腸内細菌叢異常症の概念の問題点

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アプライド・マイクロバイオロジー・インターナショナル
微生物バイオテクノロジー第13巻第2号p. 423-434
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腸内細菌叢異常症の概念の問題点

https://ami-journals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/1751-7915.13479


ハラルド・ブリュッソー
初出：2019年8月26日
https://doi.org/10.1111/1751-7915.13479
引用文献 116
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研究概要
セクション

概要
ヒトマイクロバイオーム研究は、糞便移植という特筆すべき例外を除いて、そのほとんどがまだ記述的な段階にある。研究を医療介入につなげることが困難な理由のひとつは、マイクロバイオームの構成が非常に複雑であるため、解析に高度な統計的手法が必要となり、産業応用に向かないデータセットになってしまうことにある。もう一つの困難は、用語の論理的欠陥、特に循環的な結論を避け、健全な生態学的・進化論的推論に基づく「ディスバイオシス」によるものかもしれない。多くの症例対照研究は検出力不足であるため、偽のディスバイオシスと疾患との関連から一貫性のあるものを選別するメタアナリシスが必要である。またマイクロバイオームについては、統計的関連性から、常在菌に関するコッホの定説を修正したような疾患との因果関係への移行が必要である。不愉快なことに、最も洗練された統計解析では、マイクロバイオームの分散のごく一部しか説明できない。宿主とは無関係な微生物間の相互作用や確率的なプロセスが、予想以上に大きな役割を果たしているのかもしれない。科学的プロセスにおける推測と反証に関するカール・ポパーの概念を満足させるためにも、ヒトの健康や病気における常在腸内細菌叢の役割を反証しようとする実験をもっと行うべきである。

はじめに
ヒトの微生物叢は、現代で最もダイナミックな研究分野の1つの焦点である」-この一文で、ヒトの腸内マイクロバイオームに関する最近のCellの総説（Schmidt et al.） Nature』、『Science』、『Cell』、およびそれらの姉妹誌におけるマイクロバイオーム研究の報道を見ると、この判断は決して誇張ではない。統合ヒトマイクロバイオームプロジェクト（HMP）の最新結果を発表した『ネイチャー』2019年5月30日号のように、号全体がマイクロバイオーム論文で埋め尽くされていることもある（Proctor and the Integrative HMP (iHMP) Research Network Consortium, 2019.

HMPの3つのサブプロジェクトの1つは、炎症性腸疾患（IBD）における腸内細菌叢を扱うもので、132人の患者から1年間にわたって繰り返し採取された約3000の便、生検、血液サンプルに、印象的なマルチオミクス技術が適用されている（Lloyd-Price et al.） 個体間変動が観察された分散の大部分を占め、疾患の状態による説明はごくわずかであった。追跡期間中、一部の患者で「dysbiotic」腸内細菌叢の逸脱が生じたが、疾患活動性との関連は弱かった。このような腸内細菌叢の逸脱は、潜在的に確率的な事象であった。好気性で炎症性の細菌群への分類学的シフトは、以前の報告による観察結果を裏付けるものであった。新たに、IBDではクロストリジウム属の遺伝子発現が増加し、未分類のSubdoligranulum属の減少が観察された。著者らは、マルチオミクスマイクロバイオームデータが疾患事象を発症前に予測できるかどうかは不明であることを強調した。原因解析には介入研究デザインが必要である。このデータは、将来の研究を可能にするマルチオミクス機能間の新たな関係のカタログを提供するものであるが、マイクロバイオーム研究はまだほとんど記述的なものである。

このプロジェクトのコーディネーターによれば、マイクロバイオーム研究の進展は産業界を興奮させている（Proctor and the Integrative HMP (iHMP) Research Network Consortium, 2019; Proctor, 2019）。微生物バイオテクノロジストにとって、マイクロバイオーム事業を視野に入れるには、財務上の数字が役に立つ。過去10年間で、17億米ドルを超える研究資金が、公的部門によるマイクロバイオームプロジェクトに費やされた。マイクロバイオームに基づく製品および介入（診断および治療）の市場価値は現在、世界で2億7,500万～4億米ドルと推定され、今後数年間で少なくとも3倍になると予想されている（Proctor and the Integrative HMP (iHMP) Research Network Consortium, 2019; Proctor, 2019）。これに対し、プロバイオティクスの世界市場は2017年に400億米ドルに達した（Reid et al.） どうやら、基礎的なマイクロバイオーム研究を食品、栄養、健康や医薬品に変換することには困難があるようだ。注目すべき例外は、再発性クロストリジウム・ディフィシル感染症（CDI）治療のための糞便移植である。しかし、その有効性に関する明確なデータ（Tariq et al., 2019）にもかかわらず、商業製品への開発は規制上のハードルをクリアしておらず（Vyas et al., 2015; Verbeke et al., 2017）、FDAは最近、その使用に関連する安全性警告を発した（https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/safety-availability-biologics/important-safety-alert-regarding-use-fecal-microbiota-transplantation-and-risk-serious-adverse）。さらに、このアプローチの基本概念はマイクロバイオーム研究（de Vos, 2013）より古く、再発性CDI（Tvede and Rask-Madsen, 1989; Tvede et al., 2015）のための定義された細菌株はまだ登録製品として開発される必要がある。

定義の問題
産業用途の微生物由来製品が直面する問題は多岐にわたる。そのハードルのひとつが、基本的な科学的定義の問題であることは驚くべきことかもしれない。約2000年前、医学の始祖は、『しかしながら、まず、我々が使おうとしている様々な用語を区別し、明確に説明しなければならない。プロバイオティクスの分野では、何をもってプロバイオティクスとするかについて長い間議論され、定義を見つけるためにコンセンサス会議が開催されてきた。明確な定義があるからといって、科学的な疑問が解決されるわけではない。実際、学会は限られた健康用途のプロバイオティクスしか推奨していない（Brüssow, 2019）。しかし、用語の明確な定義を欠くことは、議論を曖昧にする危険性がある。

マイクロバイオームの分野では、「ディスバイオーシス」という包括的な用語が使われ、的を絞った介入によって「ユビオシス」の状態に修正される。プロバイオティクスの分野との違いは、「ディスバイオーシス」の定義がコンセンサス会議でも決定されていないことであり、多くのマイクロバイオーム研究論文は、その場限りの定義や規定すらないままこの用語を使用している。この軽視は、科学的厳密性の欠如を示すだけでなく、マイクロバイオーム分野が記述科学からトランスレーショナル・サイエンスへと進歩する妨げになりかねない。近年、「dysbiosis」という用語の未定義な使用に対する批判が繰り返し表明されている。OlesenとAlm（2016）は、「Dysbiosis is not an answer（ディスバイオーシスは答えではない）」という短いコメントの中で、ディスバイオーシスがマイクロバイオーム科学の主要な組織概念であることを否定し、それが微生物の不均衡に関する前科学的な考えに基づいており、人間の健康に関するユーモア理論にやや似ていると主張した。これらの著者によれば、定義が曖昧であるため、科学的に有用なことを実際に達成することなく、微生物叢の構成におけるディスバイオーシスを観察することができる。彼らは例として、炎症性腸疾患（IBD）のマイクロバイオーム診断シグネチャーを引用しているが、これは糞便カルプロテクチン測定に基づくより単純な検査に優るものではない。さらに、dysbiosisを診断しても、それが疾患の原因なのか結果なのかはわからない。HooksとO'Malley（2017）によって、dysbiosisという用語の詳細な歴史的評価と現在の使用と誤用が示されている。彼らは微生物叢に関する文献をスクリーニングしたところ、「微生物叢の不均衡」がディスバイオーシスの最も一般的な特徴であることを発見し、不均衡は恒常性の喪失と定義されたが、それ自体が定義されていない、あるいは稀にしか定義されていないため、ほとんどの応用において循環的な定義につながった。この曖昧な定義が、科学的価値を欠くキャッチオール定義につながり、マイクロバイオーム分野が関連付けに焦点を当てた科学から説明的な科学へと進歩する妨げとなっている、というのがこれらの著者の見解である。

ディスバイオージスの定義へのアプローチ
Levyら（2017）は、「病原菌のブルーム、常在菌の喪失、多様性の喪失」の3つのタイプのディスバイオーシスを定義し、Vangayら（2015）は、「主要な分類群の喪失、多様性の喪失、代謝能力のシフト、病原菌のブルーム」の4つのタイプのディスバイオーシスを定義した。ここでいう病原菌とは、常在細菌叢の中で病態を引き起こす可能性のあるものを指す（Chow and Mazmanian, 2010）。基幹種は、その存在量に比して自然環境に不釣り合いなほど大きな影響を与えることで定義される。多くの定義では、常在コミュニティの構成が健康な個体で見られるコミュニティと比較して変化することを「常在コミュニティ異常症」（Petersen and Round, 2014）と呼ぶなど、常在コミュニティ異常症を疾病と結びつけようとしている。Hooks and O'Malley（2017）によると、この定義はこの分野の方法論上の大きな問題を指摘している。症例対照研究で健常者と比較した病人の微生物叢の変化を探索することで、dysbiotic状態が病気をもたらすことが黙認されており、これは古典的な循環結論である。より穏当な批判としては、Bäckhedら（2012年）は、「現在のエビデンスは、病気の原因としてのディスバイオシスか結果としてのディスバイオシスかを区別するには不十分である」と述べている。

dysbiosisという用語のナイーブな使用に対する根本的な批判は、Levyら（2017）によって定式化された。彼らは、疾患個体と疾患のない対照コホートを比較するだけでは不十分であり、特に同じ疾患の異なる症状間での比較が必要であると観察した。しかし、この要請は、原因や結果の問題を完全に解決することなく、より緊密な関連性を提供するだろう。これらの著者らはまた、微生物叢の分類学的解釈よりも機能的解釈を求め、例えば宿主の免疫系が微生物叢に作用し、微生物叢が宿主の免疫系に作用するなど、観察結果の文脈依存性が高いことを指摘した。これらの著者らは、細菌叢異常の定義は、病気を引き起こす微生物因子の定義のためのコッホの定理の基準を満たすべきであり、ここでは病気を引き起こすマイクロバイオームのために拡張されているという根本的な提案を行っている。

Vangayら（2015）は、小児科のディスバイオシスと疾患との関連を調査する際、腸内細菌叢の時間的成熟や、分娩の種類（帝王切開vs腟式）（Chuら、2017）、食事（母乳育児vs哺乳瓶育児）、抗生物質の使用歴など、このような微生物叢-疾患解析で説明する必要がある重要な交絡因子に言及した。これらの因子を考慮した乳児の腸内細菌叢の詳細な説明は、スウェーデン（Bäckhedら、2015年）と米国の健康な乳児（Baumann-Dudenhoefferら、2018年）について提供されている。単一の症例対照研究は、「相対的微生物叢成熟指数」をもたらした16S RNA配列データに対する機械学習を使用することにより、微生物叢と疾患との関連、すなわちバングラデシュの小児における栄養失調を、微生物叢の年齢発達とともに記録した。著者らは、栄養失調児の微生物叢が相対的に未熟であることを発見した（Subramanian et al.） この観察は研究上興味深いものではあるが、この状態は身体測定や視覚的診断によって容易に評価できるため、実用上の重要性は限定的である。

多様性の問題
多様性の喪失は、多くの定義においてディスバイオーシスの基準として用いられており、宿主に対する微生物サービスの低下、ひいては微生物叢の「健康」の低下を示唆している。しかし、現在の生態学理論の観点からヒトの腸内細菌叢を考察した著者らは、より微妙な評価を下している（Coyte et al.） 種の多様性が高いことは、紛れもなく腸内細菌叢の特徴である。このような複雑な群集内での協力の増加は、全体的な代謝効果を促進すると期待されるが、種の数が多いと系が不安定になる傾向があるため、生態系の安定性が低下するという代償を払うことになり、宿主はトレードオフに直面する。そのためJohnsonとBurnet（2016）は、多様性の議論をナイーブに適用することに注意を呼びかけている。例えば、哺乳瓶で育てた乳児は母乳で育てた乳児よりも腸内細菌叢が多様であることを一貫して示しているが（例としてSimeoni et al. アフリカの狩猟採集民の集団（ハザ族）は、先進国の被験者よりも腸内細菌叢の分類学的多様性（Schnorr et al. 疫学的データや健康診断なしに、多様性の議論に基づいてハザ族の腸内細菌叢が先進国の人々よりも優れた「腸の健康」と関連していると推論することは、多かれ少なかれ単なる仮定に過ぎないだろう。この結論は、微生物がヒトの進化の過程で共進化し、より近代的な食糧生産システムに適応するにつれて衰退した「古い友人」であるという、相互主義的な超組織体のような理論的概念に基づいている。しかし、これらのデータが実際の健康指標に裏付けられていない以上、その解釈には注意が必要である。実際、ハッザ族はビフィズス菌を欠いていた（Schnorr et al., 2014）。ビフィズス菌は一般に腸内細菌叢に健康効果をもたらすと考えられており、ヒト科進化の共通の遺産である（Moeller et al.） もしビフィズス菌の欠如が技術的なアーチファクト（ビフィズス菌が報告されなかったいくつかの研究のように、DNA抽出やプライマー使用の問題など）でないなら、特に一般的に不健康と考えられているハドザ族の便中のトレポネーマの観察に加えて、確かに不健康な腸内細菌叢を示唆するかもしれない。実際、ハッザ族の6％が血清検体でもトレポネーマを示し、彼らの健康状態全体についてさらなる疑念を抱かせた。異なる食糧生産システムに移行する遺伝的に均質な集団において、微生物叢組成の変化がどのように起こるかを示すデータはあるが、こうした変化がこの勾配に沿ってヒトの生理学と健康にどのような影響を与えるかについてのデータはまだ不足している（Jha et al.）

ハザ族のデータは別の側面、すなわち原始社会における腸内細菌叢の季節変動の重要性を強調しており（Smits et al. ごく少数のヒトを対象として精緻に検討されたものではあるが、腸内細菌叢組成の日内変動を示すデータさえあり、マウスではより詳細に説明されている（Thaiss et al.） もし確認されれば、このような腸内細菌叢の変動は、研究間の比較をサポートし、一般化を推論できるようにするために、標準化された便サンプリング時間（季節、1日の時間）を持つプロトコルが必要になるだろう。

また、Shade（2017）は、多様性測定を健康評価に用いることに慎重さを求めている。多様性の解釈には多くの文脈が必要であるため、多様性だけでは価値が限られる。群集多様性の異なる指標間の不一致は、生態学の分野で長い間認識されてきたため、研究間の比較を複雑にしている。このように、微生物相の多様性は良いものでも悪いものでもない。この点は、ヒトの膣内微生物叢によって容易に実証されており、微生物多様性の増加は明らかに有害な影響と関連している（細菌性膣炎、アフロ・アメリカン女性では、出産転帰の悪化とさえ関連している；Fettweisら、2019年）。微生物と健康との関連における宿主の遺伝的背景依存性は、アフロ・アメリカンと白人の米国人女性から得られた膣内微生物叢研究でよく示されている（Callahan et al.） 膣内細菌叢の場合、乳酸桿菌優位の膣内細菌叢はヒトにのみ存在し、類人猿には存在しないため、微生物叢がヒトの系統と共進化したという議論は当てはまらない（Miller et al.）

パワー不足の研究とメタアナリシス
症例対照研究でディスバイオーシスを診断する微生物叢研究の多くは、ヒトのサンプルサイズが小さいため、統計的に検出力が不十分である： < この分野では、1群あたり20人未満は珍しくない。これらの限界を説明するために、Duvallet（2018）は、ディスバイオシス分野におけるメタアナリシスを主張している。メタアナリシスは、偽陽性を背景に真のシグナルを検出することで、多くの小規模研究の統計的検出力を高めることができる。メタアナリシスの大きな利点は、独立した研究間で一貫した観察結果を同定すること、あるいは偽の関連性を否定することである。肥満と腸内細菌叢の関連について、テストケースが提供されている。

初期の研究では、肥満者と非肥満者における腸内細菌群集の多様性の違いやバクテロイデス/ファーミキューテス（B/F）比の違いが報告されていた。先駆的な研究では、被験者数が少なく（肥満12名、痩せ型5名）、カロリー制限食の摂取時間の経過とともにB/F比が上昇することが示された（Ley et al., 2006）。154人を登録した双生児の追跡研究では、肥満が腸内細菌叢の門レベルの変化（バクテロイデーテスの減少と放線菌の増加）、細菌の多様性の減少、細菌の遺伝子発現の変化と関連していることが確認された（Turnbaugh et al.） 肥満マウスと痩せマウスで観察される同様の微生物叢の変化、「肥満」微生物叢が食餌からエネルギーを抽出する能力が増加していることの証明、この形質が無菌マウスに伝達されることの証明（Turnbaughら、2006年）と合わせて、肥満と微生物叢の関連は、宿主の病理学に関連する微生物の腸内生態系における顕著な部門全体の変化を示すショーケースとなった。しかし、10の症例対照研究と約2800人の被験者（約3分の1が肥満）を含むメタアナリシスでは、除脂肪群と肥満群のB/F比に有意差は認められず、微生物叢の多様性についてもわずかな差しか認められなかった（Sze and Schloss, 2016）。Finucaneら（2014）は、米国のヒトマイクロバイオームプロジェクト（HMP）と欧州のMetaHITデータセットでデータベースマイニングを行い、B/F比と肥満度（BMI）、または門レベルのマイクロバイオーム組成とBMIの間に関連はないことを明らかにした。バクテロイデーテス（Bacteroidetes）とファーミキューテス（Firmicutes）の相対的存在量の研究間変動は、痩せ型と肥満型の研究内差よりも大きかった。対照的に、Falonyら（2016）は、Flemish Gut Flora Project（FGFP）の1106人の被験者の腸内細菌叢を分析したところ、マイクロバイオーム組成とBMIの間にわずかではあるが関連があることを発見した。しかし、彼らのデータに基づくと、P＜5％の有意水準、検出力80％で微生物叢組成のシフトを検出するには、865人の痩せ型と865人の肥満のボランティアが必要であると推定された。この規模の肥満研究はまだ行われていない。

今後行われる微生物と疾患との関連研究では、臨床試験のプロトコールで日常的に行われているように、公表される結果に現実的に予想されるエフェクトサイズによる検出力計算が行われることが望ましいのは確かである。このようなアプローチとメタアナリシスは、真の関連と偽の関連を区別するのに役立ち、C. difficile感染症における糞便移行に関するメタアナリシスがその例として挙げられるように（McKenney & Pamer 2015）、この分野を誇大広告から希望へと導く有望な微生物叢-疾患関連に焦点を当てることができるようになる（Tariq et al.）

ディスバイオシス研究の分類
Gilbertら（2016）は、微生物叢と疾患との関連を3つに分類した：予測可能な関連（過敏性腸症候群、炎症性腸症候群など）、興味深い関連（肥満、心血管疾患、大腸がん、関節リウマチなど）、驚くべき関連（大うつ病、パーキンソン病、自閉症など）。Duvalletら（2017）は、異なる疾患タイプにまたがる症例対照研究のメタアナリシス手法を用い、興味深い結論を導いた。彼らは微生物叢の変化を異なるカテゴリーに分類した。1つのカテゴリーは、フソバクテリウム、ポルフィロモナス、ペプトストレプトコッカス、パルビモナス、エンテロバクターのような少数の潜在的病原体の濃縮を特徴とし、4つの大腸がん研究のうち3つで同定された（Wangら、2011；Chenら、2012；Zellerら、2014；Baxterら、2016）。これらの研究は、治療アプローチとして特定の抗菌薬（バクテリオシンやバクテリオファージなど）を示唆している。もう1つのカテゴリーは、健康関連細菌の枯渇に関連する疾患に対応するものであった。例えば、IBD患者では、RuminococcaceaeとLachnospiraceaeの5属が一貫して減少していた。このような研究から、不足した細菌を補うためのプロバイオティクス的アプローチが示唆される。C.ディフィシル下痢症はその最も明確な例であり、複数の臨床研究によって検証されたように、糞便移植を示唆している。いくつかの微生物叢と疾患との関連は、性行為に影響されたHIVに関連した微生物叢の変化や、食事の影響に影響された肥満と微生物叢との関連など、交絡因子によるものである可能性が高い。いくつかの細菌は、明らかにいくつかの疾患と非特異的に関連していた： エシェリヒア菌、赤痢菌、サルモネラ菌は、基礎となる感染症の種類とは無関係に抗生物質治療によって誘発された。

ユビオシス
dysbiosis "という用語の比較的とらえどころのない特徴は、"eubiosis "という対極に位置する用語の鏡像である。バランスの取れた」微生物叢や健康な被験者に見られる微生物叢を超える正確な定義は、エビオーシスには与えられていない。真正微生物叢の明確な定義は、症例対照研究にとって特に重要である。もし健康な真正微生物叢が意味的にも微生物叢の構成からも明確に定義されていれば、少数の対照被験者からの微生物叢データのみが必要となる。この効果は「アンナ・カレーニナの原理」によって提唱されており、この原理では、生物多様性異常の個体は健常な個体よりも微生物群集組成がより変化するとされている（Zaneveld et al.） この原理の独特な名前は、レオ・トルストイの著書にちなんだダジャレで、「幸せな家庭はみな同じように見えるが、不幸な家庭はそれぞれに不幸である」という文章で始まる。この原則の裏付けは、海洋のサンゴで発見されたもので、共生不全のサンゴ、つまりストレスを受けたサンゴは、健康なサンゴよりもマイクロバイオームが変動しやすく不安定である（Ahmed et al.） ヒトの膣内細菌叢はこの原則に同意しているように見えるが、この原則が健康なヒトの腸内細菌叢に当てはまるかどうかは明らかでない（Brüssow, 2016）。

健康な被験者の腸内細菌叢組成が大きく変動する場合、有意な結論を得るためには、症例対照研究において多数の被験者が必要となる。必要な数の推定値は、ベルギー（Falony et al.、2016）またはオランダ（Zhernakova et al.、2016）の平均的な健康者を対象とした大規模マイクロバイオーム研究から導き出せる。微生物センサスでは約800属の細菌が検出された。しかし、西洋の腸内細菌叢の豊かさはまだ十分にサンプリングされておらず、著者らは飽和状態に達するには40,000人の被験者が必要であると推定している。ベルギーの研究では20のコア分類群（サンプルの95％に存在）が得られ、コア分類群は最も豊富な分類群にも属していた。個体間のばらつきは実際に大きかったが、主にRuminococcaceae、Bacteroides、Prevotellaのような中核分類群の存在量の変化によるもので、これらはすべて、腸型識別因子として以前に提案されていた生物である（Arumugam et al.） これら3つの主要な腸内細菌群に加えて、低存在細菌のロングテールが、健康な腸内細菌叢の機能的多様化に大きく寄与していることが報告された（Arumugam et al.） 被験者から得られた約70の因子が微生物叢組成と有意な関連を示し、その半数近くがオランダのコホートでも有意な共変量として同定された（Falony et al.） しかし、これらの因子は属数変動のわずか1～15％しか説明できなかったことから、未知の効果、生物学的相互作用、さらには確率的プロセスが健康な腸内細菌叢に大きな影響を及ぼしていることが示唆された。強い確率的要素は、健康な小児における腸内細菌叢の週ごとの大幅な変化（Sarkerら、2017a）や、バングラデシュの健康な成人における日ごとの変動（Sarkerら、2012；McCallinら、2013）にも現れていた。他の地理的地域の研究（バングラデシュの腸内細菌叢の高い変動性は、環境および食品衛生レベルの低さを反映している可能性がある）で確認された場合、少数の対照群からマイクロバイオーム異常マーカーを区別することは困難であり、特にアイルランドからの高齢者研究（Claesson et al.）

交絡因子
ベルギーのFGFPおよびオランダのLifeLines DEEP研究（Falony et al.） この観察は、常在菌に対する抗生物質以外の薬剤の影響を考慮すれば驚くべきことではない： 1000種類の一般的な薬剤の24％がin vitroで細菌の増殖を阻害した（Maier et al.） 交絡因子としての薬剤の強い影響は、腸内細菌叢異常症と2型糖尿病（T2D）との関連を調査した研究でも示されている。中国の研究では、T2D症例対照研究において中等度の腸内細菌叢異常症が報告されており、腸内細菌遺伝子の4％のみがT2Dと関連していた。機能的アノテーションでは、酪酸産生菌の減少と通性病原体の増加が示された（Qin et al.） デンマークの研究では、T2D女性において4種の乳酸菌の増加と5種のクロストリジウムの減少が関連していた。微生物分類（Lactobacillus、Akkermansia）は、中国とデンマークのT2Dコホート間で異なっており、集団特異的な影響を示唆している（Karlsson et al.） 第3の研究では、T2D患者をメトホルミンによる薬物療法によって層別化した（Forslund et al.） メトホルミン未投与患者では、酪酸産生菌の減少が疾患とともに乳酸桿菌の増加と関連していた。しかし、メトホルミン治療を受けているT2D患者では、Escherichiaの有意な増加が疾患と関連しており、これはこの最も広く使用されている抗糖尿病薬の治療効果と副作用（下痢、腹部膨満感）の両方を説明できるかもしれない。したがって、信頼できる微生物叢と疾患との関連を明らかにするためには、症例対照研究を薬剤別に層別化する必要がある。そうでなければ、微生物叢の変化は単に疾患治療の結果である可能性がある。

複数のオミックスアプローチ...
腸内細菌叢にはかなりの個人間変動と交絡因子の影響があるため、他の著者らは健康な微生物叢と不衛生な微生物叢を区別するためのより洗練されたアプローチを模索している。一つの選択肢は、理論生態学からの数学的アプローチで時間的変動を探ることである。テイラーの法則の2次元パラメータ空間により、抗生物質治療被験者、病的肥満患者、過敏性腸症候群（IBS）患者を区別できる健康な微生物叢空間を定義することができた（Marti et al.） Gilbertら（2016）は、微生物叢の変化を疾患と関連付けるために、マイクロバイオームワイド関連研究に時系列研究を推奨している。彼らは、複数のオミックスアプローチで得られたマイクロバイオーム、宿主ゲノム、疾患サブタイプの分化データを統合し、一種の微生物全地球測位システム（GPS）を確立することを主張している。このようにして、主座標分析（PCoA）プロットを通して、リスクのある被験者や患者のマイクロバイオームの軌跡をたどることを提案している。このようなプロットは、病気が顕在化する前にリスクのある患者を特定する際の診断に役立つ可能性があり、またプロットの位置の変化によって治療介入の影響を追跡することもできる。このようなプロット分析では、軽度であると考えられる食事介入は、プロット位置の小さなシフトをもたらすと考えられるが、強力な（例えば抗生物質）介入は大きなシフトを誘発し、ゲームチェンジをもたらす介入（例えば糞便移植）は、これらのプロットにおける患者の微生物叢の健常領域への「テレポーテーション」をもたらすであろう。

健康な腸内細菌叢とその異生物の変化を分析する傾向は、明らかに分析が複雑化するツールを使用する方向に向かっている。最新の開発のひとつは、一見難解に見える複雑な相互作用システムを扱うために開発された統計的アプローチから借用したもので、当初は金融市場の分析に応用された（Raman et al.） 微生物-肥満および微生物叢-栄養不良研究のパイオニアであるJ.I.Gordon率いる大規模な国際コンソーシアムは、バングラデシュの出生コホートの便サンプルで統計的共分散分析を実施し、インドやペルーの子どもにも適用可能な、健康な子どもの微生物叢の発達を簡潔に説明する15の共変化細菌分類群の「エコグループ」を明らかにした。主成分はデータ分散の80％を説明した。エコグループ解析により、健常児と重度栄養不良児（SAM）との明確な鑑別が可能であり、中等度栄養不良児（MAM）と健常対照児との鑑別は弱かった。従来の再栄養療法は、微生物叢組成の主成分分析（PCA）空間において顕著なシフトを引き起こしたが、健常対照のPCA位置に達することはなかった。微生物-微生物相互作用の側面は、gnotobiotic子豚モデルで再現可能であった。

...そしてその限界
微生物のGPSを作成するアプローチは魅力的であるが、臨床への応用にはまだ程遠い。疾患診断のための微生物叢検査の感度と特異性はまだ比較的不明確である。また、微生物叢の変化が、診断上意味のある疾患の鑑別を可能にするほど微細であるかどうかも不明である。さらに基本的なこととして、腸内細菌叢研究の大部分は、ロジスティックな理由から便サンプルを用いて実施されてきた。糞便サンプルの微生物叢組成は粘膜サンプルのそれとは異なる（Eckburg et al.） 明らかに、粘膜微生物叢は疾患腸組織と密接に関連しているため、微生物叢が調査対象疾患のドライバーである場合、疾患転帰に影響する可能性が高い。対照的に糞便微生物叢は、排出された粘膜細菌と、それとは別に存在する非付着性の管腔細菌叢の混合物であり、疾患プロセスを反映する可能性は低い。したがって、糞便微生物叢は病理学的事象の遠い鏡に過ぎない可能性があり、たとえ粘膜微生物叢に相関があったとしても、腸疾患との密接な相関を期待すべきではない。

包括的で複雑な介入試験
Gordon率いるコンソーシアムは、健全な微生物叢の発達が健全な成長と因果関係があるという仮説を支持するために、彼らのエコタイプ解析（Raman et al. 定式化すると、これは少し回りくどい結論に聞こえる。彼らの出発点は、バングラデシュの栄養失調児は対照児に比べて腸内細菌叢の成熟が遅れているという観察結果である（Subramanian et al.） 彼らは、実験動物の健康と成長のバイオマーカーに関連する栄養失調から健康な腸内細菌叢へのシフトに影響を与える、gnotobioticマウスと子豚の微生物接種実験から、バングラデシュ産の栄養成分を設計した。この事前選択に基づいて、彼らは中等度の栄養不良状態にあるMAMの子どもたち（各群14～17人）を対象に、4つの異なる給餌レジームによる無作為化二重盲検試験を行った。介入により、4群すべてで統計学的に有意であったが、臨床的にはわずかな体重増加（体重-身長Zスコアは-2.2から-1.9に改善）がみられた。MAM児の微生物叢組成は、すでに健常対照児のそれに近いものであったが、ひよこ豆、大豆、ピーナッツの粉にバナナを加えたものを与えた微生物叢主導型補完食2（MDCF2）群では、健常な腸内細菌叢組成へのシフトがみられた。これと並行して、著者らは、SAM、MAM、健常児の比較から得られた「健常児成長判別型」血漿プロテオームへの変化を観察した。この介入は、登録時にすでに健常児に近い腸内細菌叢組成を示した中等度栄養失調児を対象に行われたため、データの解釈には注意が必要である。さらに、体重増加効果は緩やかであり、エンドポイントは臨床評価ではなくバイオマーカーであった。MDCF2によって影響を受けた重大な変化のひとつは、ビフィドバクテリウム・ロンガムの減少であった。ビフィズス菌は母乳育児と関連しており（Simeoni et al., 2016）、一般的に望ましい乳児栄養とみなされており、ビフィズス菌は小児科における主要なプロバイオティクス候補であり（Brüssow, 2019）、高齢者における健康関連腸内細菌種（Brüssow, 2013）であるため、この結論は直感に反する。この微生物叢をデザインした栄養介入が、将来の臨床試験で望ましい成長効果をもたらすかどうかはまだわからない。このような腸内細菌叢異常と栄養不良との因果関係は、おそらく示唆的ではあるが証明されていない。証明には、疾患関連病原体に対するコッホの定則に従って設計されたアプローチが必要かもしれない。

微生物と健康との関連に対するコッホの定理の修正
サンガー研究所の研究者たちは、健康関連の微生物常在菌に関する定説を提案している（Neville et al.） 彼らの最初の仮定は、健康関連常在菌が健康宿主では定期的に同定され、疾患宿主では同定される頻度が低いことを要求している。これは、症例対照研究で一般的に適用されているdysbiosisの基準とよく似ているように聞こえるが、重要な点で異なっている。ヒトの微生物叢は非常に多様であるため、著者らは、この仮定を満たす確実なシグナルを同定するために、大規模なデータセットを要求している。さらに、菌株レベルでの高分解能の同定がこの第一の仮説のために必要である。属やそれ以上の分類学的レベルは言うに及ばず、種レベルでの同定では不十分である。第二の仮説を満たすには、同定された常在菌の純粋培養分離が必要である。このような要求は非現実的に聞こえる。しかし、限界希釈法（Goodman et al., 2011）により、ヒト成人の便から1000以上の分類学的に同定された細菌株が分離され、労力はかかるものの、このようなアプローチが可能であることが実証された。サンガーの科学者たちは、134種を代表する234の分離株で、単一の培地を用いても、種レベルでの便細菌の存在量の90％に相当する培養が可能であることを実証した（Browne et al.） 彼らの第3の仮説は、常在菌が新たな宿主に導入されたときに疾患を改善するというものである。in vivoモデルは、生物学的に適切な脊椎動物モデルでなければならない。この実証にはマウスが一般的に用いられ、常在菌の混合株（Lawleyら、2012年）、さらには単一の常在菌株（Buffieら、2015年）が、C. difficileやSalmonella enterica感染症に対する予防・治療活性を示した（Brugirouxら、2016年）。オリジナルのコッホの第3の定立に関しては、この基準は作業集約的ではあるが必要なアプローチであり、マウスモデルの生物学的な複雑さによって複雑化し、ヒトの状態への拡張、ひいてはトランスレーショナルリサーチを制限する可能性がある（Arrieta et al.） 第4の仮定は、健康状態の改善を経験した宿主に常在菌を導入した後に、その常在菌を検出できることを必要とする。この検出はPCR法で可能であるため、この基準は非常に実現性が高いと思われるが、いくつかのプロバイオティクスで仮定されているように、常在菌が炎症プロセスを抑制したり、腸管バリア機能を高めたりし、その後不要になるのであれば、治療効果を媒介するために常在菌が持続する必要はないかもしれない（Li et al.

常在菌-健康、ひいては腸内細菌異常症-疾病の関連性についてコッホの仮説を適用すると、常在菌とC. difficile感染症という可能性のある例外を除いて、この分野の明確な定義にはまだほど遠いことに気づく。しかし、糞便移植による明確な臨床効果が期待されるこの分野では、マイクロバイオーム時代に先駆けて行われたアプローチ（Tvede and Rask-Madsen, 1989; Tvede et al.

推測と反論について
ユビオシスの概念は、ホロビオントまたはホロゲノム（宿主とマイクロバイオームの集合ゲノム）という別の概念と関連している。この概念の支持者は、すべての動物や植物は微生物と共生関係を築き、それが世代間で伝達され、その環境内でのホロビオントの適合性に影響を与えることで、一種の超生物や進化における新たな選択単位につながると述べている（Zilber-Rosenberg and Rosenberg, 2008）。このコンセプトは多くの微生物学者に影響を与えているようで、マイクロバイオーム側の撹乱（ディスバイオシス）はホロビオントのフィットネスを低下させ、動物宿主の顕著なケースでは健康障害につながるという暗黙の前提がある。進化生物学者たちは、ダーウィン進化論にラマルク的要素を持ち込むことになるため、この概念に懐疑的である。MoranとSloan（2015）は、宿主固有の微生物群集組成が宿主の利益のために進化してきたという仮説を、宿主と共生生物の会合の特徴を説明する帰無仮説として受け入れるべきではないと主張した。例えば、サンゴ（サンゴは動物と微生物の関係がより密接である）においては、このようなケースはあり得るが、一般化することはできない。宿主とそれに付随する微生物の対立は、想像しうる限り最も近い宿主と微生物（ミトコンドリア）の相互作用であっても、細胞核の対立という結果をもたらすことはよくあることである。さらに腸内では、宿主に影響を及ぼすことなく、微生物と微生物の対立が反映される状況も多いだろう。このような目に見えない微生物間の対立は、ヒトの腸内細菌叢の構成に確率的プロセスが大きく影響していることを示唆しているかもしれない（Falony et al., 2016, Zhernakova et al.） 微生物間の競合を反映するのみで、ヒトの健康に対する微生物異常症の有害な影響をさらなる証明なしに予想するのではなく、ヒトの健康を媒介する常在微生物について修正コッホの定説を満たすケースを探すべきである。そうでなければ、ホロビオントのようなディスバイオシスの概念は、明確さよりも混乱を引き起こす危険性がある。哲学者ポパー（2002）は、知識の獲得、ひいては科学研究は、一方では推測、他方では反論という弁証法的プロセスで成り立っていると述べている。マイクロバイオームの分野では、さまざまな推測が飛び交っており、私たちは「新しい生物学」の入り口に立っているような印象を受ける。この分野でますますスリリングな推測を生み出すのではなく、修正されたコッホのような定説によってそれらを確固とした概念の土台に置くことを探すだけでなく、マイクロバイオームの作業仮説に対する反証を積極的に探すべきである。知識構築における反証は、科学界では現在過小評価されている。影響力の高い学術誌や助成機関は、新しい仮説を刺激することよりも、それに対する地に足の着いた反論を重視している。しかし、このような知識構築の両分野の不平等な評価は、知識の進歩のために反論の分野が十分に活用されていないという深刻な事態を招いている。

下痢の経験
このやや理論的な展望で終わりにする代わりに、私たち自身の健康・疾病分野におけるディスバイオシスの経験について簡単に触れておこう。バングラデシュで大腸菌性下痢症に苦しむ子供たちをコリファージ（ファージ療法）で治療しようとしたとき、私たちは患者の糞便微生物叢が地元の健康な対照群と比べて連鎖球菌の存在量が増加し、顕著なディスバイオーシスを示していることに気づいた（Sarker et al.） 大腸菌の力価は顕著ではなく、定量的な下痢パラメータと相関しなかったが、便溶連菌は相関した。下痢からの回復に伴い、連鎖球菌の量は減少し、糞便微生物叢は対照児のそれに近づいた。そのため、便中連鎖球菌数の増加を下痢と関連付けたくなった。しかし、溶連菌は2つの常在菌群（S. salivariusとS. bovis species complex）に属し、便分離株のゲノム配列からは病原性因子は検出されなかった（Sarker et al.） その後の研究で、下痢の病因に関係なく、明確に定義された小児の下痢病原体であるロタウイルスの患者を含めても、下痢患者において同じように便中連鎖球菌量が増加することがわかった（Kieser et al.） 便の細菌数と便量を補正すると、定量的に決定された溶連菌の便量は対照小児と比較して弱く増加しただけであった。相対的存在量の増加は、常に総細菌数で補正されるべきである：些細なことではあるが、多くのマイクロバイオーム研究で無視されている必須のコントロール（Vandeputte et al. 連鎖球菌数の増加と下痢との明らかな関連性は、単に水様性下痢病態（瀉下）によって典型的な大腸微生物叢が除去された結果、小腸の常在菌であり、小腸の蠕動運動が活発であるため腸が空っぽになってもあまり影響を受けない便性連鎖球菌が相対的に目立つようになっただけかもしれない（Brüssow, 2016）。下痢患者の他の2つの特別なグループ（急性下痢の栄養失調児、持続性下痢の小児）において、我々は別の糞便微生物叢異常症を観察した（Kieser et al.） 今回は、対照群と比較して、大腸菌の増加と絶対力価の増加が観察された。大腸菌はこれらの形態の下痢の病原体である可能性があるが（Sarker et al.、2017b）、メタゲノム配列決定では、患者の便における下痢特異的な病原遺伝子の増加は示唆されなかった。臨床データおよびマウスモデル（Faber et al.、2016）からの証拠に基づくと、その増加は抗生物質による治療の結果である可能性が高いと思われる。これらすべての症例において、下痢とディスバイオーシスの関連は、下痢の原因というよりもむしろ結果である可能性が高い。また、下痢からの回復とともにディスバイオーシスが改善するという観察結果は、因果関係を強く主張するものではない。

急性下痢症は持続期間が短く、自己限定的な疾患であるため、マイクロバイオーム研究の興味深いテストケースである。生理的な腸内細菌叢の均衡が自然に乱されることを意味し、病的過程によるその乱れと新たな均衡の再確立は、腸内における微生物-微生物相互作用のメカニズムを理解する上で有望である。

展望
抗生物質治療や大腸内視鏡検査準備のための腸内洗浄のような医療介入は、マイクロバイオーム解析にとって興味深い研究機会となる。これらのデータは急性下痢症研究から得られる知見を補完することができる。

疾患に対する腸内細菌叢異常の因果関係を検証するには、疾患が発生する前に全参加者の微生物叢組成を定期的に確立する前向き研究によってのみ可能である。このようなアプローチは、発展途上国の小児における下痢のように、高い頻度で発生する疾患であっても、労力とコストがかかる。病気の原因と疑われるディスバイオーシスが、顕在化した病気を発症する前の被験者で観察され、特定の病気を発症しない、年齢や環境をマッチさせた小児では観察されない場合、原因となる役割を合理的に予想することができる。決定的な証明には、やはり腸内細菌異常症による作用機序の証拠が必要である。我々は現在、バングラデシュで出生コホート研究を行っており、300人近い子供たちを対象に、2年間の観察期間と定期的な微生物叢サンプリングを組み合わせて臨床追跡を行っている。腸内細菌叢異常症とヒトの健康や病気との関連性を確固たる科学的根拠に乗せるためには、縦断的研究と「常在コッホの定説」を満たす研究が必要である。このような主張は科学的厳密主義のように聞こえるかもしれない。しかし、早計な結論に誘惑され、マイクロバイオーム研究をヒトの健康改善につなげるという非現実的な希望を抱かないためにも、私たちは、腸内細菌叢異常症／マイクロバイオーム分野で何が証明に必要なのかを認識しておく必要がある。

臨床介入試験こそが、マイクロバイオーム研究の実用的価値を見極めるための重要な試金石なのである。C.ディフィシル感染症における糞便移植の成功は希望の兆しであるが（Tariq et al., 2019）、工業製品を実現するためにも、また他の消化器疾患において糞便移植があまりうまくいかない理由を理解するためにも、糞便移植がどのように機能するのかをメカニズム的に解読する必要がある（Imdad et al.

謝辞
原稿を批判的に読んでくださったShawna McCallin博士に感謝する。

利益相反
申告なし。

参考文献
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