回数をwと呼ぶ。w値が70パーセンタイル以上のOTUを有意とみなす（59、60）。
Sphingomonas sp. R1の単離。
Sphingomonas sp.R1は、土壌接種アッセイ中に傷ついたトマトの茎から分離された。上記のように土壌接種を10dpi行った後、トマト苗の1cmの創傷部を収穫し、滅菌水で洗浄した後、1mL 0.9% NaClに移した。最高速度で3分間ボルテックスした後、上清を新しいマイクロ遠心管に移し、easySpiral Diluteシステム（参考文献［ref.］番号414 000、Interscience、フランス）の指数モードを介して523寒天プレートに撒いた。25℃で2日間増殖した後、〜20個のコロニーを選択し、523寒天プレートにストリークして純粋培養を行った。分離株の16S rRNA遺伝子の一部をV5〜V7プライマーセットを用いて増幅・配列決定し、これを用いてNCBIの16S rRNA遺伝子配列データベースのBLAST検索を行い、16菌種を同定した（表S2）。
in vitroおよびin plantaでの細菌間競争アッセイ。
in vitroでの細菌間競争のために、細菌懸濁液は、一晩培養した後、0.9％NaCl（wt/vol）中でOD600が3.0になるように調整した。in vitroでの競合は、アタッカー株（C58 WT、ΔtssL、ΔtssB）をさらにOD600が1になるように希釈し、pRL662::GFPを含む獲物Sphingomonas sp. R1をさらにOD600 0.3 または 0.1 に希釈してアタッカーと等量混合し、密度比を変えた。混合物10μLの2スポットをアグロバクテリウムのキルトリガー培地（21）上にスポットした。25℃で16時間同時培養した後、コロニーを掻き取り、1mL 0.9% NaCl（wt/vol）に再懸濁し、30μg/mLゲンタマイシンを含む523培地上でeasySpiral Diluteシステム（文献番号414 000、Interscience、フランス）の指数モードを介して広げ、餌を回収した。
スフィンゴモナスsp.R1の有無によるアグロバクテリアコロニーについては、GmR-GFPノックインした各アグロバクテリア株（C58 WT、ΔtsL、ΔtsB）を、pBBR：：mCherryを含むスフィンゴモナスsp.R1とともにOD600で1.0となるよう混合した。この5μLの混合液を、第1対の本葉を有するトマト苗の針で傷つけられた茎に接種した。トマトの苗は、接種後10日目（dpi）に収穫された。各植物について、1cmの創傷部を切断し、滅菌水で洗浄した後、1mLの0.9％NaClを含む滅菌エッペンドルフチューブに移した。最大速度で3分間ボルテックスした後、その液体を根圏サンプルとした。このサンプルを希釈し、ゲンタマイシンを含む培地にプレーティングし、CFUを算出した。
腫瘍中のC58およびSphingomonas sp.R1のCFUをカウントするために、温室内で3週間生育した後、直接接種（19）により誘導したクラウンガールを回収した。中央にギャルを含む1cmのトマト茎の切片を切り、滅菌した乳鉢と乳棒を用いて1mLの0.9％NaCl（wt/vol）を用いてホモジナイズした。ホモジナイズした組織を10倍に希釈し、50ppmのゲンタマイシンを含む523培地でeasySpiral Diluteシステムの指数モードを介して拡散し、アタッカーと獲物を回収した。25℃で2日間インキュベートした後、Scan 500自動コロニーカウンター（文献番号436 000、Interscience、フランス；ソフトウェアバージョン8.6.1）を用いてコロニーを数え、CFUを算出した。
統計と可視化
GraphPad Prism 8を使用して、シーケンスのリード数に関するt検定、CFU数に関する一元配置分散分析（ANOVA）、クラウンゴール病発生率に関する二元配置分散分析とトルコの多重比較検定、腫瘍重量に関するアルファ多様性指数とクラスカル・ウォリス検定、胆重量と農業細菌OTUの相対存在度に関するスピアマン相関を行った。α多様性曲線はRバージョン3.6.2のphyloseq(61)を用いてプロットした。QIIME 2 (62, 63)のqiime diversity beta-group-significance関数のADONISを使用して、サンプルのグループが有意に異なる微生物相組成を持つかどうかを検証した。分類学的組成プロットは、R studio 2のqiime2R（バージョン0.99.35、https://github.com/jbisanz/qiime2R）を使用して作成した。
データの利用可能性
すべての生データセットは、BioProjectアクセッション番号PRJNA894311の下、National Center for Biotechnology Information (NCBI)で入手できます。
謝辞
この原稿を注意深く読んでくれたTeng-Kuei HuangとMao-Sen Liu、有益な議論をしたLaiとKuoラボのメンバーに感謝する。また、pRL662∷GFP(S65T)を構築してくれたLay-Sun Ma、pBBR::mCherryを提供してくれたStanton Gelvinに感謝する。
イルミナシーケンスライブラリーの作成は、Genomic Technology Core（Institute of Plant and Microbial Biology, Academia Sinica）で実施した。Genomics Core (Institute of Molecular Biology, Academia Sinica)が提供するIllumina MiSeq sequencingサービスに感謝します。
概念化。S.-C.W., C.-H.K., E.-M.L. 資金獲得: C.-H.K.、E.-M.L. 調査。方法論：S.-C.W.、C.-H.-K.、E.-M.L.．プロジェクト管理：S.-C.W., A.-P.C., S.-J.C., C.-H.K: E.-M.L.監修。C.-H.K.、E.-M.L. バリデーション。検証：S.-C.W.、C.-H.K.、E.-M.L. 可視化。S.-C.W.、C.-H.K.、E.-M.L. Writing, original draft: 原案執筆：S.-C.W., C.-H.K., E.-M.L. 原案執筆、レビュー、編集。S.-C.W.、A.-P.C.、S.-J.C.、C.-H.K.、E.-M.L.
Lai研究室の研究は、Academia Sinicaの支援を受け、E.-M.L.にAcademia Sinica Investigator Award（助成番号AS-IA-107-L01）を授与しました。Kuo研究室の研究は、Academia SinicaおよびNational Science and Technology Council (NSTC 109-2628-B-001-012; 110-2628-B-001-020; 111-2628-B-001-019)から支援を受けた。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と解釈、論文投稿の決定には一切関与していない。
脚注
[本記事は、2023年3月6日に掲載されたもので、図7に誤りがありました。この図は、2023年3月9日に掲載された最新版で訂正されました]。
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クロスレフ
パブコメ
符号間干渉
グーグルシュラー
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クロスリファレンス
符号間干渉
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