腸内細菌叢のリモデリングによる腸内細菌の移動の減少が、高脂肪食による早期老化の緩和を媒介する

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腸内細菌叢のリモデリングによる腸内細菌の移動の減少が、高脂肪食による早期老化の緩和を媒介する
Kang Xu, Yannan Guo, Yida Wang, Yu Ren, Vivien Low, Sungyun Cho, Lu Ping, Kezheng Peng, Xue Li, Ying Qiu, Qingfei Liu, Zhongchi Li, Zhao Wang
初出：2022年12月25日
https://doi.org/10.1111/acel.13760
Kang Xu、Yannan Guo、Yida Wangはこの研究に等しく貢献した。
について
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要旨
加齢に伴う微生物異常は、様々な疾患や機能障害を悪化させ、高齢者の罹患率や死亡率の大きな要因となっているが、この加齢関連症候群の根本的な原因は不明であった。SIRT6ノックアウト（SIRT6 KO）マウスは早老化し、4週齢までに死に至るため、早老化研究モデルとして有用である。ここで、SIRT6 KOマウスから野生型（WT）マウスへの糞便微生物叢の移植は、SIRT6 KOマウスで観察される腸内細菌異常と早期老化を表現する。逆に、SIRT6 KOマウスにWTマウスの微生物叢を移植すると、寿命の延長が観察された。このことは、腸内細菌叢がSIRT6 KOマウスの早期老化に寄与していることを直接的に示唆している。大腸菌の過剰増殖によって引き起こされる腸内細菌の転座の増加が、マイクロバイオーム異常の早期老化作用のメカニズムであると考えられ、これは高脂肪食によって回復させることが可能であった。本研究の結果は、腸内細菌叢の異常と老化の因果関係のメカニズムを明らかにし、高脂肪食が腸内細菌叢の異常を是正し、早期老化を緩和する有益な効果を持つことを支持するものである。本研究は、マイクロバイオームを用いた高脂肪食を老化関連疾患に対する治療介入に組み込むための理論的根拠を提供するものである。

1 はじめに
腸内細菌叢の調節異常は、免疫機能障害や疾患に対する感受性の増加など、多くの老化関連変化の中核にあることを実証する証拠が増えている（Badalら、2020；DeJongら、2020）。腸の生理機能は加齢とともに変化し、これらの変化は、特定の細菌が他の細菌よりも持続または増殖することを説明すると思われます（Amatoら、2019）。例えば、Akkermansiaceaeの栄養源であるムチンの生産は加齢とともに減少し、その結果、高齢者ではこれらの細菌が失われる（Eldermanら、2017）Erysipelotrichaceaeは、地域の酸化還元および栄養環境における老化関連の変化に適応する能力により増加します（Chenら、2017）。その結果、腸内細菌の異常が変性病態と不健康な老化を悪化させる（Kim & Jazwinski, 2018）。現時点では、全身性炎症の増加および腸透過性は、加齢中の腸内細菌症に起因すると認識されている（Falkら、1998；Thevaranjanら、2017）。しかし、これが特定種の過剰増殖によるものか、機能的な微生物叢の減少によるものか、微生物-微生物相互作用の変化によるものか、あるいはその他の理由によるものかについては、まだ確定していない（Thevaranjanら、2017年）。そのため、老化における腸内環境の異常のメカニズムはまだ解明されていない。

SIRT6ノックアウト（SIRT6 KO）マウスは、生後約3週間で皮下脂肪の急性喪失、自然発症大腸炎、低血糖、骨減少、筋萎縮を起こし、4週間までに死に至るため、早老研究モデルとして有用である（Li et al, 2020; Mostoslavsky et al, 2006）。本研究では、SIRT6 KOマウスを用いて、腸内細菌叢の変化がどのように老化に寄与しているか、また、腸内細菌叢をターゲットにして老化表現型の改善が可能かどうかを機能的に評価することを目的とした。

食事介入による腸内細菌叢のリモデリングは、全身の代謝、栄養恒常性、および免疫に影響を与える（Yang et al.、2017）。例えば、機能的な腸内細菌群のリモデリングは、カロリー制限による代謝改善および寿命延長に寄与する（Fabbianoら、2018年；Zhangら、2013年）。このことから、腸内マイクロバイオームが他のダイエットの代謝効果の一部を媒介する可能性があると推測されます。炭水化物をほとんど摂取せず、高脂肪を摂取することを特徴とするケトジェニック食は、老化したマウスの寿命を延長し、運動機能を維持し、記憶を改善し、死亡率を減少させることが報告されている（Newmanら、2017；Robertsら、2018）。高脂肪食は、Sirt1の活性化を通じて、コケイン症候群の代謝および小脳の表現型を含む早老を救済することができる（Scheibye-Knudsenら、2014年）。さらに、等カロリーの中等度高脂肪食は、ラットやハエの寿命を延ばすことができた（Shi et al, 2021）。これらの相関関係にもかかわらず、マイクロバイオームがどのように変化し、このような食事による表現型老化の改善にこれらの変化がどのように寄与するかについての情報は乏しい。最近の研究によると、ケトジェニックダイエットは腸内細菌叢を変化させ、その後、免疫反応を変化させ、腸の炎症性Th17細胞を減少させる（Ang et al.） さらに、我々の以前の研究では、SIRT6 KOマウスの高脂肪食が寿命を延ばし、代謝障害を逆転させることが示されている（Li et al.） 我々は、高脂肪食が腸内細菌叢のディスバイオシスをリバランスし、その結果、早期老化の表現型が改善されるかもしれないと仮定した。

本研究では、SIRT6ノックアウトマウスにおいて、大腸菌の過剰増殖による内臓器官への腸内細菌の移動の増加が、早期老化の表現型に寄与していることを明らかにした。興味深いことに、高脂肪食は腸内細菌のバランスを整え、SIRT6欠損マウスの健康寿命と寿命延長に寄与することがわかった。本研究は、老化および加齢性疾患に対するマイクロバイオームベースの食事介入のための理論的基礎を提供するものである。

2 方法
2.1 マウスの作製と研究
129S6/SvEvTac (129Sv) 背景の SIRT6tm1.1Cxd マウスをジャクソン研究所から購入した。雄の129Sv SIRT6tm1.1CxdマウスをC57BL/6J CMV-Cre雌マウス（Nanjing Biomedical Research Institute）と交配し、F1ヘテロ接合体マウスを作製した。F1ヘテロ接合体マウスを129Sv野生型（WT）マウスと10世代以上戻し交配を繰り返し、その遺伝子構成の99.9％は129Svの遺伝子背景となり、129Sv SIRT6ヘテロ接合体（SIRT6+/-）マウスを交配してWT、SIRT6 KO、SIRT6+/-マウスを生成させた。マウスは清華大学実験動物研究センターで飼育した。すべてのマウス実験は雄で行い、規制と倫理ガイドラインに準拠し、清華大学の国際動物愛護使用委員会の承認を得た。ヘテロ接合体の交配により、予想されるメンデル比を持つ子孫が得られ、ヘテロ接合体マウスを研究のための繁殖に使用した。動物飼育室は23℃、12時間の明暗サイクルで維持された。マウスは遺伝子型判定により同定された。尾または爪先を切り取った後、組織を500μlの1M Tris-HCl, 5M NaCl, 0.5M EDTA, 10%SDS中で55℃、3時間消化させた。Protease KとRNase Aも溶解バッファーに加えた。DNA抽出には、イソプロパノールとエチルアルコールを使用した。次に、以下のプライマーをPCRに用いた：forward：5′-AGTGAGGGCTAATGGGAAC-3′；reverse．5′-ctgacggtgtcttcacaaactcac-3′. PCR産物が600bpの場合、遺伝子型はSIRT6ノックアウトとみなし、2000bpの場合はWTとした。

SIRT6ノックアウト（SIRT6 KO、129Sv）マウス、野生型（WT、129Sv）、およびSIRT6ヘテロ接合体（SIRT6+/-、129Sv）同腹子を離乳後に個別に遊具付きケージに入れて、動物施設に馴化させた。糞便サンプルは無菌状態で採取し、無菌の1.5ml遠心管に入れ、マイクロバイオームプロファイリング解析まで-80℃で保存した。マウスは炭酸ガスで犠牲にし、心臓穿刺により直ちに採血を行った。血清は、1500g、4℃で15分間遠心分離した後に取得し、アッセイのために解凍するまで-80℃で凍結した。その後、大腸、腸、その他の組織を摘出し、別々に分割した。切片染色用に準備した組織は、リン酸緩衝4%パラホルムアルデヒドで後固定し、pH7.4に維持し、4℃で保存した。一方、RT-qPCRおよびウェスタンブロット用に準備した組織は、さらなる分析のためにスナップ冷凍し-80℃で保存した。

2.2 抗生物質処理
19日齢（離乳後）のKOマウスに、100μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS；KO＋PBS）、または1g/L アンピシリン、1g/L ネオマイシン、1g/L メトロニダゾール、0.5g/L 塩酸バンコマイシン含有抗生物質カクテル（KO＋抗生物質）を連続3日間経口投与した。すべてのマウスは離乳後、動物施設に慣らすため、遊具のある単館飼育とした。マウスが28日齢になった時点で糞と組織を採取した。

2.3 高脂肪食の給与
3週齢のSIRT6ノックアウトマウス（129Sv）およびWTマウス（129Sv）に、炭水化物64％、タンパク質19％、脂肪17％を含む対照標準AIN-93G飼料（CDと略す）またはAIN-93Gに脂肪、主に水素添加ココナッツオイルからカロリーの65％を含む高脂肪飼料（HDと略す）を与えた（Table S2）。高脂肪食は、16%の炭水化物、19%のタンパク質、65%の脂肪を含んでいた。SIRT6ノックアウトマウスに供給する餌はアクセスしやすいことが望ましいので、SIRT6 KOマウスが弱く、体が小さいことを考慮し、対照餌、高脂肪餌を寝床に置いた。また、KOマウスの水へのアクセス性を確保するため、水筒も特製とした。食物繊維と水分の含有量は、対照食と高脂肪食の両方で同じであり、それぞれ5%(w/w)と8%(w/w)であった。高脂肪食および対照食の量は、4週齢のKOまたはWTマウスで体重あたりの1日摂取カロリーとして算出した。食餌介入は1週間行った。糞の採取と解剖は、高脂肪食給餌1週間後に行った。生存率算出のため、マウスは5週目終了まで飼育した。

2.4 糞便微生物叢の移植
3ヶ月齢のC57BL/6J雄マウスを微生物叢移植のレシピエントとして使用した。WT-WT（WTマウスの糞便微生物叢を移植したWTマウス）、KO-WT（SIRT6 KOマウスの糞便微生物叢を移植したWTマウス）、KOHD-WT（高脂肪食を与えたKOマウスの糞便微生物叢を移植したWTマウス）であった。移植前に、マウスは、1g/L アンピシリン（シグマ）、1g/L ネオマイシン（シグマ）、1g/L メトロニダゾール（シグマ）、および 0.5g/L 塩酸バンコマイシン（BIORIGIN）を含む抗生物質カクテルで4週間連続して飲料水処理された。飲水液は2日ごとに更新した。その後、マウスは、抗生物質サイクル後の最初の日から4週間、隔日に200μlのマイクロバイオータ懸濁液を経口投与した（各日の投与は、2時間の絶食後に経口ガベージによって行われた）。糞便微生物叢移植（FMT）の72時間後に糞便を採取し、さらに解析を行った。微生物叢懸濁液の調製には、300 mgの糞便ペレットを1 mlのPBSにボルテックスで再懸濁し、1500 gで5分間遠心して不溶化物を除去し、上清を-80℃で冷凍庫に保存した。微生物叢移植後、糞の採取と動物の解剖を行った。体重と組織重量を記録した。組織サンプルは4℃または-80℃の冷凍庫で別々に保存した。各マウスの糞便ペレットを3〜5個無作為に選び、ノギスを用いて各糞便ペレットの直径を測定した。各マウスの平均糞便径を算出し、ヒストグラムで表示した。

WTまたはSIRT6 KOドナーマウスからのFMTは、SIRT6 KOレシピエントマウスが抗生物質処理なしで19日齢（離乳後）のときに開始した（Stebeggら、2019；WT-KO：WTマウスからの便微生物叢で移植したSIRT6 KOマウス、KO-KO：SIRT6 KOマウスからの便微生物叢で移植したSIRT6 KOマウス）。WT同腹子またはKOマウスの糞をFMT直前に採取し、前述と同様に微生物叢懸濁液を調製した。マイクロビオタ懸濁液を慎重にマウスに経口投与した。SIRT6 KOマウスには、1日あたり200μlの微生物叢懸濁液を1週間投与した。1週間後、マウスは自然死するまで週2回マイクロビオサスペンションを投与し、マウスの寿命を記録した。FMTの間、レシピエントマウス（SIRT6 KO）のケージには、汚れた寝具とWTまたはKOマウスの糞便ペレットが週3回補充された。当然のことながら、KOマウスは共食いのため、WTまたはKOから腸内細菌叢を可能な限り摂取することができた。マウスが28日齢になった時点で糞便と組織を採取した。

KOHDドナーマウスからのFMTは、SIRT6 KOレシピエントが19日齢（離乳後）のときに抗生物質処理なしで開始した（KOHD-KO：SIRT6 KOマウスにKOHDマウスの糞便微生物叢を移植したもの）。FMTの直前にKOHDマウスの糞を採取し、前述と同様に微生物叢懸濁液を調製した。マイクロビオタ懸濁液を慎重にマウスに経口投与した。SIRT6 KOマウスには、1日あたり200μlの微生物叢懸濁液を1週間投与した。FMTの間、レシピエントマウス（SIRT6 KO）のケージには、汚れた寝具とKOHDマウスの糞ペレットが週3回補充された。当然のことながら、KOマウスは共食いのため、KOHDから腸内細菌叢を可能な限り得ることができた。糞と組織はマウスが28日齢になった時点で採取した。

2.5 大腸菌の培養と経口補給
SIRT6ノックアウトマウスの糞をTryptic Soy Brothに再懸濁し、37℃で指数関数的な中位相まで培養を行った。培養物を6700gで5分間遠心分離し、菌体ペレットをPBSで2回洗浄した。次に、細菌懸濁液を100倍連続希釈し、大腸菌発色培地（CHROM; Solarbio, LA0780）上にプレーティングした。CHROMプレートは、個々の陽性コロニーが現れるまで、37℃の暗所で最低24時間インキュベートされた。陽性に染色されたコロニーを摘み取り、10mlのLB培地（Solarbio、L1010）に播種して37℃、200rpmの培養を行った。LB培地のCFU（Colony Forming Unit）が1.8×1010CFU/mlになった時点で、9000gで10分間遠心分離し、菌体を採取した。細菌ペレットをPBSで2回洗浄し、各レシピエントWTマウスの2×109CFU/kg体重に相当する濃度に希釈した。濃縮菌が志賀毒素産生性大腸菌（STEC）であることを確認するために、約100mlの菌懸濁液を10分間煮沸し、13800gで10分間遠心分離してゲノムDNAを得、qPCR法によりStx1、Stx2およびeaeAを検出した。

STEC懸濁液（100μl）を3ヶ月齢のC57BL/6J雄マウスに8時間の食餌飢餓の後、経口ガベージにより投与した。対照動物には、100μlの滅菌PBSを投与した。菌懸濁液を摂取して4時間後、餌と水の両方をマウスに自由摂取させた。感染後96時間に、マウスの便を採取し、大腸菌を検出した。1ヵ月後、同じSTEC移植アッセイを操作した。さらに1ヶ月後、糞便と臓器を採取し、さらなる分析を行った。

2.6 糞便中の水分量測定
各マウスの糞便ペレットを3〜5個無作為に抽出し、各糞便ペレットの糞便水分量を測定した。各マウスの糞便水分量の平均値を算出し、ヒストグラムで表示した。糞便水分量は、以前に記載されたように測定された（Jeongら、2017；Wangら、2020）。簡単に言えば、糞ペレットを蓋のない予め秤量したシャーレに採取し、各ペレットの重量を湿重量として測定した。その後、ペレットを80℃で24時間乾燥させ、乾燥重量を測定した。各糞ペレットの含水率は、以下の式により算出した。
\left/ ゙raisebox{-1ex}{$mathrm{fecal}} \mathrm{wet}$} {right.right}の倍数 100% $$$ ゙raisebox{-1ex}{$mathrm{wet} {$mathrm{weight}{weight}{weight}{weight%}の倍数
2.7 qPCR
TRIzol reagent (Invitrogen Life Technologies)で処理した後、製造元の指示に従って組織からTotal RNAを単離した。RNA濃度と純度は、Thermo Scientific Nanodrop 2000c (Thermo)を用いてA260/A230およびA260/A280比を測定することによって推定した。mRNAの逆転写はcDNA Synthesis Kit（TIANGEN社製）を用いて行った。本キットにはgDNaseが含まれており、ゲノムDNAを効率的に除去できるため、Total RNA中のゲノムDNAの干渉を回避することができる。PCRはSYBR Green (Yeasen) とCFX Manager 3.1 (Bio-Rad) を用いて実施した。各サンプルは3連で処理し、2-ΔΔCT法によりGAPDHまたはβ-アクチン量に正規化し、コントロール群の値との相対値で表した。プライマーはInvitrogen社に発注し、配列は表S3に示した。

細菌の定量には、QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（QIAGEN社製）を用いて、説明書に従ってマウス糞便からDNAを抽出した。20 ngのDNAサンプルを、細菌の16S rRNAを増幅するための特異的プライマー（Table S3）を用いたqPCR反応に用いた。細菌量は、保存された真正細菌16S rRNAプライマーペアを用いて糞便総菌量と正規化した。結果は相対定量値で示した。

細菌トランスロケーション解析のために、脾臓、腎臓、肝臓の組織を秤量し、TIANamp Genomic DNA Kit を用いて、製造者のプロトコールに従ってゲノムDNAを精製した（TIANGEN社）。大腸菌の遺伝子レベルはqPCRによって決定し、保存された真正細菌によって正規化した。データは相対的な定量化により解析した。

2.8 酵素結合免疫吸着測定法
マウス血清および糞便サンプルは、キットメーカーの説明書に従って、以下のようにELISAで評価した。LPS、LCN2、IL-1β、TNFα、CRP（LCN2：クラウドクローン社、その他：CUSABIO）。糞便サンプルは、まずサンプル40 mgを0.2 ml PBSに加え、1分間十分にピペッティングした後、室温（20〜25℃）で10分間平衡させ、最後に室温で6000〜8000 RCF、10分間遠心分離を行った。上清をELISA測定用の清潔な1.5 mlチューブに採取した。血清試料は、濃度およびキットの説明書に基づき評価した。測定は通常、各ウェルに上清50μlと検出抗体50μlを加え、キットからのマニュアルに記載された手順で検体を検査しました。標準曲線とサンプルウェルの生データは、GLOMAX Multi Detection System (Promega) を用いて最適化し、解析した。

2.9 16S rRNA シークエンス解析
糞便サンプルから微生物DNAを抽出し、バーコード付き分離DNAの16S rRNA遺伝子V4領域（515F-806R）をPCRで増幅し、Illumina HiSeqプラットフォーム（サービス提供：株式会社ノボジェン）を用いて製造元のガイドラインに従った塩基配列を決定した。プライマー配列は、515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGTAA、806R：5′-GGACTACHVHHTWTCTAATであった。すべてのPCR反応は、15μlのPhusion® High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs); 0.2 μMのフォワードおよびリバースプライマー、および約10 ngの鋳型DNAを用いて30μlの反応で行われた。サーマルサイクリングは98℃で1分間の初期変性、98℃で10秒間の変性、50℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の伸長を30サイクル行い、最後に72℃で5分間の伸長とした。生配列の品質保証とOTUピッキングにはUSEARCH v10.0.240を使用した（Edgar, 2013）。簡単に説明すると、まず生配列を脱多重化した。次に、脱多重化したリードをペアリードにマージし、Vsearch (2.14.2) に基づいてプライマーのストリッピングを行った。マージされたリードのうち、予想誤差閾値が1.0より大きいもの、またはリード長が160より短いものは、quality filtrationとして廃棄された。Amplicon Sequence Variantsの非クラスタリングノイズ化は、Usearch10のUnoise3で行った。quality filteredされたリードは、ユニークな配列にdereplicatedされた。ユニークな配列の多さから、シングルトンは破棄された。その後、類似度97%でOTUクラスタリングを行った。このOTUクラスタリングの実装では、Silvaデータベースを基にキメラフィルターを構築した。UPARSEによってピックアップされたすべてのマージされた配列をOTUにマッピングした後、テーブルを構築した。このOTUテーブルをQIIME 1.9.1解析にかけた(Kuczynski et al., 2011)。OTUの系統情報は、RDP classifier 11.5を用い、Ribosomal Database Projectの16S rRNAトレーニングセット16から参照配列をブートストラップカットオフ0.6で求めた（Wang et al.、2007年）。

腸内細菌叢の多様性解析と種の分類は、PCoAプロットとLEfSeで表示されるUniFrac距離として示されるα多様性、およびβ多様性に基づいて行われた。

2.10 短鎖脂肪酸分析
短鎖脂肪酸分析は、記載されたとおりに行った（Zhao et al, 2006）。各マウスサンプルの糞ペレットを秤量し、約100mgを50%アセトニトリル水溶液を含む1ml脱イオン水中でステンレススティール棒を用いて3分間ホモジナイズした。次に、ボルテックスによりSCFAを5分間抽出した。その後、懸濁液のpHを2〜3に調整し、続いて懸濁液をポリプロピレンチューブに移し、3000gで20分間、10℃で遠心分離した後、透明な上清を採取した。試料調製後の上清40μlに200mM 3NPHの50％アセトニトリル水溶液20μlと120mM EDC-6％ピリジン溶液20mlを混合し化学誘導体化した。40℃で30分間反応させた後、Speedvac™ Vacuum Concentrator（Thermo社製）で乾燥し、-80℃で冷凍庫に保存した。糞便上清には、あらかじめ標準溶液をスパイクしておいた。最後に、清華大学メタボロミクスコアファシリティプラットフォームがサポートするExactive™ GC Orbitrap™ GC-MSシステム（Thermo）でサンプル物質の蒸留物を分析し、検出限界より50%以上高い酢酸、ギ酸、プロピオン酸、イソ酪酸、酪酸、イソバレレート、バレレートなどのSCFAsが評価されました。

2.11 ウェスタンブロット
タンパク質を得るために、プロテアーゼ阻害剤カクテル（AbMole Bioscience）およびホスファターゼ阻害剤（Solarbio）を含む RIPA バッファー（Biomiga）で組織マッシュを溶解させた。タンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイキット（Solarbio）を用いて、製造元から提供された説明書に従い、測定した。次に、タンパク質（50μg/サンプル）を6×ローディングバッファー（Solarbio）と混合し、5分間煮沸して変性させた。次に、標準プロトコールに従って、12％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲルを調製した。その後、標準的な電気泳動を行い、タンパク質をポリビニリデン・ジフルオリド膜（ミリポア社）に移した。膜を5%スキムミルクと0.1%子牛胎児血清で37℃、1時間ブロッキングした後、Sirt6 (1:1000, ab62739, Abcam), p16 (1:1000, ab51243, Abcam), p21 (1:1000, ab188224, Abcam), β-actin (1:1000, 4970S, Cell Signaling Technology) 及びGAPDH (1:1000, ab181602, Abcam) に対する一次抗体とともに1夜インキュベーションした。インキュベーション後、ブロットをTBSTで3回洗浄し、次に、西洋わさび過酸化物標識ヤギ抗ウサギ抗体（Abcam）の1：1000希釈を含むTBSTで室温で2時間インキュベートした。TBSTで3回洗浄した後、ブロットをECLキット（Sigma）で現像し、Chemi Capture（CLINX）で可視化した。画像を撮影し、Imaging Lab ソフトウェアを使用してグレーの統計量を解析した。

2.12 組織学的染色
すべての組織を4％パラホルムアルデヒド（Servicebio）中で4℃、24時間固定し、パラフィンに包埋した。試料を脱水し、4μm 切片を検討した。H&E染色、PAS染色、アルシアンブルー染色は、製造元の説明書に従って行った（Servicebio）。写真は、光学顕微鏡（Axio Scan.Z1）を用いて撮影した。Zen 2.3 (blue edition, Carl Zeiss Microscopy GmbH, 2011) を用いて、既報のように盲検下でスコアリングシステムに基づいて形態学的評価を行った (Xu et al., 2020)。腸絨毛の長さは、ImageJ（Fiji）を用いて測定した。Analyze-Set Scale」で測定スケールを設定し、直線ツールで腸絨毛の長さを測定する。各セクションの3フィールドをランダムに選択し、このフィールドのすべての絨毛を測定し、各フィールドの平均絨毛長を算出した。各フィールドの平均長さはヒストグラムで表示された。

炎症の重症度（0から3までのスコアで、炎症なし、軽度、中等度、重度を示す）、粘膜損傷（0から3までのスコアで、なし、粘膜、粘膜下層、膜貫通を示す）、クリプト損傷（0から4までのスコアで、なし、基底部の3分の1を示す。大腸と小腸の組織学的スコアを得るために、それぞれ独立に測定した。各パラメータに組織の割合を乗じ、その合計を病理組織学的スコアとした。各セクションの3フィールドを無作為に選択し、スコアリングを行った。各セクションの平均病理組織学的スコアを算出し、ヒストグラムで表示した。

2.13 免疫組織化学染色
免疫組織化学（IHC）は、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織で実施した。5μm のパラフィン切片を作成した。クエン酸溶液で抗原を回収した後、スライドを水洗し、ペルオキシダーゼ阻害試薬でブロックし、p16INK4a抗体またはp21WAF1抗体（ab51243およびab188224、アブカム）とインキュベートした。免疫反応シグナルはDAB Quanto chromogen (Servicebio)で可視化した。その後、スライドをヘマトキシリンで対比染色し、脱水してマウントし、カバースリップで覆った。免疫反応は、光学顕微鏡（Axio Scan.Z1）で可視化した。p16とp21は、カラーデコンボリューションアルゴリズムを使用して定量化し、各フィールドの定義されたImageJベースのマクロ関心領域（ROI）においてDAB陽性を同定するために使用した。特定のROIは、不適切な領域を除外するために選択された。核陽性染色が併存しない領域は、偽陽性領域とみなした。計算の際には、これらの領域は特に除外した。各フィールドについて、陽性細胞の割合を算出した。各セクションの3フィールドを無作為に選択し、測定した。各セクションの平均値を算出し、ヒストグラムで表示した。

2.14 SA-β-gal活性アッセイ
SA-β-gal染色は、製造者の説明書に従って行った（Servicebio、G1073）。簡単に言うと、凍結した組織（厚さ8μm）を室温で10分間再加温し、フィックス液で室温で20分間固定した。凍結切片をPBSで3回洗浄した後、SA-β-gal染色液（pH6.0）と共に37℃、無CO2で一晩インキュベートした。SA-β-gal染色終了後、切片をエオシンで5分間対比染色し、ddH2Oで3回リンスした。切片を絶対アルコールで2回脱水し、キシレンで5分間清澄化した。余分なキシレンを除去し、カバースリップを切片の上に置いた。4℃で一晩乾燥させた後、光学顕微鏡（Axio Scan.Z1）で観察・可視化した。各切片の3フィールドを無作為に選択し、測定した。各切片の平均割合を算出し、ヒストグラムで表示した。SA-β-galで染色した肝臓、脾臓、腎臓の凍結切片は、ImageJソフトウェア（NIH、バージョン2.1.0/1.53c）により定量し、陽性染色面積を計測した。総面積は、エオシン陽性面積で定量した。SA-β-gal陽性面積を総面積で割った相対的なSA-β-gal陽性面積を算出した。"Color threshold "は、ターゲット領域の選択に使用し、SA-β-gal陽性領域については、閾値をRed (0,100), Green (0,20), Blue (0,200) とし、エオシン陽性領域については、閾値をRed (100,255), Green (0,58), Blue (140,255) として設定した。面積の測定には、閾値に限定した "Measure "を使用した。肝臓と脾臓のSA-β-gal陽性面積の統計は、ランダムに撮影部位を選択し、撮影した。腎臓のSA-β-gal陽性領域は、偽陽性を避けるため、腎近位尿細管上皮を避けた領域を無作為に選択した。

2.15 大腸菌の検出と識別
SIRT6 KO マウスの糞便サンプル 20 mg を 1 ml のトリプトカゼイン-大豆 (TCS) ブロス (Solarbio) でホモジナイズした。糞便ストックをTCSブロスを用いてそれぞれ100倍、1000倍、10000倍に希釈し、37℃で3時間培養した。100μlのアリコートを大腸菌発色培地（Solarbio）にプレーティングし、37℃で20時間好気的条件下で培養した。大腸菌発色培地は、すべての大腸菌といくつかの非発酵グラム陰性菌を分離するための選択的で差動性のある培地である。一晩培養したものを、細菌の増殖とコロニーの形態について調べた。発色培地上のアクアマリンブルーのコロニーは大腸菌であった。無作為に選んだアクアマリンブルーのコロニーからDNAを抽出し、qPCRによりaggR、eaeA、Stx1、Stx2、St（1a/1b）、It、ipaHおよびdaaD遺伝子について直接検査した。プライマー配列は Table S3 に示した。

2.16 FITC-デキストラン腸管透過性アッセイ
Fluorescein isothiocyanate（FITC）-dextran（平均分子量：4000 Da）を用いて、腸管透過性を測定した。簡単に説明すると、6時間絶食させたマウスにFITC-dextran（600mg/kg体重、180mg/ml）を胃内投与した。4時間後、血液を採取し、10分間遠心分離（3000g、4℃）し、血清を採取した。GLOMAX Multi Detection System (Promega) を用いて、FITC-デキストラン濃度を測定した。標準曲線は、無処置マウスの血清中のFITC-dextranを連続希釈することで作成した。

2.17 統計解析
結果は、平均値±SEMで表した。統計的有意性は、両側不対t検定、一元配置分散分析、またはTukeyの多重比較検定付き二元配置分散分析を用いて評価した。PCoA解析にはPERMENOVA検定を使用した。p値が0.05未満を有意とした。データの解析とプロットは、Graph Pad Prism 9.0 ソフトウェア、STAMP ソフトウェア、または R version 3.6.2 で行った。

3 結果
3.1 SIRT6 KOマウスは腸内細菌叢の異常を示し、KOマウスからWTマウスへの微生物叢の移植により早期老化の表現型が付与される
SIRT6 KOマウスにおける腸内細菌叢の存在とレベルを特徴付けるために、SIRT6 KOマウスとWT同腹子の糞便サンプルを採取した（図1a）。大腸組織総タンパク質のウェスタンブロット解析により、SIRT6がKOマウスに存在しないことが確認された（図S1a）。腸の病理学的損傷（図S1b）および炎症（図S1c,d）の増加が観察され、SIRT6 KOマウスでは自然発症の大腸炎が起こったことが示された（Mostoslavsky et al.、2006）。次に、16S rRNA遺伝子プロファイリングを行い、主座標分析（PCoA；重み付き、図1b；重みなし、図S1e）により2つの異なるグループのマイクロバイオームを見出した。WTマウスの1419個からSIRT6 KOマウスの1190個まで、操作的分類単位（OTU）の著しい減少が観察された（図S1f）。実際、SIRT6 KOマウスでは、SCFAs、特に酢酸と酪酸の濃度が急激に低下しており、腸内細菌の異常が観察された（図S1g）。この結果は、複雑な食餌性化合物を消化し、食物から採取したエネルギーの収量を向上させる能力が広く認められているバクテロイデット類の全体的な存在量の低下（図S1h）からも裏付けられた（Khan Mirzaei et al.、2020）。したがって、RuminococcaceaeおよびLachnospiraceaeを含む主要なSCFAs産生分類群の存在量がわずかではあるが減少していることも確認された（図S1i）。SIRT6 KOマウスは、Enterobacteriaceaeなどの炎症性細菌分類群に実質的に富んでいた（図1cおよびS1j；Fachiら、2019；Sassone-Corsiら、2016）。さらに、プロジェリアマウスや患者で濃縮されることが知られているVerrucomicrobiaceae、Proteobacteria、Prevotellaceaeも、SIRT6 KOマウスで有意に豊富であった（図1cおよびS1j）。また、Helicobacter属の細菌（Helicobacter typhlonius、Helicobacter bilis、Helicobacter hepaticusを含む）、Enterococcus、Bacteroidesの著しい増加、Faecalibacterium prausnitziiの減少も見出した（図S1j；Haleら、2007；Niら、2017；Shinら、2015）。これらのデータを合わせると、SIRT6 KOマウスは、重度の腸内環境異常の存在によって特徴付けられることが示される。

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図1
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腸内細菌の異常が老化の表現型に寄与しているかどうかを調べるために、FMTを実施した。SIRT6 KOマウスまたはWTマウスをマイクロバイオームドナーとして、若いWTマウスをレシピエントとして使用し、それぞれKO-WTおよびWT-WTと略記した（図1d）。さらに、対照として何も介入しないWTマウス群も含めた。FMTの有効性は、ドナーとレシピエントの腸内細菌叢プロファイルを比較することで評価した。この解析により、移植されたWTマウスはドナーの微生物叢を獲得したことが示された（図S2a,b）。KO-WTマウスでは、PCoAプロットで示されるβ多様性指数、OTUの減少、Chao1指数とACE指数で示されるα多様性の減少が見られた（図1e、S2c,d）。KO-WTマウスは、FMT4週間後に毛が粗くなり、白髪が増えた（図1fおよびS3a）。KO-WTマウスは体重は正常であったが、血清グルコースレベルが低かった（図S3b,c）。注目すべきは、低血糖がSIRT6 KOマウスの主な死因の1つであると広く考えられていることである（Mostoslavskyら、2006；Xiaoら、2010）。我々は、KO-WTマウスにおいて軽度の脂肪減少を観察し（図S3d；表S1）、白色および褐色脂肪組織におけるより小さな脂質滴を伴い（図S3e）、SIRT6 KOマウスにおける脂肪組織の萎縮と一致した（Li et al.、2020）。以上のデータから、KOマウスの腸内細菌叢がレシピエントの脂質代謝に影響を与え、KO-WTマウスがSIRT6 KOドナーマウスの病態的特徴を一部模倣することがわかり、SIRT6欠損の表現型が腸内細菌叢によって伝達されうることが示唆された。腸は腸内細菌叢の影響を受ける主要な臓器であることを考慮し、我々は次にFMTが腸管バリア機能にどのような影響を与えるかを理解することを目指した。興味深いことに、KO-WTマウスでは、SIRT6 KOマウスと同様に、直径と水分量が減少した萎んだ糞便粒子が観察された（図1g）。大腸組織のqPCR分析では、TNFα、IL-1β、IL-6などの炎症因子のレベルがKO-WTマウスで上昇した（図1h）。また、KO-WTマウスでは、組織学的スコア、絨毛長、粘液糖タンパクの評価により、結腸および小腸の構造が損傷していることが確認された（図S4a）。クローディン-1、オクルディン、およびZO-1を含む、腸の上皮接合部の形成に関与する遺伝子は、ダウンレギュレートされていた（図S4b）。一般にリポ多糖（LPS）と呼ばれる血清内毒素は、腸管透過性の間接的な指標としてよく用いられる（Vancamelbeke & Vermeire, 2017）。血清LPS濃度は、WT-WTマウスよりもKO-WTマウスで有意に高かった（図S4c）。また、腸管透過性アッセイを実施し、KO-WTマウスで腸管透過性が上昇することを見出した（図1i）。以上のことから、SIRT6 KOマウスから移植された糞便微生物叢は、レシピエントマウスにおいて腸の炎症を促進し、腸のバリア機能を破綻させることが示唆された。

また、生物学的老化の測定によく用いられる脾臓、腎臓、肝臓で老化に伴う変化を観察した（Lee et al., 2013; Levitsky, 1980）。KO-WTマウスの脾臓、腎臓、肝臓では、炎症マーカーの発現が有意に増加した（図1j）。さらに、血清IL-1β、TNF-α、CRPの高値、および脾臓の肥大は、KO-WTマウスにおける炎症の存在が全身的であることを示した（図1kおよびS3d）。全身性の炎症は、脂肪減少および低血糖を促進することが報告されており（Fischerら、2015；Grutherら、2008；Kealyら、2020）、観察された脂肪量および血清グルコース値の減少は、KO-WTマウスの炎症状態の増加による可能性が示唆された。P16lnk4a（p16）およびp21waf1（p21）は、齧歯類およびヒトの正常な老化の間に様々な組織で蓄積するため、老化マーカーとして使用されている（Krishnamurthyら、2004；Yousefzadehら、2020）。我々は、免疫組織化学およびウェスタンブロットで観察したところ、これらのマーカーのmRNAレベルは結腸で増加し（図S4d）、一方、タンパク質レベルは脾臓、腎臓および肝臓で増加した（図2a〜c、およびS4e）。しかし、これらのマーカーの発現増加は、活性化したマクロファージによって引き起こされることもある。そこで、β-ガラクトシダーゼ染色アッセイを行ったところ、WT-WT対照マウスと比較してKO-WTマウスの異なる組織でβ-ガラクトシダーゼ陽性面積比が増加し、KO-WTマウスにおける内臓老化を直接示すことがわかった（図2a-c）。このように、SIRT6 KOマウスの腸内細菌叢をWTマウスに移植すると、炎症と細胞老化が誘導されることを示し、SIRT6 KOマウスの早期老化表現型に腸内細菌叢の異常が寄与している可能性が示唆された。

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図2
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SIRT6 KOマウスにおける腸内環境の異常と早期老化の表現型との因果関係を確認するために、19日齢のKOマウスに抗生物質カクテルを3日間連続で経口投与し（図3a）、28日齢のマウスの糞便と組織を採取した。その結果、KO＋抗生物質マウスでは、TNFα、IL-1β、IL-6などの炎症因子や、p16、p21などの老化マーカーの発現が減少していることも確認された（図3b）。これらのデータは、SIRT6 KOマウスの早期老化の表現型に腸内細菌の異常が寄与していると主張する因果関係の直接的な証拠を提供する。

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図3
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3.2 WTマウスの腸内細菌叢はSIRT6 KOマウスの寿命を延長し、腸内細菌叢の異常を改善する
腸内細菌叢を改善することで、KOマウスの寿命短縮を救い、早期老化の表現型を抑制できるかどうかを調べるために、SIRT6 KOマウスにWTマウスの細菌叢を用いたFMTを行った（WT-KO、図4a）。WT-KOマウスは、KO-KOマウス（SIRT6 KOマウスの微生物叢を移植したSIRT6 KOマウス）およびSIRT6 KOマウスと比較して、生存期間の延長を示した（図4b）。KO-KOマウスは、SIRT6 KOマウスよりも生存率がやや悪かった。そこで、SIRT6 KOマウスではなく、WT-KOマウスでSIRT6 KOマウスと比較して改善されることを引き続き検証し、SIRT6 KOマウスにおけるFMTの有用性を検討した。生後28日目に糞便を採取し、16S rRNA遺伝子プロファイリングを行った。その結果、WT-KOマウスでは、SIRT6 KOマウスと比較して、β多様性指数に明確な差が見られ、また、Shannon指数とSimpson指数で示されるα多様性がわずかに増加した（図4c,d）。FMTの有効性は、ドナーとレシピエントの腸内細菌叢プロファイルを比較することによって評価された。この解析により、WT-KOマウスはWTマウスのマイクロバイオームを部分的に獲得していることが示された（図4e）。LEfSe解析では、SIRT6 KOマウスでは濃縮されていたEnterobacteriaceae, Verrucomicrobiaceae, Proteobacteria, Prevotellaceaeなどの複数の病原性細菌種がWT-KOマウスでは消失しており（図4e、f）、WT-KOマウスの腸内細菌の異常が改善したことが示唆された。さらに、28日齢のWT-KOマウスから臓器・組織を採取し、炎症因子や老化マーカーのmRNA量を測定したところ、WT-KOマウスでは、炎症因子や老化マーカーが減少していた。WT-KOマウスは、脾臓、腎臓、肝臓などの異なる組織において、炎症と細胞老化の減少を示した（図4g）。これらの結果は、WTマウスのFMTがSIRT6 KOマウスの腸内細菌症を改善し、寿命を延ばし、炎症と細胞老化を抑制できることを示し、SIRT6 KOマウスの早期老化における制御不能なマイクロバイオームの役割を支持するものであった。

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図4
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3.3 大腸菌の過剰増殖による腸内細菌科細菌の内臓への移行が、加齢に伴う特徴を促進する
大腸菌（腸内細菌科）の存在量は年齢依存的に増加し、投薬や病気などの他の要因には影響されないようである（Leite et al.、2021）。SIRT6 KOマウスとWTマウスの微生物集団組成を比較すると、最も有意に濃縮された種は大腸菌であり、qPCRで検証したように、SIRT6 KOマウスではWTマウスの300倍以上高かった（図5a,b）。大腸菌の増加は、レシピエントKO-WTマウスでも観察された（図5c,d）。さらに、大腸菌量の差はFMT後2ヶ月間持続し（図S5a）、FMT後のコロニー形成が成功したことを示している。特に、SIRT6 KOマウスと比較して、存在量が最も減少した細菌はWT-KOマウスの大腸菌であった（図5e,f）。KOマウスの糞便中の大腸菌の存在量は、抗生物質処理によって効果的に減少させることができた（図S5b）。大腸菌の高い存在量は、他のプロバイオティクスの相対的存在量だけでなく、全体の微生物多様性に悪影響を及ぼす（Leiteら、2021）ことから、大腸菌の過剰増殖は、SIRT6 KOマウスにおけるさらなる細菌異常症と関連症状を悪化させる触媒的事象である可能性が高いことが示唆された。

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図5
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有害な腸内細菌の過剰増殖は、細菌の転座の増加と組織損傷をもたらす（Nicolle et al.、2004）。大腸菌の過剰増殖に伴う細菌の転座の増加が早期老化に寄与しているかどうかを調べるため、qPCRを用いてKOマウスの脾臓、腎臓、肝臓組織における腸内細菌科細菌の相対転座を測定したところ、KOマウスで腸内細菌科細菌の負荷が増加していた（図5g）。同様に、KO-WTマウスの腸内細菌負荷量もWT-WTマウスのそれよりも高かった（図5h）。これらの結果は、腸内細菌科細菌の内臓への移行を通じて、KOおよびKO-WTマウスの老化表現型を促進する可能性を示している。

Stx1、Stx2、およびeaeAのPCR結果が陽性で、他の遺伝子の結果が陰性であることから、SIRT6 KOマウスには志賀毒素原性大腸菌（STEC）株が存在することが示唆された（図S5c；Guionら、2008）。STECが老化表現型に寄与しているかどうかをさらに調べるために、SIRT6 KOマウスの糞便から抽出したSTECを培養し、これらの抽出物をPBSまたはPBS単独に懸濁して3ヶ月齢のWTマウスに経口投与した（それぞれWT＋STECおよびWT＋PBS；図5i）。介入開始2ヶ月後に糞および別組織を採取した。qPCRにより、最初の介入から96時間後と2ヶ月後に、WT + STECマウスで、大腸菌の存在量が多いことを確認した（図5j）。一方、異なる組織における腸内細菌科細菌の相対的な負荷を測定した結果、WT + STECマウスの脾臓、腎臓、肝臓の組織への腸内細菌科細菌の移行がより大きいことが示された（図5k）。実際、WT + STECマウスでは、腎臓、脾臓、肝臓、大腸など様々な組織でp16およびp21タンパク質の発現、β-ガラクトシダーゼ陽性面積比が増加しており（図5lおよびS5d）、WT + STECマウスの様々な臓器で細胞老化が発生していることが示唆された。以上のことから、大腸菌の過剰増殖は腸内細菌の転座を促進し、その結果、特定の老化表現型を加速させることが示唆された。

SIRT6が腸内細菌叢に直接影響するかどうかを調べるために、4週齢のSIRT6ヘテロ接合体（SIRT6+/-）マウスと同腹のWTマウスから糞便を採取して分析したところ、SIRT6+/-マウスの糞便は、SIRT6+/-マウスの糞便とほとんど変わらなかった。SIRT6+/-マウスとWTマウスの間で、糞便中の腸内細菌科と大腸菌の存在量に差はなかった（図S6a）。さらに、SIRT6+/-マウスは、結腸および小腸の正常な組織学的スコアおよびPAS+粘液面積比、ならびに小腸の絨毛長によって支持される健康な組織構造および機能を保有していた（図S6b）。TNFα、IL-1β、IL-6などの炎症因子、p16やp21などの老化マーカーは、SIRT6+/-とWTマウスとの間に有意差はなかった（図S6c）。以上のことから、SIRT6+/-マウスは腸内細菌叢の異常を示さず、従ってSIRT6自体も腸内細菌叢に影響を与えないことが示唆された。

3.4 SIRT6 KOマウスの高脂肪食による早期老化の回復には、腸内細菌叢のリバランスが寄与していること
上記の結果は、早期老化を促進する腸内細菌叢の役割を明らかにし、腸内細菌叢を標的にして老化の表現型を改善できることを示唆している。食事介入は、マイクロバイオームを再構築するための最も効果的な戦略の一つである。私たちは以前、高脂肪食がSIRT6 KOマウスの代謝障害と早期老化を回復させることを報告しました（Li et al.、2020）。このことから、高脂肪食の利点は、SIRT6 KOマウスの腸内細菌叢の変化に起因するのかどうか疑問に思った。この疑問を解決するために、我々はSIRT6 KOマウスに離乳直後から高脂肪食を与え始めた（KOHD）。驚くべきことに、35匹中31匹（生存率89%）が5週目を過ぎても生存していた（対照食群の生存率6.7%）。十分なKOマウスを確保するため、実験には4週齢のマウスを使用した。高脂肪食群の生存マウスは、血糖値が有意に高く、絨毛長の増加や粘液分泌など、より正常な腸内構造を示した（図6bおよびS7a-c）。KO群とKOHD群の細菌多様性には明確な違いがあり、WTHD群とKOHD群の間には多くの類似性が見られた（図6c）。高脂肪食下のKOマウスとWTマウスの腸内細菌叢プロファイルが類似していることから、高脂肪食はKOマウスの腸内細菌叢の異常を改善し、比較的正常な状態にリバランスできる可能性が示唆された。高脂肪食の介入により、有害細菌分類群、特にEnterobacteriaceaeとE. coliの有病率の減少によって測定されるように、腸内細菌叢は当然改善された（図6d、e、およびS7d）。さらに、Bacteroides、Proteobacteria、Enterococcusの減少、Actinobacteria、Streptococcus、Faecalibacteriumの豊富な存在は、腸内細菌症の減衰を実証した（図6d）。さらに、KOマウスでは、内臓器官への腸内細菌の移行が高脂肪食によってほぼ完全に回復することも見いだした（図6f）。

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図6
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高脂肪食が早期老化を抑制するメカニズムが腸内細菌のバランスを整えることであることを確認するために、WTマウスにKOHD微生物叢を用いたFMTを行った。FMTの有効性は、ドナーとレシピエントの腸内細菌叢プロファイルを比較することで評価した。この解析により、移植されたWTマウスはKOHD微生物叢を獲得していることが示された（図S8a）。その結果、KO-WTマウスと比較して、KOHD-WTマウスの腸内環境はバランスが取れており、腸内組織構造が健全で（図S8b，c）、大腸菌の存在量も少ない（図S8d）ことが分かりました。さらに、KOHDマウスから19日齢のKOマウスへのFMTを実施した（図6g）。KOHD-KOマウスの糞便中の大腸菌の相対量がKOマウスと比較して減少していることに加えて（図6h）、KOHD-KOマウスは、炎症因子TNFα、IL-1β、IL-6、および老化マーカーp16とp21の発現が低下していることも見いだした（図6i）。これらのデータは、高脂肪食の効果が腸内細菌叢のリバランスによって媒介されると主張する因果関係の直接的な証拠を提供するものである。

これらのデータを総合すると、高脂肪食はバランスのとれた腸内細菌叢を再構築し、特に大腸菌の過剰繁殖を抑え、早老症の表現型を改善するという概念を裏付けるものである。

4考察
高脂肪食は、自然老化マウスと早老マウスの両方において、寿命と健康寿命を高めることが示されている（Robertsら、2018；Scheibye-Knudsenら、2014；Shiら、2021）。しかし、高脂肪食によってマイクロバイオームがどのように変化し、これらの変化が表現型の老化改善にどのように寄与するかについての情報は乏しい。ここでは、老化研究モデルとして有用なSIRT6 KOマウスが、バランスの悪いマイクロバイオームシグネチャーを持つこと、このプロファイルは、それに関連する老化促進特性に加えて、SIRT6 KOドナーからの糞便移植によりWTマウスに移行し得ることを見出した。逆に、WTマウスからSIRT6 KOマウスへのFMTは、SIRT6 KOマウスで観察された寿命の短さと腸内細菌の異常を回復させた。また、抗生物質投与により大腸菌の過剰増殖が効果的に抑制され、KOマウスの早期老化表現型が救済された。この腸内細菌叢による老化のメカニズムは、大腸菌、特にSTECの過剰増殖が内臓器官への腸内細菌の移行を促進し、ある種の老化表現型の加速につながることを突き止めた。重要なことは、高脂肪食によって健康な腸内細菌叢が再構築され、寿命の短縮が逆転することである。これは主に、腸内の大腸菌量と内臓への腸内細菌科細菌の移行が減少することによって起こる（図7）。今回の研究成果により、腸内細菌と老化プロセスの関連性を標的とした、老化および老化関連疾患の新規治療戦略の可能性が浮き彫りになりました。

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図7
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SIRT6 KOマウスでは、WTマウスと比較して大腸菌の存在量が著しく増加することが観察された。このことから、SIRT6の世界的な欠損が、どのようにして腸内の大腸菌の増殖やコロニー形成を促進するのか、不思議に思いました。SIRT6を阻害すると、ヒト樹状細胞（DC）の分化と免疫賦活能が低下し、抗原の取り込み、処理、提示が低下する。無効になったDCは、T細胞およびB細胞の免疫応答を効率的に活性化できず、病原性細菌集団がマイクロバイオームを圧倒することを可能にします（Honda & Littman, 2016; Lasigliè et al, 2016）。したがって、免疫系機能の異常は、SIRT6 KOマウスにおける大腸菌の適切な増殖微小環境に潜在的に寄与している（Small et al.、2013）。SIRT6+/-マウスではストレスがなければ生理的な影響は見られないという以前の報告と一致するように（Naiman et al., 2019; Wang et al., 2016）、通常の成長条件下で1ヶ月齢のSIRT6+/-マウスに腸内環境の異常は見つからず、SIRT6ハプロイン欠損は十分な活性を保持していると示唆された。過剰な大腸菌は、高齢者において広く観察されている（Bana & Cabreiro, 2019; Biagi et al.） この過剰増殖は、腸内細菌科細菌の全体的な増加を促進し、これがさらに他のプロバイオティクスの相対的な存在量と全体の微生物多様性の両方に悪影響を与え、老化に伴う特定大腸菌群の増加と微生物多様性の減少との間の関連性を支持する（Leite et al.、2021年）。したがって、大腸菌と腸内細菌科細菌の両方が過剰に存在することが、SIRT6 KOマウスにおける細菌症症状の最初のドライバーである可能性が高い。腸内細菌の過剰増殖が、全身の炎症や内臓の老化を促進するという我々の知見と一致し、細菌の転座や組織損傷の増加をもたらすことが報告されている (Nicolle et al., 2004)。我々のデータは、過剰な大腸菌によって引き起こされる腸内細菌科細菌の転座が、脾臓、腎臓、肝臓の組織の老化を引き起こすことを示唆している。これは、腸内細菌の異常と老化の間の因果関係であると考えられる。

腸内細菌は食事の影響に非常に敏感で、宿主の代謝を調整する中心的な役割を担っている（Ang et al.） 本研究では、短期間の高脂肪食により大腸菌量が有意に減少し、腸内細菌叢が改善され、SIRT6 KOマウスの寿命延長と早期老化の逆転に貢献した。マウスを脂肪の多い食事に切り替えると、24時間以内に腸内細菌叢の組成が変化し、肥満状態ではなく、食事脂肪量の増加によって駆動された（Hildebrandt et al.） 高脂肪食は、脂質の消化を促進するために胆汁の分泌を促進します（Islam et al.、2011）。デオキシコール酸やリトコール酸などの二次胆汁酸を含む総胆汁酸濃度は、ヒトや動物モデルにおいて高炭水化物食と比較して高脂肪食摂取時に増加する (Reddy, 1981)。Bárcenaは、食事中のコール酸のin vivo補充が、健康全般の改善、中央値および最大生存率の向上など、プロジェリアに対する有益な効果を促進することを見出し、胆汁酸代謝の調節がマウスの長寿を制御し得ることを示唆しました（Bárcena et al.、2018）。チェノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、およびリトコール酸は、大腸菌の集団に対して強力な抗菌活性を有する（Kongら、2011年；Wangら、2019年）。メカニズム的には、大腸菌に対するデオキシコール酸の効果には、この微生物のラグタイム定数と生成時間の増加、および増殖速度定数と総細胞収量の減少が含まれる。したがって、高脂肪食によって引き起こされる大腸菌の増殖抑制の説明の一つは、胆汁酸分泌の増加であると考えられる。高脂肪食によるディスバイオーシス改善メカニズムのもう一つの可能性は、本研究で使用したココナッツオイルの効果である。ココナッツオイルの特徴的な栄養素であるカプリル酸などの中鎖飽和脂肪酸は、大腸菌に対して大きな抗菌活性を示しています（Lemariéら、2018；Marounekら、2003）。さらに、Proteobacteriaなどの他の病原体の存在量の変化は、おそらくEnterobacteriaceae科、特にEscherichia属の減少に起因していると考えられる（Leite et al.、2021）。今後の研究で、健康維持や疾病防御における胆汁酸のさらなる機能を取り上げたいと考えています。

高カロリー食と呼ばれることもある高脂肪食は、ほとんどの研究でカロリーの過剰摂取と関連しています（Bisanz et al.、2019）。脂肪および／またはカロリーが高い傾向にある西洋の食事は、代謝症候群、悪性腫瘍、および他の加齢に伴う機能不全の発生率の増加と関連している（Albenberg & Wu, 2014）。対照的に、エネルギー摂取量を減少させた高脂肪、低炭水化物ダイエットは、ヒトにおいて脂肪量の減少および体重減少をもたらし、循環トリグリセリドおよびインスリン抵抗性の減少を伴う（Veumら、2017年）。さらに、中鎖トリグリセリドに富む等カロリー高脂肪食は、肥満に関連する代謝異常を改善し、総体脂肪を減らし、全体的な代謝の健康を改善し、肝臓および皮下白色脂肪組織における熱発生を誘導する（Rialら、2020年）。最近の研究では、脂肪からのエネルギーが34.6％の等カロリーの中等度高脂肪食が、雄ラットやショウジョウバエの寿命を延ばすことが報告されています（Shi et al.、2021）。ココナッツオイルは、抗肥満性、抗炎症性、およびインスリン感受性があり、肥満誘発性および糖尿病誘発性であり、腸内細菌叢の好ましくない変化と関連している大豆油とは対照的です（Deolら、2015年；Wanら、2019年）。本研究では、WTおよびSIRT6-KOマウスの両方に、等カロリーのココナッツオイルベースの高脂肪食を与えた。WTマウスでは、1週間の高脂肪食投与後、明らかな腸内細菌の異常や代謝異常は検出されませんでした。したがって、等カロリー高脂肪食が若年者および高齢者の腸内細菌叢、代謝および寿命に及ぼす長期的影響については、さらなる研究が必要である。

以上のことから、今回の研究結果は、腸内細菌叢と老化プロセスの関連性を標的とした、老化および老化関連疾患の新たな治療戦略の可能性を浮き彫りにするものである。これらの知見のメカニズム的基盤の解明を継続的に進めることは、加齢および加齢関連疾患を治療するための食事介入において、より個別化されたアプローチを提供するための基礎となるであろう。

著者の貢献
K.X.、Z.C.L.、Z.W.は研究の着想を得た。K.X.、Z.C.L.、Z.Wは実験のデザインを行った。Y.N.Gは実験およびデータ分析の大部分を行った。Y.D.W、K.Z.P、L.Pは動物の飼育、解剖および組織の染色の実施を行った。S.C.とV.L.はデータの解析と解釈に貢献した。Y.R.とY.Q.は染色分析と定量を行った。X.L.、Y.Q.、Q.F.L.、Z.W.は考察とデータ解釈に貢献し、K.X.、Z.C.L、 V. L. および Z.W. は原稿執筆にあたった。最終原稿は全著者が読み、承認した。

謝辞
原稿の議論と批判的な読解を行ったZhihua Liu博士（清華大学医学部）に感謝する。本研究は、助成番号81871095の中国国家自然科学基金、助成番号2018YFC2000304および2018YFD0400204の中国国家重点研究開発プログラム、助成番号2016YFE0113700の中国重点国際S&T協力プログラムにより支援されたものである。

利益相反
著者は競合する利害関係を宣言しない。

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