非ステロイド性抗炎症薬は、Clostridioides difficile毒素を介したミトコンドリア障害に対して上皮細胞を感作する。

2023年7月20日 15:05

https://www.genengnews.com/topics/infectious-diseases/nsaids-sensitize-colon-cells-to-c-diff-toxin-disrupting-mitochondria/

JOSHUA SOTO OCAÑA HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-8898-6630, NILE U. BAYARD, [...], AND JOSEPH P. ZACKULAR HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-3228-3055 +5著者著者情報&所属機関
科学の進歩
19 7月 2023
第9巻第29号
DOI: 10.1126/sciadv.adh5552
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クロストリジオイデス・ディフィシル（Clostridioides difficile）は、2種類の強力な外毒素の作用により大腸粘膜を損傷する。C. difficileの病因を形成する因子は不完全に理解されているが、消化管生態系における生態学的因子、粘膜免疫応答、および環境因子によるものと考えられる。C. difficile感染症（CDI）における医薬品の役割についてはほとんど知られていないが、最近の研究で非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）がCDIを悪化させることが示された。この現象の根底にある機序は依然として不明である。ここでわれわれは、NSAIDsがシクロオキシゲナーゼ（COX）酵素を阻害するという一般的な役割とは別に、大腸上皮細胞（CECs）を障害し、C. difficile毒素を介する障害に細胞を感作することによってCDIを悪化させることを示した。注目すべきは、NSAIDsとC. difficile毒素がCECのミトコンドリアを標的とし、C. difficile毒素が介在する障害を増強することである。我々の結果は、NSAIDsがC. difficile毒素と相乗的に作用して宿主細胞のミトコンドリアにダメージを与えることにより、CDIを悪化させることを示している。これらの結果から、NSAIDsが大腸の微生物感染を悪化させる役割を担っていることが明らかになった。
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はじめに
コロニー形成の過程で、腸内病原体は複雑な生態系にさらされ、多くの因子が感染の結果に影響を及ぼす(1-3)。病原体の行動を形成する外的圧力には、宿主の免疫環境、腸内細菌叢、食事要因、および生体外物質が含まれる。このような免疫的、生態学的、環境的要因との関連で病原体の挙動を理解することは、疾病発現のメカニズムを理解し、この増大する問題に対する予防・治療戦略を開発する上で不可欠である。最も重要な腸内病原体のひとつがClostridioides difficileである。この院内感染病原体は、抗生物質関連下痢の世界的な主要原因であり、公衆衛生上の緊急の脅威である(4)。C.difficileによる感染は、軽度の下痢から複雑な感染症や死亡に至るまで、重症度が異なる様々な疾患症状を引き起こす(5)。この広範な臨床結果に影響を及ぼす因子は、ほとんど不明なままである。新たな証拠によれば、食事や医薬品など、これまで認識されていなかった環境因子が、感染感受性や疾患の発現に影響を及ぼすことが示唆されている(6-10)。しかし、C. difficile感染症（CDI）に対する生体外因子や医薬品の影響については、まだほとんどわかっていない。
非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）は世界中で最も処方されている薬剤であり、痛みの治療や炎症を抑えるために広く使用されている(11)。これらの薬剤はシクロオキシゲナーゼ（COX）酵素1および2を阻害し、脂質メディエーターであるプロスタグランジン、プロスタサイクリン、トロンボキサンの産生を減少させる。NSAIDは疼痛や炎症管理において重要な役割を担っているにもかかわらず、その使用は消化管合併症や炎症反応の調節障害を引き起こす可能性がある(12, 13)。NSAIDの長期使用は腸管障害や胃潰瘍と関連している(14-16)。小腸では、これらの薬剤は腸組織の出血や穿孔を含む多くの腸管障害を引き起こす(17, 18)。上部消化管におけるNSAIDを介した腸症は、COX酵素阻害を介した粘膜機能障害によって引き起こされるという仮説がある(12)。COX阻害はプロスタグランジンやプロスタサイクリンの産生低下を招き、これらの分子が消化管で発揮する細胞保護作用を阻害する。COX阻害だけでなく、NSAIDsは小腸の上皮の酸化的リン酸化を阻害し、ミトコンドリアの機能を破壊するオフターゲット効果を持つことが知られている(19)。このメカニズムは薬物の酸性度に依存しており、酸性のNSAIDsはミトコンドリア膜に移行し、最終的にミトコンドリア機能を破壊する(20)。現在までのところ、COX酵素阻害とは無関係に、NSAIDが介在するミトコンドリア作用が腸症の発症に及ぼす影響は定義されていない。さらに、大腸におけるNSAIDsのオフターゲット作用の役割についてはほとんど知られておらず、大腸の感染に対するこれらの作用の役割についても深く検討されていない。
NSAIDの使用は炎症性腸疾患(IBD)患者の危険因子であり、高リスク患者における炎症の自然再燃と関連している(21, 22)。NSAIDはCDIおよび疾患のリスク増加とも関連しており、CDIが疑われる患者ではNSAID治療を避けるべきであることはよく知られている(23-26)。注目すべきことに、われわれの以前の研究で、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）であるインドメタシンの投与はCDIを増悪させ、マウス感染モデルにおいて死亡率を著しく増加させることが証明された（26, 27）。非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）の投与は、免疫応答の調節障害、大腸上皮細胞（CEC）におけるタイトジャンクションタンパク質の非局在化、およびCDIにおけるマイクロバイオームの崩壊を引き起こす。これらの結果から、インドメタシンの投与は、CDIの数日前であっても、動物モデルにおいてCDIの転帰に長期的かつ顕著な影響を及ぼす可能性があることが示された。しかし、NSAIDの前投与がマウスを重症CDIに感作する機序や、NSAIDが介在する上皮の変化に関連する機序は不明である。本研究では、CDI時のNSAIDによる死亡率の分子機序を明らかにし、感染時のNSAIDs、C. difficileおよび大腸上皮間の相互作用を明らかにすることを目指した。驚いたことに、CECにおけるNSAIDが介在する病勢亢進におけるCOX阻害の主要な役割は見出されなかった。その代わりに、NSAIDsは、大腸上皮の宿主ミトコンドリアに対するオフターゲット効果および相乗効果を通して、C. difficile毒素の影響にCECを感作することにより、C. difficile関連疾患を悪化させることが示された。ミトコンドリア機能の破壊は、CECの損傷と炎症死を増加させ、CDIに対する非ステロイド性抗炎症薬の確立された悪影響を説明すると考えられる。本研究は、重要な感染症に対する非ステロイド性抗炎症薬の作用機序を明らかにし、大腸上皮のミトコンドリアに対するインドメタシンの標的外影響について報告するものである。
結果
非ステロイド性抗炎症薬はC. difficile中毒のin vitroモデルにおいて上皮細胞障害を増加させる。
我々の以前の研究で、インドメタシンがC. difficile症を悪化させることが示されたが、病態悪化の機序は不明であった(27)。大腸に定着したC. difficileは2つの強力な外毒素TcdAとTcdBを産生する。これらの毒素はグルコシルトランスフェラーゼであり、CECにおいてアクチン細胞骨格の解離、タイトジャンクションの完全性の喪失、プログラムされた細胞死を引き起こす。そこで、NSAIDが介在する疾患亢進の分子メカニズムを明らかにするために、Caco-2 CECのC. difficile中毒のin vitroモデルを用いた。小腸で腸症を引き起こすことが知られている非選択的COX阻害剤であるインドメタシンを、代表的なNSAIDとして用いた(28)。このCaco-2細胞上皮バリアモデルを用いると、インドメタシンと組換えTcdB投与の両方が上皮細胞バリア透過性を増加させることが観察された（図1A）。この効果は相加的で、TcdBとインドメタシンの複合効果は、それぞれ独立した治療と比較して増大した。この現象がタイトジャンクションの完全性と関連しているかどうかを調べるため、以前報告されたように（27）、免疫細胞化学（ICC）を用いてタイトジャンクションタンパク質の局在を調べ、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（rt-qPCR）を用いて発現を調べた。インドメタシンおよび／またはC. difficile毒素による処理後、ゾナ・オクルーデンス-1（ZO-1）の変化に対応する細胞形態の変化が観察された（図1B）。TcdBに細胞をさらすと、細胞境界での点状突起の形成が増加した。一方、インドメタシン単独、およびインドメタシンとTcdBの併用処理では、細胞間に局在するタンパク質の量が減少した。インドメタシンとTcdBの共処理では、ZO-1（tjp1）の発現に変化は見られなかった（図1C）。しかし、インドメタシン、およびTcdBとインドメタシンの併用は、タイトジャンクションタンパク質であるオクルディン（ocludin）の発現を増加させた（図1D）。これらのデータから、インドメタシンとTcdBはともに大腸上皮に作用し、これら2つの障害の複合作用が感染時に観察されるバリア機能低下の原動力となっていることが示唆される。
図1. NSAIDs はC. difficile中毒のin vitroモデルにおいて上皮細胞障害を増加させる。
(A）インドメタシン（indo）またはビヒクルコントロールで16時間処理した分化Caco-2細胞において、TcdB（C.d.）中毒の6時間後に測定した経上皮電気抵抗（TEER）。「未処理」（Unt）線は、ビヒクル処理細胞のベースライン透過性を示す［平均、各処理につきn＝5、多重比較による一元配置分散分析（ANOVA）］。(B）TcdB（C.d.）、インドメタシン（indo）、C.d.+indo、またはビヒクルコントロール（Unt）で処理し、抗ZO-1抗体とDAPIで染色したCaco-2細胞の代表的なICC画像。(CとD）タイトジャンクションタンパク質tjp1とoclnのリアルタイムrt-qPCRデータ（平均、各処置n＝8、多重比較による一元配置分散分析）。(E)インド、1:5希釈のC.difficile上清（C.d.）、C.d.+インド、ビヒクルコントロールまたは模擬感染で処理した後の上皮細胞の生存率。データはモック感染およびビヒクルコントロール処理細胞（未処理ライン）に対して正規化した。灰色の線はC.difficileによって誘導された細胞死の量（平均±SEM、インドメタシン濃度ごとにn=4、二元配置ANOVAによる多重比較、*P < 0.0001）。(F)200μMインド、1:5希釈のC.d.上清、C.d.+インド、1:15希釈のC.d.上清(C.d.dil)、C.d.dil+インド、ビヒクルコントロールまたは模擬感染で処理した後に測定した上皮細胞生存率。(平均、各処置につきn = 8、多重比較による一元配置分散分析）。TcdB（C.d.）、indo、C.d.+indo、またはビヒクルコントロール（Unt）で処理し、アネキシンV抗体とヨウ化プロピジウムで染色したCaco-2細胞のフローサイトメトリー解析。(G) 代表的フロープロット。(H）アネキシンV＋ヨウ化プロピジウム細胞でゲーティングされたアポトーシス細胞。(I)アネキシンV+、ヨウ化プロピジウム+細胞にゲーティングされた壊死細胞（平均、各処置n=5、多重比較による一元配置分散分析）。(JからL）Caco-2細胞における炎症マーカーilb、cxcl8、il10についてのrt-qPCR。
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C. difficile毒素は、上皮細胞において複数の独立した経路を介して細胞死を誘導する(29-31)。非ステロイド性抗炎症薬がCECにおける毒素媒介性細胞死を促進するか変化させるかを調べるため、in vitroモデルでインドメタシンがCaco-2細胞の生存に及ぼす影響を調べた。予想通り、インドメタシンはC. difficileとは無関係に、用量依存的にCaco-2細胞の細胞死を引き起こすことが観察された（図1E）。しかし、実質的な細胞死を引き起こさないインドメタシンの濃度では、両方の毒素（TcdAとTcdB）を含むC. difficile濾過上清を加えると、細胞死が著しく促進されることがわかった（図1E）。このことは、NSAID治療とC. difficile毒素による中毒の組み合わせ効果が、CECsに大きなダメージを与えることを示唆している。注目すべきことに、インドメタシンで細胞を前処理すると、CECの死滅を増加させるのに必要なC. difficile上清の閾値が下がったことから、インドメタシンが毒素の影響に対して細胞を感作することが示唆された（図1F）。インドメタシンに限らず、イブプロフェン、ナプロキセン、アスピリンなど他の非ステロイド性抗炎症薬もC. difficile毒素の存在下で細胞死を増加させた（図S1、A～C）。C. difficile毒素は、上皮細胞に複数のプログラムされた細胞死経路を誘導する能力があり、この現象は毒素と濃度に依存する(32)。そこで、アポトーシス細胞を同定するためにアネキシンV+ヨウ化プロピジウム、壊死細胞を同定するためにアネキシンV+ヨウ化プロピジウム+の細胞集団をゲーティングして、誘導された細胞死のメカニズムを調べた。インドメタシンとTcdBの併用処理によってアポトーシス細胞の数が増加したが、この現象はインドメタシン単独処理によっても媒介された（図1、GとH）。インドメタシンとTcdBの併用療法では、壊死細胞死の増加が観察されたが、これはこの治療群に特有の現象であった（図1、GとI）。最後に、TcdBとインドメタシン処理後のCECの炎症プロフィールをrt-qPCRで評価した。インドメタシン投与後、炎症性サイトカインであるインターロイキン-1β（IL-1β）（il1b）およびIL-8（cxcl8）の発現増加が観察され（図1、JおよびK）、抗炎症性サイトカインであるIL-10の変化は観察されなかった（図1L）。このことは、CDIにおけるNSAIDが介在する細胞死は炎症性である可能性が高いことを示唆している。これらのデータを総合すると、インドメタシンはC. difficile毒素に対してCECを感作し、NSAIDsとC. difficile毒素の併用は、細胞死、透過性、および炎症を増強することにより、大腸上皮細胞のバリア機能を障害することが示された。
NSAIDsのCDIに対する作用はCOX酵素やプロスタグランジンに対する作用とは無関係である。
NSAIDsはCOX酵素を標的とし、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、トロンボキサンの産生を阻害する。腸内では、プロスタグランジンE2（PGE2）が炎症や感染時に重要であることが示されている(33, 34)。このことから、インドメタシンが介在するPGE2の阻害がC. difficile関連疾患の亢進に寄与するという仮説を立てた。これを裏付けるように、我々は以前にPGE2アナログであるミソプロストールによる治療がマウスを重症のCDIから保護することを証明した(35)。ここでは、CDI発症時のCOX酵素阻害とPGE2産生の寄与をさらに明らかにしようとした。まず、選択的COX-1およびCOX-2阻害剤がC. difficile毒素上清による中毒に及ぼす影響をモデル上皮で検討した。予想外なことに、COX-1またはCOX-2阻害がC. difficile中毒時の上皮細胞の生存にマイナスの影響を与えることを示すことはできなかった（図2、AおよびB）。これと一致して、COX-1阻害剤とCOX-2阻害剤の併用は、in vitro系ではCECの死に影響を与えなかった（図2C）。また、選択的COX-1阻害剤とCOX-1阻害剤による共処理後の上皮細胞透過性を測定したところ、これまでのデータと一致して、これらはTcdB処理後の上皮細胞透過性を増強しなかった（図2D）。PGE2がCDI時の上皮細胞の健康をサポートするかどうかを調べるため、C. difficile中毒時にNSAIDで処理したCECにPGE2を補充した。PGE2の添加は、インドメタシンとC. difficile毒素の併用処理による透過性の亢進と細胞死から細胞を保護しなかった（図2、EおよびF）。この解釈をさらに強化するために、モデル上皮のインドメタシン処理後のPGE2レベルを測定した。その結果、インドメタシンおよびインドメタシンとTcdBの併用で、PGE2レベルの低下が観察された（図2G）。これらのデータは、インドメタシン投与後にプロスタグランジン産生の阻害が起こるものの、これがC. difficile中毒時のCECに対するNSAID介在作用の主要な様式ではないことを示唆している。さらに、PGE2レセプターを介したシグナル伝達は、その役割を担っている可能性は高いものの、これらの条件下で上皮細胞バリアを保護するには、それだけでは十分ではない。このことは、COX酵素の阻害によるプロスタグランジンシグナル伝達の遮断とプロスタグランジンシグナル伝達そのものは、CDI時にNSAIDsが大腸上皮に障害を引き起こすために絶対的に必要なものではないという仮説を補強している。
図2. CDIに対するNSAIDsの作用はCOX酵素やプロスタグランジンに対する作用とは無関係である。
(A～C）バレロイルシルシル酸塩（iCox-1）、セレコキシブ（iCox-2）、iCox-1＋iCox-2の組み合わせ、1：5希釈（C.d.）、C.d.＋iCox-1、C.d.＋iCox-2、またはC.d.＋iCox-2＋iCox-2の組み合わせ、ビヒクルコントロール、または模擬感染で処理した後の上皮細胞の生存率を測定した。データは、モック感染細胞およびビヒクルコントロール処理細胞（未処理ライン）に対して正規化した（平均、各単一処理および二重処理につきn=8、多重比較による一元配置分散分析）。(D）分化Caco-2細胞をiCox-1、iCox2またはビヒクルコントロールで16時間処理した後、TcdB（C.d.）中毒の4時間後に測定したTEER。点線は、ビヒクル処理細胞のベースライン透過性を示す（平均、各処理につきn = 6、多重比較による一元配置分散分析）。(E）200μMのindo、1:5希釈のC.d.上清、C.d.+indoの組み合わせ、indo+PGE2、C.d.+indo+PGE2の組み合わせ、ビヒクルコントロール、または模擬感染で処理した後に測定した上皮細胞の生存率。データは、模擬感染およびビヒクルコントロール処理細胞（未処理ライン）に対して正規化した（平均、各処理につきn＝6、多重比較による一元配置分散分析）。(F)分化Caco-2細胞をindo、indo+PGE2またはビヒクルコントロールで16時間処理した後、TcdB（C.d.）中毒後6時間で測定したTEER。点線は、ビヒクル処理細胞のベースライン透過性を示す（平均、各処理につきn＝3、多重比較による一元配置分散分析）。(G）TcdB（C.d.）、indo、C.d.+indoの組み合わせ、またはビヒクルコントロール（Unt）で処理した後のCECにおけるPGE2濃度（平均値±SEM、各処理につきn = 10、多重比較による一元配置分散分析）。
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NSAIDsはCOX阻害とは無関係にCDIを悪化させる
NSAIDsはCOX酵素とは無関係に標的外作用を示すことが示されている(36)。具体的には、NSAIDsはミトコンドリアと相互作用し、細胞のミトコンドリア機能を阻害する可能性がある。これはNSAIDsがミトコンドリア内膜に入り込み、水素イオンをミトコンドリア内膜に侵入させるイオノフォアを形成する能力によってもたらされる(20)。これらのミトコンドリア相互作用は、その後のアデノシン5′-三リン酸（ATP）産生の低下、細胞質へのカルシウム放出、プログラムされた細胞死経路の活性化につながる(37, 38)。C.ディフィシル菌感染におけるNSAIDsのオフターゲット作用の役割を調べるため、NSAIDsと構造的に類似し、COX酵素を阻害する能力を欠き、ミトコンドリア機能のカップリングを解除する能力を持つNSAIDs前駆体であるR-(-)-2-フェニルプロピオン酸（R2PPA）を用いた(39)。R2PPAは、C. difficileの培養上清を濾過し、インドメタシンと同程度にCECの細胞死を誘導した（図3A）。COX-1およびCOX-2選択的阻害剤をR2PPAに添加しても、R2PPAまたはインドメタシン単独よりも細胞死がさらに促進されることはなかった（図3B）ことから、COX酵素阻害はCDI時の上皮細胞障害の誘発には必要ないことが示された。さらに、上皮細胞の透過性に対するR2PPAの役割を評価したところ、インドメタシンと同様に、この分子はTcdB存在下で上皮透過性を悪化させることが観察された（図3C）。注目すべきことに、細胞をR2PPAで前処理し、細胞死を誘導しない濃度のC. difficile毒素で処理すると、C. difficile上清に対する感受性が増強された（図3D）。これらのデータは、NSAIDsがCOX活性とは無関係に、毒素を介した損傷に対して顕著な効果を示すことをさらに示している。次に、CDI時のオフターゲット効果の役割を調べるため、R2PPAとインドメタシンで前処理したマウスを感染させた。リボタイプ027株Cd196に感染したマウスは、C. difficileのみに感染した無処置の対照マウスと比較して、R2PPAまたはインドメタシンのいずれかで処理した場合、疾患の重症度と死亡率が同等に増強した（図3、EおよびF）。インドメタシンおよびR2PPAを投与したマウスは、未投与のC. difficile感染マウスと比較して、便中のC. difficile負荷量および毒素力価が同程度であったことから、NSAIDsはCDI時の病原体の挙動に影響を与えないことが示された（図3、GおよびH）。非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）のin vivoでの影響はインドメタシンに限ったことではなく、非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）であるアスピリンで前処置したマウスでも死亡率が上昇し、C. difficileの感染量も同程度であった（図S2、AおよびB）。R2PPAとインドメタシンを投与したマウスの大腸組織は、C. difficile感染マウスのみと比較して、病理学的スコアが高く、大腸の長さが短かった（図3、I～K）。特に、R2PPAとインドメタシンを投与したマウスは、C. difficile単独感染マウスと比較して上皮細胞傷害が高く、NSAIDsが感染時のCEC傷害を増加させることを示す以前のin vitroデータを支持した（図3L）。これらのデータから、NSAIDsはCOX酵素阻害活性とは無関係にCDIを悪化させる可能性が高いことが示された。
図3. NSAIDsはCOX阻害作用とは無関係にCDIを悪化させる。
(AおよびB）200μMのindo、R2PPA、R2PPA＋iCox1＋iCox2の組み合わせ、またはビヒクルコントロールで処理した後、C. difficile上清を1:5希釈（C.d.）または模擬感染させ、上皮細胞の生存率を測定した。データは、模擬感染およびビヒクルコントロール処理細胞（未処理ライン）に対して正規化した（平均、各処理につきn＝8、多重比較による一元配置分散分析）。(C）分化Caco-2細胞をR2PPAまたはビヒクルコントロールで処理した後、TcdB（C.d.）中毒の4時間後に測定したTEER。点線は、ビヒクルで処理した細胞のベースライン透過性を示す（平均、各処理につきn = 6、多重比較による一元配置分散分析）。(D）200μMのindo、R2PPA、1:5希釈のC.difficile上清（C.d.）、1:15希釈のC.difficile上清（C.d.dil）、またはC.d.dil+indoもしくはC.d.dil+R2PPAの組み合わせ、ビヒクルコントロールまたは模擬感染で処理した後の上皮細胞の生存率を測定した。データは、模擬感染細胞およびビヒクルコントロール処理細胞（未処理ライン）に対して正規化した（平均、各処理につきn＝8、多重比較による一元配置分散分析）。indoまたはR2PPAで前処理した後、C. difficile Cd196（C.d）に感染させたマウスを（EおよびF）、生存、体重減少、行動、および便の一貫性についてモニターした（各群n = 15マウス、log-rank検定）。(GおよびH）感染マウスの便から得られたC. difficileコロニー形成単位（CFU）および毒素力価。毒素力価は細胞毒性で測定し、便の重量で正規化した（平均±SEM、各群n＝15マウス、ノンパラメトリック一元配置ANOVAと多重比較）。(I）ヘマトキシリン・エオジン染色した組織の代表画像。(J) 大腸の長さを測定した（平均、各群n = 10マウス、多重比較による一元配置分散分析）。(KおよびL) 感染マウスの大腸の病理学的スコア（平均、n=8（C.d.）、n=7（C.d.+indo）、n=10（C.d.+R2PPA）、多重比較による一元配置分散分析）。
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NSAIDsとC. difficileは相乗的にCECのミトコンドリア機能を破壊する
ミトコンドリアは代謝や細胞死を含む多くの細胞機能を制御する細胞小器官である(40, 41)。NSAIDsがミトコンドリアと相互作用して結合を解除し、最終的に細胞機能を破壊することを示す証拠がある。また、上皮細胞におけるC. difficile毒素中毒時にミトコンドリアが果たす役割の可能性についても研究されている（42, 43）。従って、我々はNSAIDsがミトコンドリアへの影響を介してC. difficile毒素にCECを感作している可能性を仮定した。CDI時のNSAIDが介在するダメージにおけるミトコンドリアのアンカップリングの役割を具体的に調べるため、フローサイトメトリーを用いてミトコンドリア機能を評価した。Caco-2細胞をTcdBとインドメタシンで処理した場合、C. difficileまたはインドメタシンのみの両群と比較して、損傷を受けたミトコンドリアの増加が観察され、Mitotracker GreenhiおよびMitotracker Deep Redlowを用いた細胞集団のゲーティングによって測定された（図4、AおよびB）（44）。インドメタシン処理と同様に、TcdBとR2PPAの併用により、Mitotracker GreenhiおよびMitotracker Deep Redlow細胞の数が増加することが観察された（図4C）。これらのデータは、C. difficile毒素がミトコンドリア障害を引き起こす可能性があり、非ステロイド性抗炎症薬のミトコンドリア脱共役能がCDI中の上皮障害を促進することを示している。試験管内でのミトコンドリア機能の特徴をさらに明らかにするために、テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRN）低濃度細胞をゲーティングしてミトコンドリア膜電位を測定した。この結果、インドメタシンとTcdBを併用すると、単独処理に比べてミトコンドリア膜電位が低下した細胞の割合が増加することが観察された（図4D）。次に、MitoSOXを用いて、NSAIDとTcdB処理中のミトコンドリア・スーパーオキシドの産生を評価した。TcdBとインドメタシンの併用により、MitoSOX陽性細胞の割合が増加し、CECによるスーパーオキシド産生が増加していることが観察された（図4E）。これらのデータは、非ステロイド性抗炎症薬とC. difficile毒素が相乗的に作用し、大腸上皮に誘導されるダメージが、感染時にミトコンドリア機能を破壊する能力に一部起因していることを示している。
図4. NSAIDsとC. difficileは相乗的にCECsのミトコンドリア機能を破壊する。
インド、TcdB（C.d.）、C.d.+インド併用、CCCP（ポジティブコントロール）またはビヒクルコントロール（Unt）で処理したCaco-2細胞をMitotracker GreenおよびMitotracker Deep Redで染色した。(A）代表的なフロープロット。丸で囲まれた集団は、Mitotracker GreenhiおよびMitotracker Deep Redlow細胞をゲーティングして、損傷したミトコンドリアを持つ集団の割合を示す。(B）プロットされたMitotracker GreenhiおよびMitotracker Deep Redlow細胞の割合（平均、各処置につきn＝8、多重比較による一元配置分散分析）。(C）R2PPA、TcdB（C.d.）、C.d.+R2PPA、CCCPの組み合わせ、またはビヒクル対照（Unt）で処理した後のMitotracker GreenhiおよびMitotracker Deep Redlow Caco-2細胞の割合（平均、各処理につきn = 10、多重比較を伴う一元配置分散分析）。(D）TMRM低値Caco-2細胞の割合（平均、各処置n＝10、多重比較による一元配置分散分析）。(E）MitoSOX陽性Caco-2細胞の割合（平均、n＝10/処理、多重比較による一元配置分散分析）。(F）セフォペラゾン（Abx）、indo、C.difficile Cd196（C.d.）またはC.d.+indoで処理および／または感染させたマウスから単離したMitotracker GreenhiおよびMitotracker Deep Redlow CECの割合（平均、処理あたりn = 12、多重比較による一元配置分散分析）。(G)感染マウスから単離したTMRM-low CECsの割合（平均、各処置n=12、多重比較による一元配置分散分析）。(H）感染マウスから単離したMitoSOX陽性CECs細胞の割合（平均、各処置n＝12、多重比較による一元配置分散分析）。
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感染におけるNSAIDsとC. difficile毒素の相乗効果を明らかにするため、次にCDIモデルにおけるミトコンドリア機能を測定した。インドメタシンで前処置し、その後C. difficileに感染させたマウスは、インドメタシン、C. difficileまたはセフォペラゾンのみを投与したマウスの細胞と比較して、ミトコンドリアが損傷したCECのレベルが増加した（図4F）。さらに、C. difficile、インドメタシン、またはその両方を併用したマウスCECのミトコンドリア膜電位は、TMRN低値細胞によって測定されるように、同様に低下することが観察された（図4G）。このデータは、マウスにC. difficileが感染すると、NSAIDsとは無関係にCECのミトコンドリア機能が障害されることを示している。この効果はNSAIDs治療により増幅される。in vitroでの研究とは異なり、in vivoで大腸上皮のミトコンドリア・スーパーオキシド産生を測定したところ、投与群間で変化は見られなかった。このことは、我々のマウス感染モデルがこの効果を検出するのに十分な感度を有していない可能性を示唆している（図4H）。これらのデータを総合すると、NSAIDsはミトコンドリア機能を擾乱することによってC. difficile関連疾患を増強し、感染時の上皮細胞障害を引き起こすことが証明された。これらの所見は、NSAIDsがこの重要な院内感染の臨床転帰をどのように悪化させるかについて予期せぬ枠組みを提供し、大腸上皮に対するNSAIDsのオフターゲット効果について重要な洞察を与えるものである。
考察
非ステロイド性抗炎症薬はCDIにおいて有害であるが、非ステロイド性抗炎症薬が介在する病勢亢進の機序は不明であった。本論文では、NSAIDsを介したCDI時の病勢亢進の機序をさらに明らかにし、感染時の上皮障害を促進する結腸におけるNSAIDsの予期せぬ標的外作用を明らかにした。我々は、大腸におけるNSAIDsの作用が、CDIにおけるこれらの薬剤の正統的な標的とは無関係であることを証明した。その代わりに、NSAIDsがCECのミトコンドリアに影響を及ぼし、C. difficileの毒素に対する感受性を高め、CDI時の死亡率を増加させていることを提唱する。これらの結果は、大腸の消化管感染におけるNSAIDsの過小評価された役割を強調するものである。
NSAIDによる消化管上皮へのダメージは、COX-1およびCOX-2阻害の作用によって媒介されることが理解されている。過去のデータでは、これらの薬剤が宿主細胞に及ぼすオフターゲット効果や、小腸においてミトコンドリアの脱共役剤として作用する能力も強調されている。しかし、NSAIDのオフターゲット作用と腸内病原体感染時の大腸におけるダメージとの関連は明らかにされていない。さらに、in vitro研究では、C. difficile毒素がCECのミトコンドリア機能を調節する可能性が示されている。本研究では、C. difficile毒素がCECのミトコンドリア機能を障害することを感染環境下で証明し、これまでの研究と一致して、C. difficileの病原体形成においてミトコンドリア機能が重要な役割を果たすことを示唆した。さらにわれわれの研究は、NSAIDsがCOX酵素阻害とは無関係に大腸上皮の細胞死と透過性を引き起こすことを示唆している。CDIとの関連では、NSAID前処置は上皮細胞障害の増強とC. difficile毒素に対する上皮細胞の感作をもたらす。この現象はCECミトコンドリアに対するNSAIDsのオフターゲット効果によって媒介され、C. difficile毒素の影響に対して細胞を感作し、細胞死、腸管透過性、炎症の亢進につながると考えられる。NSAIDsの使用、特にアスピリンの使用は、ミトコンドリアへの突然の障害によって引き起こされる全身疾患であるRaye症候群と関連している(45)。また、CDI患者にはNSAIDsの投与を避けるのが一般的であるが、その背景にあるメカニズムはよくわかっていない。我々の研究は、CDI患者における非ステロイド性抗炎症薬の臨床的重要性と、これら2つの併用がなぜ有害なのかに光を当てるものである。本研究は、CDIにおける大腸上皮の重要性と、病原性細菌から宿主を守るために大腸上皮が果たす重要な役割を明らかにするものである。我々の知見は、CDI時のミトコンドリア機能の影響を理解することを目的とした更なる研究の出発点となりうる。さらに、これらのデータは、NSAIDが介在するミトコンドリアのアンカップリングが、小腸障害、IBD、大腸がんなどの他の疾患にどのような影響を及ぼすかを示すものである。
材料と方法
細菌株と増殖
この研究ではC. difficile VPI10463株を用い、嫌気チャンバー（窒素85％、水素10％、二酸化炭素5％、Coy Laboratory Products社製）中、0.5％酵母エキス（BD Life Sciences社製）および0.1％システイン（Sigma-Aldrich社製）を添加したブレインハートインフュージョン（BHI）ブロス中、37℃で増殖させた（6, 46, 47）。インビトロ中毒アッセイでは、VPI10463 培養液を 600 nm の光学密度（OD600）が 0.7 になるまで増殖させた。組換え毒素はC. difficile株VPI10463から単離し、精製方法は以下に詳述する。
組換え毒素
組換えTcdBは、以前に記載されたように発現され、精製された(48)。簡単に述べると、Hisタグ付きTcdBをコードするプラスミド（pBL377）を、製造業者のプロトコール（MoBiTec）に従ってBacillus megateriumに形質転換した。テトラサイクリン（10 mg/l）を添加したLuria-Bertani培地6リットルに一晩培養し、OD600が0.1程度になるように接種した。細胞は37℃、220rpmで培養した。細胞がOD600で0.3から0.5に達したら、5g/リットルのd-キシロースで発現を誘導した。4時間後、細胞を遠心分離し、20mMトリス（pH8.0）、500mM NaCl、プロテアーゼ阻害剤に再懸濁した。EmulsiFlex C3マイクロフルイダイザー（Avestin社製）を15,000 lb/in2で2回使用し、溶解液を調製した。溶解物を40,000gで20分間遠心した。毒素を含む上清を最初にNiアフィニティーカラム（HisTrap FastFlow Crude、GE Healthcare）に通した。さらなる精製は、Q-セファロース陰イオン交換クロマトグラフィー（GEヘルスケア）および20 mM Hepes（pH 6.9）-50mMのNaCl中でのゲルろ過クロマトグラフィーを用いて行った。
大腸細胞株
Caco-2細胞はK. Hamilton（Children's Hospital of Philadelphia）から提供されたもので、10％ウシ胎児血清（FBS）、1％GlutaMAX、1％ピルビン酸ナトリウム、1％非必須アミノ酸を添加した改変イーグル培地（MEM）で維持した。細胞はすべて、37℃、5％CO2雰囲気の加湿インキュベーターで培養した。
CDIの動物モデル
すべてのマウス実験は、フィラデルフィア小児病院（Children's Hospital of Philadelphia）のInstitutional Animal Care and Use Committeeの承認を得た。マウスはジャクソン研究所から入手し、到着時に4週齢であったC57BL6/J雄であった。マウスは7日間馴化され、到着時に寝具が混合された。馴化後、セフォペラゾン0.5g/リットルを5日間飲水投与し、2日ごとに抗生物質水を交換した。5日後、水を無処置のものに変えた。
5日間の抗生物質投与後、マウスにインドメタシン（Cayman社製）10 mg/kg、アスピリン（Cayman社製）10 mg/kg、R2PPA（Sigma-Aldrich社製）100 mg/kg、またはビヒクルのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を2日間連続で経口投与した。その後、マウスをC. difficileのリボタイプCd196の芽胞105個に感染させた。マウスは生存をモニターされ、瀕死の状態になるか、ベースラインから20％以上の体重減少を示すという終末点に達した後に安楽死させられた。C. difficileコロニー形成単位は糞便サンプルから毎日定量した。サンプルはPBSで希釈してホモジナイズし、連続希釈してタウロコール酸シクロセリン・セフォキシチン・フルクトース寒天培地にプレーティングした。すべての動物は、動物施設への到着時および感染当日にC. difficile培養陰性であることが確認された。
糞便からのC. difficile毒素力価
細胞毒性アッセイによるC. difficile毒素力価の定量には、Vero細胞円形細胞毒性アッセイを用いた。96ウェル平底プレートに1ウェルあたり1×104個のVero細胞をプレーティングし、24時間インキュベートした。新鮮な糞便サンプルを1mlの滅菌PBSでホモジナイズし、4000gで5分間ペレット化した。上清を0.2μmフィルターで濾過し、ウェル内で10倍希釈して最大希釈度10-8まで滴定した。一晩培養後、Vero細胞の丸まりを10倍の倍率で評価した。細胞毒性データは、サンプル1gあたり100%の細胞を丸めた最高希釈度の逆数で表した。
組織学的分析
剖検時にケカを採取し、10%ホルマリン溶液で固定し、パラフィンに包埋した。切片はヘマトキシリン・エオジンで染色した。各切片には、先に述べた基準に基づき、病理学者による盲検評価によって疾患スコアを割り当てた。組織学的スコアは、特に断りのない限り、炎症、浮腫、上皮細胞損傷の3つの独立した採点基準の累積スコアとして報告された。
細胞生存アッセイ
Caco-2細胞を黒色96ウェルプレートに1ウェル当たり3×104細胞ずつプレーティングし、48時間培養した。48時間後、細胞培養液をリフレッシュし、細胞をインドメタシン、イブプロフェン（ケイマン）、ナプロキセン（ケイマン）、アスピリン、R2PPA、バレロイルシリシエート（ケイマン）、セレコキシブ（ケイマン）、PGE2（ケイマン）、またはビヒクルコントロール［ジメチルスルホキシド（DMSO）］で一晩16時間処理した。翌日、細胞をフィルター滅菌したC. difficile VPI10463培養物を最終希釈度1:5または1:15、あるいは模擬感染（BHI）で感染させ、8時間インキュベートした。細胞生存率は、CellTiter Glo Reagent（Promega）を用いてATPレベルを測定することにより示した。データは、ビヒクル処理および模擬感染細胞のATPレベルに対して正規化した。
透過性アッセイ
Caco-2細胞を12ウェルインサートプレート（Corning社製）に1.5×105個ずつプレーティングし、抵抗が1000Ω以上になるまで1日おきに培地を交換しながら少なくとも14日間培養した。細胞は、500μMインドメタシン、4mM R2PPA、10μMバレロイルシルシレート、10μMセレコキシブ、1mM PGE2、またはビヒクルコントロール（DMSO）で一晩16時間処理した。翌日、細胞は50nMの濃度で組換えTcdBで中毒された。Millicel-ERS2 Volt-Ohm Meter（Fisher Scientific社製）を用いて、感染後4時間または6時間で抵抗を測定した。データはビヒクル処理細胞の抵抗値で正規化した。
タイトジャンクションタンパク質局在化アッセイ
Caco-2細胞を96ウェルコラーゲンIVコートプレートに1.5×104個ずつプレートし、48時間培養した。細胞は250μMインドメタシンまたはビヒクルコントロール（DMSO）で一晩16時間処理した。翌日、細胞を50 nMの濃度で組換えTcdBに4時間感染させた。感染後、細胞をPBSで2回洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで20分間インキュベートして固定した。細胞をPBSで洗浄し、0.1% Triton X-100（MP Biomedicals）で15分間透過処理した。非特異的結合をブロックするために、細胞を10％ヤギ血清（Fisher Scientific社製）で室温で1時間インキュベートし、次いで一次抗ZO-1マウスモノクローナル抗体（BD Biosciences社製）で25mg/mlの濃度で4℃で一晩染色した。翌日、細胞を1％ヤギ血清で10分間2回洗浄した後、2次抗マウスAlexa Fluor 488抗体（Thermo Fisher Scientific）を8μg/mlの濃度で室温で2時間インキュベートした。細胞を1％ヤギ血清で2回洗浄し、次いで4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI；Fisher Scientific）で300ng/mlの濃度で室温で10分間染色した。細胞はEvos FL Autoで緑色蛍光タンパク質とDAPIフィルターを用いて20倍の倍率で画像化した。
RNA抽出とrt-qPCR
Caco-2細胞を24ウェルプレートに1ウェルあたり1.5×105細胞ずつプレーティングし、48時間培養した。細胞を250μMインドメタシンまたはビヒクルコントロール（DMSO）で一晩16時間処理した。翌日、細胞を50 nM組換えTcdBで4時間中毒させた。処理後、RNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いてRNAを回収した。採取したRNAを定量し、200 ngに正規化した。M-MLV Reverse Transcriptase（Promega）を用いて、200 ngのRNAから相補的DNAを製造者の指示に従って合成した。
ヒトプライマーペアはIntegrated DNA Technologies (IDT)から購入した。使用したプライマー配列は以下の通りである： il1b、TGATGGCCCTAAACAGATGAAG（フォワード）およびATCCAGGGCAGAGGTCC（リバース）；cxcl8、ATGACTTCCAAGCTGGCCGT（フォワード）およびTCCTTGGCAAAACTGCACCT（リバース）；il10、GGTTGCCAAGCCTTGTCTGA（フォワード）およびAGGGAGTTCACATGCGCCT（リバース）； tjp1、CAACATACAGTGACGCTTCACA（フォワード）およびCACTATTGACGTTTCCCCACTC（リバース）；ocln、ACAAGCGGTTATCCAGTC（フォワード）およびGTCATCCACAGGCGAAGTTAAT（リバース）；およびgapdh、TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA（フォワード）およびAGGTCGGTGTGAACGGATTTG（リバース）。プライマーは50μM濃度で使用した。rt-qPCRは、iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）を用い、反応量10μl、サンプル2μlで行い、CFX384 Touch Real Time Detection System（BioRad）で実行した。サイクリング条件は、iQ SYBR Green Supermixの製造元のプロトコールに従って行った。データはハウスキーピング遺伝子gapdhで正規化し、相対遺伝子発現としてプロットした。
PGE2の測定
Caco-2細胞を24ウェルプレートに1ウェルあたり1.5×105細胞ずつプレーティングし、48時間培養した。細胞を250μMインドメタシンまたはビヒクルコントロール（DMSO）で16時間一晩処理した。翌日、細胞を50 nMの組換えTcdBで4時間中毒させた。処理後、Prostaglandin E2 ELISA Kit-Monoclonal (Cayman)を用いて、細胞培養上清中のPGE2濃度をメーカーの指示に従って測定した。
CECにおけるフローサイトメトリー分析
細胞死メカニズムを調べるため、Caco-2細胞を24ウェルプレートに1ウェルあたり1.5×105細胞ずつプレーティングし、48時間培養した。細胞は250μMインドメタシンまたはビヒクルコントロール（DMSO）で16時間一晩処理した。翌日、細胞を50 nM組換えTcdBで4時間中毒させた。陽性コントロールとして、細胞を3%パラホルムアルデヒドで30分間処理した。処理後、TrypLE Express（Thermo Fisher Scientific）を用いて細胞をプレートから剥離し、37℃で5分間インキュベートした。次に、細胞を染色バッファー（PBS中2％FBS）で2回洗浄した。アネキシンV結合バッファー（BioLegend）中で、Pacific BlueアネキシンV抗体（BioLegend）とヨウ化プロピジウム（BioLegend）を用いて、メーカーの指示に従って細胞を染色した。細胞を一度洗浄し、アネキシンV結合バッファーに再懸濁した。細胞は直ちにCytek Auroraで回収した。アポトーシス細胞を同定するため、アネキシンV陽性ヨウ化プロピジウム陰性細胞をゲーティングした。壊死細胞については、アネキシンV陽性ヨウ化プロピジウム陽性細胞をゲーティングした。
ミトコンドリア機能を評価するため、Caco-2細胞を24ウェルプレートに1ウェルあたり1.5×105細胞ずつプレーティングし、48時間培養した。細胞を250μMインドメタシン、2mM R2PPA、またはビヒクルコントロール（DMSO）で16時間一晩処理した。翌日、細胞を50 nMの濃度で組換えTcdBで中毒させるか、陽性対照として2 μMのカルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン（CCCP）で4時間処理した。処理後、細胞をTrypLE Expressでプレートから剥離し、37℃で5分間インキュベートした。細胞を染色バッファー（PBS中2％FBS）で2回洗浄した。細胞を50μM Mitotracker Green（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）および50μM Mitotracker Deep Red（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、2.5μM MitoSox（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、100nM TMRM（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、LIVE/DEAD Fixable Aqua（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を1:1000の最終希釈液で染色し、37℃で30分間インキュベートした。この後、細胞を一度洗浄し、染色バッファーに再懸濁した。細胞は直ちにCytek Auroraで染色した。ミトコンドリア色素を生細胞上でゲーティングし、既報のように損傷ミトコンドリアの集団を同定した(44)。
マウス上皮細胞の分離
マウスは3日目に犠牲にし、大腸を採取して縦に開いた。糞便を除去し、脂肪を切り落とし、組織を冷PBSできれいになるまで洗浄した。大腸は10mlの氷上PBS中0.5％BSA溶液に回収された。次に、組織をスターバー付きコニカルに移し、1mM EDTA、10mM Hepes、および1mMジチオスレイトールを含むあらかじめ温めた1×Hanks' balanced salt solutionを10ml入れた。加熱したウォーターバス中、37℃で10分間、150rpmで組織を撹拌した。10分後、チューブを20秒間静かに振った。組織を取り出し、細胞上清を500g、4℃で5分間スピンダウンした。上清を除去し、細胞ペレットを2mlのTrypLE Expressに懸濁した。細胞を25℃で10分間インキュベートし、インキュベート中は5分ごとに細胞をピペッティングした。10分後、10mlの冷PBSを加え、細胞を70μmのセルストレイナーに通した。細胞を500g、4℃で5分間スピンダウンした。この後、細胞を染色バッファーに再懸濁し、トリパンブルーでカウントした。細胞を50μM Mitotracker Greenおよび50μM Mitotracker Deep Red、2.5μM MitoSox、100nM TMRM、抗マウスCD45抗体（BioLegend）、抗マウスCD326（EpCAM）抗体（Thermo Fisher Scientific）、およびLIVE/DEAD Fixable Aquaで37℃で30分間染色した。この後、細胞を一度洗浄し、染色バッファーに再懸濁した。細胞は直ちにCytek Auroraで染色した。ミトコンドリア色素は、CD45陰性、EpCAM陽性の生細胞にゲーティングされた。
謝辞
この試みを通してフィードバックとサポートを提供してくれたZackular研究室の全メンバーに感謝する。本研究のために細胞株を提供してくれたK. Hamiltonに感謝する。ミトコンドリア実験と試薬を指導してくれたY. S. AlbretchとD. Wallaceに感謝する。E. RicciottiとK. Barekatには、本研究について思慮深い議論をしていただいた。F. TulucとCHOPフローコアのサポートに感謝する。
資金提供この研究は、NIH助成金K22AI7220（J.P.Z.へ）、R35GM138369（J.P.Z.へ）、R37AI095755-12（D.B.L.へ）、およびChildren's Hospital of Philadelphia Junior Faculty Pilot Grant（J.P.Z.へ）の支援を受けた。
著者貢献構想： J.S.O.およびJ.P.Z.： J.S.O.、N.U.B.、J.L.H.、E.E.F.、D.B.L.、A.K.T.、D.M.A.、J.P.Z. 調査：視覚化：J.S.O.、N.U.B.、J.L.H：監督：J.S.O.、J.P.Z： J.S.O.およびJ.P.Z. 原案執筆：査読および編集：J.S.O., J.P.Z： J.S.O.、D.B.L.、D.M.A.、J.P.Z.
競合利益：著者らは競合する利益はないことを宣言する。
データおよび資料の入手：本論文の結論を評価するために必要なすべてのデータは、論文および/または補足資料に記載されている。
補足資料
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図S1およびS2
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参考文献
1
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M. C.Abt、B.B.Lewis、S.Caballero、H.Xiong、R.A.Carter、B.Sušac、L.Ling、I.Leiner、E.G.Pamer、2つのILCサブセットが介在する自然免疫防御は、急性クロストリジウム・ディフィシル感染からの防御に重要である。Cell Host Microbe 18, 27-37 (2015).
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