SARS-CoV-2による胸腺感染では、疾患の重症度と相関する機能低下が引き起こされる

アレルギーと臨床免疫学ジャーナル
151巻4号、2023年4月、911-921ページ
COVID-19
SARS-CoV-2による胸腺感染では、疾患の重症度と相関する機能低下が引き起こされる

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091674923001471

Author links open overlay panelMarco Rosichini MSc a b ∗, Veronica Bordoni PhD a c ∗, Domenico Alessandro Silvestris PhD a, Davide Mariotti MSc c, Giulia Matusali PhD d, Antonella Cardinale MSc a, Giovanna Zambruno MD e, Angelo Giuseppe Condorelli PhD e, Sara Flamini PhD a、 Shirley Genah PhD a, Marialuigia Catanoso MD a f, Franca Del Nonno MD g, Matteo Trezzi MD h, Lorenzo Galletti MD h, Cristiano De Stefanis MSc i, Nicolò Cicolani BSc j, Stefania Petrini PhD j, Concetta Quintarelli PhD a k, Chiara Agrati PhD a c∗, Franco Locatelli MD a l∗... Enrico Velardi PhD a ∗（エンリコ・ヴェラルディ博士）。
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引用元
https://doi.org/10.1016/j.jaci.2023.01.022Get 権利と内容
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オープンアクセス
背景
リンパ球減少、特にT細胞コンパートメントに限定されたリンパ球減少は、コロナウイルス疾患2019（COVID-19）患者の主な臨床的特徴の1つとして記載されており、疾患の重症度を示す指標として提案されています。COVID-19に関連したリンパ球減少を促進するメカニズムとして、細胞アポトーシスや組織ホーミングなどいくつかのメカニズムが報告されていますが、T細胞数と機能の低下の根本的な原因はまだ完全に解明されていません。
目的
ウイルス感染症は胸腺微小環境を直接標的とし、T細胞の生成過程を損なう可能性があることから、我々は重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の胸腺機能への影響を調査することを目的とした。
方法
SARS-CoV-2感染者におけるT細胞およびB細胞の新生を評価するために、T細胞受容体切除円およびκ-欠失性組換え切除円の分子定量を行った。また、SARS-CoV-2がTECの機能に与える影響を機構的に調べるために、初代ヒト胸腺上皮細胞（TEC）をin vitroで培養するシステムを開発しました。
結果
COVID-19患者は胸腺機能が低下しており、それは重症度と逆相関していることがわかった。SARS-CoV-2が宿主細胞に侵入する経路となるアンジオテンシン変換酵素2が胸腺上皮、特に髄質TECで発現していることを明らかにした。また、SARS-CoV-2がTECを標的とし、上皮細胞の接着と生存に関連する重要な遺伝子と経路をダウンレギュレートすることが示された。
結論
我々のデータは、ヒト胸腺がSARS-CoV-2の標的であり、感染後に胸腺の機能が変化することを実証している。これらの知見は、SARS-CoV-2感染がT細胞のホメオスタシスに及ぼす影響に関する現在の知識を拡大し、胸腺の活動をモニターすることが、疾患の重症度と進行度を予測する有用なマーカーになる可能性を示唆している。

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キーワード
COVID-19
SARS-CoV-2
免疫不全
胸腺
T細胞
胸腺上皮細胞
使用した略語
ACE2
アンジオテンシン変換酵素2
βTREC
βTREC（ベータトレック
cjKREC
コーディングジョイントKREC
CK1
サイトケラチン1
CK5
サイトケラチン5
COVID-19
コロナウイルス病2019
cTEC
皮質胸腺上皮細胞（Cortical thymic epithelial cell
DEGs
差分発現遺伝子
EpCAM
上皮細胞接着分子（Epithelial cell adhesion molecule
hTEC
ヒト胸腺上皮細胞
ICU
集中治療室
KREC
κ-デレッティング組換え切除環
LCMV
リンパ球性絨毛膜炎ウイルス
mTEC
髄質胸腺上皮細胞
sjKREC
シグナルジョイントKREC
sjTREC
シグナルジョイントTREC
TEC
胸腺上皮細胞
SARS-CoV-2
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型
TREC
T細胞受容体切断サークル（T-cell receptor excision circle
UEA1
ウラジロガシアグルチニンI
2019年12月以降、コロナウイルス病2019（COVID-19）と名付けられた、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）に起因する新しい感染性呼吸器疾患が中国・武漢で発生し、世界中に広がり、パンデミックを引き起こしています。SARS-CoV-2感染では、呼吸器以外にも多種多様な臓器や組織が影響を受ける。リンパ球減少は、多くの呼吸器系ウイルス感染症に共通する特徴ですが、通常2〜4日程度で回復します。それとは対照的に、COVID-19で観察されるリンパ球減少は、より深刻で持続的であり、特にT細胞系に選択的であるようです。4 したがって、複数の研究が、COVID-19患者におけるT細胞リンパ球減少の根本原因および疾患の重症度および進行との相関について調査しました。COVID-19の進行に伴うT細胞の枯渇と枯渇は、異常な活性化、細胞のアポトーシス、組織の動員など、炎症性の高い微小環境によって引き起こされるいくつかの過程に起因すると考えられています5, 6, 7, 8。
胸腺は、T細胞の生成と教育のための主要な器官である。このプロセスは、発達中の胸腺細胞と、胸腺上皮細胞（TEC）、マクロファージ、内皮細胞、線維芽細胞、樹状細胞からなる胸腺間質区画との間のクロストークに大きく依存している9、10、11 TECは胸腺間質集団の大部分を占め、その局在と機能特性により、古典的に皮質TECと髄質TEC（それぞれcTECとmTEC）に分けられます 11、12 cTECは、発達中の胸腺細胞の運命決定、拡大、ポジティブセレクションを制御する。mTECは、胸腺細胞のネガティブセレクションと、MHCによって周辺臓器に限定された自己ペプチドを提示することによる「中枢耐性」の確立に主に関与している。このように、mTECは、組織に制限された多数の抗原に対する寛容の誘導に重要な役割を担っている13。
T細胞の発生過程は、一般的な抗腫瘍療法（放射線療法や化学療法）、免疫抑制療法、感染症などに伴う免疫学的障害によって大きく変化する14。ウイルスや細菌感染は、胸腺微小環境の細胞を直接標的としたり、グルココルチコイドや炎症性サイトカインなど、血流中に放出される可溶性因子のバイスタンダーによる全身的影響によって胸腺機能に悪影響を及ぼす。15、 16, 17, 18, 19 HIV、17,20, 21, 22, 23 麻疹ウイルス、24, 25 ヒトTリンパトロピックウイルス1型、26, 27 ジカウイルス、28 慢性C型肝炎ウイルス、19高病原鳥インフルエンザウイルス、29およびシミア免疫不全ウイルス30などの複数のウイルスが胸腺局所微環境に影響を与えてその機能を破壊し、T細胞新生を低下させることを臨床および実験証拠が示している。ウイルス感染による胸腺機能への有害な影響にもかかわらず、SARS-CoV-2感染時のTリンパ球の造血を分析した非常に少数の研究では、対照的な結果が示されている31,32）。
ここで、我々は、SARS-CoV-2が胸腺の細胞を直接標的とし、その機能に影響を与えることができるという仮説を立てた。我々は、COVID-19患者が胸腺機能の変化を示し、SARS-CoV-2が胸腺上皮の機能に直接影響を与えるという説得力のある証拠を提供する。我々は、COVID-19患者が胸腺のT細胞出力を著しく低下させ、疾患の重症度が胸腺機能の低下と関連していることを証明した。その結果、SARS-CoV-2が宿主細胞に侵入する際の主要な受容体であるアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）が胸腺上皮、特にmTECsで発現していることがメカニズムとして判明した。また、SARS-CoV-2がTECに侵入し、その遺伝子発現プロファイルに影響を与え、「コロナウイルス病」に関連する遺伝子をアップレギュレートし、上皮細胞の接着と生存に関連する経路をダウンレギュレートすることを実証しました。
この結果は、SARS-CoV-2感染が患者の免疫系に及ぼす影響に関する現在の知識を拡大し、胸腺活動のモニタリングが疾患の重症度と進行度を評価する有用なマーカーとなる可能性を示唆しています。
研究方法
研究計画
COVID-19を発症した入院患者34名をレトロスペクティブに研究に登録した。組み入れ基準は、鼻咽頭ぬぐい液のRT-PCRで確認されたSARS-CoV-2感染の分子診断であった。除外基準は、HIV、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス感染、および妊娠であった。患者はさらに、疾患の重症度に基づいて2つのコホートに分けられた： 9名の患者は集中治療室（ICU）に入室し、25名の患者は入室しなかった（非ICU）。対照群（健康ドナー群）には、SARS-CoV-2に感染していない成人健康ドナーが合計21名登録された。患者の人口統計学的情報は表Iに詳述されている。
表I. 患者の人口統計学的情報
研究グループ健康なドナーCOVID-19（非ICU）COVID-19（ICU）健康な被験者と患者、21259人年齢（y）、中央値（IQR）49（30-52）59（48-73）57（55-77）性別（M/F）、No.7 /1418/77/2解析日（入院からの日数）、中央値（IQR）N/A1（0-2）2（1-4）リンパ球数（κ109/L）、平均±SDN/1.2±0.71±0.8
本観察研究は、INMI Lazzaro Spallanzani Hospital-IRCCS（イタリア・ローマ）に2020年3月初旬から2020年10月末日まで入院した成人患者を対象に実施されました。INMI, Lazzaro Spallanzaniの倫理委員会から倫理的承認を受け（プロトコル承認番号9/2020）、各患者は書面によるインフォームドコンセントにサインした。本試験は、Good Clinical Practiceガイドライン、International Conference on Harmonizationガイドライン、およびヘルシンキ宣言の最新版に従って実施されました。
hTEC培養液の作製
初代ヒトTEC（hTEC）の細胞培養は、Greenら33が当初記載した手順に修正を加えながら行った。胸腺組織サンプルは、小児患者の心臓血管の矯正手術中に、両親がインフォームドコンセントの書面に署名した後に入手した。胸腺の被膜を除去し、最も内側の小葉を見えるようにした。胸腺標本を細かくミンチにし、0.06mg/mLのリベラーゼ（Merck, Darmstadt, Germany）、0.4mg/mLのウシ膵臓由来DNAse（Roche, Basel, Switzerland）、および2mM l-Glutamine (Euroclone, Pero, Italy) を含むRPMI培地に懸濁してスピナーフラスコに37℃で各20分の3サイクルの回転させた。消化された検体は、2％FBS（ThermoFisher Scientific, Waltham, Mass）を含むRPMI培地に集め、プールし、300gで5分間、4℃で回転させた。TECを濃縮するために、抗EpCAM（CD326）（クローンHEA-125、Miltenyi、Bergisch Gladbach、ドイツ）染色および抗APCマイクロビーズ（Miltenyi）分離を用いて上皮細胞接着分子（EpCAM）陽性の細胞を濃縮した。TEC濃縮細胞画分をプレーティングした（2. 5×104細胞／cm2）を致死的に照射された3T3-J2マウス線維芽細胞（Kerafast, Boston, Mass）のフィーダー層上に置き、ダルベッコ改変イーグル培地とハムズF-12（3：1混合物）、10％FCS（ThermoFisher Scientific）、インスリン（5μg／ml、 Eli Lilly, Indianapolis, Ind）、アデニンを含む成長培地で5％CO2の湿潤雰囲気において培養させた（0. 18mM、Sigma、St Louis、Mo）、ヒドロコルチゾン（0.4μg/mL、Sigma）、コレラ毒素（0.1nM、List Labs, Campbell, Calif）、トリヨードサイロニン（2nM、Sigma）、グルタミン（4mM、ThermoFisher Scientific）および抗生物質を含む。上皮成長因子（10 ng/mL, Austral Biologicals, San Ramon, Calif）は、培養48時間後に培地に添加した。培養したTECは、TEC様形態の維持については標準的なライトシート顕微鏡で、TECマーカーEpCAMの発現については蛍光活性化セルソーティングで評価した、 Ulex europaeus agglutinin I (UEA1, clone GoH3, DBA), CD205 (clone C205, BD, Franklin Lakes, NJ)を用いてmTEC (CD205low UEA1high) とcTEC (CD205high UEA1low) とを識別する。実験開始の24時間前に、フィーダー層のないKGM-Gold defined medium（Lonza, Basel, Switzerland）にhTECsをプレーティングした。
TECsのSARS-CoV-2感染
hTECは、感染させないか、またはSARS-CoV-2（SARS-CoV-2/Human/ITA/PAVIA10734/2020、クレードG、D614G [S] Ref-SKU: 008V-04005, from the EVAg portal）に最小必須培地で、感染多重度を1として感染し、ウイルス接種液または培地のみ（非感染）、細胞を37℃で90分間、5％CO2でインキュベートした。その後、ウイルス接種液を除去し、細胞を0.3mLのPBSで2回洗浄した。感染後の指示された時点で、免疫蛍光のためにhTECをパラホルムアルデヒド4％で固定し、または遺伝子発現解析のために溶解した。
ウイルスRNAの定量化
ウイルスRNAの定量化のために、E-およびS-ウイルス遺伝子を増幅するRealStar-SARS-CoV-2 RT-PCR Kit（Altona Diagnostics, Hamburg, Germany）を用いて、40ngの細胞関連RNAに対してリアルタイムRT-PCRを実施した。各RT-PCRにおいて、実験サンプルと並行して5点標準曲線（反応あたり106-102 SARS-CoV-2 RNAコピー；Human 2019-nCoV strain 2019-nCoV/Italy-INMI1 RNA； Ref-SKU：008N-03894, from EVAg portal）を実行した。
免疫蛍光法（Immunofluorescence
hTECsを用いたin vitro実験では、SARS-CoV-2感染後に細胞をパラホルムアルデヒド4％で固定し、PBSで5分間3回洗浄し、ブロッキング緩衝液（Invitrogenの2％ヤギ血清、Sigma Aldrichの1％BSA、Biotium（Fremont， Calif）製の0.1％魚ゼラチンブロッキングエージェント、Sigma AldrichのPBSに0.1％Triton X-100と0.05％Tween20）で1時間常温で遮断した。洗浄後、一次抗体緩衝液（PBS中1%BSAおよび0.1%魚ゼラチンブロッキング剤）中の一次抗体抗Zonula occludens-1 (anti-ZO-1) (Invitrogen, Waltham, Mass) および抗SARS-CoV-2 SPIKE (clone 1A9, GeneTex, Irvine, Calif) を加え、4℃、暗所で一夜インキュベートした。洗浄後、二次抗体（Sigma Aldrich製の抗マウスIgG1 Alexa-488および抗ウサギIgG Alexa-647）を各条件に加え、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、スライドを4',6-diamino-2-phenylindole（Invitrogen社製）を含むSlowFade Gold Antifade Mountantでマウントした。画像はLeica THUNDER 3D Live Cell Imaging systemでTHUNDER Computational Clearing Settingsを使用し、倍率63倍で取得しました。
ヒト胸腺サンプルにおけるACE2、SPIKEタンパク質、サイトケラチン1（CK1）、およびサイトケラチン5（CK5）の発現を評価するために、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から得た2.5μm厚の切片に対して免疫蛍光分析を実施した。脱脂と再水和の後、EDTA（pH9）（Dako, Santa Clara, Calif）でスライドを煮沸することにより、熱によるエピトープ回収を実施した。
ACE2抗体の特異性は、ACE2発現量の多い組織である精巣34において、免疫組織化学および免疫蛍光法を用いて検証した。
免疫組織化学では，切片を proteinase K (S3020) (Dako) と共に室温でインキュベートすることにより，エピトープを回収した．内因性ペルオキシダーゼは3％過酸化水素でブロックし、その後5％BSAで再度ブロッキングした。切片を抗ACE2抗体（希釈度1：500）と共に4℃で一晩インキュベートした。二次ビオチン化抗体（K8024、Dako）およびペルオキシダーゼDABキット（Dako）を用いて、一次抗体を明らかにした。また、ヘマトキシリン・エオシン染色は標準的な手順で行った。次に、デジタルスキャナープラットフォーム（Nanozoomer 2.0、浜松、静岡、日本）を使用して、染色された切片を取得した。
免疫蛍光については、5％BSAで1時間ブロッキングした後、組織切片をACE2、SPIKE、CK1、またはCK5（希釈度1：100）と4℃で一晩インキュベートした。一次抗体は、二次抗体Alexa Fluorヤギ抗ウサギ555または抗マウスIgG1 Alexa-488 (Applied Biosystems, Waltham, Mass)で明らかにした。核染色には、グリセロール／PBS（1：1）で切片マウントする前に、HOECHSTを5分間添加した。画像は、470～670nmの範囲で調整可能な白色光レーザー源、405nmのダイオードレーザー、3つの光電子増倍管、および2つの内部スペクトル検出器チャンネル（HyD）GaAsPを備えたLeica TCS SP8Xレーザー走査共焦点顕微鏡（Leica Microsystems, Wetzlar, Germany）を使用して取得した。405nm、488nm、555nmの励起分光レーザーラインを用いた連続共焦点画像は、C PLAN 10×/0.40ドライおよびHC PL APO CS2 63×/1.40 油浸対物レンズ（Leica Microsystems）を用い、1024× 1024フォーマット、スキャン速度200Hz、電子ズーム4×までで取得しました。ACE2-およびサイトケラチン陽性細胞（CK1またはCK5）の総数を、2人の独立したオペレーターが各組織サンプルについてランダムに選択し分析した3〜4枚のデジタル共焦点画像において数えた。
RNA配列決定とバイオインフォマティクス解析
RNeasy Plus Micro Kit（Qiagen、Hilden、Germany）を用いて、製造者の指示に従って初代細胞からtotal RNAを抽出した。サンプルは、3生物学的複製を使用した4（24時間）および3（48時間）の独立した実験から得られたものである。品質管理は、TapeStation 4200とNanoDrop 2000cで行った。ライブラリーを作成し（TruSeq stranded mRNA, Illumina, San Diego, Calif）、Illuminaプラットフォームでペアエンドシーケンスを実施した。前処理ステップでは、FASTPを使用してfastq形式の生リードを検査および洗浄した35。塩基あたりの平均品質はphredスコア20に固定し、30%以上の修飾されていない塩基（-q 20 -u 30 -l 55 -detect_adapter_for_pe） を含むリードを削除した。また、55塩基より短いリードも削除された。クリーンアップされたリードは、ENCODE標準オプションを使用してSTAR（2.7.9a）36で参照ヒトゲノムのコンセンサスバージョン（GRCh38）にアライメントしました。ゲノム生成の段階で、コンセンサス一塩基バリアントと挿入/欠失（InDels）を含む1000 Genomes Projectバリアントコールフォーマットファイルを提供し、このバリアントコールフォーマットの代替対立遺伝子を参照ゲノムに挿入して「変換」ゲノムを作製しました。マッピングの段階では、リードは変換されたゲノムにマッピングされ、アラインメントは元の（参照）座標に戻るように変換されました。ヒトゲノムに対してマッピングされていないリードを収集し、Burrows-Wheeler Aligner (0.7.17) minimum essential mediumを用いてSARS-CoV-2参照ゲノム（NC_045512v2）にデフォルトパラメータで再整列した。遺伝子発現は、Gencode (release 42)の参照遺伝子アノテーションを用い、featureCounts37でリードのストランド指向性を利用して定量化した。SARS-CoV-2感染およびCOVID-19疾患に関連するヒトタンパク質コード遺伝子のリストは、Gencodeデータベース（https://www.gencodegenes.org/human/covid19_genes.html）から入手した。行数はDESeq238（1.38.1）で正規化し、R limmaパッケージでバッチ効果補正を導入した39。ヒートマップはR ComplexHeatmapライブラリで作成し、共役遺伝子のクラスターも強調した。遺伝子発現の差分解析は、DESeq2を用いて行った。ボルケーノプロットはR EnhancedVolcanoライブラリを用いて作成した。遺伝子セットの濃縮は、EnrichRウェブツール（入手先：https://maayanlab.cloud/Enrichr/）を用いてテストした。RNAシーケンスデータは、NCBI Sequence Read Archive (SRA)にIDで寄託されている： SRP422324。
フローサイトメトリーおよびセルソーティング
生存率の定量化のために、hTECをFixable Viability Stain 440 UV（BD、カタログ番号566332）で製造者の説明書に従って染色した。その後、細胞をIntracellular Fixation and Permeabilization buffer set (catalog no. 88-8824-00, eBioscience, San Diego, Calif)を用いて固定した。表面マーカー分析のために、TECサブセットを識別するために、細胞を蛍光色素標識抗体で染色した。使用した抗体は以下の通りである： CD326 (EpCam) (Miltenyi Biotec, catalog no. 130-113-822) および UEA1 (Catalog no. FL-1061, DBA, Segrate, Italy)。取得はBD LSRFortessa X-20（BD Biosciences）で行い、データはFlowJoバージョン8（Treestar）を用いて解析した。胸腺細胞のソーティングのために、小児健康ドナーの胸腺を100μmのセルストレーナー上で潰し、全胸腺細胞を得た。細胞は、フルオロクロム標識抗体で染色された： CD3（BD、カタログ番号565119）、CD4（BD、カタログ番号563876）、およびCD8（BD、カタログ番号557746）。7-アミノアクチノマイシンD（7aad）（BD、カタログ番号559925）は、細胞生存率を評価するために使用した。細胞は、BD Aria IIIセルソーターを用いてソート精製された。細胞純度のレベルは98％以上であった。
TRECおよびKRECの定量化
ゲノムDNAは、製造者の指示に従って、Quick-gDNA Miniprep Kit（Zymo Research, Irvine, Calif）を用いてPBMCから抽出された。T細胞受容体切除円（TREC）およびκ-欠失組換え切除円（KREC）は、以前に記載されたように、T細胞およびB細胞の新生を評価するために定量化された40、 41, 42 簡単に説明すると、最初のPCR反応は、プライマーを含むプライマーミックス、0.5〜1μgのゲノムDNA、200μMの各2′-デオキシヌクレオシド5′-三リン酸（dNTP）、2. 5 mM MgCl2、1×バッファー、および1.25 Uのplatinium Taq polymerase（ThermoFisher）を20μLに溶解した（95℃で3分、95℃で15秒、60℃で30秒、68℃で30秒の18サイクルを繰り返す）。定量は、QuantStudio 12K FlexリアルタイムPCRシステムで、最初のPCR産物の1/200または1/2000希釈液4μLを含む第2の反応と重複して行った；プライマー； およびアルブミン、シグナルジョイント（sj）TREC（sjTREC）、コーディングジョイント（cj）KREC（cjKREC）、sjKREC、またはDβ-Jβセグメントの1つに対するプローブ、Takyon Low Rox master mix（Eurogentec、Seraing、ベルギー）の最終容量10μL（95℃15秒および60℃1分の40サイクル）。10個のDβ-Jβセグメントの合計を最終的に1.3倍して、13個の既存のDβ-Jβセグメントのすべてについて外挿した。値は、アルブミン遺伝子の定量化を用いて、ゲノムコピー数について正規化した。データは150,000PBMCあたりで表現した。すべてのプライマーおよびプローブはMerckから購入した（Table II）。
表II. プローブとプライマーのリスト
ターゲットプライマー／プローブアルブミンFAM-CCTGTCATGCCCACAAATCTCC-TAMRADb1FAM-CAAACCTCTGCGGTCCCAAC-TAMRADb2FAM-CCCACCCAGCTCAGGGAATGCA-TAMRAsjTRECFAM-ACACCTGTTTGTAAAGGTGCCCACT-ACTGTGCTGCTCTCTGCTCCCC TAMRAcjKRECFAM-AGCTGCATTTGCCATCCACTATTTGGAGT-TAMRAsjKRECFAM-CCAGCTTACCCTAGAGTTCTGCACG-TAMRAアルブミン-FGCTGTCATCTTGGCTGTAアルブミン-RACTCATGGAGCTGGTTCDb1-inTGACCCAGGAGGAAAGAG1． 1-inTGTCCTCCATCCTAGCCAGG1。 2-inTCCGTCACAGGGAAAAGTGG1.3-inTGTCCCTGTGAGGGAAGTT1.4-inTGGACTTGGGGAGCAGGA1.5-inCTCATAAAATGTGGTCAGTGGA1.6-inTGAATCCAGCAGAAAGGDb2-inGGACCAGCCAGAA2-inCCAGCTAACTCGAGACGAAA2. 2-inGAACCCTGTTCTTAGGGGAGT2.3-inTGAGGGCTGTGCTGAGA2.4-inAAGCGGGCTCCCGCTGAAcjKREC-FCCCGATTAATGCTGCCGTAGcjKREC-RCCTAGGAGCAGGGCTTsjKREC-FTCAGCCCATTACGTTCTsjKREC-RGTGAGGACGCAGCC
統計情報
バーおよびエラーバーは、各群の平均値プラスマイナスSEMを表す。ほとんどの実験において、正規分布が仮定できない場合はノンパラメトリックテストを実施した。2群間の統計解析は、ノンパラメトリックの対にならないMann-Whitney U testで実施した。一般に、グループ内および実験間のばらつきは少なかった。しかし、実験間のばらつきを考慮し、すべての実験は少なくとも2回行われた。実験内変動を考慮するため、特にin vitroの研究では、少なくとも2つの異なる胸腺組織サンプルから得た一次試料を用いて、条件ごとに複数のウェルを評価した。すべての統計は計算され、表示グラフはGraphPad 9を使用して作成された。
結果
COVID-19患者では、T細胞およびB細胞の新生が損なわれている。
COVID-19がT細胞の発生過程に与える影響を評価するため、胸腺T細胞の新生を測定するためのよく定義された戦略である患者末梢血中のTRECを定量化した。40、41、42 我々は特にsjTRECとβTREC（βTREC）を評価したが、これらはそれぞれT細胞受容体-αおよび-β遺伝子座の細胞内VDJ組み換え時に発生するエピソードDNA分子を表している43。COVID-19患者では、胸腺の機能が著しく低下しており、年齢をマッチさせた健常対照者のレベルと比較して、sjTRECのレベルが低下していることが示された（図1、A）。重要なことは、ICU患者は、非ICUコホートと比較して、sjTREC数がより劇的に減少したことであり、生命を脅かす疾患を持つ患者における胸腺機能の障害がより深刻であることを示唆している（図1, A）。βTRECは希釈率が高いため、末梢血中ではsjTRECよりも検出されにくいという定説があるにもかかわらず、COVID-19の全患者でβTRECレベルの強い低下が観察されましたが、サンプルサイズが限られているためか、非ICU患者のレベルと比較して統計的有意差には達しませんでした（図1、B）。本研究のICU患者コホートは非常に少なかったが、ICUから回復せず死亡した患者のsjTRECレベルは、生存している患者よりも有意に低いことがわかった（オンラインレポジトリの図E1（www.jacionline.org）参照）。
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図1. COVID-19患者（pt）では、T細胞およびB細胞の新生が損なわれている。sjTREC（A）およびβTREC（B）は15万細胞あたりの定量、cjKREC（C）およびsjKREC（D）は15万細胞あたりの定量を示す。解析は、21人の健康なドナー（HD）、25人の非ICU患者、9人のICU患者のデータを含む。∗p < .05; p < .01; p < .001; p < .0001。NS, Not significant.
B細胞リンパ球減少症はCOVID-19のもう一つの特徴であるため、44,45我々はKRECの定量化を通じて患者におけるB細胞新生不全の可能性を調査することを目指した。sjKRECとcjKRECは、それぞれ新生B細胞と全B細胞を反映するものである40。以前の報告46と一致して、COVID-19患者では、cjKREC定量化によって測定した全B細胞レベルの点で違いは認められなかった（図1、C）。しかし、新たに生成されたB細胞のレベルは、ICUコホートに限定されるものの、低下していることが確認された（図1、D）。これらのデータから、SARS-CoV-2感染はT細胞およびB細胞の生成に影響を及ぼし、T細胞コンパートメントにはより劇的な影響を及ぼすことが示唆された。
重要なことは、リンパ球の数で正規化したsjTRECとsjKRECのレベルは、ICU以外の患者のレベルと比較すると、ICU患者では依然として有意な低下を示している（オンラインレポジトリの図E2 www.jacionline.org）。胸腺不全がCOVID-19に関連する一般的なリンパ球減少とは独立していること、sjTRECとsjKRECの定量化が生命に関わる疾患のリスクを持つ患者を評価する貴重なツールになることを示唆している。
TECのin vivo SARS-CoV-2感染症
いくつかのウイルスは、胸腺微小環境の細胞に感染することで、胸腺機能に直接影響を与えることができる47。そこで、心臓矯正手術を受けている小児患者および致死的COVID-19の成人患者から得た胸腺組織の切片で、ヒトSARS-CoV-2受容体ACE2の発現を分析した。小児胸腺切片の免疫蛍光イメージングでは、胸腺内でACE2が発現しており、主に間質微小環境の大型細胞（特に髄質）に限定されていた。重要なことは、ACE2が、主にmTECサブセットに限定されるマーカーであるCK5と共発現していることである（図2、AおよびF、オンラインレポジトリの図E3参照、www.jacionline.org）。公開されている単細胞RNA配列データを精査したところ50、ACE2は、CK1の発現を特徴とする特定のmTECクラスターに優先的に濃縮されていることがわかった。これらのデータと一致するように、さらなる解析により、胸腺髄質のCK1+細胞内でACE2が広く共発現していることが明らかになった（図2、BおよびF）。ACE2の発現は、入院中にCOVID-19で死亡した成人患者の胸腺組織切片でも評価された。この場合、ACE2を発現するCK5+およびCK1+のmTECの割合が、小児組織での割合と比較して多いことがわかった（図2、A-D、F）。興味深いことに、マウスとヒトを対象とした過去の単一細胞RNAシーケンス研究では、CK1+ mTECの割合が年齢とともに増加することが示されており、ACE2+ mTECの頻度が小児患者よりも成人患者で高い可能性が示唆された50,51。
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図2. ヒト胸腺はSARS-CoV-2感染の直接的な標的である。小児胸腺におけるACE2発現とCK5（A）またはCK1（B）の組み合わせ。COVID-19の致死例から分離した成人の胸腺におけるCK5（C）またはCK1（D）と組み合わせたACE2発現。E、COVID-19の致死的な症例から分離した成人胸腺におけるCK5と組み合わせたSPIKE発現。F、髄質区画の細胞におけるACE2およびCK5、ならびにACE2およびCK1共発現の定量化（n＞1画像あたり3フィールド）。白い点線は皮質・髄質接合部を示す。白いボックスは拡大した領域を示す。∗∗p＜0.01；＊＊＊p＜0.001；＊＊＊＊p＜0.0001。
SARS-CoV-2が生体内でTECに感染するかどうかを評価するために、COVID-19の致死例の胸腺におけるSPIKEタンパクの存在を評価した。ACE2の発現データと一致し、髄質コンパートメントでのSPIKEの発現とCK5との共発現が確認された（図2、E）。これらのデータから、胸腺上皮はヒトのSARS-CoV-2感染の直接的な標的であることが示された。
ヒト初代TECのin vitroでのSARS-CoV-2感染
SARS-CoV-2感染によるTEC機能への影響を調べるために、初代hTECのin vitro培養システムを開発した（図3、A）。小児の胸腺からhTECを分離・培養し、ACE2の発現を定量PCRで確認した（オンラインレポジトリ（www.jacionline.org）の図E4、A参照）。そこでhTECをSARS-CoV-2でin vitro感染させ、感染後24時間および48時間のウイルス複製を計測した。具体的には、SARS-CoV-2の複製能力を、hTECに結合したウイルスRNAの比較、およびhTECがin vitroで排出するウイルス粒子の感染力価の測定によって評価した。hTECでは、感染後24時間で、また感染後48時間でも同程度の細胞内SARS-CoV-2 RNAレベルの上昇が検出された（図3、B）。ウイルス粒子の感染力価（組織培養感染量の中央値）を測定しても同じプロファイルが観察されたことから、hTECは感染することはできるが、活性なウイルス複製を長期間維持することはできないことが示唆された（図3、C）。これらのデータは、免疫蛍光染色によって確認され、感染後24時間および48時間にSPIKE陽性のhTECが確認されました（図3、D-E）。
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図3. SARS-CoV-2はin vitroで効率的にhTECに感染する。A, SARS-CoV-2による初代ヒトTECのin vitro感染モデルの確立。B、感染したhTECにおけるウイルスRNAの定量化。データは、5つの生物学的複製で行われた5つの独立した実験の代表値である。C、hTECs感染後24時間および48時間における放出されたウイルス粒子の感染力価（中央値組織培養感染量［TCID50］）。D、SARS-CoV-2感染hTECsにおけるSPIKEとZonula occludens-1（ZO-1）の共局在を定量化した。E、hTEC感染後の細胞内SARS-CoV-2の検出。ZO-1は上皮細胞マーカーとして使用した。2つの独立した実験の代表画像。F、EpCam陽性細胞でゲートされたmTEC（UEA1＋）およびcTEC（UEA1-）サブセットの細胞生存率を評価するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略。G、EpCam陽性細胞の頻度として表したmTECおよびcTECサブセット内の細胞死亡率の定量化。∗P < .05. NS, Not significant.
SARS-CoV-2感染によるhTECへの影響をさらに調べるため、髄質および皮質hTECの割合と、感染後の生存率を評価した。髄質および皮質のhTECの割合に有意差は認められなかったが（図E4、B参照）、感染24時間後にmTECサブセットで死亡率の増加が認められた（図3、F-G）。この観察は、in vivoで髄質に観察された高いACE2およびSPIKEレベル陽性と一致するように思われる。これらのデータから、hTECはin vitroで効率的に感染させることができるが、活性なウイルス複製を長時間持続させることはできないことがわかった。
SARS-CoV-2感染による初代ヒトTECの遺伝子発現への影響
SARS-CoV-2が胸腺上皮に引き起こす生物学的影響を探るため、感染後のhTECsの遺伝子発現プロファイルを評価した。感染24時間後の差次発現遺伝子（DEG）の発現プロファイルを非感染hTECsのものと比較したところ、SARS-CoV-2感染後に1588個の差次変調遺伝子を発見した： 760の遺伝子が発現を増加させ、828の遺伝子が減少した（図4、A）。これらの遺伝子の大部分は、感染後48時間でも同様の差分発現を維持していた（オンラインレポジトリのFig E5, A-D、www.jacionline.org を参照）。注目すべきは、感染後24時間および48時間において、University of California Santa Cruzデータベースから取得した参照ウイルスゲノムにマッピングされたシーケンスリードが著しく濃縮されていることで、hTECのin vitro感染が経時的に持続することをさらに示唆している（オンラインリポジトリ www.jacionline.org の Fig E6, A を参照）。DEGのうち、ITGB4、HSPG2、LAMB3、LAMA5、FN1といった、上皮の接合部と完全性の維持に重要な役割を果たす遺伝子は、感染後にダウンレギュレートされた上位の遺伝子に含まれていた（図4、A）。さらに、FASN、FLNB、RRBP1、MYH9、HSPG2、DYNC1H1などの他の負の調節遺伝子は、最近、推定自己抗原として提案され、COVID-19患者の自己免疫に関連している可能性がある52。トップ3のダウンレギュレーション遺伝子の発現は、感染hTECsの非配列RNAサンプルの定量PCRにより確認した（図E6、B参照）。
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図4. SARS-CoV-2感染後のhTECsにおける遺伝子発現の変化。A, SARS-CoV-2感染後24時間のhTECにおける1588個のDEGを示すVolcano plot。B, DEGsのKyoto Encyclopedia of Genes and GenomesパスウェイおよびGene Ontology生物学的プロセスの濃縮解析。上位10パスウェイが示されている。完全なリストはTable E1に記載されている。遺伝子セット濃縮のカウントと有意水準については、それぞれサイズと色のダブルスケールが適用されている。C、感染後24時間のhTECにおいて有意に（Padjusted <.05）調節されていることが判明したCOVID-19（Gencode annotation）への応答に関与する70のタンパク質コード化遺伝子を示すヒートマップ。並行して、感染後48時間における同一遺伝子の発現量も示す。遺伝子発現値は、分散安定化データ（vsd）正規化カウントのzスコアとして示し、遺伝子とサンプルの階層的クラスタリングを適用して、同様の遺伝子発現シグネチャーを持つ共役遺伝子とサンプルのクラスターをハイライトした。ECM、細胞外マトリックス、ER、小胞体、FC、fold change、NI、not infected、NS、not significant。
次に、TECの発達と機能に関連する遺伝子の発現を個別に評価した。その結果、感染によって、LTBR、RELA、NOTCH1、EGFRといったTECの発生と分化に重要な役割を果たす遺伝子がダウンレギュレーションすることがわかった（図E6、C参照）。一方、SARS-CoV-2感染では、CTSLとATG5の発現が誘導された。興味深いことに、CTSL（カテプシン1）は最近、SARS-CoV-2感染後に発現が上昇することが示されている53。TECによる末梢組織制限抗原の発現は、自己に対する中枢寛容の確立に不可欠であるため、さらにhTEC感染後に異なる制御を受ける既知の自己抗原について検索した。興味深いことに、皮膚に発現が限定される組織自己抗原SOX9が、SARS-CoV-2感染後に有意に発現が低下することが判明した13。自己抗原の発現に関するデータは限られているが、本研究は、TECの維持に重要な遺伝子の転写変化を引き起こすとともに、SARS-CoV-2感染が組織制限抗原の発現をマイナスに制御する可能性を示唆した。
その後、SARS-CoV-2感染によって影響を受ける生物学的経路を知るために、DEGのGene Ontology（GO）分類とKyoto Encyclopedia of Genes and Genomesパスウェイ解析を実施した。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomesの解析では、コロナウイルス疾患パスウェイを含む様々なパスウェイが濃縮されており、感染TECが他のコロナウイルス感染細胞型が示すのと同様のトランスクリプトーム状態を示していることが示された（図4、B）。さらに、SARS-CoV-2感染が、細胞代謝に関連する重要なプロセスを制御していることが解析から明らかになった。特に、酸化的リン酸化は、感染後に活性化される上位3つの経路の中に含まれていることがわかりました（図4、B）。さらに、SARS-CoV-2感染hTECsでは、トリカルボン酸サイクルも有意に増加した（オンラインレポジトリの表E1 www.jacionline.org を参照）。一方、上皮細胞の維持、接着、生存に重要な役割を果たす焦点接着と細胞外マトリックス相互作用に関わる経路は、感染後に有意にダウンレギュレートされた。
SARS-CoV-2感染によって引き起こされる遺伝子発現の摂動をさらに調べるために、DEGをSARS-CoV-2感染に関連するヒトのタンパク質コード遺伝子の公開セットであるGencode COVID-19 Gene Annotationと比較しました。現在、遺伝子セットで検証されている321個の遺伝子のうち、70個が感染hTECで観察されたDEGと一致し（36個のダウンレギュレートと34個のアップレギュレート）（図4、C）、63個が感染後48時間でも同様の遺伝子発現変化を維持していました。SARS-CoV-2感染によって影響を受ける生物学的経路をよりよく理解するために、Gene Ontologyを用いて機能アノテーションを行い、コロナウイルス疾患関連DEGの濃縮を検証した。宿主細胞へのウイルス侵入に関連する経路（CTSLおよびPPIA遺伝子）の活性化が観察されたが、一方、ダウンレギュレートされた遺伝子の多くはタンパク質分解と細胞周期制御に強く関連していた（図E6、D参照）。これらの結果から、SARS-CoV-2感染はヒトTECの遺伝子発現に大きな影響を与え、TECの維持に重要な経路をネガティブに制御し、COVID-19遺伝子シグネチャーと一致する転写変化を誘導することが示されました。
考察
2019年12月に出現して以来、SARS-CoV-2は急速に世界中に拡散しています。このウイルスは、主要な細胞侵入受容体としてACE2を悪用し、その感染は感染力の高いCOVID-19につながる。この病気の複雑さと致死率の高いウイルス変異体の急増を考えると、COVID-19に対する有効な治療法を開発し、重症化するリスクのある患者を特定するためには、ウイルスの生物学的標的への影響を包括的に特徴付けることが最も重要です。
臨床的には、COVID-19は広範な症状や合併症と関連しています。リンパ球減少に対する感染の影響については多くの文献が調査しているが、COVID-19患者においてT細胞およびB細胞リンパ球の造血過程が変化しているかどうかを評価した研究は非常に少ない。ここでは、胸腺が生体内でSARS-CoV-2感染の標的であり、COVID-19患者において胸腺機能が損なわれているという証拠を初めて提示するものである。我々はまず、COVID-19患者が、T細胞およびB細胞の新生を示す代用マーカーであるTRECおよびKRECのレベルをそれぞれ低下させていることを示した。さらに、TRECはICU以外の患者さんでもICUの患者さんでも、より深刻な減少を示したが、KRECはあまり影響を受けなかった。これらの結果は、B細胞コンパートメントよりもT細胞プールがCOVID-19の間により大きな影響を受けるという以前に発表されたデータと一致している46,54。これらの結果を踏まえ、我々はSARS-CoV-2の胸腺への直接的影響の可能性について調査しようとした。我々のデータは、小児および成人患者の胸腺上皮がSARS-CoV-2受容体ACE2を発現し、SARS-CoV-2の細胞への侵入によって遺伝子発現プロファイルが根本的に変化することを示した。我々のデータは、感染後、SARS-CoV-2は、リボソーム生合成とタンパク質翻訳に関連する様々な経路の活性化によって示唆されるように、生存と自己増殖のために様々な宿主因子をリクルートすることを示唆する。これらの作用は、TECの正常な遺伝子発現プロファイルの乱れと関連しており、上皮細胞の維持に関わる重要な経路（焦点接着や細胞外マトリックス相互作用など）のダウンレギュレーションと代謝過程（酸化的リン酸化など）のアップレギュレーションにつながる。これらの代謝経路の活性化は、酸化ストレスの上昇をもたらすと考えられ、SARS-CoV-2感染細胞で観察された生命力の低下とマイトファジー経路の上昇を説明できると考えられる（表E1参照）。初代hTECがin vitro培養系で効果的なウイルス複製を維持できないことを示したが（これは他の細胞系で観察された所見である55,56）、今回のデータは、SARS-CoV-2がin vitroおよびin vivoで長期間にわたって感染したhTECに持続することを実証した。したがって、細胞の直接感染によって引き起こされる変化とともに、再循環するウイルス特異的T細胞が感染したTECを標的とし、胸腺の損傷と胸腺出力の低下に大きく寄与する可能性があります。マイコバクテリアおよびリンパ球性絨毛膜炎ウイルス（LCMV）感染モデルマウスで行われた先行研究は、この仮説を支持している57,58。
COVID-19の患者における胸腺機能の低下は、免疫学的に重大な結果をもたらす可能性がある。生後間もないころのT細胞プールの生成における重要性に加え、抗悪性腫瘍治療、免疫抑制治療、感染症などによる免疫学的障害の後にT細胞免疫を再確立するためには、胸腺機能の最適化が必要である。胸腺機能の低下とそれに伴うT細胞輸出の減少は、COVID-19の急性疾患患者のリンパ球減少を悪化させ、回復後の循環T細胞数と機能の回復に要する時間を長くする可能性がある。胸腺機能の回復が遅れると、二次感染の発生につながり、病気の重症度を悪化させ、病気の進行リスクを高め59、ヘルペスウイルスの再活性化に伴う症状の持続を促進する可能性がある60。さらに、SARS-CoV-2がTECに与える直接的な影響と、インターフェロン、IL-6、TNF-αなどの炎症性分子の増加によるさらなるダメージは、いずれも急性胸腺不全に関与しており61、発達中の胸腺細胞の最適な教育につながらない可能性があります。T細胞の発達過程の障害は、中枢性寛容の過程を変化させ、自己抗原に対するT細胞応答の成熟を引き起こし、自己組織抗原に対する自己免疫反応の発生につながるかもしれない。ウイルス感染と多発性硬化症、関節リウマチ、1型糖尿病、SLEなどの自己免疫疾患の発症との関係はよく知られている62。しかし、分子模倣、バイスタンダーT細胞の活性化、核酸感知異常などが関与している可能性が示唆されているものの、この関連の基礎となるメカニズムはまだほとんど解明されていない63、64。中枢性寛容の破壊もまた提案されてきた。HIV、麻疹ウイルス、LCMV、黄熱ウイルス、ジカウイルスなどのいくつかのウイルスは、胸腺の退縮や胸腺上皮の構造および機能の変化を引き起こす可能性があります20、24、28、57、65、66。SARS-CoV-2感染は、自己免疫疾患や炎症性疾患と一般的に関連することが知られている経路や標的を含む強力かつ過剰な炎症反応を引き起こす。特に、COVID-19と自己免疫疾患（特発性血小板減少性紫斑病、小児の多系統炎症症候群、自己免疫性甲状腺疾患、ギランバレー症候群など）との関連性に関するいくつかの報告が徐々に出始めている現在、SARS-CoV-2の自己免疫の誘導や悪化の有無は活発な研究分野である68。
最後に、胸腺微小環境に感染すると、病原体特異的耐性が出現することが、LCMV、マウス白血病ウイルス、69 B型肝炎ウイルス、69 Mycobacterium avium感染で示されたように、マウス実験モデルで研究されている70 しかし、これがヒト感染症に関連するかは検討課題である。
我々の知る限り、SARS-CoV-2が胸腺を直接標的とし、胸腺上皮の遺伝子発現プロファイルを変化させることができることを立証したのは、我々の研究だけである。胸腺機能の評価（例えば、患者末梢血中のsjTRECの定量化）は、急性期と回復期の両方で合併症のリスクを持つCOVID-19患者を特定するための有用なマーカーとなる可能性があることを提案します。自己抗原の発現変化に関するデータは限られているが、SARS-CoV-2による胸腺機能の障害は、過剰な炎症を説明する新たなメカニズムであり、COVID-19に関連した自己免疫疾患の発症に寄与する可能性がある。
臨床的意義
COVID-19患者は胸腺のT細胞出力が低下しており、疾患の重症度は胸腺機能と逆相関している。胸腺活動のモニタリングは、疾患の重症度や進行度を評価するための有用なマーカーとなる可能性がある。
フローサイトメトリーコアの協力、特にEzio Giorda博士とGabriele Volpe博士に感謝する。また、免疫蛍光アッセイをサポートしてくれたMarco Pezzullo博士に感謝する。特にLoredana Ruggeri博士（University of Perugia）には、hTEC培養システムのセットアップに関する知見と試薬について感謝する。
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E.V.は、Amy Stelzer Manasevit Research Program、Italian Association for Cancer Research（AIRC）、イタリア保健省（「Ricerca Corrente」）からの助成金により支援を受けています。F.L.は、AIRCからの助成金（Special Program Metastatic disease： The Key Unmet Need in Oncology 5 per mille 2018 Project Code 21147 and Accelerator Award 2017 INCAR）、Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca (grant PRIN ID 2017 WC8499_004), and the Italian Ministry of Health (grant RF-2016-02364388). S.F.とS.G.は、イタリアのAIRCフェローシップの支援を受けています。また、本研究は、欧州連合のHorizon 2020研究・革新プログラム（助成金契約番号871029）の助成を受けたEuropean Virus Archive - GLOBALの支援を受けています。
潜在的な利益相反の開示 著者らは、関連する利益相反がないことを宣言する。
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これらの著者は、本作品に等しく貢献した。
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