早産はゼノバイオティクスと関連し、膣内メタボロームで予測される

公開日：2023年1月12日
早産はゼノバイオティクスと関連し、膣内メタボロームで予測される
William F. Kindschuh, Federico Baldini, ...Tal Korem 著者紹介
Nature Microbiology (2023)この記事を引用する

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指標詳細

概要
自然早産（sPTB）は母体および新生児の罹患率と死亡率の主要な原因であるが、その予防と早期のリスク層別化は限られている。これまでの研究で、膣内の微生物や代謝物がsPTBに関与している可能性が示唆されている。ここでは、早産で終わった妊娠の80人の第2期膣サンプル232個を対象に、アンターゲットメタボロミクスを実施しました。膣内代謝物とその後の早産との間に複数の関連性を見出し、ジエタノールアミンやエチルグルコシドなど、これらの代謝物のいくつかは外因性であることを提唱する。また、16SリボソームRNAアンプリコンシークエンスで得られたマイクロバイオームプロファイルとメタボロームの間に関連性が見られ、Gardnerella vaginalisなどの最適でないと考えられる細菌と、チラミンなどの満期妊娠に豊富に含まれる代謝物との間に相関があることがわかりました。私たちは、代謝モデルを用いてこれらの関連性を調査しています。機械学習モデルを用いて，出産の数週間から数カ月前の代謝物レベルからsPTBリスクを予測したところ，高い精度（受信者動作特性曲線下面積0.78）で予測することができた．これらのモデルは、2つの外部コホートを用いて検証し、マイクロバイオームベースおよび母親の共変量ベースのモデルよりも正確である（受信者動作特性曲線下の面積は0.55～0.59）。この結果は、sPTBの早期バイオマーカーとしての膣内代謝物の可能性を示し、未熟児の潜在的リスク因子としての外来性曝露を浮き彫りにしています。

主な内容
妊娠37週未満の出産である早産（PTB）は、新生児死亡の主な原因であり、生涯にわたってさまざまな病的状態に陥る可能性があります1,2。また、PTBには顕著な人種間格差があり、黒人女性におけるPTB率が大幅に高いことが明らかになっています3。この格差は、制度的・環境的な人種差別による持続的なストレスや、妊産婦ケアへのアクセス不足など、さまざまな要因によってもたらされています4。自然早産（sPTB）、医学的に誘発されないPTBは、PTB全体の3分の2を占めます1。広範な努力にもかかわらず、PTBを早期に予測、予防または治療する方法は欠如しており1,5,6、その有病率は依然として高い1。

ヒトのマイクロバイオームは、多くの複雑な疾患の強力なバイオマーカーです7,8,9,10,11。特に膣内マイクロバイオームは、sPTBやその他の有害な妊娠転帰と繰り返し関連しています12,13,14,15,16,17。しかし、膣マイクロバイオームと妊娠悪阻の関係については明確なコンセンサスが得られておらず18、妊娠悪阻における宿主-マイクロバイオーム相互作用の基盤となる特定のメカニズムに関する知見は不足しています。

マイクロバイオームが産生または修飾する代謝産物は、宿主に局所的および全身的な影響を及ぼす可能性のある顕著な要因として浮上している19,20,21,22。その研究は、生態系に存在する何千もの小分子の測定を可能にするメタボロミクスによって促進され、マイクロバイオーム-メタボロームペア研究によって、さまざまな病態における宿主-マイクロバイオーム相互作用のメカニズム解明が期待されています23,24。膣メタボロームに関するいくつかの研究では、マイクロバイオーム、炎症およびPTBとの関連について述べられています25,26。しかし、未熟児やその他の妊娠の結果における膣の生態系の役割についての理解を深めるためには、幅広い代謝物のセットを測定し、sPTBの堅牢な予測モデルを作成する、sPTBの高リスクの人口集団を対象とした研究が依然として必要である。

ここでは、16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンシークエンス14を用いて微生物叢の特性評価を行った妊婦232名の第2期膣内メタボロームを測定しました。膣メタボロームが部分的に群集状態タイプ（CST）に対応することを示し、妊娠中期に測定した代謝物とその後のsPTBとの関連を明らかにし、これらの代謝物の一部は外因性のものであることを提案する。最後に、膣内メタボロームを用いて、出産3ヶ月前以降のsPTBを予測する機械学習アルゴリズムを考案し、2つの外部コホートで検証を行った。この結果は、未熟児の潜在的な原因を研究し、早期のリスク層別化を行うための有望なアプローチであることを示しており、sPTBの危険因子として環境曝露を研究する必要性を強調しています。

研究成果
妊娠コホートからの膣内細菌叢とメタボローム
単胎妊娠の女性から妊娠20週から24週の間に採取した232個の膣サンプルを質量分析計でプロファイリングしたところ、同じタイムポイントから微生物叢が以前に特徴づけられていた14（補足表1および方法）。その後のsPTBと利用可能なサンプルを持つすべての女性（N = 80）、および類似の有期産対照（TB; N = 152）を対象とした（表1）。予想通り、PTB歴はsPTBと関連していた（フィッシャーの正確なP = 3 × 10-4）。

表1 コホート特性
フルサイズ表
635の同定された代謝物および110の無名のスペクトル特徴を定量化した（Methods）。代謝物は、アミノ酸、脂質、ヌクレオチド、炭水化物、ゼノバイオティクスなど、多様な生化学的クラスに属していた。ほとんどの代謝物 (549) はコホートの 50 % 以上で測定され、108 の代謝物はすべてのサンプルに存在しました (Extended Data Fig. 1; サンプルのバッチ処理については、補足説明 1 および Extended Data Fig. 2 を参照してください)。我々は以前、同様の測定値が独立した認定医療検査機関の測定値と非常によく一致することを示しました27。

膣メタボロームはCST構造を部分的に保存している
膣内マイクロバイオームは、明確に定義されたCSTに集まっている28。我々は、このコホート14について同じことを証明し（順列的多変量分散分析（PERMANOVA）P < 0.001; 図1a）、膣メタボロームがこの構造を再現しているかどうかを調査した。メタボロームはCSTによって分離され（P < 0.001；図1b）、以前に説明したように、一般的にマイクロバイオームと関連していた（Mantel P < 0.001）29。しかし、特定のCSTはそれほどうまく分離されていなかった。CST-I（Lactobacillus crispatusが優勢）とCST-IV（多様な嫌気性菌に富む）のマイクロバイオームを持つ女性のメタボロームは、他のコホートとよく分離していたが（PERMANOVA P < 0.001）、CST-IとCST-IVのメタボロームは、どちらも他のコホートとよく分離していなかった。 001）、CST-IV-AとIV-B、CST-II（Lactobacillus gasseriに富む）とCST-III（Lactobacillus inersに富む）の女性の代謝系は互いにあまり分離しなかった（それぞれ、P = 0.158 と P = 0.155 ）。全体として、これらの結果は、膣マイクロバイオームとメタボロームの間に強い対応関係があるが、不完全であることを示しています。

図1：腟のメタボロームクラスターはPTBと関連している。
図1
a-c、マイクロバイオーム（a、N = 503）およびメタボロームデータ（bおよびc、N = 232）のUMAP順序付け、CST（aおよびb）または代謝物データのde novoクラスタリング（c、MC；方法）で色分けしたもの。膣マイクロバイオームとメタボロームは、CSTによって有意に分離されています（PERMANOVA P < 0.001 for both）が、メタボロームではその分離はあまり明確ではありません。d, 代謝物プロファイルが各MCにクラスター化した女性の割合で、CSTごとに分けて示した。 f, マイクロバイオームが各CSTに属する白人（上）および黒人（下）女性の割合で、妊娠経過ごとに分けた。g, fと同様に、代謝物が各MCにクラスター化した女性の割合。黒人女性において、sPTBとMC A、B、Dとの有意な関連性が示された（それぞれP = 0.047, P = 0.025, P = 0.006, q < 0.1)．d-gの横線の上の数字は、両側フィッシャーの正確なP、q < 0.1。

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代謝物クラスターとSPTBの関連性
次に、メタボロームのde novo k-medoids clusteringを行ったところ、6つの「代謝物クラスター」（MC A-F；方法、図1c、拡張データ図3、補足表2）が明らかになりましたが、膣マイクロバイオームとCSTの分離ほどには分離されていません。各MC内で最も濃縮された代謝物サブパスウェイは、MC A-Fではそれぞれポリアミン代謝、ジペプチド、ジカルボン酸代謝、グルタミン酸代謝、トリカルボン酸サイクル、ジペプチドでした（いずれもフィッシャーの正確 P < 0.05）．アミノ酸関連代謝物はMC A,B,D (P < 0.01, q < 0.1 for all)で、異種代謝物はMC-C (Fisher's exact P = 0.005, q < 0.1) で同様に濃縮されていました。MC A-Dはほとんどが乳酸菌主体のCSTと対になっているが（54-93%）、MC-FはすべてCST-IVで構成され、MC-Eは均等に分かれている（50% CST-IV; Fig. 1d and Extended Data Fig. 4a）。逆に、MCでは様々なCSTが濃縮されていることがわかった（Extended Data図4b）。

このコホートにおけるグローバルマイクロバイオームシグネチャーと自称人種の間の強い関連性（PERMANOVA P < 0.001; 拡張データ図4c）と同様に、黒人女性と白人女性のメタボロームの間に有意差があることがわかりました（P < 0.001; 拡張データ図4d）。しかし、これらのサブグループの間では、MCへの割り当てにわずかな違いしか認められませんでした（図1e）。興味深いことに、CSTはsPTBと弱い関連しかなく、白人女性においてのみである（フィッシャーの正確なP = 0.047, q = 0.21; 図1fおよび拡張データ図4e; 以前の分析14と同様）一方で、いくつかのMCが黒人女性においてsPTBと有意に関連していることが分かった（MC A、B、Dについてそれぞれ、P = 0.047, P = 0.025, P = 0.006; 全てにおいてq < 0.1; 図1gおよび拡張データ図4f)。しかし、早期PTB（32週未満、q＞0.1、拡張データ図4g）との有意な関連は観察されなかった。これらの結果を総合すると、このコホートにおけるメタボローム構造は、マイクロバイオーム構造よりも黒人女性における未熟児との関連をよりよく捉えていることが実証された。

複数の代謝産物がsPTBと関連する
次に、sPTBと特定の代謝産物との関連について調べました。その結果、sPTBと有意に関連する代謝物が4つ見つかった（Mann-Whitney P < 0.05, q < 0.1; Fig. 2aおよびExtended Data Fig.） このうち、β-グルコピラノシドエチル（ethyl glucoside; P = 1.9 × 10-4, q = 0.065）; 酒石酸（tartrate; P = 4.8 × 10-4, q = 0.078）; そしてジエタノールアミン（DEA; P < 10-10, q = 5 × 10-8）は、いずれもSPTBで高く、外因性であるようだ30, 31,32,33,34,35,36. 我々は、代謝物の起源を予測する手法であるAMON37（Methods）を用いてこれを確認したところ、DEAと酒石酸塩は異種物質起源であると予測された（エチルグルコシドについては予測できなかった；補足表3）。注目すべきは、DEAがMC-A (P = 0.006, q = 0.014) とMC-D (P = 0.04, q = 0.07) にも関連していることである（図1-g）。外因性である可能性が高いにもかかわらず、これらの代謝物はこのコホートの95%超で検出されました（拡張データ図5b）。

図2：腟内代謝産物とその後の早産との関連。
図2
a、特定の代謝物測定値と出生アウトカムとの間の統計的に有意な関連（両側Mann-Whitney P < 0.05）を示すヒートマップ、母親の人種で層別し、関連の有意性と方向で色分け。FDR <0.1の関連が少なくとも1つある代謝物のみを表示。代謝物は、平均符号付き（倍数変化の方向）対数P値でソートされている。 b, sPTBと有意な関連を持つ3つの代謝物の箱ひげ図（線は中央値、箱はIQR、ひげは1.5×IQR）。b で示した 3 つの代謝物に関する文献の一部を要約した図。sPTB と関連する DEA は、コリンの取り込みを阻害することが示されている41。結核に関連するコリンとベタインは、膜脂質合成と浸透圧調節に重要である38,40。 d、a と同じで、GAB による層別化、黒人女性で実施。NSは有意ではなく、q＜0.1は明るい色で示されている（凡例）。

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我々はさらに、sPTBを発症した女性ではコリンレベルが低いことを発見した（P = 5.5 × 10-4, q = 0.078；図2a,b）。コリンは必須栄養素であり38、未熟児の臍帯血でコリン濃度が低いことが以前に判明している39。コリンはまた、ベタイン40の前駆体であり、これもまたsPTBと負の相関があった（P = 0.007, q = 0.29; Fig.2b）。DEAはコリン代謝を阻害することが知られており41、マウスに経皮投与すると肝コリンを枯渇させる42,43。したがって、我々は、sPTBにおけるDEAの高濃度は、コリンおよびベタインの低濃度とも関連している可能性を提案する（Fig. 2b、c）。DEA はさらに、マウスにおいて発がん性44 および催奇形性42 があることが示された。しかし、我々のメタボローム解析は相対的なものであるため、過去の研究で測定されたレベルとの定量的な比較はできない。これらの結果を総合すると、未熟児におけるいくつかの代謝物の役割の可能性が強調され、そのうちのいくつかは環境暴露から外来的に生じる可能性がある。

代謝物の関連は人種およびsPTBのタイミングと相互作用する
黒人女性と白人女性ではメタボロームが異なるため、人種で層別化しながら同様の関連性解析を行った。興味深いことに、sPTBと負の相関を示す代謝物が5つ追加で検出された（Mann-Whitney P < 0.05, q < 0.1; 図2aおよびExtended Data 図5a）。黒人女性では、以前に子癇前症で変化すると報告されたグリセロホスホセリン（P = 3 × 10-5, q = 0.014）、以前に早産児の血液で増加すると示されたスペルミン（P = 3.5 × 10-4, q = 0.07）46、ヒドロキシブチルカルニチン（P = 2. 6 × 10-4, q = 0.065）、低出生体重の満期新生児47の血液中で枯渇していることが示されているケトカルニチン、およびグルタミン酸γ-メチルエステル（P = 4.9 × 10-4, q = 0.078）である。生物起源アミンであるチラミンは、早産だった白人女性のサンプルで有意に低かった（P = 2.8 × 10-4, q = 0.065; Fig.2a）。チラミンはマウスの子宮叢のシナプス小胞と共局在することが示されており、子宮収縮に関与している可能性があることが強調された48。これらの結果から、膣内の代謝物、他の臓器の代謝物レベル、およびsPTBに関連する可能性があることが明らかになった。

このコホートでは、数人の参加者（N = 13、黒人女性ではN = 11）がサンプル採取前または採取間近（妊娠18〜23週）に膣内プロゲステロン投与を受けていたため、膣内プロゲステロン投与を受けていない女性のみで同様の解析を行った。黒人女性におけるグルタミン酸γ-メチルエステルと結核の関連（図2a）は、もはや多重仮説検定の補正を通過しなかった（P = 0.002, q = 0.12; Extended Data 図5c）。しかし、黒人女性では、さらに7つの代謝物が結核と関連していることがわかりました（すべてP < 0.05; q < 0.1; Extended Data Fig.5c）。これらには、コラーゲン49のアミノ酸残基の約4分の1を占め、細胞外マトリックスに不可欠であるプロリン（P = 6 × 10-4, q = 0.08）、胎盤血管新生50に重要なポリアミンであり、sPTB後の黒人女性で低かった（P = 4 × 10-4, q = 0.08）、ベタイン（P = 9 × 10-4, q = 0.091）などが含まれていた。プロリンから生成され、スペルミンなどのポリアミンの合成に必要なN-アセチルアルギニン（P = 0.0015, q = 0.102）も、sPTB後の黒人女性で低値であった。胎盤の血管新生の障害と細胞外マトリックスのリモデリングは、いずれもsPTBと関連している51。

早産はより悪い転帰と関連している1。したがって、次に、膣内代謝物とその後の超早産および極早産（出生時の妊娠年齢がそれぞれ32週未満および28週未満）との関連性を調査した。この分析では、黒人女性の割合が高いため、黒人女性に限定した（それぞれ26人中21人、15人中14人）。これらの早期のSPTBにのみ関連する13の代謝物を同定した（P < 0.05, q < 0.1; Fig. 2d）。リン脂質であるパルミトイルスフィンゴミエリンとパルミトイルジヒドロスフィンゴミエリンは、ともに極度のPTBと負の相関を示した（それぞれP = 8.7 × 10-4, q = 0.061 および P = 0.0011, q = 0.069）。シトラコン酸は同様に極めてPTBと負の相関があり（P = 0.0014, q = 0.075）、以前に重症子癇前症の女性の胎盤ミトコンドリアにおける濃度が低いことが判明している52。また、マンノース（P = 4 × 10-4, q = 0.052）は大腸菌などの泌尿器科病原体と以前から関連があり53、アラビノース（P = 9 × 10-4, q = 0.061 ）は細菌性膣炎（BV）54と以前から関連があり、マンニトール／ソルビトールはPTB55と関連があるなど、いくつかの糖または糖アルコール代謝物が初期のPTBで高いことが判明しています。エチレンジアミン四酢酸（EDTA）は、外因性56,57,58であることがAMONによって確認され（方法および補足表3）、PTBが非常に多い場合（P = 8 × 10-4, q = 0.061 および P = 1.6 × 10-4, q = 0.044）にも増加した。EDTAは膣上皮細胞で細胞毒性を示し59、ラットでは非殺傷性用量で催奇形性を示す57,60。EDTAは、このコホートの女性の100％から検出され（拡張データ図5b）、これは、サンプル収集バッファに含まれることから予想されることではあるが、このことがこれらの関連を説明することはないだろう。全体として、sPTBとの代謝物の関連は、人種とsPTBのタイミングの両方と相互作用することがわかり、さらにsPTBと関連する異種物質が検出されました。

sPTBとの関連に富む機能的な代謝物群
次に、代謝物の機能グループ（例えば、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）パスウェイ61；補足表4）が、特定の代謝物に対する変化が小さくても、SPTBとの関連に富むかどうかを調べた（Methods）。プロリンおよびアルギニン代謝に有意な濃縮が見られ（P = 0.0018, q = 0.058; 拡張データ図5d）、プロリンおよびN-アセチルアルギニンに関する知見（拡張データ図5c）と一致する。さらに、白人女性におけるチラミンと結核の関連性（図2a）と再び一致するが、白人女性では内分泌系に関連する代謝物が豊富に含まれていることがわかった（P = 0.0045, q = 0.077; Extended Data 図5d）。さらに、脂質代謝関連代謝物が、黒人女性の早期sPTBとの関連で濃縮されることを確認し（非常にPTBと非常にPTBではそれぞれP = 0.0019, q = 0.032およびP = 0.0047, q = 0.038；拡大図5d）、PTB62で報告された他の脂質代謝変化に関連している可能性があった。特に、黒人女性では、sPTBに関連するゼノバイオティクスが全体的に濃縮されており（P = 0.006, q = 0.054; 拡張データ図5d）、特定の代謝物に関する我々の発見と一致した（図2）。

sPTBにおける微生物と代謝物の関連性ネットワーク
次に、推定された微生物種の絶対量とsPTB関連代謝物の相関を調べた（Methods）。その結果、sPTBと代謝産物の関連とは異なり、微生物と代謝産物の関連は、人種およびsPTBのタイミングの両方と弱い相互作用を示した（補注2）。この結果は、Dialister speciesやEnterococcus faecalisとチラミン63,64（Spearman ρ > 0.54, P < 10-10, q < 0.1 for all；図3aおよびExtended Data Fig.6a）など、複数の既知の関連性を再現している。6a）、G. vaginalis65 と Corynebacterium aurimucosum66 におけるコリン代謝の証拠（それぞれ、ρ = 0.34, P < 10-6, q = 1.7 × 10-5 および ρ = 0.40, P = 4 × 10-4, q = 0.006）であった。さらに、BV67ではより高いチラミン濃度が以前から見つかっており、我々が見つけたBV関連微生物との関連性を裏付ける結果となった（Fig.3a）。

図3: 微生物-代謝産物相関と代謝モデルから示唆されるsPTB関連代謝産物の供給源。
図3
a, sPTBに関連する代謝物との微生物相関のネットワーク。楕円は微生物種、青と赤の菱形はそれぞれ結核とsPTBに富む代謝物、青と赤の辺はそれぞれFDR < 0.1, |ρ| > 0.25 の負と正のスピアマン相関、辺の幅、中央値ρ。グループ化ノードなしの同じネットワークについては、拡張データ Fig. b,c、箱ひげ図（線は中央値、箱はIQR、ひげは1.5×IQR）、測定値（b）および代謝モデルで予測したチラミンレベル（方法、c）、早産と期産の比較および母親の自認する人種による層別化。早産した白人女性は，測定した膣内のチラミンレベルが低かったが（P = 0.0002），我々の代謝モデルでは，早産した女性において，非統計的に有意ではあるが，マイクロバイオームによるチラミン産生が高いと予測された（全人口および白人女性でそれぞれ P = 0.18，P = 0.26）．d、マイクロバイオーム代謝モデル（NMPC、Methods、Y軸）を用いて測定したチラミンレベル（X軸）に対してプロットし、人種および出生転帰で色分けしたもの（凡例）。我々のモデルはチラミンに対して概ね正確であるが（Spearman ρ = 0.62, P < 10-10 全女性共通）、早産した白人女性の精度は著しく低かった（Spearman ρ = 0.19, P = 0.02 相関強度と他の女性における相関を比較、両面フィッシャーR-z変換）、我々のモデルでは把握できない菌株、機能能力の違いまたは非微生物間相互作用を示唆した。

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sPTBと正の相関を示すゼノバイオティクスと膣内微生物の相関は、他の代謝物について観察された相関よりも有意に弱いことに注目します（Mann-Whitney P = 0.024）。例えば、DEAは、すべての膣内微生物と弱い相関しか示していない（ρ < 0.23、すべての微生物でq > 0.1）。この観察は、これらの代謝物の外因性供給源をさらに支持するものである。

チラミン（35件、スピアマン0.27＜ρ＜0.73、図3a）については、最も強い相関が見られ、その数は白人女性で結核が多いことが分かりました（図2a）。チラミンに関連する35種類の微生物のうち8種類は、コリンとも相関があり、全女性で結核に濃縮されていた（図2a）。興味深いことに、Atopobium vaginae、G. vaginalis、いくつかのPrevotella種、BV-associated bacteria（BVAB）など、結核関連代謝物と正の相関を示す種の多くは、BV68、PTB13、14、15、17などの負の転帰、および妊娠69や新生児70の有害転帰と関連があると以前に報告されている。また、BV71や早産児の敗血症72と関連するStaphylococcus epidermidisと酒石酸塩およびエチルグルコシド（それぞれρ = -0.28, P = 6.9 × 10-4, q = 0.009, ρ = -0.26, P = 0.0015, q = 0.016, 図3a）には、同様に逆説的に負の相関が見られ、これらはsPTBと正の相関を持っていることが明らかにされた。したがって、これらの関連性の多くが知られていたとしても、我々の結果は、最適でない膣内微生物、sPTB関連代謝物、健康アウトカム間の複雑な相互作用も示唆しています。

マイクロバイオームによるチラミン産生を裏付けるメタボリックモデル
このモデルは、遺伝学的および生化学的知識を統合して、各微生物サンプルの代謝出力（コミュニティの純最大生産能力73（NMPC）、方法）を予測するものである。我々のモデルは、プトレシンやヒスタミンなど、膣マイクロバイオームによって生成されることが知られているいくつかの代謝物について正確な予測を示しています（NMPCとメタボローム測定値の間のスピアマンρ = 0.64、N = 214、P < 10-10およびρ = 0.54、N = 167、P < 10-10, それぞれ；拡張データ図7a、図7b）。

2つのsPTB関連代謝物、チラミンとコリンは、我々のモデルで表現された。我々のモデルでは、コリンは膣マイクロバイオームの影響を受けないと予測されたため（すべての女性でNMPCは0）、我々は、先行研究が膣微生物によって生成されることを示唆しているチラミンに焦点を当てた63,74。ゲノムキュレーションの結果（Methods）、我々のモデルの予測は非常に正確だった（Spearman ρ = 0.62, N = 229, P < 10-10; Extended Data Fig.7c）。興味深いことに、白人女性では、測定されたチラミンレベルは結核に濃縮されていたものの（Mann-Whitney P = 2.8 × 10-4；図3b）、予測されたマイクロバイオーム出力はそうではなく、sPTBではさらにやや高い（P = 0.26；図3c）ことが分かった。これは、早産した白人女性のチラミン予測精度が低いことに起因する（Spearman ρ = 0.19 対 ρ = 0.65、ρの差はP = 0.02、図3d）。

この精度の差は、代謝モデルにおける微生物の表現では説明できず、実際、黒人女性では低く（Mann-Whitney P = 0.05, Extended Data Fig.7d） 、おそらくこの集団では膣の微生物多様性が一般的に高いためである75。さらに、チラミン予測精度は、代謝物の取り込みに関する制約や、低存在量の分類群の代表性に対して敏感ではありませんでした（方法、補足表5および拡張データ図7e）。これらの分析から、白人女性のsPTBにおけるチラミン予測精度の低さは、モデリングのアーチファクトの結果ではないことが示唆されるため、精度の違いは、株の違い、機能的能力、または微生物以外の効果に起因する可能性がある。また、いずれの現象も、前述のチラミンと微生物との逆説的な関連性を説明する可能性がある（図3a）。微生物の違いまたは宿主の影響の可能性は、チラミンが微生物または宿主由来であると予測するAMON37によっても支持されている（補足表3）。全体として、今回の結果は、マイクロバイオーム-メタボローム相互作用の研究における代謝モデルの有用性を示すとともに、さらなる研究のための興味深い仮説を提起している。

膣メタボロームによるSPTBリスクの早期予測
未熟児リスクの高い妊娠を早期に診断することは、予防・介入戦略の開発にとって極めて重要です。そこで、出産3か月前（平均14.5±4.2週）に収集した臨床データ、マイクロバイオームデータ、メタボロームデータを用いて、その後のsPTBを予測できるかどうかを検討した。我々は，ブーストされた決定木を使用したが，これは代替モデルよりも優れていた（拡張データ図8a）．マイクロバイオームおよびメタボロームベースのモデルでは，白人女性と黒人女性で別々のモデルを使用するように，複合予測因子をトレーニングした．各モデルの有効サンプルサイズが小さいにもかかわらず、この方法はより良いパフォーマンスをもたらした（Extended Data 図8b）。我々は，テストデータのリークを伴わないネステッドクロスバリデーションを用いて，ホールドアウトサンプルですべてのモデルを評価した（Methods）．

臨床データ（年齢、肥満度（BMI）、人種、PTB歴、無月経）と微生物量データを用いたモデルでは、精度に限界がありました（臨床データの受信者動作特性曲線下面積（auROC）0.59、精度-再現曲線下面積（auPR）0.46、微生物量データのauROC = 0.55, auPR = 0.41、モデルの差はP = 0.12; Methodsおよび図4a、b）。注目すべきは、メタボロミクスデータを使用して、優れた精度のモデルを生成できたことです（auROC = 0.78, auPR = 0.61, 臨床またはマイクロバイオームモデルとの比較でP < 10-10; Methodsおよび図4a,b）。最後に、臨床データ、マイクロバイオームデータ、メタボロームデータを組み合わせたモデルは、メタボロームベースモデルと同等の精度（auROC = 0.76, auPR = 0.62, P = 0.44 対 メタボロームベースモデル；拡張データ図8c、d）で、代謝物がモデルに最も大きく寄与していることが分かりました（拡張データ図8e）。このことから、代謝物測定は、sPTBに関して、これら3つのデータタイプに含まれる情報を十分に表現していることがわかります。

図4: メタボロミクスに基づく、その後のSPTBの予測。
図4
a,b, 臨床データ（auROC = 0.59, auPR = 0.46）, マイクロバイオームデータ（auROC = 0.55, auPR = 0.41）, メタボロミクスデータ（auROC = 0.78, auPR = 0.61） に基づくモデルについて sPTB の予測精度を比較した Receiver operating characteristic (ROC, a) および precision-recall (PR, b) カーブ（凡例）, nested cross-validation (Methods) において評価される。すべてN = 232。斜線は、5つの独立した外側の10倍クロスバリデーションによる抽選の結果を示す（Methods）。対象基準、測定代謝物、バッチ効果が異なる難しい再現設定にもかかわらず、我々の予測器は再トレーニングなしで比較的正確な予測を得ることができました（Ghartey 2017（N = 50）および2015（N = 20）コホートについてそれぞれauROC = 0.66, auROC = 0.65, Methods）。 d, 代謝物ベースの予測器において最も予測性の高い10代謝物についての、重要度の降順に並べた合計予測（SHAPベース83、X軸）に関する影響。各ドットは特定のサンプルを表し、色はそのサンプルにおける代謝物の相対的なレベルを他のすべてのサンプルと比較したものに対応します。

フルサイズ画像
私たちのメタボロームベースのモデルは、羊水メタボローム（auROC 0.65-0.70, N = 24）（文献76）、母親血清メタボロームと臨床データ（auROC 0.73, N = 164）（文献77）、母親尿と血漿メタボローム（auROC 0.69-0.79, N = 146）などの既出のモデルよりも精度で優れているか同様であることが分かりました。 69-0.79、N = 146）（参考文献78）、血中無細胞RNA測定（auROC 0.81、N = 38）（参考文献79）または膣タンパク質バイオマーカー（auROC 0.86、N = 150、sPTB N = 11）（参考文献80）は、サンプルサイズが小さい、人口動態の多様性がない、高リスクコホートに焦点を当てている多くが存在します。全体として、今回の結果は、sPTBの早期かつ正確なバイオマーカーとして、膣内代謝物の有用性が期待できることを示しています。

次に、同じモデルを再トレーニングなしで、同じホールドアウトデータ（つまり、結果の真実の分類のみが変更された）から黒人女性における極めて高いPTBを予測するために評価しました。興味深いことに、メタボロームベースのモデルは、精度がわずかに低下した（黒人女性のsPTBに対するauROCの0.77に対して、極めてPTBと非常にPTBに対するauROCはそれぞれ0.69と0.73；P = 4.3 × 10-4 とP = 0.001；拡張データ図）。 001，それぞれ；拡張データ図 8f），微生物ベースのモデルは，精度の向上を示した（auROC 0.55 に対して，auROC 0.69 と 0.62；P = 0.031 と P = 0.49，それぞれ；拡張データ図 8g）．これらの結果は、早期のSPTBにおける膣内マイクロバイオームの関与が高まる可能性を反映していると考えられる1。

外部コホートにおける代謝物ベースの予測変数の再現性
メタボロームベースのモデルの一般性を検証するために、我々は2つの独立したコホートでその精度を検証した（方法）：妊娠24〜28週にサンプルを収集した、PTBに対して高リスクの、ほとんど（75％）白人の女性20人（PTB10）のケースコントロール研究（「Ghartey、2015」）（ref. 81）、および早産の症状を呈しPTB歴のない50人の女性（20人のPTB）、ほとんど（88％）黒人のケースコントロール研究（「Ghartey, 2017」）（文献55）、妊娠22-34週にサンプルを採取した。

この検証は非常に困難でした：異なる対象基準および集団構造のため、異なる研究間でメタボローム測定における実質的なバッチ効果82、そして最後に、データが4-6年前に生成されたため、私たちの予測因子によって使用される代謝物のごく一部しか測定されませんでした（34％および39％）。これを強調するために、これらのコホートでは、膣内代謝物とsPTB（図2a）の間に検出した10の関連性のうち1つと2つ（それぞれGhartey 2015と2017について）しか調べることができず（方法）、そのうちどれも有意ではなかった（マン・ホイットニーP>0.05）。これらのsPTBに関連する代謝物は、おそらく予測に重要な特徴であり、これらのコホート全体での一般化を困難にしている。この困難な設定にもかかわらず、再トレーニングや適応を行わず、今回プロファイリングした232サンプルに対してのみトレーニングした我々のメタボロームベースの予測器は、両方の外部コホートにおいて比較的正確な予測を行いました（Ghartey 2015と2017についてそれぞれauROC = 0.65, auPR = 0.67, auROC = 0.66, auPR = 0.58, 図4cおよび拡張データ 図8h,i）。これらの結果は、膣メタボロームと研究特有のバイアスに対する我々の予測アプローチの頑健性を示しています。

モデルの解釈により、他の寄与する特徴が明らかに
モデルで使用される特徴についての洞察を得るために、SHapley Additive exPlanations（SHAP）83を使用して各サンプルの予測に対する各特徴の寄与を評価しました（補足表6）。予想通り、最も予測精度の高い10種類の代謝物のうち、DEA、チラミン、アラビノース、グルタミン酸γ-メチルエステル、マンニトール/ソルビトール、マンノースの6種類が関連解析でも確認され、同様の関連方向性を示した（図2、4d）。さらに、ピペコレートが高く、ラクトシル-N-パルミトイル-スフィンゴシンとオロチジンが低いと、sPTB予測に寄与することが分かった。これらのうち、ピペコレートはBV84の女性で高いことが示された。

我々のマイクロバイオームベースの予測因子に関する同様の分析では、Mobiluncus mulieris14 と Finegoldia magna85 、Lactobacillus14 と Dialister species15 を含む膣内微生物と sPTB との関連も以前に検出されている (Extended Data Fig. 8j)．これらの結果は、我々のモデルの解釈のしやすさと、複雑な非線形相互作用をモデル化する能力を強調し、一変量解析では検出されなかった関連性を明らかにすることを可能にするものである。

考察
本研究では、232名の妊婦の第2期膣内メタボロームを測定しました。その結果、膣マイクロバイオームとの関連、および代謝物シグネチャーが黒人女性におけるsPTBに濃縮されていることが示された。また、黒人女性と白人女性で別々に、sPTBと関連する複数の代謝物を同定した。その結果、sPTBと強い相関を持つ外因性代謝物が明らかになり、これらは重要なリスク因子であることが示唆された。さらに、結核に関連する代謝物と潜在的に最適でない微生物との間の興味深い相互作用を明らかにし、早産した白人女性におけるチラミンの膣内代謝の差異を提案する。最後に、メタボロームベースのモデルにより、その後の結核を数週間から数カ月前に予測できることを示し、早期診断への道を開く可能性を示しました。

我々は、SMTPBに関連するいくつかの異種物質を検出した。DEA、エチルグルコシド、酒石酸塩、EDTAは、先行文献や機能解析37から、外因性であることが示唆されている。DEAは、天然由来が知られていない化学物質86で、一般的に掘削や金属加工液35に使用され、生殖年齢の女性が多く暴露される87、エチルグルコシドはアルコール含有製品31に含まれ、いずれも衛生的で化粧品製品の前駆体または成分である30,33。酒石酸塩とEDTAは食品添加物として使用され32,58、また衛生用品や化粧品にもよく含まれている32,57。これらの代謝物の出所は特定されていないが、いずれも衛生用品や化粧品に含まれていることが記録されていることから、これらの製品の中にはsPTBのリスクを高めるものがあるのではないかと懸念される。我々の結果は、妊娠中の環境暴露に関する懸念を示した最近の研究88,89と一致し、生殖管にこれらの化学物質が存在することが確認された。これらの代謝物の発生源を特定し、宿主、マイクロバイオーム、妊娠転帰に対する影響を明らかにし、様々な製品および妊娠中の使用に関する政策提言を行えるように、さらなる研究が必要である。

私たちが分析したコホートには黒人女性が多く含まれており、PTBやその他の有害な妊娠転帰の負担が不釣り合いである一方で、多くの研究で少数に限られている女性のPTBを研究する機会を提供しています。しかし、母親の自認する人種は、サンプリング時の既存の違い、格差、臨床共変数を複雑に表しているため、黒人女性と白人女性との関連性の違いから結論を導き出すことには注意が必要である。黒人女性はパーソナルケア製品を通じて内分泌撹乱化学物質に多く暴露されているという報告92,93や、PTBを引き起こす要因として外来化学物質を同定した研究94,95と一致している。メタボローム曝露パターンは、未熟児率の人種間格差と膣マイクロバイオームの人種間差との関連に寄与している可能性がある96。

我々は、微生物によるチラミン代謝を調査するために、コミュニティスケールの代謝モデルを使用したが、これには重要な限界がある。モデルのキュレーションは現在進行中の作業であるため、モデルは各サンプルに合わせて調整されていない可能性があり、ニッチ特有の代謝能力を表現できていない可能性がある。また、16S rRNAアンプリコンシーケンスの分解能に起因するもう一つの限界は、種または属レベルで分類群を特定するため、菌株固有のモデリングができないことである。これらの制限にもかかわらず、我々のモデルはいくつかの代謝物を正確に予測し、チラミンの潜在的な供給源に関する知見を提供しました。

1）sPTBに富むケースコントロールコホートを使用したため、集団レベルの予測値を評価する能力に限界があり、前向き研究でさらなる検証を行う必要がある。(2) このコホートはsPTBに焦点を当てたものであるため、我々のモデルがsPTBに特化したものか、あるいは妊娠の有害事象に対する一般的なリスクを検出しているのかを評価することはできない。(3）我々のモデルで人種を使用することは、医学界では一般的であるが97、議論の余地があり、実施に際して問題を生じる98。これは、このコホートにおける黒人女性と白人女性のサンプルサイズと膣メタボローム自体の違いによってもたらされ、全体的に精度を高める結果となりました。(4)最後に、さらに以前のサンプルを予測に使用することで、さらに未解明の可能性がある。サンプルサイズを大きくし、母親の尿や血清メタボローム、膣メタゲノミクス、無細胞RNA測定など、他のデータソースと組み合わせることで、予測精度をさらに向上させることができるかもしれません。

私たちの結果は、PTB の初期バイオマーカーとしての膣内代謝物の有用性を示し、黒人女性に不釣り合いに影響する可能性のある修正可能な sPTB 危険因子としての異種代謝物を同定しました。私たちが観察した強い関連性は、子癇前症、PTBおよびBVのような他の有害な妊娠転帰との関連において、膣マイクロバイオームおよびメタボロームの調査を動機づけるものです。

研究方法
研究デザインおよびコホートの説明
我々は、以前に収集され記載されたMotherhood and Microbiomeコホート（NCT02030106）からバンクされたサンプルを分析した（参考文献14）。このコホートは、ペンシルバニア大学（IRB 818914）およびメリーランド大学医学部（HP-00045398）の機関審査委員会によって承認され、すべての参加者が書面によるインフォームドコンセントを提供した。Motherhood and Microbiome cohortは、妊娠20週以前の単胎妊娠の女性2,000人を募集した。女性は出産まで追跡され、sPTBは、子宮頸管拡張および/または膜早期破裂の提示を伴う妊娠37週以前の出産と定義された。このうち、503人の女性の膣内細菌叢は、妊娠20～24週に採取した膣スワブの16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシング（V3～V4領域）により以前に特徴づけられ、総菌量はTaqMan BactQuantアッセイを用いて評価された14。本研究では、マイクロバイオームデータが入手可能な女性のうち、早産した女性（N = 80）から入手可能なすべてのサンプルを選択し、さらに、満期出産した152人の対照者からのサンプルも選択した。選択した子宮頸管サンプルは、16S rRNA遺伝子配列決定に使用したサンプルの複製で、ダブルシャフトダクロンスワブを使用して採取したものである。子宮頸管スワブは、自分で採取するか、研究訪問時に研究コーディネーターが採取したものである14。

統計と再現性
本研究では、解析から除外されたデータはなかった。本研究は観察研究であるため、割付や無作為化は行わなかった。本研究では、早産をした利用可能なすべてのサンプル（N = 80）を含み、サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いなかった。我々のサンプルサイズは、過去の論文で報告されたサンプルサイズと同様である25,26。サンプルはメタボロミクスバッチ間でランダムに分配され、メタボロミクス解析は各サンプルのアウトカム評価について盲検化されたMetabolon社によって実施されました。代謝物レベルとsPTBの関連を確認するために、両側Mann-Whitney U検定（SciPy 1.5.2）およびロジスティック回帰（Statsmodels 0.12.1）を使用した。MC、CST、人種、sPTB間の関連性を確認するために、両側フィッシャーの正確検定（R stats 3.6.1）を使用した。PERMANOVA 検定 (scikit-bio 0.5.6) を用いて、マイクロバイオーム、メタボローム、CST、人種、メタボロミクスバッチ間の関連性を同定した。代謝物セットとsPTBとの関連を明らかにするために、代謝物セットエンリッチメント分析（Methods）を使用した。代謝物レベルとNMPC、代謝物レベルと微生物量の一致度を測定するために、スピアマン相関を使用した。サブグループ内で測定された相関を比較するために、Fisher R-to-z 変換を使用した。機械学習モデルの評価は scikit-learn 0.24.2 を用いて行った。データ処理には pandas 1.1.5 と NumPy 1.18.5 を使用した。予測モデルの一般化誤差のロバストな評価は、ネステッドクロスバリデーションによって達成された。

メタボロミクスプロファイリングと前処理
メタボロームレベルは、アンターゲット液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS/MS）プラットフォーム99を使用して、Metabolonによって膣スワブから測定された。サンプルのバッチ処理については、Supplementary Note 1およびExtended Data Fig. 我々は、スワブのロット番号、ブランク処理用の滅菌スワブ、およびサンプルコレクター（コーディネーターまたは自己採取）が利用できないことに注意してください。このため、バッチ効果の可能性の分析には限界があるが、サンプルは分娩とアウトカム決定の前に採取されているため、バッチの交絡（例えば、スワブのロットとsPTBとの関連）は考えにくいと思われる。

メタノールベースの低分子抽出後、サンプルは5 µlのアリコートに分けられ、それぞれを適切な抽出溶媒に再懸濁し、4つのクロマトグラフィー手法のうちの1つで分離した。各クロマトグラフィー法は、疎水性、塩基性または極性化合物の抽出に最適化されていた。各代謝物の定量に使用したクロマトグラフィー法は、補足表 4 に示すとおりです。同位体標識またはハロゲン化標準物質は、抽出前に一定濃度ですべてのアリコートに添加し、保持時間マーカーとして使用した。抽出後、化合物をエレクトロスプレーイオン化し、Q-Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap高分解能質量分析計によるタンデム質量分析で測定しました。Metabolon社製のソフトウェアと保持指標およびフラグメントイオンスペクトルのデータベースを用いて、m/zピークの同定と注釈付けを行いました。注釈されたm/zピークの下の領域を代謝物測定値としました。クロマトグラフィーおよび質量分析計の全パラメータの概要は、Supplement Table 7に記載されています。各メタボロームプレートでプロセスブランクス（陰性対照）を実行し、これらの対照の少なくとも3倍のレベルで検出された場合のみ、代謝物が存在すると見なされました。膣サンプルと陰性コントロールにおける、本研究で注目されたゼノバイオティクスの検出レベルを、Extended Data 図5eに示し、同じことを実証しています。これらの異種代謝物の質量誤差については、Extended Data Fig.

代謝物の大部分 (N = 556) は、実験的に測定されたライブラリ標準物質と一致するフラグメントスペクトルによって Metabolon によって同定された Tier 1 ですが、Metabolon プラットフォームの独自の性質により、独自の同定には Tier 2 のみ利用可能です。代謝物の測定は、使用したバッファーの容量に正規化されましたが、これは必ずしも元の組織の違いを考慮していない可能性があります。続いて、log（base 10）変換された値のロバスト標準化27（中央値を引き、上下5％の異常値をクリップしながら計算した標準偏差で割る）を行いました。Shapiro-Wilk 検定により、大半の代謝物 (635 名の代謝物のうち 389 名) で対数 (基底 10) 変換値が正規性から逸脱していると判断された。このため、以降のメタボローム解析ではノンパラメトリック検定を使用しました。

マイクロバイオームデータ処理
すべてのマイクロバイオームベースの解析は、DADA2（文献100）およびSpeciateIT14で事前に処理したデータを用いて行われ、文献の補足データ2より入手可能である。14. この例外は予測モデルで、USEARCHパイプライン101を使用して97%クラスター化された運用分類単位（OTU）で学習させた。Genotypes and Phenotypesデータベース（dbGaP）から、研究アクセッション：phs001739.v1.p1のもと、生配列を入手した。プライマーはリードにアライメントした後、トリミングし、エンドマージと品質フィルタリング（-fastq_maxee 1.0）を行いました。フィルターしたリードをプールし、デリプレートし、97%の閾値でクラスタリングし、UPARSEアルゴリズムでキメラフィルターしてOTU数行列を作成した。

グローバルマイクロバイオームとメタボローム構造
マイクロバイオームデータにはBray-Curtis距離、代謝物データにはCanberra距離を用いてPERMANOVA解析を行った。これは外れ値に強く、共通の特徴の違いに敏感である。代謝物ベクトルのデノボクラスタリングは、k-medoidsアルゴリズム（scikit-learn-extra 0.2.0）を用い、同じくCanberra距離で実施した。kが1～15のクラスタリング解について、クラスタ内二乗誤差とギャップ統計量を比較し、最適なクラスタ数を決定しました（Extended Data 図3a,b）。これらのクラスタの頑健性と一貫性を確認するため、232サンプルのうち209サンプル（90%）をランダムに100回選択し、それぞれのランダムサブセットについて同じ手順でクラスタを新たに作成した。その結果、多くのサブセット (36) で95%以上のサンプルが元のクラスタと同じ代謝物クラスタに割り当てられ (補足表2)、すべてのランダムサブセットで平均86%の割り当て精度でした (Extended Data Fig. 3g) 。Python umap-learn パッケージ102 を用いて、マイクロバイオームデータでは n_neighbors 15、min_dist 0.05 で、メタボロームデータでは n_neighbors 15、min_dist 0.25 で Uniform manifold approximation and projection (UMAP) 102 が実行されました。各メタボロミクスクラスターをさらに説明するために、フィッシャーの正確検定を使用して、各クラスターに関連する代謝物スーパーおよび代謝物間で濃縮されたサブパスウェイを同定しました（P < 0.05）。

差分アバンダンス検定と代謝物セットのエンリッチメント解析
症例の半分以上に存在する代謝物について、両側Mann-Whitney U検定を用いて、代謝物レベル間の存在量の差検定を行った。早期PTBとの関連は、これらの分娩の中で黒人女性の割合が高いため（妊娠32週未満の分娩では26例中21例、28週未満の分娩では15例中14例）、黒人女性のサンプルだけを用いてすべて計算された。sPTBとTBの間で変化した代謝物の機能セットを特定するために、各セットについて、セット内の代謝物のPTBとsPTBの間の存在量の差に関するP値を、セット外の代謝物の同じP値と、追加のMann-Whitney U検定を使って比較しました。後者の検定のP値を、sPTBとTBのラベルのランダムな並べ替えで計算した類似のP値10,000個と比較することで有意性を算出しました。機能セットについては、KEGG61パスウェイと同様に、Metabolonが提供するスーパーパスウェイとサブパスウェイの定義を使用した。FDR（False Discovery Rate）補正は、代謝物セットの種類ごとに個別に行いました。

AMONを用いた代謝物起源の予測
AMON37は、KEGGデータベース61による機能アノテーションを用いて、KEGGエントリにマッチするすべての代謝物（名前付き代謝物635種のうちN = 334種）の代謝物起源を予測する手法です。PICRUSt2 (ref. 103) を使用して各サンプルの機能プロファイルを作成し、AMON37 を適用して、KEGG データベースに一致するエントリがある代謝物がヒト代謝産物か微生物代謝産物かを予測しました。両方が偽の場合、その代謝物は異種物質であると解釈しました。

微生物と代謝物の相関関係
微生物と代謝物の関連を特定するため、TaqMan定量ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）ベースのパネル14,104,105を用いて得られたサンプルの総16S rRNAコピー数に各分類群の相対量を乗じることで微生物の絶対量を推定し、sPTBと関連があると思われる代謝物のレベルとのスピアマン相関を算出した。すべての相関ネットワーク解析（図3aおよび拡張データ図6a,c-e）において、少なくとも22%のペア測定値との相関が含まれており、図3aでは232サンプル中50サンプルに相当します。すべての相関測定は、インピュテーションなしで利用可能なデータを使用し、多重検定の補正はBenjamini-Hochberg FDR法を介して行われた。ネットワーク内のエッジが人種（拡張データ図6b）またはsPTBの重症度（拡張データ図6f）に影響されるかどうかを判断するために、両側フィッシャーR-z変換を用いて、黒人女性におけるこれらの相関を白人女性における同じ相関と比較し、32週以前に出産した黒人女性におけるこれらの相関を他のすべての黒人女性における同じ相関と比較しました。

膣マイクロバイオームモデルの作成と照会
マイクロバイオーム代謝モデリングは、Microbiome Modeling Toolbox (COBRA toolbox commit: 71c117305231f77a0292856e292b95ab32040711) (refs.73, 106) を用いて、AGORA2 (ref.107) からのモデルを使って行った。すべての計算は、IBM CPLEX（IBM）12.10.0ソルバーを使用して、MATLABバージョン2019a（Mathworks）で実施された。

各サンプルについて、テーラードマイクロバイオームモデルを区画化技術108によって作成した：サンプルに存在する種の代謝再構成を共有区画にマージし、入力区画および出力区画を追加した。共有区画は、微生物が代謝物を共有することを可能にし、入力区画と出力区画は、化合物の摂取と分泌を可能にするために存在する。また、refs.109,110 と同様に結合制約を追加している。109, 110 と同様に結合制約を追加し、相対的な存在量と各生物種のネットワークフラックスの間の依存性を保証している。最後に、各微生物バイオマスの合計に対応する相対存在量値を乗じたサンプル固有のマイクロバイオームバイオマス目的関数を、各マイクロバイオームモデルに追加しています。

各サンプル固有のマイクロバイオームモデルの分泌能を調べるために、Microbiome Modeling Toolbox73 のパイプライン mgPipe.m を使用して NMPC を計算した（補足表 8）。NMPCの計算は、マイクロバイオーム化合物の最大生産量と取り込み速度を考慮し、特定の化合物の代謝に対するマイクロバイオームの全体的な寄与を予測することを目的としている73。後で予測精度を評価するために、NMPC と対応する代謝物測定値との間のスピアマン相関を計算した（インピュテーションなし）。

チラミン予測のサポートと精度向上のため、チロシンデカルボキシラーゼをコードするTDC遺伝子の存在を確認した。代謝モデルに含まれる各生物種（N = 95）について、Prodigal111を使用して、ランダムに選択した最大200のRefseq112アセンブリのオープンリーディングフレームを予測し、Hmmer3.3.2のhmmsearch機能（文献113）とTDC114のプロファイルhmm（NCBI HMMアクセッションTIGR03811.1）でTDCの証拠を検索しました。次に、少なくとも1つのアセンブリに対応する遺伝子が含まれているモデルにおいて、対応する反応が存在することを確認し、代謝モデルをキュレーションしました。

代謝モデルを構築するために、マイクロバイオームサンプルで検出された生物種とAGORA2（文献107）で存在する生物種をマッチングさせた（補足表9）。モデルの代表性を高めるため、対応する AGORA2 モデルを持たない膣内の豊富な種のうち、少なくとも 20 サンプルに相対存在度 5%超で存在する 3 つの代表を追加しました (補足表 9 に記載)。この閾値を超えた唯一の種は、Candidatus Lachnocurva vaginae (BVAB1)で、適切なAGORAモデルが存在しなかったため、我々のモデルには含まれていません。種レベルのモデルを作成するために、Microbiome Modeling Toolbox73 の関数 createPanModels.m を使用して、利用可能な菌株から代謝モデルを組み合わせました。合計で、私たちのマイクロバイオーム代謝モデルには95の異なる種が含まれ、各サンプルには平均20の種が含まれています。膣マイクロバイオームは非常に歪んだ分布をしているため28、この結果、我々のモデルによって表されるサンプル全体の存在量の中央値（四分位範囲（IQR））は96.7%（88.4～98.8%）となりました（拡張データ図7d）。

低存在量の微生物の表現不足に対する我々のモデルの感度をテストするために、最も存在量の少ない10種を我々のモデルで考慮しないように繰り返しシミュレーションを行い、よくモデル化された代謝物チラミン、プトレシン、ヒスタミンを予測する際の我々のモデルの精度を評価しました。予想通り、私たちのモデルは各微生物の存在量を考慮しており、膣マイクロバイオームは歪んだ分布をしているため、95のモデルのうち70を削除しても、存在量の少ない微生物の表現には敏感ではありませんでした（Extended Data Fig.7e）。

代謝モデリングには、培地や炭素源の利用可能性などの環境条件が必要です115。そこで、AGORA で対応する代謝物が同定された少なくとも 50 サンプルに存在するすべての代謝物の連合体として、無制限（つまり非常に高い）濃度で存在すると仮定して「一般膣培地」（補足表 10）を定式化しました。この膣内メディアは、代謝物取り込み反応に対する制約という形で各マイクロバイオームモデル入力区画に適用され、環境に存在しない化合物の取り込みをゼロに制約した。mgPipe で自動的に実行される特定の腸関連食物化合物の取り込みは、膣内の代謝環境が異なることを考慮して無効にし、マイクロバイオーム増殖の達成に必要な必須代謝物を、それぞれのフラックス値とともに、COBRA ツールボックス106 の fastFVA および findMIIS 機能を用いて検出して膣培地に追加した。一般」培地と、黒人女性と白人女性のサンプルの75%に存在する代謝物と定義し、取り込みフラックスをサブグループ全体の平均値に拘束したサブグループ特異的培地、および取り込みフラックスを各サンプルに個別に拘束した人特異的培地の比較では、チラミンの予測に関して同様の精度を示した（補足表5）。

sPTB分類法の訓練、テスト、検証
臨床データ（年齢、人種、分娩状況、sPTBの既往、BMI）、マイクロバイオームデータ、メタボロミクスデータ、およびこれらすべてのデータを組み合わせた組み合わせモデルを用いて、個別に予測モデルを構築した。人種はマイクロバイオームやメタボロミクスデータと非常に強い相互作用があったため、マイクロバイオーム、メタボロミクス、組み合わせモデルについては複合予測因子をトレーニングし、黒人女性については個別のモデルをトレーニングした。各モデルのサンプルサイズが小さいにもかかわらず、これにより経験的に予測性能が向上しました（拡張データFig.8b）。微生物ベースのモデルは、上述のようにUSEARCH処理されたOTUから計算された絶対量を使用した。qPCRベースの総負荷量が利用できない場合（N = 14）、トレーニングサンプルのみを使用して平均総負荷量にインプットした。

サンプルは10倍クロスバリデーション（「外倍」）を用いてトレーニングセットとテストセットに分け、出生時の妊娠年齢（GAB）の10進数でブロック層別し、マイクロバイオーム、メタボロミクス、複合モデルについては人種で層別した。10倍への分割の確率を考慮し、このプロセスを5回繰り返した。訓練と試験の無菌性は厳密に維持された。最適なハイパーパラメータ（特徴量のエンジニアリングと選択のためのパラメータを含む）のセットを調整し、一般化誤差のロバストな推定値を得るために、ネスティッドクロスバリデーションを使用した。この訓練-テスト-バリデーションのフレームワークの拡張では、訓練セットをさらに5つのフォルド（「内部フォルド」）に分割し、その上でハイパーパラメータのランダムなセットを1000回反復使用した（補足表11）。さらに、確率を考慮し、このプロセスを5回繰り返した。我々は、最適なハイパーパラメータセットを、sPTB分類の平均R2に基づく最も正確な上位5つのモデルのうち、内側の折り目に対する性能に基づいて、平均auROCスコアが上位のモデルとして選択した。そして、これらのハイパーパラメータを用いて、外側フォールドの全トレーニングデータでモデルを学習し、保持していたテストデータで評価した。なお、このフレームワークでは、ハイパーパラメータは各外側の10フォールドのクロスバリデーションフォルドのトレーニングデータのみを用いて選択され、テストセットでは1度だけ評価される。予測パイプラインは、メタボロームデータの標準化とインピュテーション、主成分分析（PCA）変換（オプション）、スパース性、SHAP83特徴重要度、情報利得、スピアマン相関による特徴選択、LightGBM116による予測、であり、すべてのステップはトレーニングデータを用いて厳密に実行されている。次に、選択されたモデルは、再トレーニングなしで、外褶曲の極めて（GAB <28週）または非常に（GAB <32週）PTBを分類する際に評価された。ベンチマーク分析（Extended Data Fig. 8a,b）は、10回クロスバリデーションを用いて行い、5回繰り返した。2つのモデル間のauROCの差の有意性は、auROCの正規分布のzスコアを計算することで評価した117。

解釈と検証のための最終モデルを得るために，外側のフォールドのそれぞれについて選択したハイパーパラメータを用いて，コホート全体（N = 232）について新しい複合モデルをトレーニングし（50モデル），同じコホートについて最高のauROCを持つモデルを選んだ（トレーニングフィット）．各モデルの最終的なパラメータセットは、補足表12に記載されています。外部の膣メタボロームデータセットでの検証では、被験者レベルでの母親の人種に関する情報が得られなかったことに留意した。そこで、非黒人女性に用いたメタボロミクスモデルを、再トレーニングや適応なしに、Ghartey 2015（文献81）コホートのメタボロミクスデータに適用し、同様に黒人女性に用いたメタボロミクスモデルをGhartey 2017（文献55）コホートからのメタボロミクスデータに適用しました。これらのコホートにおける代謝物とsPTBとの関連性（図2a）の検証については、図2aの10種類の代謝物のうち、Ghartey 2015コホートで検証できるのは全員と白人女性に該当する6種類のみであり、そのうち1種類のみ測定され、Ghartey 2017コホートで検証できるのは全員と黒人女性に該当する9種類のみで、そのうち2種類のみ測定されたことに注意されたい。

報告書の概要
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされている「Nature Portfolio Reporting Summary」にてご確認いただけます。

データの入手方法
本研究で分析した16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスデータ、関連サンプルおよび被験者のメタデータは、アクセッション番号phs001739.v1.p1下のGenotypes and Phenotypesデータベース（dbGaP）および文献の補足データ2において公に利用可能である。14. メタボロミクスの生データは、Supplementary Table 1に掲載されています。マススペクトルデータはMetaboLightsからアクセッション番号MTBLS702 (https://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS702) で入手可能です。ゼノバイオティクスに関する追加情報は、Supplement Table 13に記載されています。KEGG データベースは https://www.genome.jp/kegg/ で、AGORA モデルは https://www.vmh.life/ で利用可能である。

コードの入手
解析を再現するためのスクリプトは GitHub リポジトリ（https://github.com/korem-lab/PTB_Metabs_2021）で公開されている。mgPipeパイプラインは、COBRAツールボックス（https://github.com/opencobra/cobratoolbox）で利用可能です。

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論文

CAS

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参考文献のダウンロード

謝辞
M. A. Elovitz, J. Ravel, K. D. Gerson, P. Gajer, L. Antonには、研究開始、サンプル収集、サンプル共有、資金獲得への協力、有益な議論に感謝する。また、Koremグループのメンバー、L. Shenhav、D. Zeevi、N. Bar、R. Wapnerには、有益な議論をしていただきました。Motherhood and Microbiome cohortは、National Institute of Nursing Research (NINR; R01NR014784)から資金提供を受けた。使用したデータセットの一つは、dbGaPアクセッション番号phs001739.v1.p1を通じて、Genotypes and Phenotypes（dbGaP）データベースから入手したものである。本研究は、NINR（R01NR014784）、ペンシルバニア大学精密医療センター、コロンビア大学精密医療イニシアチブが提供するVagelos賞、コロンビア大学数理ゲノムプログラム、CIFAR Azrieli Global Scholarship in the Humans & the Microbiome Programによる支援を受けて実施されました。W.F.K.はNIH T32GM007367およびF30HD108886の支援を受けている。I.T.とA.H.は、欧州研究評議会（ERC）からI.T.に与えられた欧州連合のHorizon 2020研究・革新プログラム（助成契約番号757922）の助成金によって支援されています。

著者情報
著者ノート
これらの著者は等しく貢献した。William F. Kindschuh, Federico Baldini, Martin C. Liu.

著者と所属
コロンビア大学アービング・メディカルセンター、システムバイオロジー学科、数理ゲノミクスプログラム、米国ニューヨーク州ニューヨーク市

William F. Kindschuh、Federico Baldini、Martin C. Liu、Jingqiu Liao、Yoli Meydan、Harry H. Lee & Tal Korem

コロンビア大学アービング・メディカルセンター生物医学情報学部門（米国ニューヨーク州ニューヨーク市

マーティン・C・リュー

アイルランド、ゴールウェイ、アイルランド大学医学部

アルムート・ハインケン＆イネス・ティーレ

アイルランド、ゴールウェイ、ゴールウェイ大学、微生物学教室

Ines Thiele

アイルランド、ゴールウェイ、ゴールウェイ大学、ライアン研究所

Ines Thiele

コーク大学APCマイクロバイオームアイルランド（アイルランド、コーク

Ines Thiele（イネス・ティーレ

ペンシルバニア大学ペレルマン医学部微生物学教室（米国ペンシルバニア州フィラデルフィア市

クリストフ・A・タイス＆マーヤン・レヴィ

米国ペンシルバニア大学ペレルマン医学部糖尿病・肥満・メタボリズム研究所

クリストフ・A・タイス

ペンシルバニア大学ペレルマン医学部免疫学研究所（米国ペンシルバニア州フィラデルフィア

Christoph A. Thaiss & Maayan Levy

コロンビア大学アービング・メディカルセンター産科婦人科（米国ニューヨーク州ニューヨーク市

タル・コレム

CIFARアズリエリ・グローバル・スカラーズ・プログラム、CIFAR、カナダ、オンタリオ州、トロント

タル・コレム

寄稿
W.F.K.、F.B.、M.C.L.は、すべての分析の設計と実施、結果の解釈、原稿執筆を行い、この仕事に等しく貢献した。H.H.L.、J.L.、Y.M.はデータ解析に協力した。A.H.とI.T.は、代謝モデリング解析のためのリソースとサポートを提供した。C.A.T.はメタボローム解析の監修を行った。M.L.とT.K.はプロジェクトの構想、研究の設計、結果の解釈を行った。T.K.は解析の指揮をとり、原稿を執筆した。すべての著者が原稿を確認し、貢献した。

対応する著者
Maayan LevyまたはTal Koremに連絡すること。

倫理的宣言
利益相反
M.L.とT.K.は、この研究に関連する特許の仮出願の発明者である。他の著者は，利害関係のないことを宣言している。

査読
査読情報
Nature Microbiology誌は、Rodman Turpin氏と他の匿名の査読者の方々に対し、この論文の査読に貢献したことに感謝します。

追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して、中立的な立場を維持しています。

エクステンデッドデータ
Extended Data 図1 測定された代謝物の有病率とスーパー経路。
a, 測定された代謝物のスーパーパスウェイの分布。メタボローム・スーパーパスウェイはMetabolon社から提供された。グレーは全代謝物（N = 745）の有病率分布。青色は、名前付き代謝物（N = 635）のみの有病率分布。破線は、80%以上のサンプルに存在する代謝物（N = 352）と20%以上のサンプルに存在する代謝物（N = 694）を区別しています。

Extended Data 図2 メタボロミクスバッチ効果に対する解析のロバスト性。
a, b, メタボロミクスデータのUMAP順序付け（N = 232）、図1bと同じ、Pos Early, Pos Late, Polarプラットフォームバッチ（a; 2バッチ）、Negプラットフォームバッチ（b; 3バッチ）で色分け。各プラットフォームでどの代謝物が測定されたかは、補足表4を参照してください。c, 各バッチ（y軸；上：Pos Early、Pos Late、Polarプラットフォームバッチ、下：Negプラットフォームバッチ）の代謝物プロファイルが各代謝物クラスター（MC；x軸）にクラスター化したサンプルの割合を、各MCについて個別に示したものです。d, 図2a（x軸）の各代謝物に対するsPTB（カラーバー）のオッズ比を、バッチ（代謝物の適切なプラットフォームによる、補足表4）で調整し、母親の人種（y軸）で層別したロジスティック回帰モデルで示したヒートマップ。正確なオッズ比と信頼区間は、統計的に有意なすべての関連性（FDR < 0.1）のセルに書かれている。 e, 全コホート（図4、方法）に使用したものと同様の予測モデルのsPTB分類精度（auROC、x軸）、すなわち、バッチ1（N = 114、オレンジ、 auROC = 0. 66；ランダムドローより低い精度に対する片側並べ替えP = 0.44）；バッチ1（N = 114）で訓練し、バッチ2（N = 118；紫；auROC = 0.66；P = 0.46）で評価；バッチ2（N = 118；マゼンタ；auROC = 0.66；P = 0.44）で訓練しクロスバリデーションで評価；およびバッチ2（N = 114） で訓練しバッチ1（N = 114；茶；auROC = 0.69；P = 0.66）について評価したものです．灰色のヒストグラム（黒線、KDE）は、このコホートからのランダムなサンプル（N = 116）に対してクロスバリデーションで評価したモデルの精度（平均auROC = 0.67）を示しています。この解析は、2つのバッチの一方について学習した予測モデルが、もう一方のバッチによく汎化すること、また、限られたサンプルサイズを考えると、どちらの精度も予想されることを実証しています。

Extended Data Fig. 3 代謝物クラスターの特徴。
a, b, キャンベラ距離を用いたk-medoidsクラスタリングにおけるクラスタ内二乗距離和（a）およびギャップ統計量（b）、kは1～15まで。また、このような場合にも、「閾値」を設定することが可能である。被験者は割り当てられた代謝物クラスタ（MC）によりソートされ、代謝物はキャンベラ距離とワード連鎖を用いて階層的にクラスタリングされます。d-f, Fig. 1c と同様、PCA (d), Canberra distance-based PCoA (e), t-SNE (f) を使用。 g, コホートの 90% (209 女性) をランダムに選択し、6代謝物クラスターをデノボで生成した 100 の反復処理における同じ MC (x 軸) に割り当てられたサンプルの割合として定義した MC 割り当ての整合性のヒストグラムです。解析の結果、多くの反復（36反復、36%）で95%以上の整合性があり、全体の平均整合性は86%であった。

Extended Data Fig. 4 代謝物クラスターと CST の対応。
a. 全女性（上：N = 232）、白人（中央：N = 51）、黒人（下：N = 173）の各代謝物クラスター内のCSTの分布。棒グラフの各グループは、1つの代謝物クラスターに対応し、グループ内の棒グラフの合計は100%になる。P - 両側フィッシャーの正確な p 値、q < 0.1. c, d, 図 1b, c と同じ、母方の人種で色分け。e,f、図1f,gと同じ、全女性について実施。 g、図1gと同じ、早期SPTB（出生時の妊娠年齢32歳未満）との関連について実施。

Extended Data 図5 sPTBで変化する代謝物。
a, 箱ひげ図（線は中央値、箱はIQR、ひげは1.5IQR）、早産と期産を比較し、母親の自認する人種で層別したsPTBに関連する代謝物レベル。p-両側Mann-Whitney U。 b-本コホートにおけるsPTBまたは早期sPTBに関連する4つの生体内物質の分布（カーネル密度推定）。c、図2aと同じ、プロゲステロン治療を受けていない女性の場合。 d、このコホートの様々なサブセットでsPTBで変化した代謝物セットを示すヒートマップ。色分けは、代謝物セットの濃縮解析の両側p値に対応する（方法）。FDR < 0.1の関連性だけを示す。 e. bと同じ4種類の生体異物についてサンプル間で測定した生の強度レベルを、プレート陰性プロセスコントロールからの測定値と比較した。箱は中央値、箱はIQR、ひげは1.5IQR、縦線は最小：最大の範囲、ドットは平均、N.D.は検出されず。f, スペクトルマッチングの質量誤差(y軸)を、すべての非外科生物学的代謝物の平均質量誤差と比較した結果、4つの外科生物学的代謝物は非常に優れた同定品質を有していることが示されました。

Extended Data 図 6 PTB 関連代謝物との微生物相関のネットワーク。
a, Fig. 3a と同じだが、各微生物分類を個別のノードとして表現した。 b, 各ポイントが微生物と代謝物の関連を表すボルケーノプロット。X軸は、黒人女性と白人女性で別々に計算したスペアマンρの差を表示する。Y軸は、両側フィッシャーのR-z変換を用いて、その差の有意性を表示する。水平の水色の線は、p = 0.05を示す。c, d, a と同じで、黒人女性（c）と白人女性（d）のみの相関。 e, a と同じで、黒人女性の極早産または超早産に関連する代謝物。 f, b と同じで、コホート内の極早産または超早産の黒人女性とその他の黒人女性との相関の差について。

Extended Data Fig. 7 代謝モデルによるプトレスシン、ヒスタミン、チラミンの正確な予測。
a-c、プトレスシン（a）、ヒスタミン（b）、チラミン（c）の予測値をマイクロバイオーム代謝モデル（NMPC、方法、y軸）と測定代謝物レベル（x軸）にプロットすると、すべてで良好な精度を示した（スピアマン ρ = 0.64; ρ = 0.54、ρ = 0.54）。 d, モデルカバレッジ（Y軸，線は中央値，枠はIQR，ひげは1.5*IQR），代謝モデルで表されるサンプル総量の割合として，サブグループごとに別々に記述した．白人女性のサンプルは、黒人女性のサンプルと比較して、チラミン予測の精度が低いにもかかわらず、より高いモデルカバレッジを有していた。N = 173（黒人女性）、N = 21（sPTB白人女性）、N = 30（結核白人女性） e, 最大 N 種の最量産種のみを含むモデル（x 軸）の代謝モデル予測（NMPCs）と代謝物測定（y 軸）間のスピアマン ρ。私たちの代謝モデルは、各微生物の存在量を考慮し、膣マイクロバイオームは歪んだ分布をしているため、低存在量の微生物の表現不足に頑健である。

Extended Data Fig. 8 sPTB の予測モデルの性能と特徴。
メタボロミクスデータを用いた様々なSPTB予測アルゴリズムの性能を比較したROC（Receiver Operating Characteristic）曲線。LightGBM (auROC = 0.81) は、ロジスティック回帰 (auROC = 0.78, LightGBM との auROC 比較では P = 0.017) 、サポートベクトル分類 (auROC = 0.76, P = 2.9 × 10-4) および弾性ネット (auROC = 0.72, P = 0.004) より優れた性能を示した。 b, 人種で層別した複合モデルとすべてのサンプルを使って学習したモデルの性能を比較する ROC 曲線。黒人女性の sPTB 予測を 10 倍クロスバリデーションで評価した場合，すべての女性のサンプルで学習したモデルは，黒人女性のサンプルのみで学習したモデルと同じ精度を達成した（それぞれ auROC 0.83，0.82）．しかし，すべての女性から得たサンプルで学習させたモデルは，同じサブグループについて10倍のクロスバリデーションで評価した場合，黒人でないと識別される女性からのサンプルだけで学習させたモデルを大幅に下回る（auROC 0.64 対 0.80，auROC 比較で P = 4 × 10-7）．c, d, ネステッドクロスバリデーションで評価したROC (c) とPR (d) の曲線で、メタボロミクスデータのみに基づくモデルのSPTB予測精度 (auROC = 0.78, auPR = 0.65) を比較しています。 e, SHAP83に基づく予測全体に対する効果（x軸）は、組み合わせモデルで使用した上位10個の特徴量の重要度を降順に並べたもの。f、g、図4a、bと同じメタボロームベース（f）とマイクロバイオームベース（g）のモデルのROC曲線で、予測が極めて（妊娠28週未満）および非常に（32週未満）PTBについて評価された場合。h, i, 2つの外部コホートにおけるsPTB予測のPR曲線。メタボロームベースの予測器を用いて、再トレーニングや適応なしに得られた。a-d, f, g の斜線は，5 回の独立した 10 回クロスバリデーションから得られた結果である（Methods）．117.

補足情報
補足情報
補足説明1-2.

報告書の概要
補足表
補足表1 生の代謝物測定値。サンプルIDはref.のSupplemental Data 2を参照。14. 数値は生の面積カウント。補足表2 代謝物クラスター（MC）へのサンプルの割り振り。サンプルIDはref.14のSupplementary Data 2を参照。14. 補足表3 AMONによる代謝物起源の予測。補足表4 代謝物アノテーションと抽出プラットフォーム。補足表5 異なる媒体定義を用いた代謝モデルによるチラミン予測精度。数値はNMPC値とチラミン測定値の間のスピアマンρ。補足表6 予測モデルのシャプレー値。補足表7 クロマトグラフィーと質量分析計のパラメータ。Metabolonの各LC-MS/MSプラットフォームの技術的パラメータを全て記載。補足表8 Tyramine、Putrescine、HistamineのNMPC予測値。サンプルIDは文献のSupplemental Data 2を参照。14. 補足表9 AGORAモデルへのSpeciateITの化学種の割り当て。SpeciateITの生物種は、文献14のSupplemental Data 2のカラムである。14. 補足表 10 代謝モデルで使用した膣培地に含まれる代謝物。含まれる代謝物をAGORAの識別子とともに列挙した。補足表11 予測モデルの最適化に使用したハイパーパラメータセット。補足表12 最終的な予測モデルのパラメータ。補足表 13 注目された生体内物質の測定特性。

権利と許可
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転載と許可

この記事について
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この記事の引用
Kindschuh, W.F., Baldini, F., Liu, M.C. et al. Preterm birth is associated with xenobiotics and predicted by the vaginal metabolome. Nat Microbiol (2023)。https://doi.org/10.1038/s41564-022-01293-8。

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受付終了
2022年7月21日

受理済
2022年11月23日

公開日
2023年1月12日発行

DOI
https://doi.org/10.1038/s41564-022-01293-8