全身および腸管の生物学的老化の促進に関連する腸内微生物の特徴的なシグネチャー

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出版：2024年2月22日
全身および腸管の生物学的老化の促進に関連する腸内微生物の特徴的なシグネチャー
https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-024-01758-4


シャリーニ・シン, レイラ・B・ジロン, ...モハメド・アブデル・モーセン 著者
マイクロバイオーム第12巻、論文番号：31（2024） この論文を引用する

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126 Altmetric

指標詳細

概要
背景
HIV感染者（PLWH）は、抗レトロウイルス療法（ART）によってウイルス複製が制御されている場合でも、持続的な炎症を経験する。この炎症の一因は腸内細菌の異常繁殖と転移していることであり、これがAIDSに関連しない加齢に伴う合併症の原因となっている可能性がある。HIVとの共存が、感染そのもの、ARTの使用、性的指向、その他の関連因子の影響を受けて、腸の生物学的年齢にどの程度影響するかは不明である。さらに、PLWHの生物学的加齢における微生物異常と転座の役割もまだ解明されていない。これらの不確実性を調査するため、我々はシステム生物学的アプローチを用いて、ARTを受けているPLWHと対照としてHIVに感染せずに生活している人（PLWoH）の結腸・回腸生検、血液サンプル、便検体を分析した。

結果
PLWHは、PLWoHと比較して、様々なエピジェネティック老化時計によって測定されるように、大腸、回腸、血液において生物学的老化の加速を示した。微生物の移動と生物学的老化の関係を調べたところ、PLWHでは微生物の移動が増加するとともに、腸内のタイトジャンクションタンパク質のレベルが低下していた。この腸管透過性は、生物学的老化の促進や炎症の増加と相関していた。微生物異常と生物学的老化の関係を調べたところ、PLWHの腸内には、カテニバクテリウムやプレボテラといった特定の炎症性細菌がより多く存在していた。これらの細菌は生物学的老化の加速と相関していた。逆に、PLWHの腸内では、抗炎症性の短鎖脂肪酸を産生することで知られる細菌、例えばスブリグランリウムやエリシペロトリカスの存在量が少なく、これらの細菌は生物学的老化の遅さと関連していた。相関ネットワークにより、大腸と回腸の特定の微生物属（糞便には含まれない）と、老化の進行、炎症性微生物関連代謝産物（トリプトファン代謝経路のものなど）の増加、ヒプリン酸のような抗炎症性代謝産物の減少との間に有意な関連があることが明らかになった。

結論
われわれは、腸および全身の生物学的老化に関連する特定の微生物組成および微生物関連代謝経路を同定した。この生物学的老化の微生物シグネチャーは、HIV感染そのもの、ARTの使用状況、性的指向、HIVとともに生きることに関連するその他の側面など、さまざまな要因を反映している可能性が高い。このような関連性の根底にあるメカニズムをより深く理解することで、加速する老化とそれに関連する健康合併症を軽減するための潜在的な戦略を提供できる可能性がある。

ビデオ要約

はじめに
胃腸（GI）管は、HIV感染の発症と持続において重要な役割を果たしている [1] 。HIV感染は腸管上皮バリアを破壊し [2,3,4]、微生物やその産物に対する腸管の透過性を亢進させる [5]。このような透過性の亢進は、局所的・全身的な炎症を引き起こし、HIVの複製をさらに刺激し [5,6,7,8,9,10]、AIDSに関連しない老化に伴う合併症 [5,11,12,13,14,15,16,17,18]の発症につながる可能性がある。この炎症はウイルスの持続にも関与している可能性がある [7, 8, 10]。残念なことに、抗レトロウイルス療法（ART）を使用しても、HIVによる腸管上皮バリアの損傷は修復されないままであり、微生物の移動と炎症が持続している [19,20,21] 。

いくつかの研究から、HIVに関連した微生物の転流は、微生物ディスバイオーシスとして知られる腸内細菌叢の組成と多様性の変化によって悪化する可能性が指摘されている。このディスバイオーシスには、抗炎症性善玉菌の減少、および/または炎症性有害菌の蓄積が関与している。善玉菌の中には、腸管バリアを強化する重要な代謝産物である短鎖脂肪酸（SCFA）を産生するものがある [22,23,24,25,26,27,28] 。しかし、HIVそのもの、あるいはARTの使用や性的指向などHIVとともに生きることに関連する他の因子が、このような微生物異常症を引き起こすかどうかは、依然として不明である。HIVとともに生きる人々（PLWH）においては、性行為のような行動に起因する微生物異常症もある [29] 。しかし、最近の知見によると、HIVに関連した微生物異常症は、性的指向とは無関係に発生する可能性がある [30] 。おそらく、HIV関連ディスバイオーシスは多因子性であり、HIV感染そのもの、性的指向、およびHIVとともに生きることに関連する追加的要因によって部分的に引き起こされるのであろう。それにもかかわらず、このHIVとの共存に関連した微生物異常は、より大きな全身性炎症、疾患進行の悪化、炎症と老化に関連した病態の増加と関連している [30] 。

ARTを受けているPLWHにおいて、炎症と加齢に関連した合併症の発生が増加していることから、最近では、HIVとの共存が、感染そのもの、ARTの使用、性的指向、またはその他の関連因子の影響を受けて、生物学的老化のプロセスを加速させるかどうかについての研究が進められている。最近の報告では、PLWHの血液において生物学的老化が促進または亢進している証拠が実際に示されている [31,32,33,34,35,36] 。しかし、これらの研究は、PLWHにおける慢性炎症の調節に腸が重要な役割を果たす可能性があるにもかかわらず、血球に焦点を当てたものである。したがって、HIVとの共存とその関連因子の組み合わせが、腸の老化プロセスに影響を及ぼすかどうかは依然として不明である。さらに、微生物による腸内環境の異常と転流が、ARTを受けているPLWHにおける全身的な生物学的老化の加速に寄与しているかどうかも不明である。本研究の目的は、これら2つの知識のギャップを解決することである。

研究方法
研究コホート
Rush University Medical Centreにおいて、年齢、性別、BMI、民族がほぼ同じである、抑制的ARTを受けている25人のPLWHと23人のHIV非感染者（PLWoH）から、回腸・結腸生検、血液、便サンプルを採取した（表1）。参加者は全員、インフォームド・コンセントを得た。各参加者は、人口統計、病歴、ARTレジメンに関する詳細なアンケートに回答した。研究コホートに関するその他の詳細は表1を参照されたい。菜食主義者、ベジタリアン、グルテンフリー、パレオ、特異的炭水化物食などの特別な食生活を実践している人の検体は、微生物群集に影響を与える可能性があるため、調査対象には含めなかった。また、セリアック病に罹患している人のサンプルは含まなかった。本試験のプロトコルは、Rush大学のInstitutional Review Boardによって承認された（ORA#19020710）。

表1 試験参加者の人口統計学的および臨床的特徴
拡大表
DNAおよびRNAの分離
AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit（Qiagen, catalog #80004 ）を用いて、結腸と回腸の生検（Thermo Fisher社製RNAlater溶液に保存）からDNAとRNAを単離した。簡単に説明すると、生検片をRLT Lysis buffer（Allprep分離キット、Qiagen、カタログ番号80204）中で、Qiagen TissueLyser II上のステンレス鋼ビーズ（5 mm、Qiagen、カタログ番号69989）を用いてホモジナイズした。製造業者のプロトコールに従って、組織溶解物から全RNAとDNAを同時に精製した。RNA抽出の際、オンカラムDNAse消化を行った。DNAとRNAの定量は、Nanodrop (ND-1000)分光光度計を用いて行った。

DNAメチル化の定量とエピジェネティッククロックの計算
サンプルあたり300 ngのDNAを、EZ DNA Methylation kit（Zymo Research社製）を用いて、製造元の説明書に従ってバイサルファイト変換した。これらのバイサルファイト変換DNAサンプルをInfinium HumanMethylationEPIC v1.0 BeadChipのチップウェルにランダムに割り当て、増幅し、アレイにハイブリダイズさせ、染色、洗浄し、Illumina iScan SQ装置で画像化し、生の画像強度を得た。生のMethylation EPICアレイIDAT強度データをロードし、SeSAMe解析スイートRパッケージ[37]を用いてR統計プログラミング言語（http://www.r-project.org）で前処理した。353個のCpG部位に基づくHorvathの多組織予測因子DNAmAge [38]、391個のCpG部位に基づくHorvathの皮膚・血液時計 [39]、513個のCpG部位に基づくLevineのDNAmPhenoAge [40]、71個のCpG部位に基づくHannumの時計 [41]、Luのテロメア長予測因子 [42]、およびDNAメチル化に基づく死亡リスク評価（GrimAge [43]）のエピジェネティック推定値を算出した。主成分ベースのエピジェネティッククロック推定値は、Higgin-Chenらによって提供されたRスクリプトを利用して計算され、各サンプルについて78,464個のCpGがベータマトリックスに含まれた[44]。欠損値にはMean imputationを利用した。老化のDunedinPACEペースは、一般公開されているGithubコード[45]を使用して計算した。

テロメア長定量
末梢血単核球（PBMC）におけるテロメア長の定量は、Life Length Technologies社が開発したハイスループット（HT）Q-FISH（定量的蛍光in situハイブリダイゼーション）法を用いて行った[46]。簡単に言うと、細胞を固定し、3つのテロメアリピートを認識する蛍光ペプチド核酸（PNA）プローブでハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、細胞を十分に洗浄して非特異的結合を除去し、核をDAPIで染色した。核とテロメアの画像は、より信頼性の高いテロメアの画像を得るために、複数のZスタック個別画像から最大投影画像を用いて、ハイコンテントスクリーンシステム（Opera Phenix, Perkin Elmer）で取り込まれる。蛍光強度は、テロメアの長さが既知の対照細胞株を用いて作成した標準回帰曲線を用いて塩基対に変換した。データは独自のソフトウェア（TAT Analyzer）を用いて解析され、すべてのテロメア関連変数（TAV）が生成された。データは、テロメア長の記述統計、テロメア長の各パーセンタイルの値、テロメア長値のパーセンテージ、特定のテロメア値を持つ細胞のパーセンテージ、各サンプルの分散パラメーターを含むTAVプロファイルを生成した。

細胞関連HIV-1 DNAおよびRNAの定量化
全細胞関連HIV DNAおよびRNAを、LTRを増幅する特異的プライマーを用いたqPCR TaqManアッセイを用いて定量した： F522-43（5' GCC TCA ATA AAG CTT GCC TTG A 3'; HXB2522-543）およびR626-43（5' GGG CGC CAC TGC TAG AGA 3'; 626-643）とFAM-BQプローブ（5' CCA GAG TCA CAC AAC AGA CGG GCA CA 3）を組み合わせたLTRを増幅する特異的プライマーを用いて、QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を用いてqPCR TaqManアッセイで定量した。細胞数は、DNAについてはヒトゲノムTERT（テロメラーゼ逆転写酵素）を、RNAについてはRPLP0発現（Life Technologies社）をそれぞれ用いたqPCRによって正規化した。細胞関連HIV DNAコピー数の決定には、UNGを含む2×TaqMan Universal Master Mix II（Life Technologies社製）10μl、各プライマー4pmol、プローブ4pmol、DNA5μlを含む20μlのPCR反応を調製した。以下のサイクリング条件を用いた： 50 °Cで2分間、95 °Cで10分間、続いて95 °Cで15秒間、59 °Cで1分間のサイクルを60回繰り返した。細胞関連HIV RNAコピー数の測定には、2×TaqMan RNA to Ct 1 Step kit（Life Technologies社製）10μl、各プライマー4pmol、プローブ4pmol、逆転写酵素0.5μl、およびRNA5μlを含む20μlのPCR反応を用いた。サイクリング条件は、48℃で20分間、95℃で10分間、その後95℃で15秒間、59℃で1分間のサイクルを60回繰り返した。HIV DNAの絶対量測定には、ACH-2細胞からのDNA抽出により外部定量標準物質を調製し、Virology Quality Assurance (VQA, NIH Division of AIDS)の細胞DNA定量標準物質に校正した。HIV RNA測定では、全長NL4-3ビリオンRNAから外部定量標準を調製し、VQA HIV-1 RNA標準に校正されたAbbott RealTime assay（Abbott Diagnostics, Des Plains, Ill）を用いてコピー数を測定した。最大500 ngの全細胞RNAまたはDNAを各反応ウェルに添加した。HIV RNAまたはDNAのコピー数は、3連で行った7点標準曲線（1～10,000cps）に対する外挿によって決定した。

大腸および回腸におけるタイトジャンクションタンパク質の評価
回腸と結腸の生検片を至適切断温度（OCT）で包埋し、厚さ5μmの切片に切り出した。その後、1:1のアセトン/メタノール溶液で-20℃、2分間固定した。スライドを風乾した後、1X PBSで10分間すすぎ、水分を補給した。その後、スライドを0.2% Triton X-100/PBS溶液で40℃、5分間透過処理し、洗浄後、2%脱脂乾燥乳溶液を用いて室温で1時間ブロッキングした。この後、スライドを2％牛乳で希釈したZO-1（Invitrogen、カタログ番号61-7300）またはオクルディン（Invitrogen、カタログ番号33-1500）に対する一次抗体で37℃で1時間染色し、洗浄した後、二次抗体（Invitrogen Alexa Fluor donkey anti-rabbit 488 #A -21206またはAlexa Fluor donkey anti-mouse 488 #A -21202）で37℃で1時間、1：250の希釈率で染色した。その後、スライドを洗浄し、核をDAPIで3分間染色した後、洗浄し、Fluoromount™ Aqueous Mounting Medium（シグマ、カタログ番号F4680）を用いてマウントした。各マーカーの相対的発現を決定し、代表的な画像を選択するために、各サンプルにつき少なくとも5つの染色組織野の画像を使用した。すべての染色画像は、Zeiss Axio Observer 7デジタルデコンボリューション免疫蛍光顕微鏡（Zeiss, Oberkochen）を用いて、2人の独立した盲検観察者が評価した。すべての画像は40倍の倍率で撮影した。

16S rRNA 遺伝子ライブラリー調製
Qiagen DNeasy PowerSoil Proキットを用いて約200 mgの便または組織からDNAを抽出し、Quant-iT PicoGreen Assay Kitを用いて定量した。ライブラリー作成には、16S rRNA遺伝子のV1-V2領域をターゲットとするバーコード付きPCRプライマーを使用した。PCR 反応は、Q5 High-Fidelity DNA Polymerase（NEB）を用いて二重に行った。糞便のような微生物バイオマスの高いサンプルの場合、各50 µl PCR反応ミックスには、0.5 µMの各プライマー、0.34 U Q5 Pol、1X Buffer、0.2 mM dNTPs、および5 µl DNAが含まれていた。サイクリング条件は以下の通り： 1 サイクル98 °C 1 分、20 サイクル98 °C 10 秒、56 °C 20 秒、72 °C 20 秒、1 サイクル72 °C 8 分。大腸や回腸組織のような微生物バイオマスの少ないサンプルのPCR反応も同様に、10 µlのDNAを用いて行った。サイクリング条件は以下の通りである： 98 °C、1分間の1サイクル；98 °C、10秒間、56 °C、20秒間、72 °C、20分間の25サイクル；72 °C、8分間の1サイクル。二重に増幅したサンプルをプールし、1:1容量のSPRIビーズを用いて精製した。各サンプル中のDNAをPicoGreenを用いて定量し、等モル量でプールした。得られたライブラリーは、2×250 bpケミストリーを用いてイルミナMiSeqでシーケンスした。環境汚染や試薬汚染を経験的に評価できるように、同じ増幅・精製手順を経た抽出ブランクとDNAを含まない水を使用した。遺伝子ブロックで合成され、既知の存在量で組み合わされた8つの人工16S遺伝子断片からなる陽性対照も含まれた。陰性コントロールではコンタミネーションは観察されず、陽性コントロールサンプルでは期待通りのリードカウントが得られた（補足表1）。1サンプルあたり平均81.4kの生リードと51.9kの品質管理（QC）フィルター付きリードを取得した（補足表1）。QCフィルターをかけたリードが不十分（1000未満）であったため、5サンプルを最終解析から除外した。最終解析に使用したサンプルの平均リード数は、サンプルあたり84.6 k raw readsと53.5 k QC-filtered readsで、最小値は5 k raw readsと3.9 k QC-filtered readsであった（補足表1）。

16S rRNA遺伝子のバイオインフォマティクス処理
16S rRNA配列データはQIIME2バージョン2019.7[47]を用いて処理した。リードペアは、DADA2が240ヌクレオチドでフォワードリードとリバースリードの両方を切り捨てたアンプリコン配列バリアントを同定するために処理された[48]。scikit-bioに実装されたnaive Bayes分類器を使用し、デフォルトパラメータ[50]を使用して、SILVA参照データベースバージョン132[49]との比較により分類学的割り当てを生成した。Prevotella 2 などの番号の付いた分類群は、SILVA 分類法における別個の分類群を表す。QIIMEのデータファイルは、統計計算のためのR環境[51]で解析した。サンプルタイプ間の平均差を推定するために線形混合効果モデルを使用した。各サンプルタイプについて、コントロール群とART施行中のPLWH群の平均差を推定するために線形モデルを使用した。相対的存在量は、試験のために対数10変換した。少なくとも1種類の検体で平均相対存在量が1％以上の細菌のみを検定した。マーカーと細菌量の相関は、Spearman相関を用いて決定した。複数の検定を行った場合、p値はBenjamini-Hochberg法[52]を用いて偽発見率で補正した。属分類レベルの16S rRNA微生物相対存在量を用いた推論モデリングアプローチにより、個々の分類群を同定し、総SCFA産生、総酪酸産生、および推定炎症性産生への既知の関与に基づいて、それらをグループ化することができた。総酪酸産生菌は、PubMed [53,54,55,56,57,58,59]の広範な研究文献検索から同定した。この分析で同定されたグラム陽性抗炎症性有益酪酸産生属の多くは、ファーミキューテス門のクロストリジウムクラスターXIVaとIV（それぞれLachnospiraceae科とRuminococcaceae科）に属する。これらの予測微生物相対存在量比の評価が計算され、3つのサンプル部位すべてにおいてPLWHと対照群との間で比較された [60, 61]。

便代謝物の非標的測定
1サンプルあたり約200mgの便を、0.2mM NaN3を含む250μLのLC-MS用水に溶解した。サンプルは、Bullet Blender 24（Next Advance Inc.製）で0.5 mmの酸化ジルコニウムセラミックビーズを用いて30秒間ビーズビーティングを行った。750µLのメタノールを各チューブに加え、16,000 xg、4℃で15分間遠心した。800µLの上清を新しいチューブに移し、Speedvac（Eppendorf, model 5301）で乾燥させた。乾燥したサンプルを200µLの1%メタノール水溶液に再溶解し、16,000 xg、4℃で5分間遠心した。サンプルを1%メタノール水溶液でさらに10倍に希釈し、マイクロバイアルに移し、オートサンプラーにセットした。各サンプル10 µLをプールしてQCサンプルを作製し、メタボローム解析を定期的に行いました。糞便抽出物のメタボローム解析は、社内の代謝物ライブラリーを使用して液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）システムで実施しました。島津製作所製Nexera X2（2台のLC30ADポンプ、SIL30ACオートサンプラー、CTO20ACカラムオーブン、CBM20Aコントローラーで構成；島津製作所、オランダ）を用いて、0.1%ギ酸を含む水（溶離液A）とメタノール（溶離液B）のプログラムグラジエントを供給した。0.4mL/分の流量を用い、0分で0％B、1.5分で0％B、9.9分で97％B、12.9分で97％B、13.0分で0％B、13.8分で0％Bのグラジエントを行った。カラムにはSynergi Hydro-RP（粒子径2.5 µm、100×2 mm）を、ガードカラムにはPhenomenex SecurityGuard Ultra C8（粒子径2.7 µm、5×2.1 mm）カートリッジを使用した。カラムは40˚Cに保たれ、注入量は2 µLであった。MSはSciex TripleTOF 6600（AB Sciex Netherlands B.V.、オランダ）を用い、ポジティブおよびネガティブESIモードで、次の条件で操作した：イオン源ガス1 50psi、イオン源ガス2 50psi、カーテンガス30psi、温度500℃、取り込み範囲m/z 75-650、イオンスプレー電圧5500 V（ESI +）および-4500 V（ESI-）、デクラスタリング電位80 V（ESI +）および-80 V（ESI-）。異なる代謝物を同定するために、情報依存取得（IDA）法が使用され、MS分析には次の条件が用いられた：コリジョンエネルギー±10、取得時間80ms、MS/MS分析には次の条件が用いられた：コリジョンエネルギー±30、コリジョンエネルギースプレッド15、イオン放出遅延30、イオン放出幅15、取得時間40ms。IDAの切り替え基準は、1サイクルあたり最大18個の候補イオンをモニターするために、4 Da以内の同位体を除外することでした。MS-DIAL（v4.90）[62]と社内の代謝物データベースを使用してデータをアライメントし、正確な質量、リテンションタイム、およびほとんどの場合、MS/MSフラグメンテーションパターンが真正の化学標準物質と一致する代謝物を同定しました。QCサンプルのピーク面積のRSDが30%未満で、実験グループ内のサンプルの少なくとも80%でサンプル対ブランク比が5を超える代謝物を、さらなるデータ解析の対象としました。標準化は便サンプル重量を用いて行った。

血漿中炎症マーカーの測定
フラクタルカイン、IFN-α2a、IL-12p70、IL-2、IL-4、IL-5、IP-10、MCP-2、MIP-1α、SDF-1α、エオタキシン、IFN-β、IFN-γ、IL-10、IL-1β、IL-21、IL-6、レプチン、CXCL9、およびTNF-αの血漿レベルを、Meso Scale DiagnosticsのU-PLEXキット（Biomarker Group 1 (hu) Assays； Biarkerグループ1（hu）アッセイ；カタログ番号K151AEM-2、Custom Immuno-Oncology Grp 1（hu）アッセイ；カタログ番号K15067L-2、およびHuman MIG（CXCL9）抗体セット；カタログ番号F210I-3）のU-PLEXキットを用い、製造者の指示に従って測定した。成長分化因子-15（GDF-15）のレベルは、Human GDF-15 DuoSet ELISA Kit（R＆D Systems；カタログ番号DY957）を用いたELISAにより測定した。ミエロペルオキシダーゼ（MPO）およびC3aの血漿レベルは、ELISA（Thermo Fischer；カタログ番号BMS2038INST、および＃BMS2089）によって測定した。

タイトジャンクション透過性および微生物移動の血漿マーカーの測定
可溶性CD14（sCD14）、可溶性CD163（sCD163）、LPS結合蛋白（LBP）、およびFABP-2/I-FABPの血漿中濃度は、DuoSet ELISAキット（R&D Systems社製；カタログ番号DY383-05、#DY1607-05、#DY870-05、および#DFBP20）を用いて定量した。ゾヌリンの血漿中濃度は、MyBiosorce社のELISAキット（カタログ番号MBS167049）を用いて測定した。血漿中のβ-D-グルカンの検出は、Limulus Amebocyte Lysate (LAL) assay (Glucatell Kit, CapeCod; catalog # GT003)を用いて行った。オクルジンのレベルはELISA（Biomatik；カタログ番号EKC34871）により測定し、Reg3AのレベルはELISA（RayBiotech；カタログ番号ELH-REG3A-1）により測定した。

血漿中代謝物の非標的測定
メタボローム解析は、以前に記載された方法[63, 64]に従って実施した。簡単に説明すると、極性代謝物は80%メタノールを用いて抽出した。QC サンプルは全サンプルを等量プールして作成し、サンプルシーケンス中に定期的に注入しました。LC-MS は、Thermo Scientific Q Exactive HF-X 質量分析計と HESI II プローブ、Vanquish Horizon UHPLC システムを使用して実施しました。親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC）は、ZIC-pHILICカラム（2.1 mm×150 mm、EMD Millipore）を用い、45℃で0.2 ml/分で行った。全サンプルを極性切替を伴うフルMSで分析し、QCサンプルもデータ依存MS/MSで正極性と負極性に分離して分析した。生データは、Compound Discover 3.3 SP1（ThermoFisher Scientific）を使用して解析しました。正確な質量または保持時間を使用して、純粋な標準物質から作成した社内データベースを利用するか、MS/MS スペクトル データで mzCloud データベース (www.mzCloud.org) を照会して代謝物を同定しました。スコア 50 以上の一致が選択された。代謝物の定量は、フルMSランの積算ピーク面積を利用した。これらの値は、定期的な QC ランに基づいて補正され、各サンプルで同定された代謝物の総シグナルに対して正規化されました。

統計解析
統計解析は、Mann-Whitney U 検定、Friedman 検定、Kruskal-Wallis 検定、および Spearman の順位相関を用いて行った。多重比較補正にはBenjamini-Hochberg法[52]とBenjamini, Krieger, and Yekutieliの2段階ステップアップ法[65]を用いた。これらの解析は、GraphPad Prism release 9.0（GraphPad Software）を用いて行った。

結果
ARTを受けているPLWHは、腸において生物学的老化の加速を示し、その速度は血液中とは異なる
ウイルス量が50copies/ml未満のART中PLWH25人と、年齢、性別、民族、BMIをマッチさせたPLWH23人から、結腸と回腸の生検、血液、便のサンプルを採取した（表1）。図1Aに示すシステム生物学的アプローチを用いて、ARTが抑制されたHIV感染者との生活が腸の生物学的年齢のシフトと関連しているかどうか、また微生物の転座やディスバイオーシスがARTを受けているPLWHの生物学的老化と関連しているかどうかを明らかにすることを目的とした。

図1
図1
ART施行中のPLWHにおける腸および血液の生物学的老化の促進。A 研究デザインの概略図。B PLWoHとART施行中のPLWHの年齢比較（中央値と四分位範囲（IQR））。統計解析はMann-Whitney U検定を用いて行った。C-E 複数のエピジェネティッククロックに基づく血液（C）、回腸（D）、結腸（E）の生物学的年齢の有意な加速を示すドットプロット： 血液についてはHorvath1、Horvath2、Hannum、PhenoAge、DNAmTL、GrimAge、DunedinPACE、回腸についてはHorvath1、Horvath2、Hannum、DNAmTL、結腸についてはHorvath1、DunedinPACE。グラフの正の値は時計ごとの生物学的老化の加速の差を示し、DNAmTLの負の値はテロメア減少の差を示す。中央値とIQRの両方が描かれており、Mann-Whitney U検定による統計解析が行われている。F Horvath1を用いて、血液、回腸、結腸における組織特異的な生物学的年齢加速差を対比したドットプロット。統計的評価はノンパラメトリック・フリードマン検定を用い、Benjamini, Krieger, and Yekutieliの2段階ステップアップ法で補正した。

フルサイズ画像
特定のCpG部位におけるDNAメチル化パターンは、ヒトや他の哺乳類の多くの細胞タイプ、組織、臓器において、年代や生物学的年齢の測定に用いられてきた [38, 40, 41, 43, 66, 67]。このようなDNAメチル化の異なるパターンは、複数のエピジェネティックな加齢時計の基礎を形成しており、異なる時計は異なるCpG部位のセットを計算に用いている。われわれはまず、6つの確立されたDNAメチル化エピジェネティック老化時計を使用して、ART施行中のPLWHとPLWoHの血液中の生物学的年齢を測定した。具体的には、PBMCからのDNAを用いて、以下の主成分ベースのエピジェネティック・クロックで生物学的年齢を推定した[44]： 353個のCpG部位に基づくHorvathの多組織予測DNAmAge（PCHorvath1）[38]、391個のCpG部位に基づくHorvathの皮膚・血液時計（PCHorvath2）[66]、71個のCpG部位に基づくHannumの時計（PCHannum）[41]、 513個のCpG部位に基づくLevineのDNAmPhenoAge（PCPhenoAge）[40]、DNAメチル化に基づく死亡リスク評価（PCGrimAge）[43]、およびLuのテロメア長予測因子（PCDNAmTL）[67]。これらのうち5つの時計では、値が高いほど生物学的年齢が高いことを示す。しかし、PCDNAmTL時計については、値が低いほど年齢が高いことを示す。

同程度の年代を持つにもかかわらず（図1B）、ARTを受けているPLWHの血液は、PLWoHの血液よりも生物学的年齢が高いことを示した。その差は＋3.1歳（PCGrimAgeを使用）から＋7.62歳（PCHorvath2を使用）までであった（補足図1A）。次に、生物学的年齢の加速度を、時計の出力を年代に対して回帰することによって計算した。指数が大きいほど生物学的老化が速いことを意味するが、PCDNAmTLは例外で、指数が小さいほど老化が加速していることを示す。この解析の結果、ARTを受けているPLWHの生物学的年齢は2.59〜7.05歳早まっていることがわかった（図1C）。また、老化のペースを推定するDunedinPACEエピジェネティッククロック[45]も用いた。この指標の値が高いほど、老化が加速していることになる[45]。これは、PLWHが血液中の生物学的老化を加速させていることを示唆する最近の研究 [31,32,33,34,35,36]を反映している。

次に、回腸と結腸から単離したDNAに同じエピジェネティック老化時計を適用した（補足図1B-C）。ARTを受けているPLWHの回腸では、7つのエピジェネティッククロックのうち4つ（Horvath1、Horvath2、Hannum、PCDNAmTL；図1D）によって、対照群と比べて生物学的老化が促進されていた。同様に、ARTを受けているPLWHの大腸では、2つの時計（Horvath1とDunedinPACE；図1E）で生物学的老化の促進が認められた。回腸と結腸で老化の加速を検出できなかった時計があるのは、これらの時計のほとんどが血液サンプル用に設計されたためかもしれない。Horvath1[38]は組織を用いて開発されたので、血液、回腸、結腸のサンプル間で生物学的年齢加速度を比較した（図1F）。これらのデータは、ARTを受けているPLWHの回腸、結腸、血液はすべて生物学的老化の加速を示していることを強調している。しかし、その加速度は組織によって異なる。

われわれのコホート研究では、PLWoHとART施行中のPLWHの2つのグループ間で、明確な性習慣が見られた。特に、PLWoHの大多数が異性愛者であるのに対し、ART施行中のPLWH群では異性愛者はわずか7人であった（表1）。観察された生物学的老化の加速が、もっぱら性的習慣と関連しているかどうかを調べるために、両群の異性愛者参加者において、特に生物学的老化の加速率を比較する二次解析を行った。その結果、補足図2に詳述するように、ARTを受けている異性愛者のPLWHは、コホート全体に対するサンプルサイズが小さいにもかかわらず、異性愛者のPLWoHと比較して、生物学的老化の加速率が増加する傾向を示した。このことは、この老化促進現象にARTが抑制したHIV感染が寄与している可能性を示唆している。

我々はまた、ARTレジメンの違いが、ARTを受けているPLWHにおける生物学的老化の加速速度にどのような影響を与えるかを評価するための探索的分析も行った。我々のコホートではARTレジメンが多様であったため（表1）、参加者を3つのグループに分類した： a）エムトリシタビンとテノホビルアラフェナミド（2種類のヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬、NRTI）を併用したビクテグラビル（Btg）投与群、b）プロテアーゼ阻害薬とともにNRTIと非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬（NNRTI）の両方を含む多様なARTクラスを併用したドルテグラビル（Dtg）投与群、c）BtgまたはDtg非投与群である。注目すべきは、各グループともPLWoHと比較して、特に結腸と回腸の組織において、年齢が加速する割合が異なっていたことである（補足図3）。傾向として、Dtgを含むARTを受けているPLWHでは、他のグループと比較して生物学的老化の加速率が高い可能性が示された（補足図3）。今回のサンプル数では、特定のARTレジメンと生物学的老化の速度の高低との関連について結論を出すことはできないが、参加者全員がARTレジメンを併用していたことから、これらの知見は、PLWHにおける生物学的老化速度にARTの種類が大きく影響していることを示唆している。このことは、より大規模なコホートにおけるさらなる研究の必要性を示唆している。

生物学的加齢のエピジェネティックな時計による推定値は、他の確立された加齢マーカーおよび新たな加齢マーカーを用いて検証された。
エピジェネティッククロックの結果を支持するために、老化の確立されたバイオマーカーおよび新たなバイオマーカーと比較した。テロメア長（TL）は確立された老化マーカーであることから[68, 69]、HT-Q-FISH法でPBMCのTLを評価した。TLの中央値は、ARTを受けているPLWHと対照群で差がなかったが（補足図4A-C）、ARTを受けているPLWHは、対照群に比べてテロメアが短い細胞の割合が高かった（テロメアが長い細胞の割合は低かった）（補足図4D）。次に、エピジェネティック・クロックで推定される生物学的年齢とTLの測定値との相関を調べた（図2Aおよび補足表2）。これらの相関は、エピジェネティック時計によって推定された生物学的年齢が高いほど、TLが短くなることと強い相関があることを示している。

図2
図2
エピジェネティック・クロックによって評価される生物学的年齢の加速度は、生物学的老化を測定する他の確立された方法および新しい方法と対応している。Horvath1、Horvath2、Hannum、PhenoAge、DNAmTL、GrimAgeを含む様々なエピジェネティック・クロックによって測定された、血液中のテロメア長（行）と、血液、回腸、結腸のDNAメチル化に基づく生物学的老化（列）との相関をSpearmanの順位相関ヒートマップで表示したもの。正の相関は赤で、負の相関は青で示されている。Bドットプロットは、PLWoHと比較したART施行中のPLWHの血漿中の炎症マーカーの上昇を示す。データは中央値と四分位範囲（IQR）で表し、各ドットは個人を示す。比較はMann-Whitney U検定を用いて行った。C 血漿中の炎症性老化マーカー（行）と血液、回腸、結腸中のエピジェネティックな加速年齢（列）との間のスピアマンの順位相関のヒートマップ。正の相関は赤で、負の相関は青で示されている。* p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.001

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加えて、iAge [70]と呼ばれるディープラーニングベースの「炎症性老化時計」を含む、生物学的年齢の新しい測定基準が最近出現した。この指標は、CXCL9やエオタキシンなど、血漿中のいくつかの炎症マーカーの測定から得られたもので、これらは老化の加速を予測できる炎症性老化時計に組み込まれている[70]。複数のサイトカインアレイを用いて、iAgeに含まれるいくつかのマーカー、およびHIV感染に関連する他の炎症指標（IL4、IL-6、MIP-1αなど）[71, 72]の血中濃度を測定した。CXCL9やエオタキシンを含むいくつかのマーカーのレベルは、コントロールと比較してARTを受けているPLWHで上昇していた（図2B）。これらの炎症マーカーのレベルの高さは、特に血液において、生物学的老化の促進（図1C-Fと同様にエピジェネティッククロックから導かれる）と相関していた（図2Cおよび補足表3）。興味深いことに、組織の生物学的加齢と炎症マーカーとの間に最も強い相関が見られたのは、回腸のミエロペルオキシダーゼ（MPO）と生物学的加齢との間であった。MPOは好中球に最も多く発現している。好中球は回腸末端部ではクラスターを形成するが、結腸では見られない [73] 。このことは、好中球レベルの低い大腸とは対照的に、好中球レベルの高い回腸でMPOと老化の間に強い関連があることを説明するかもしれない。HIV持続性の代用指標として、加速加齢（Horvath1に基づく）とPBMC、回腸、大腸の細胞関連HIV DNAレベル、およびPBMCの細胞関連HIV RNAレベルとの相関も調べた。これらのうち、エピジェネティックな年齢加速と最も強く関連していたのは回腸のHIV DNAレベルであった（補足図5）。これらの知見は、エピジェネティック時計で得られた結果を検証するものであり、HIVとともに生きることは、たとえARTを受けたとしても、組織と血液の両方で生物学的老化を加速し、その速度は両者で異なるという結論を支持するものである。

腸管透過性と微生物移行は生物学的老化の加速に関連している。
腸内細菌の移動と腸内細菌叢の異常は、全身の炎症を促進し、その結果、炎症に関連した老化性疾患を促進するという仮説がますます強まっている。ARTを受けているPLWHは、全身的にも組織内でも生物学的老化が加速していることから、われわれは、微生物転流と微生物ディスバイオーシスがこのような老化の加速を引き起こしている可能性を探った。まず、免疫蛍光法と補足図6に記載したスケーリング法を用いて回腸と結腸のタイトジャンクションタンパク質（ZO-1とオクルディン）のレベルを評価することで、ARTを受けているPLWHと対照群における微生物移行の間接的指標である腸の完全性を評価した。図3A-Bのデータから、ZO-1とオクルジンのレベルで評価した腸の完全性は、対照群と比べてARTを受けているPLWHで有意に低かった。この観察は、サンプル数が少ないにもかかわらず、各群内の異性間でも見られた（補足図7A）。このことから、ARTを受けているPLWHでは腸管透過性が高いことが示唆された。一貫して、血漿中の腸管損傷マーカーと微生物転位マーカーは、対照群と比較してART施行中のPLWHで高かった（図3Cおよび補足図7B）。評価された損傷/転位マーカーは、REG3α（腸ストレスマーカー[74]）、I-FABP（腸細胞アポトーシスマーカー[75]）、Zonulin（タイトジャンクション透過性マーカー[76, 77]）、LPS結合蛋白（細菌転位マーカー[78]）、β-グルカン（真菌転位マーカー[79]）、およびsCD163（微生物トリガー骨髄性炎症マーカー）であった。これらのデータを総合すると、PLWHでは腸管の完全性が損なわれており、その結果微生物の移動が亢進していることが示唆される。

図3
図3
腸管透過性と微生物の移動は、生物学的老化の促進率の増加と関連している。A-B PLWoHおよびART施行中のPLWHの回腸（A）および結腸（B）サンプルは、ZO-1またはオクルジンの発現（緑）を示す。核はDAPI（青）で染色した。画像はZeiss Axio Observer 7顕微鏡で40倍の倍率で撮影したもので、スケールバーは20μmである。タイトジャンクションのスコアは中央値とIQRで示した。統計的有意性はMann-Whitney U検定を用いて決定した。C PLWoHと比較したART血漿中PLWHにおける微生物転座マーカーの上昇。統計的有意性はマン・ホイットニーのU検定を用いて決定した。D タイトジャンクションの完全性（上段）および微生物転座（下段）と生物学的老化の促進（左列）および炎症マーカー（右列）とのスピアマンの順位相関のヒートマップ。正の相関は赤で、負の相関は青で色分けされている。* p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.001。E-H 散布図は、様々な組織におけるHIV DNA/RNAレベルとタイトジャンクションスコアとの間のスピアマンの順位相関を示す：（E）結腸におけるHIV DNA vs 結腸におけるオクルジンスコア、（F）PBMCにおけるHIV DNA vs 結腸におけるオクルジンスコア、（G）PBMCにおけるHIV RNA vs 結腸におけるオクルジンスコア、および（H）PBMCにおけるHIV RNA vs 回腸におけるZO-1スコア。

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次に、腸の完全性または微生物の移動の程度と、生物学的老化の2つの指標との関係を調べた。具体的には、腸の完全性（タイトジャンクションタンパク質のレベルに基づく）または微生物の転位（損傷／転位マーカーのレベルに基づく）と、老化の促進（血液と組織のエピジェネティック老化時計のデータを用いて図1C-Fのように計算）または血液ベースの炎症性老化マーカー（図2Bのように測定）との相関を求めた。相関ヒートマップ（図3Dおよび補足表4）によると、腸の完全性は生物学的老化の促進および炎症性老化マーカーのレベルと負の相関（弱いながらも有意な相関）を示し、一方、微生物の転位は生物学的老化の促進および炎症性老化マーカーのレベルと正の相関を示した。さらに、血液中および/または組織中のHIV DNAおよびRNAのレベルの高さ（HIVの持続性の代用として）は、腸の完全性の低下と相関していた（図3E-H）。これらの所見は、ARTを受けているPLWHの血液および腸組織における、腸管透過性の上昇と微生物の移動、老化の促進、炎症の増大、HIVの持続性の増大との関連を強調している。

HIVとの共存は、特に酪酸産生菌の減少など、腸内および糞便中の微生物異常と関連している。
前節で述べたように、ART治療を受けているPLWHは腸内環境が損なわれており、それが全身および組織における生物学的老化を加速させている可能性がある。このような腸内環境の悪化の根底にあるもっともらしいメカニズムのひとつが、微生物による腸内環境の異常である。微生物異常は、トリプトファンの異化に関与するような有毒な代謝産物を産生する細菌の増加に道を開く可能性がある [27, 80, 81]。また、短鎖脂肪酸（SCFA） [82] 、特に酪酸など、有益とされる代謝産物を生成する細菌の減少を引き起こすこともある。SCFAは、腸管バリアの完全性を強化することが知られている微生物叢由来の代謝産物である [83] 。このような背景を念頭に置いて、われわれは、16S rRNA配列決定を用いて、ARTを受けているPLWHと対照群から採取した便、回腸、大腸のサンプル中のマイクロバイオームを調査した。

その結果、様々なモデル（Richness、Shannon、Faith）で測定される健康な微生物叢 [84] の特徴である微生物のα多様性が、ARTを受けているPLWHの大腸では対照群と比べて低いことがわかった（図4A）。この差は主にRichnessで観察されたが、この指標は多様性の推定に本質的に偏りがあることに注意すべきである。糞便と回腸では、群間で有意でない小さな差が観察された（補足図8A-B）。また、2群間およびサンプルタイプ間のβ多様性にも違いが観察された（補足表5および補足図9）。次に、SCFA、特に酪酸を産生することが知られている細菌の相対的存在量と、炎症性細菌（"pathobionts"、補足表6）の相対的存在量を評価した。酪酸産生菌の相対量は、ARTを受けているPLWHでは対照群よりも少なかった（図4B）。また、ARTを受けているPLWHは、より炎症性糞便微生物叢が多く、SCFA産生糞便細菌が少ない傾向があったが、その傾向は統計学的に有意ではなかった（補足図8C-D）。

図4
図4
HIVとの共存は、酪酸産生菌の減少を特徴とする腸内・糞便微生物異常症と関連している。A アルファ多様性指標（Richness、Shannon、Faithの系統的多様性）は、ARTを受けているPLWHと対照群との比較において、大腸マイクロバイオームの多様性が減少していることを明らかにした。B 両群の糞便、回腸、大腸における酪酸産生微生物叢の相対的存在量を図示。中央値とIQRが描かれており、有意性はMann-Whitney U検定から導かれた。C組織サンプルと糞便サンプル間の細菌量の差を対数スケールで示す。比較対象は結腸対糞便（赤）、回腸対糞便（青）、回腸対結腸（緑）。有意性マーカー： FDR＜0.05（閉じた円）およびFDR＞0.05（開いた円）。Benjamini-Hochberg法を用いた多重検定による調整。D結腸（三角形）、回腸（四角形）、および糞便（円）における、PLWoHとART施行中のPLWHとの細菌量の対数スケール差。解析には平均相対存在量が1％を超える細菌分類群を組み入れた。線形モデルは存在量の変化を推定し、多重検定の調整にはBenjamini-Hochberg法を用いた。有意性マーカー： FDR＜0.05（紫）、FDR＜0.1（シアン）、P＜0.05（緑）。

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糞便、結腸、回腸の特定の細菌属を調べたところ、これらの場所のマイクロバイオームは有意に変化していた（図4C；FDR＜0.05）。ARTを受けているPLWHとPLWoHを比較すると（図4D）、ARTを受けているHIV感染者は、糞便、結腸、回腸において、いくつかの細菌属が濃縮され、他の細菌属が枯渇することと関連していることがわかった。濃縮された細菌属には、カテニバクテリウム（Catenibacterium）、プレボテラ2（Prevotella 2）、アロプレボテラ（Alloprevotella）、プレボテラ9（Prevotella 9）、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）など、炎症性細菌 [23] が含まれる。減少した属には、抗炎症性細菌 [85, 86]、およびSCFA産生能力で知られる細菌（Erysipelotrichaceae UCG - 003、Alistipes、Coprococcus 3、Peptostreptococcaceae、Romboutsia、Subdoligranulum、Bacteroidales、[Ruminococcus] gauvreauii group、Faecalibacteriumなど）が含まれた。

生物学的老化の加速率に関する解析と同様に、観察された微生物異常症が性行為にのみ関連しているかどうかを調べるために、2群内の異性愛者の参加者に焦点を当てた追加解析も行った。その結果、図10に示すように、ARTを受けている異性愛者のPLWHでは、以下のことが明らかになった： 1）糞便または組織中のα多様性のいくつかの指標が減少する傾向（補足図10A-C）、2）糞便中の酪酸産生菌のレベルが減少する（ただし、結腸と回腸の組織では減少しない）（補足図10D）、3）いくつかの細菌属のレベルが異性愛者のPLWoH対照と比較して異なる。しかし、コホート全体に対するサンプルサイズが小さかったためと思われるが、多重検定補正後（FDR < 0.05）では、そのほとんどは有意ではなかった（補足図10E）。このことは、以前の研究 [27, 82] から得られた知見を補強するものであり、HIVに関連した微生物の不均衡を示唆している。この微生物の不均衡は、以前に観察された腸の完全性の低下、ひいてはARTを受けているPLWHにおける生物学的老化の加速に寄与している可能性がある。

独特の粘膜微生物シグネチャーが生物学的老化の加速と関連している。
PLWHで観察された腸内細菌叢の異常（図4D）を踏まえて、次に、この腸内細菌叢の異常がPLWHで観察された生物学的老化の加速と関連しているかどうかを検討した。図5Aおよび補足表7で解析した結果、ARTを受けているPLWHの結腸組織で濃縮された特定の細菌属（カテニバクテリウム、プレボテラ2、アロプレボテラ、プレボテラ9など）は、老化の加速と強く相関していた（FDR＜10％）。対照的に、ARTを受けているPLWHの大腸組織で減少していた他の属（Erysipelotrichaceae UCG-003、Alistipes、Coprococcus 3、Romboutsia、Subdoligranulumなど）は、老化の加速が遅いことと相関していた。注目すべきことに、濃縮された細菌と生物学的老化の促進との相関は、ARTを受けているPLWHからのサンプルによってもたらされたのに対し、減少した細菌と生物学的老化の促進が遅いとの相関は、PLWoHからのサンプルによってもたらされた（図5B）。回腸サンプル（図5Cおよび補足表7）および糞便サンプル（図5Dおよび補足表7）を用いた同様の解析では、FDR＜10％の相関は得られなかったが、いくつかの公称P値は有意であった。

図5
図5
生物学的老化の加速に関連する粘膜の微生物シグネチャー。スピアマンの順位相関分析により、ART施行中のPLWHにおける大腸マイクロバイオームの濃縮（上段）または枯渇（下段）と、大腸および血液における生物学的老化の促進（列）との関連を示す。赤と青はP < 0.05の相関を示す。白はP > 0.05を示す。FDR＜10％。Bプロットは、大腸の特定の細菌分類群とエピジェネティック老化の促進との相関を示す： Catenibacterium vs. DunedinPACE（結腸）［左］；Prevotella 9 vs. DunedinPACE（結腸）［中］；Erysipelotrichaceae UCG-003 vs. GrimAge（血液）［右］。C-Dスピアマンの順位相関ヒートマップは、回腸微生物叢（C）および糞便微生物叢（D）と、異なる部位における老化促進との関連を示している。赤はP < 0.05の正の相関、青はP > 0.05の負の相関を示す。E Spearmanの順位相関ヒートマップは、結腸（上）、回腸（中）、および糞便（下）のマイクロバイオームと、タイトジャンクションの完全性、微生物の移動、および炎症マーカーとの相関を示す。Fスピアマンの順位相関ヒートマップは、回腸または大腸の炎症性、酪酸、SCFA産生微生物叢とHIV DNA/RNAレベルとの関連を描いている。赤は正の相関、青は負の相関を示す。 p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.001。G Spearmanの順位相関は、回腸とPBMCにおける炎症性マイクロバイオーム（回腸）とHIV DNA/RNAの相対的存在量との間に示される（上）。下段は、回腸およびPBMCにおけるSCFA産生マイクロバイオーム（回腸）とHIV DNA/RNAの相関を示す。

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生物学的老化速度の加速との関連以外にも、ARTを受けているPLWHで濃縮された分類群は、組織におけるタイトジャンクションタンパク質レベルの低下、微生物転座の上昇、炎症の亢進と関連していた（図5E、各セクションの上段、および補足表8）。対照的に、ARTを受けているPLWHで減少している分類群は、腸内環境の改善、微生物の移動の減少、炎症の減少と関連していた（図5E、各セクションの下段、および補足表8）。別個の解析により、炎症性マイクロバイオームは血液と組織の両方でHIV DNAとRNAの高レベルと関連していることが明らかになった。対照的に、SCFA産生細菌、特に酪酸を産生する細菌は、HIVのDNAとRNAのレベルを低下させた（図5F-G）。これらの知見は、特定の細菌属、特に大腸の細菌属が、生物学的老化のペースに影響を及ぼす可能性を示唆している。さらに、これらの知見は、微生物プロファイル、炎症、HIVの持続性、およびARTを受けているPLWHにおける生物学的老化の軌跡の間の複雑な関係に光を当てた。

相関ネットワークは、粘膜微生物叢、微生物関連代謝産物、および生物学的老化の促進との関連を明らかにした。
SCFAが生物学的老化の遅延に関連するという観察結果（図5）を基に、我々は他の微生物関連代謝産物へと調査を拡大した。微生物叢の多くの作用はSCFA以外の代謝産物によって媒介されることを認識し、ARTを受けているPLWHとコントロールの両方の便および血漿サンプルについて非標的メタボローム解析を行った。その目的は、微生物シグネチャー（図5）と観察された生物学的老化の加速パターンを結びつける可能性のある、さらなる代謝産物を同定することであった。

まず、微生物および腸内細菌に特異的な代謝物を評価した（補足表9）。ARTを受けているPLWHでは、トリプトファン異化の副産物であるL-キヌレニンやキノリン酸など、有害であることが知られている代謝物のレベルが高かった [80, 87]。我々は、トリプトファン異化の2つの一般的な指標であるキヌレニン／トリプトファン比（K/T）およびキノリン酸／トリプトファン比（Q/T）を評価することにより、このことを確認した［88］。両比率とも、ARTを受けているPLWHでは、対照群よりも確かに高かった（図6A）。さらに、ARTを受けているPLWHでは、ヒプロン酸 [89] 、L-エルゴチオネイン [90] 、オレイン酸 [91] など、微生物の多様性と腸の健康に関連する代謝物のレベルが低かった（図6A）。この代謝のアンバランスは、異性愛者の参加者に焦点を当てた分析でも観察され、性行為のみに依存するものではないことが示唆された（補足図11）。ARTを受けているPLWHで濃縮された代謝産物は、生物学的老化の促進、腸の完全性の低下、微生物移行の亢進、炎症の亢進と関連していた（図6B補足表10）。逆に、ART施行中のPLWHで豊富でなかった代謝物は、生物学的老化が遅く、腸の完全性が高く、微生物の移動が少なく、炎症が少ないことと相関していた（図6Bおよび補足表10）。

図6
図6
相関ネットワークにより、粘膜マイクロバイオーム、マイクロバイオーム関連代謝産物、および生物学的老化の加速の間に特異的な関連があることが明らかになった。Aヒートマップは、ARTを受けているPLWHとPLWoHの便および血漿の両サンプルにおける、腸の健康に関連する代謝産物の相対的な存在量を示している。青から赤への色のグラデーションは、正規化された代謝物の値を示し、赤は存在量が多く、青は存在量が少ないことを示す。グループ間の差は、Mann-Whitney U 検定を用いて評価した。B Spearmanの順位相関ヒートマップは、腸特異的代謝産物（行）と生物学的老化の促進、タイトジャンクションの完全性、微生物の移動、および炎症マーカーの指標（列）との関係を示している。上段は、ARTを受けているPLWHで発現が増加している代謝物を強調し、下段はこのグループで発現が減少している代謝物を示している。正の相関は赤で、負の相関は青で表している。キー： * p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.001。Cサルコスプロットは、組織特異的マイクロバイオーム（黄色）、血漿および便サンプル由来の代謝産物（緑色）、組織と血液の両方に特異的な生物学的老化加速指標（青色）の間のスピアマンの順位相関を可視化したものである。赤線は有意な正の相関を示し、青線は負の相関を示す。三者相関を示す相関関係のみが含まれている。強調された線は、機能的関連性の可能性を示唆している。5-HIAAは5-ヒドロキシインドール-3-酢酸、K/T比はキヌレニン/トリプトファン比、Q/T比はキノリン酸/トリプトファン比を表す。

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このような複雑な相互作用を可視化するために、ネットワーク解析を行ったところ、ARTを受けているPLWHで濃縮された微生物属、トリプトファン異化代謝産物の上昇、ヒプリン酸やオレイン酸のような有益な腸内代謝産物の減少、生物学的老化の促進という3つの相互作用が明確に示された（図6C）。逆に、ネットワーク分析では、ARTを受けているPLWHで枯渇している微生物属、トリプトファン異化代謝産物の減少、豊富な保護的腸内代謝産物、および生物学的老化の緩慢の間の明確な関連も同定された（図6C）。これらの複雑な関係は大腸で最も顕著であり、次いで回腸、そして糞便の順であった。これは、生物学的老化を加速させる組織特異的な微生物の痕跡を強調するもので、糞便のマイクロバイオームには見られなかった。

考察
これまでの研究から、ART下であっても、HIV感染は血液中の生物学的老化を促進することが示されている［32, 35, 92］。しかし、HIVの持続と発症の主要な部位である腸における生物学的老化に対するHIVの影響や、加齢と腸管透過性の亢進、微生物の移動、ウイルスの持続との関連はわかっていない。本研究では、システム生物学的アプローチを用いて、ARTを受けているPLWHとPLWoHの大腸、回腸、血液サンプルを調べた。その結果、HIVとの共存は、回腸と結腸において、血液とは異なる速度で生物学的老化が加速あるいは強調されることと関連していることが明らかになった。重要なことは、腸および全身の生物学的老化に関連する特定の細菌分類群および関連する微生物代謝シグネチャーを同定したことである。これらの知見は、これらの関連性の根底にあるメカニズムや、PLWHにおける老化に関連した合併症を予防または遅延させるための潜在的戦略に関するさらなる研究への道を開くものである。

我々は、生物学的老化に関連する特定の微生物シグネチャーを粘膜組織で同定したが、糞便では同定できなかった。腸の完全性の低下と微生物移行の主な要因は、腸内細菌叢の不均衡である微生物ディスバイオシスである。健康な腸内細菌叢は、有益な常在菌と病原性細菌の間で微妙なバランスを保っている。しかし、HIVとの共存はこの均衡を崩し、腸内の病原菌や日和見病原体の増殖を助長する。多くの研究が糞便中のマイクロバイオームに焦点を当てているが、粘膜生検サンプル中の細菌（粘膜関連マイクロバイオームと呼ばれる）は、糞便中の細菌とは大きく異なる可能性がある [23, 93]。さらに、粘膜マイクロバイオームにおけるHIVに関連したシフトは、同じ個体から採取された糞便サンプルに反映されるとは限らない［23］。我々の発見は、粘膜関連マイクロバイオームと糞便関連マイクロバイオームの間に顕著な違いがあることを浮き彫りにし、前者のみが生物学的老化の加速と密接に関連している。このことは、異なる解剖学的部位にわたってマイクロバイオームを調べることの重要性を強調している。マイクロバイオーム間の差異と、それらが生物学的老化のような多様な生物学的状態と関連していることを認識することは、特化した戦略を導き出すことにつながる。そのような戦略は、微生物によるディスバイオーシスに対抗し、腸の完全性を強化し、腸と全身の炎症を予防することで、加速する生物学的老化のプロセスを遅らせることができる。

カテニバクテリウム（Catenibacterium）属、プレボテリウム（Prevotellaceae）属、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）属などの特定の細菌は、ARTを受けているPLWHに多く、生物学的老化の加速と強く関連していた。これらの細菌属はトリプトファンを異化し [27] 、トリプトファン異化の代謝副生成物レベルの上昇と相関していた。トリプトファンの異化が進むと、キヌレニンやキノリン酸などの有毒な代謝副産物が蓄積する。これらの副産物は、慢性HIV感染における有害な転帰と関連している [27, 80, 81, 87, 88]。例えば、神経毒でありN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体の活性化因子として知られるキノリン酸は、HIV感染における神経学的合併症と関連している [94, 95]。同様に、キヌレニン濃度の上昇は、高齢者集団における神経障害と関連している [96, 97]。我々の研究では、トリプトファンの異化を誘導できる細菌分類群、これらの有毒な代謝副産物の生成、および全身レベルおよび腸内レベルの両方における生物学的老化の促進との間に強い相関関係が一貫して同定された。しかし、トリプトファンの異化を開始する特定の細菌種を特定し、生物学的老化との関連が因果関係にあるかどうかを理解するためには、さらなる研究が必要である。このような因果関係を明らかにすることで、生物学的老化の急速な進行に対抗する治療戦略を立てることができる。例えば、EpacadostatやLinrodostatのようなIDO-1（インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1、トリプトファン異化に関与する律速酵素）の阻害剤は、トリプトファンの枯渇を阻止するために、がん臨床試験（しばしば免疫チェックポイント阻害剤と併用）で試験されており、有望な介入経路を提供するかもしれない［27］。

逆に、Erysipelotrichaceae UCG-003、Coprococcus、Faecalibacterium、およびSubdoligranulumを含む特定の細菌分類群は、PLWHで有意に低く、生物学的老化の遅い速度と関連していた。これらの細菌種の中には、Erysipelotrichaceae UCG-003のように、以前に健康的な老化と関連づけられたものもあるが [98]、PLWHにおける健康的な老化を促進する潜在的な役割は、我々の研究以前には確立されていなかった。これらの細菌の多くは、腸の健康維持に不可欠なSCFAを産生する能力で知られている。SCFAの中でも酪酸は腸管上皮細胞の主要なエネルギー源であり、腸内のT細胞応答を調節する上で極めて重要な役割を果たしている [99]。HDAC阻害剤（HDACi）として認識されているこの代謝産物は、強い抗炎症作用を持ち、腸管バリアの完全性を維持するのに役立っている [83]。同様に、われわれの研究では、ARTを受けているPLWHの糞便サンプルにおいて、回腸と結腸の両方でコプロコッカス（Coprococcus）、サブドリグラヌラム（Subdoligranulum）などの酪酸産生細菌属が、結腸ではフェーカリバクテリウム（Faecalibacterium）が、そしてコントロールと比較して[Ruminococcus] gauvreauiiグループが顕著に減少していることが明らかになった。さらに、これらの細菌は、タイトジャンクションの完全性の維持と正の相関を示し、炎症マーカー、微生物転位、生物学的老化の促進とは負の相関を示した。これらの知見は、腸管バリアの完全性を維持し、腸の健全な老化を促進する上でSCFA産生が果たす役割の可能性を強調するものである。このような洞察は、SCFAを促進するプレバイオティクスの採用など、SCFAレベルを高める戦略を研究する基盤を提供し、腸内環境の老化プロセスを遅らせる可能性がある。

SCFAに加えて、我々は、抗炎症作用が確立されている他の微生物関連代謝物と、腸および全身の老化速度の低下との間に強い関連性を見出した。中でも注目すべきは、ヒプリン酸、L-エルゴチオネイン、オレイン酸である。ヒプリン酸は、大腸の微生物活動によって産生され、腸内環境が良好で微生物の多様性が高まっていることを示す指標としてよく用いられている [89]。同様に、L-エルゴチオネインは健康な腸内細菌叢の指標として機能し、試験管内や動物モデルで観察されたように、腸内の酸化ストレスに対抗するのに役立つ抗酸化特性を示している [100, 101]。オレイン酸には抗炎症作用があり、HIVに感染している高齢者に摂取させると、αの多様性を高めることが判明している [91] 。これらの知見を総合すると、HIVに罹患すると腸内細菌叢に変化が生じ、修正可能な主要な微生物叢関連代謝経路に混乱が生じる可能性がある。このような混乱は、腸の完全性を弱め、微生物の移動を増加させ、炎症を進行させる一因となる可能性がある。これらの因子は、局所的および全身的な生物学的老化の過程に大きく寄与する可能性がある。

性的指向や習慣を含む様々な交絡因子は、腸内細菌叢の構成に影響を与える可能性がある。例えば、カテニバクテリウム（Catenibacterium）とプレボテラ（Prevotella）は、HIV感染の有無にかかわらず、男性と性交渉を持つ男性（MSM）に多くみられる [24] 。しかし、微生物異常は性的指向や習慣に関係なくPLWHにもみられる [30] 。われわれの研究では、PLWHのかなりの部分がMSMであった。したがって、性的習慣が腸内細菌叢に及ぼす潜在的影響を無視することはできない。とはいえ、本研究では、PLWoHとART施行中のPLWHの両方において、異性愛者の参加者に焦点を当てたいくつかの解析が行われた。これらの解析では、生物学的老化の促進率、腸管透過性、微生物転位、マイクロバイオーム組成、代謝産物について、両群間で差が認められた。このことは、性行為がこれらの違いの唯一の要因ではないことを示唆している。私たちが観察した差異と相関は、ARTを受けたHIV感染者との生活、性行為、HIVに関連する人口統計学的および非出生統計学的要因など、さまざまな要因の組み合わせによって引き起こされている可能性がある。今後の研究では、HIV、特定のARTレジメン、性／性別、性行為、その他の潜在的交絡変数が、腸内マイクロバイオームと腸内および全身の生物学的老化との関係に及ぼす明確な影響を注意深く調べる必要がある。このような複雑な相互作用を包括的に理解するためには、大規模で多様な参加者コホートや対照動物実験が必要である。とはいえ、本研究は、腸の完全性、微生物の転流、微生物のディスバイオシス、および生物学的老化の間の新規の関連性を明らかにしたものであり、これは、老化に伴う疾患の高い発生率に関連するさまざまな状態や要因に応用できる可能性がある。

本研究には以下のような限界がある： 1）ヒトを対象とした本研究では、炎症性微生物分類群の濃縮、抗炎症性微生物分類群の枯渇、および生物学的老化の促進との間の機序的関連性を明確に示すことはできないが、これらの細菌分類群に関する既存の文献は、我々の知見や仮説と一致し、支持している。とはいえ、詳細なメカニズム解明には、腸管オルガノイドや動物モデルを用いたさらなる研究が必要である。2）ヒトの腸内細菌叢は細菌だけで構成されているわけではなく、真菌類、古細菌、原生生物、ウイルスを含んでおり、それぞれが腸と全身の健康に不可欠である。最近の研究では、ブラストシスチス（Blastocystis）のような原生生物がトリプトファンの代謝に関与し、免疫活性化とCD4+ T細胞応答に影響を与えていることが強調されている [102]。また、β-グルカン（真菌移行のマーカー）は、ARTを受けているPLWHの全身性炎症と関連しており、PLWHは、消化器疾患に関連する真核ウイルスが濃縮された腸内ビロームの変化を持っている [103] 。このように、多様な微生物叢が加齢に与える影響については、さらに詳しく調査する必要がある。3) 我々は、腸と血液の両方において、細菌分類群、微生物代謝産物、老化促進、細胞関連HIV DNAレベルとの関連を突き止めた。これらの知見は、腸内細菌叢、その代謝活動、老化、HIVの持続性の間に複雑な相互作用があることを示唆している。しかし、ARTを受けているPLWHの細胞関連HIV DNAの大部分は欠損していることに注意することが重要である [104, 105]。今後の研究では、加齢を促進するマイクロバイオーム、腸内の無傷のHIVリザーバー、およびHIVの持続と加齢の促進との関連性を調査する必要がある。これにより、HIV持続性の増加が免疫機能障害を悪化させるフィードバックループが明らかになるかもしれず、さらなる研究が必要である。

結論
効果的なARTは過去10年間にHIV治療法に革命をもたらし、PLWHの寿命を著しく延ばした。しかし、この長寿は、心血管疾患や腎疾患、神経認知障害、消化器疾患など、加齢に関連したAIDS以外の合併症の多発を伴っている。本研究は、特定の腸内微生物のシグネチャーとその代謝活性、そして生物学的老化の促進との間に、これまで認識されていなかった関連性を明らかにした。これらの知見は、微生物叢と代謝産物を標的とした新規介入への道を開くものであり、腸管バリアの強化、老化の抑制、PLWHや腸管バリアの障害に起因する慢性炎症を有する他の集団における炎症関連疾患の軽減を目指すものである。

データと資料の入手
生のマイクロバイオームデータはSequence Read Archive (SRA) dataset ProjectID PRJNA1030421 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1030421)で入手可能。生のエピジェネティックDNAメチル化データはGene Expression Omnibus (GEO)で入手可能： GSE245924 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE245924)。

略語
PLWH：
HIVとともに生きる人々

ART：
抗レトロウイルス療法

SCFA：
短鎖脂肪酸

BMI
肥満度指数

PNA：
ペプチド核酸

OCT
最適切断温度

QC
品質管理

LC-MS
液体クロマトグラフ質量分析計

HILIC：
親水性相互作用液体クロマトグラフィー

IDA：
情報依存の取得

PBMC：
末梢血単核球

TL
テロメア長

HT-Q-FISH：
ハイスループット定量蛍光in situハイブリダイゼーション

iAGE：
炎症性老化

LBP
LPS結合タンパク質

Q/T：
キノリン酸/トリプトファン

K/T
キヌレニン/トリプトファン

IQR：
四分位範囲

5-HIAA
5-ヒドロキシインドール-3-酢酸

NMDA
N-メチル-D-アスパラギン酸

IDO-1：
インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1

HDACi
HDAC阻害剤

MSM
男性とセックスする男性

TERT
テロメラーゼ逆転写酵素

TAVs
テロメア関連変数

MPO
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参考文献のダウンロード

謝辞
何よりもまず、本研究のボランティア参加者に感謝したい。Life Length Technologies社（スペイン）によるテロメア長定量サービスに感謝する。また、コメントを寄せてくれたRachel E. Locke, Ph.D.に感謝する。

資金提供
本研究は、M.A-M、A.L、A.KにはNIH R01 DK123733から、A.KとM.A-MにはNIH R01AA029859から助成を受けた。また、A.K.にはR24AA026801から、M.A-M.にはR01AG062383、R01AG062383-04S1、R01NS117458、R01AI165079、R21AI170166から追加支援を受けた。M.A-Mは、Penn Center for AIDS Research（P30 AI 045008）およびNIHの資金提供によるBEAT-HIV Martin Delaney Collaboratory to cure HIV-1感染症（1UM1Al126620）からも資金提供を受けている。I.P.はR01HL123096の支援を受けている。Wistar Proteomics and Metabolomics Shared Resourceは、NIH Cancer Center Support Grant CA010815から一部支援を受けている。Thermo Q-Exactive HF-X質量分析計はNIH grant S10 OD023586により購入された。本研究の一部は、Larry Field夫妻、Glass夫妻、Marcia夫妻、Silas Keehn夫妻、Sklar Family、Johnson Family、Harlan Berk氏からA.K.への篤志的資金援助によっても支えられている。

著者情報
著者メモ
Ali KeshavarzianとMohamed Abdel-Mohsenは共著者である。

著者および所属
ワクチン・免疫療法センター、ウィスター研究所、3601 Spruce Street, Philadelphia, PA, 19104, USA

シャリーニ・シン、レイラ・B・ジロン、アーロン・R・ゴールドマン、ジョアン・L・C・アゼベド、トシタ・カナン、モハメド・アブデル・モーセン

米国イリノイ州シカゴ、ラッシュ大学、ラッシュ統合マイクロバイオーム・クロノバイオロジー研究センター

Maliha W. Shaikh、Shivanjali Shankaran、Phillip A. Engen、Zlata R. Bogin、Simona A. Bambi、Alan L. Landay、Ali Keshavarzian

米国イリノイ州シカゴ、ラッシュ大学医学部

シヴァンジャリ・シャンカラン、アラン・L・ランデイ、アリ・ケシャヴァルジアン

スペイン、マドリッド、ライフレングス

ロレーナ・オルガス、ヌリア・デ・ペドロ、パトリシア・ゴンサレス

プロテオミクスおよびメタボロミクスセンター、ライデン大学メディカルセンター、ライデン、オランダ

マーティン・ジエラ、アスウィン・バーホーベン、エレナ・サンチェス＝ロペス

米国ペンシルベニア州ピッツバーグ、ピッツバーグ大学

イボナ・パンドレア

米国ペンシルベニア州フィラデルフィア、フィラデルフィア小児病院、消化器・肝臓・栄養部門

セイラン・E・タネス・アンド・カイル・ビッティンガー

米国ニューヨーク州ニューヨーク、ワイル・コーネル医学研究所

マイケル・J・コーリー

貢献
M.A-MとA.Kは本研究を発案・計画した。Sh.Sh、S.A.B、A.Kは研究参加者の選定と臨床データの解釈を行った。Sh.S、L.B.G、M.W.S、P.A.E、Z.R.B、J.L.L.C.Aが実験の大部分を実施した。A.R.G、A.V、M.G、E.S-Lは血液と便からメタボロームを解析した。L.O、N.deP、P.Gはテロメアの長さを測定した。M.J.Cはエピジェネティッククロックを測定した。C.E.T.とK.B.はマイクロバイオームデータを解析した。I.V.P.、A.L.、T.K.はデータの解析とリソースの提供を行った。原稿はS.S.とM.A-M.が第1稿を執筆し、著者全員で編集した。

責任著者
Mohamed Abdel-Mohsenまで。

倫理宣言
倫理承認と参加同意
本研究プロトコルは、The Wistar Institute and Rush UniversityのInstitutional Review Boardにより承認された（IRBプロトコル19020710-IRB02）。すべての人体実験は、米国保健社会福祉省および著者らの所属機関が定めたガイドラインに従って行われた。

出版に関する同意
該当なし。

競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。

追加情報
出版社ノート
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っている。

補足情報
追加ファイル1：
補足図1. 腸組織と血液における生物学的年齢の評価。

補足
ファイル2：補足図2。異性愛者のPLWoHとART施行中のPLWHの血液と組織における生物学的老化の加速率。

追加ファイル3：
補足図3. 異なるARTレジメンのPLWHにおける生物学的老化の加速率。

追加ファイル4：
補足図4. PBMCにおけるテロメア長の評価。

補足ファイル5：
補足図5. HIV DNA量と生物学的年齢の相関分析。

追加ファイル6：
補足図6. タイトジャンクションの完全性スコアの可視化。

補足ファイル7：
補足図7. ART施行中の異性愛者PLWHでは、異性愛者PLWoHと比較して腸管透過性と微生物転座が高い。

追加ファイル8：
補足図8. マイクロバイオームαの多様性と相対的存在量。

補足ファイル9：
補足図9. マイクロバイオームβ多様性。

補足ファイル10：
補足図10. ART施行中の異性愛者PLWHにおけるマイクロバイオーム異常症。

追加ファイル11：
補足図11. 異性愛者PLWoHとART施行中の異性愛者PLWHの血漿および便の代謝産物レベルの差。

追加ファイル12
補足表1。マイクロバイオームデータのリードカウント。

追加ファイル13：
補足表2。テロメアの長さ（血液）とDNAメチル化に基づく生物学的老化の間のスピアマンの順位相関（図2Aに関連）。

追加ファイル14：
補足表3. 生物学的老化の加速と炎症マーカー（血漿）との間のスピアマンの順位相関-図2Cに関連。

追加ファイル15：
補足表4. 生物学的老化の促進、タイトジャンクションタンパク質、微生物移行マーカー、炎症マーカー間のスピアマンの順位相関（図3D関連）。

補足ファイル16：
補足表5. PLWoHとART施行中のPLWHの間のβ多様性。

追加ファイル17：
補足表6。a）SCFA産生菌、b）酪酸産生菌、c）炎症促進菌のリスト。

追加ファイル18：
補足表7。マイクロバイオームと生物学的老化促進との間のスピアマンの順位相関（図5A、C、Dに関連）。

追加ファイル19：
補足表8. 生物学的老化の促進、タイトジャンクションタンパク質、微生物転座マーカー、炎症マーカー間のスピアマンの順位相関（図5E関連）。

補足ファイル20：
補足表9. 腸関連代謝産物のリスト。

追加ファイル21：
補足表10。代謝産物と生物学的老化の促進、タイトジャンクションタンパク質、微生物移行のマーカー、炎症マーカーとのスピアマンの順位相関（図6Bに関連）。

権利と許可
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Singh,S.、Giron,L.B.、Shaikh,M.W.他、全身および腸の生物学的老化の加速に関連する腸内微生物の特徴的なシグネチャー。Microbiome 12, 31 (2024). https://doi.org/10.1186/s40168-024-01758-4

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受領
2023年10月25日

受理
2024年01月05日

掲載
2024年2月22日

DOI
https://doi.org/10.1186/s40168-024-01758-4

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マイクロバイオーム
ISSN: 2049-2618

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