全身性抗生物質による微生物叢の病原性と口腔内骨量減少の増加
公開日：2023年1月12日
全身性抗生物質による微生物相の病原性と口腔内骨量減少の増加
Xulei Yuan, Fuyuan Zhou, ...Jinlin Song 著者紹介
国際口腔科学ジャーナル第15巻、記事番号：4（2023）この記事を引用する
1 アルトメトリック
メトリクス詳細
要旨
歯周炎は最も広く蔓延している口腔疾患であり、口腔内細菌叢と密接な関係がある。口腔内細菌叢は、いくつかの薬物療法により悪影響を受ける。全身性抗生物質は感染症に広く使用されているが、腸内細菌叢の異常を引き起こし、人体に悪影響を及ぼす可能性がある。全身性抗生物質による腸内細菌叢の異常が、口腔内細菌叢、あるいは歯周炎に影響を与えるかどうかは、まだ検討されていない。本研究では、4種類の抗生物質のカクテルを含む飲料水をマウスに飲ませ、全身性抗生物質がマイクロバイオータの病原性と口腔内骨量にどのような影響を及ぼすかを探りました。その結果、抗生物質の長期服用による腸内細菌の異常が、口腔内細菌叢を乱し、歯周炎を悪化させることが初めて明らかになった。さらに、歯周組織において、Th17に関連するサイトカインの発現が増加し、Tregに関連する転写因子やサイトカインが減少していることも確認された。正常マウスの糞便を用いた糞便微生物叢移植は、腸内細菌叢とバリアーを回復させ、口腔内細菌叢の病原性を低下させ、歯周組織におけるTh17/Tregのアンバランスを回復させ、歯槽骨の減少を緩和させた。本研究は、長期間の全身性抗生物質投与による腸内細菌の異常が、口腔内細菌叢と歯周炎に悪影響を及ぼす可能性があることを明らかにした。この関係には、Th17/Tregのアンバランスが関係している可能性がある。これらの結果から，臨床において全身性抗菌薬を使用する際には，患者の歯周状態を定期的に評価する必要があることが明らかになった．
はじめに
歯周炎は、世界の成人人口の約半数が罹患している口腔疾患で、歯周軟組織および硬組織の破壊を引き起こす。歯周炎は，肥満，糖尿病，関節炎，心臓病，癌などの全身疾患と関連している。全身疾患の薬物療法による治療は、歯周組織に悪影響を及ぼし、歯周炎を悪化させることさえあることが分かっている。例えば、フェニトイン、シクロスポリン、カルシウムチャンネルブロッカーの長期使用は、薬剤誘発性歯肉過形成を引き起こす1。関節炎治療に用いられるデキサメタゾンは、歯槽骨の減少を増加させる2。
抗生物質の全身投与は、慢性骨髄炎、細菌性眼内炎、気道感染症、にきびなどの感染症に広く用いられている。腸内細菌叢は、人体で最も多様かつ最大の細菌集団であり、生理的発達、栄養消化、病原体のコロニー形成に対する防御に寄与しています6。全身性抗生物質の長期使用は、多様性の減少、代謝系の変化、腸の防御機能の損傷、抗生物質耐性の原因によって腸内細菌叢を乱します4、7。抗生物質による腸内細菌叢の障害は、様々な全身疾患と関連しており、それらの疾患のいくつかは歯周炎とも相関している9,10,11,12。しかし、抗生物質による薬物療法によって引き起こされる腸内細菌叢の異常が歯周炎に悪影響を及ぼすかどうかは、まだ不明である。
一方，全身的な抗生物質治療そのものは，歯周炎の補助的な治療法である．局所的な抗生物質治療と異なり、全身的な抗生物質治療は、舌背や扁桃陰窩の病原体など口腔内に広く分布する病原体に抗生物質をよりよく暴露することができる13。スケーリング・ルートプレーニング単独治療と比較して、全身的な抗生物質治療とスケーリング・ルートプレーニングの併用は、よりプローブポケットの深さを縮小させ、臨床付着性を獲得するなど優れた臨床結果が得られる14。しかしながら、全身的抗生物質の腸内マイクロバイオータと他の多くの疾病への有害性は無視できないものである。腸内細菌叢は、消化管を介して口腔内細菌叢と連関しており、両者は密接に関連していることを示唆する研究もある。口腔内細菌叢の異常は、口腔内病原体の腸への移行を招き、インフラマソームの活性化により大腸の炎症を引き起こす15。臨床的歯周病パラメータが同等で腸が健康な患者に比べ、腸疾患患者は歯肉縁下部位に多くの病原細菌を有している16。したがって，抗生物質による腸内細菌叢の異常が，口腔内細菌叢と宿主の反応を変化させ，それによって歯周炎に影響を与えるかどうかは，十分に検討に値すると思われる．
いくつかの研究により、Th17/Treg（T-helper and regulatory T cell）のアンバランスが歯周炎に関係することが明らかにされている。Th17細胞は、インターロイキン（IL）-17Aを分泌し、IL-6やRANKLなどの他の炎症性サイトカインの産生を促進し、歯槽骨の損失をもたらす18,19。逆に、CD4 + Tリンパ球のサブセットであるTreg細胞は、免疫恒常性を維持し、歯周炎の炎症性破壊から組織を保護する。20,21 Foxp3はTreg細胞によって特異的に発現する転写因子で、IL-10やTGF-βなどの抗炎症サイトカインも作り出す18,22 卵巣摘出（OVX）ラットの腸内細菌叢のディスバイオーシスは、Th17/Tregのアンバランスを介して歯周炎を悪化させるが、プロバイオティクスやベルベリンは腸内細菌叢を改善し、Th17/Tregアンバランスを逆転させて歯槽骨の減少を抑えることができる。23 これらの研究は、Th17/Tregアンバランスが歯周炎を悪化させ、細菌叢に関連するかもしれないことを示す。
本研究では、全身性抗生物質が口腔腸管軸の微生物病原性にどのように影響するかを明らかにするため、全身性抗生物質の長期使用を模擬して、4種類の抗生物質のカクテルを含む飲料水を4週間マウスに暴露した。リガチャー誘発歯周炎モデルマウスを用い、その後の歯周炎への影響を検討した。さらに、抗生物質によって乱された腸内細菌叢を回復させるために、糞便微生物叢移植（FMT）を行った。その結果、抗生物質による腸内細菌の異常は、腸管バリアーを傷つけ、口腔内細菌叢を乱し、Th17/Tregのアンバランスを介して歯周炎の歯槽骨の減少を悪化させることが示された。これらの知見から、全身性抗生物質を使用している患者の歯周病状態を評価する必要性が明らかになった。
研究成果
抗生物質の長期使用は、腸内細菌叢に歯周炎関連病原体を増加させ、腸内細菌叢の異常を引き起こした
Abs群には4種類の抗生物質カクテル（セフォキシチン、ゲンタマイシン、メトロニダゾール、バンコマイシン、各1 mg-mL-1）を、N群には通常の飲料水を投与し、4週間飼育した（図S1a）。その結果、抗生物質投与後のAbs群の腸内細菌叢の群集均一性と群集多様性は、N群よりも低いことが示された（Fig.1b）。主座標分析（PCoA）では、N群とAbs群は属レベルで有意に区別され、これらの群間の群集組成の違いが示唆された（Fig. 1c）。門レベルでは、腸内細菌叢の異常や腸疾患の要因24 とされるProteobacteriaがAbs群で急激に増加した（図1a）。属レベルでは、プロバイオティクスであるLachnospiraceae_NK4A136_groupとAlistipes25がAbs群で減少していた（Fig. 1d, S2b）。
Fig.
図1
抗生物質の長期使用は腸内細菌叢の異常を引き起こした。腸内細菌叢の門レベル（a）と属レベル（d）の群集棒グラフとWilcoxon rank-sum検定棒グラフ。腸内細菌叢のα多様性(b)。腸内細菌叢のPCoA解析(c)。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001
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腸内細菌叢の結果とは異なり、抗生物質は口腔内細菌叢の群集の均一性と多様性を増加させた（Fig.2b）。また、抗生物質は口腔内細菌叢の組成を変化させ（図2a、c-d、S2c、d）、病原性を増加させることもわかった。Streptococcus、Neisseria、Corynebacterium26など、歯周病に関連する細菌が減少していた（Fig. 2d）。さらに、EnterococcusやDysgnomonas27などの歯周炎に関連する細菌が増加していた（図2d）。これらの結果は、抗生物質の長期使用は、腸内細菌叢の異常を引き起こし、歯周炎関連病原体を増加させ、口腔内細菌叢の中で歯周健康に関連するプロバイオティクスを減少させることを示すものである。
図2
図2
抗生物質の長期使用は、口腔内細菌叢における歯周炎関連病原体を増加させた。口腔内細菌叢の門レベル（a）と属レベル（d）の群集棒グラフとWilcoxon rank-sum test棒グラフ。口腔内細菌叢のα多様性（b）．口腔内細菌叢のPCoA解析（c）．*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001
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実験的歯周炎マウスの腸内細菌叢の異常は回復せず、抗生物質休薬2週間後に口腔内の病原性が増加した
4週間後、Abs群から抗生物質の水を抜き、その後、N群とAbs群のマウスをそれぞれ2群に分けた（n = 12）。N＋N群、N＋Lig（リガチャー）群、Abs＋N群、Abs＋Lig群に分けた。N＋Lig群およびAbs＋Lig群では、シルクリガチャーを用いた実験的歯周炎モデルを2週間構築した（Fig.S1a）。腸内細菌叢については、Sobs indexにより、抗生物質休薬2週間後、Abs+N群ではN+N群に比べ、種の豊富さが激減していた（Fig. 3b）。抗生物質によるこれまでの群集均一性、群集多様性の低下（Abs+N群、Abs+Lig群）は回復していなかった。一方、結紮群（N＋Lig群、Abs＋Lig群）では、群集の均一性、群集の多様性が増加した（Fig.3b）。抗生物質と歯周炎はともに群集組成を変化させた（Fig. 3c, S3a, b）。Abs+N群では、腸内細菌叢のうちProteobacteriaが依然として多く、Actinobacteriotaは有意に減少していた（Fig.3a, S4a）。アクチノバクテリオ タは、腸管透過性、免疫系、代謝、腸脳軸の調節に重要な役割を果たしている28 。属レベルでは、Blautia、 Parasutterella、Moganella29 などの病原性細菌が著しく増加した（図 3d、S3b）。しかし、Abs+N群では腸内健康関連菌norank_Muribaculaceae30の存在量が減少した（図3d, S3b）。これらのデータは、抗生物質を2週間休薬しても、腸内細菌叢は回復しないことを示唆している。以前の研究では、抗生物質が腸内細菌叢を撹乱し、その影響が長期に及ぶことも報告されている31。
Fig.
図3
腸内細菌叢の異常は、2週間の抗生物質休薬後も回復しなかった。腸内細菌叢の門レベル（a）と属レベル（d）の群集棒グラフとWilcoxon rank-sum test棒グラフ。腸内細菌叢のα多様性(b)。腸内細菌叢のPCoA解析（c） *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001
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口腔内細菌叢では、各群間で種の豊富さに有意差は認められなかったが、抗生物質投与群（Abs＋N、Abs＋Lig）では、抗生物質非投与群（N＋N、N＋Lig）に比べて群集均一性と群集多様性が大きく低下した（図4b）。実験的歯周炎を起こした群（N＋Lig、Abs＋Lig）では、抗生物質投与により口腔内細菌叢の病原性が上昇した。N + Lig群に比べ、Abs + Lig群では、Streptococcus, Neisseria, Bergeyella, Lactococcus, Weissellaなどのプロバイオティクスが有意に減少し、口腔病理細菌Klebsiellaが増加した14,26,32 (Fig. 4d, S3d). 以上の結果から、歯周炎の条件下では、抗生物質治療により口腔内細菌叢の病原性が亢進することが明らかになった。
図4
図4
実験的歯周炎マウスの口腔内病原性は、2週間の抗生物質休薬後に増加した。口腔内細菌群の門レベル（a）と属レベル（d）の群集棒グラフとWilcoxon rank-sum test棒グラフ。口腔内細菌叢のα多様性（b）．口腔内細菌叢のPCoA解析（c）．*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001
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抗生物質が腸管障害を引き起こし、歯槽骨の減少を悪化させた
実験期間中、マウスの体重を記録した。D1からD9まで、Abs群では体重の明らかな減少が観察された。その後、これらのマウスの体重は、N群のマウスよりも高いレベルまで急速に増加した。D30以降、結紮したマウス（N＋Lig、Abs＋Lig）は、特にAbs＋Lig群で顕著な体重減少が見られた（Fig.5b）。抗生物質投与群（Abs＋N、Abs＋Lig）では、ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色および組織学的スコア解析から明らかな腸管障害が、特に回腸と盲腸で観察された（Fig. 5a）。抗生物質投与群（Abs+NおよびAbs+Lig）では、非投与群に比べ、杯細胞の減少（Fig. 5c）およびタイトジャンクション関連タンパク質の陽性発現の減少（Fig. 5d）が観察された。さらに、抗生物質はリガチャーを装着したマウスの歯周炎を悪化させた。マイクロCTおよびHE染色解析によると、Abs＋Lig群はN＋Lig群に比べ、歯槽骨の減少および好中球の浸潤が大きかった（Fig.6c、d）。さらに、Abs＋Lig群ではN＋Lig群に比べTRAP陽性破骨細胞が多く、Th17細胞関連炎症性サイトカイン（IL-17A、IL-6）の発現が多かった（図6a, b）。また、抗生物質は、Abs+Lig群において、N + Lig群と比較してTreg細胞関連の炎症性サイトカイン（Foxp3、IL-10）の発現を減少させた（Fig. 6a）。
Fig.
図5
a 回腸、盲腸および結腸のHE染色と組織学的スコア（スケールバー＝200μm） b マウスの体重記録（*Abs+N vs N + N、#Abs+N vs Abs+Lig） c 抗生物質の使用による腸の障害。c 結腸のAB-PAS染色と杯細胞の相対面積（スケールバー＝200μm）。 d 閉塞とZO-1陽性領域の免疫組織化学分析（スケールバー＝250μm、ROI：80μm×80μm）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001
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図6
図6
a 免疫組織化学的解析によるIL-17A, IL-6, Foxp3, IL-10 (Scale bar = 250 μm, ROI: 80 μm × 80 μm) b トラップ染色と解析 (Scale bar = 250 μm) c マイクロCT解析 d 上顎のHE染色 (Scale bar = 250 μm), CEJ-ABC 測定と好中球数解析. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001
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正常なマウスの糞を用いたFMTは、抗生物質による腸内細菌叢の異常を改善したが、口腔内細菌叢には明らかな影響を与えなかった
新しい治療法であるFMTは、健康なドナーの糞便微生物叢を病気のレシピエントに移植することで、正常な腸内細菌叢の種構成と生理機能を再構築するものである。別の30匹のマウスには、4種類の抗生物質カクテルを飲料水として、上記Abs群と同じように4週間提供した。その後、抗生物質入りの水を通常の飲料水に交換し、マウスをFMT-N群とFMT-Abs群に分けた。N＋N群およびAbs＋N群のマウスの糞便微生物叢を、それぞれFMT-N群およびFMT-Abs群に移した（図S1b）。FMTから2週間後、FMT-N群とFMT-Abs群のレシピエントマウスの腸内細菌叢は明確に区別された（図S5a.c、d、S7a、b）。FMT-N群の腸内細菌叢はFMT-Abs群と比較してBacteroidotaとActinobacteriotaが多く、Firmicutesが少なかった（Fig. S5a）。各群のレシピエントマウスはドナーマウスと同様の腸内細菌叢を示し、FMTの成功が示された。口腔内細菌叢の組成は異なるが（図S6a、c、d、S7c、d）、FMT-Abs群とFMT-N群の間でαおよびβ多様性に統計的に有意な差は見られなかった（図S6b、c）。これらの結果は、FMTが腸内細菌叢を変化させたように、口腔内細菌叢を直接変化させないことを示している。
抗生物質で治療した実験的歯周炎マウスの口腔内細菌叢の病原性は、正常マウス糞便のFMTにより低下した
FMTの2週間後、すべてのマウス（FMT-N＋Lig群およびFMT-Abs＋Lig群）で実験的歯周炎モデルを確立した（図S1b）。FMT-N + Lig群では、マウスの腸内細菌叢は、FMT-Abs+Lig群のマウスよりも、より安定で健康な細菌叢に関連する高いα多様性を示した（Fig.7b）。また、norank_MuribaculaceaeやPrevotellaceae_UCG-001などのプロバイオティクスの存在量は、FMT-N + Lig群で非常に高かった（図7d, S8b）。口腔内細菌叢については、FMT-Abs+Lig群とFMT-N + Lig群の間でα多様性に明らかな差は見られなかったが、β多様性には統計的に有意な差が見られた（Fig. 8b, c）。属レベルでは、FMT-N + Lig群では、FMT-Abs + Lig群に比べ、口腔内病原菌unclassified_Enterobacteriaceae15と日和見病原体Morganella33の存在量が少なかった（図8d, S8d）。これらの結果は、実験的歯周炎を誘発した場合、正常なマウスの糞便をFMTしたマウスでは、より健康な口腔内細菌叢組成が形成されることを示した。
図7
図7
正常マウス糞便を用いたFMTにより、抗生物質により乱された腸内細菌叢が一部回復した。腸内細菌叢の門レベル（a）と属レベル（d）の群集棒グラフとWilcoxon rank-sum検定棒グラフ。腸内細菌叢のα多様性(b)。腸内細菌叢のPCoA解析(c)。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001
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図8
図8
正常マウス糞便を用いたFMTは、抗生物質投与実験歯周炎マウスの口腔内細菌叢の病原性を低下させた。口腔内細菌叢の門レベル（a）と属レベル（d）の群集棒グラフとWilcoxon rank-sum test棒グラフ。口腔内細菌叢のα多様性(b)．口腔内細菌叢のPCoA解析（c）．*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001
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正常マウス糞便のFMTは実験的歯周炎マウスの腸管障害および歯槽骨の減少を緩和した
実験期間中、マウスの体重を記録した。D30以降、FMT-N群のマウスはFMT-Abs群のマウスに比べ、より大きな体重増加を示した。結紮後、FMT-N＋Lig群とFMT-Abs＋Lig群の体重差はさらに大きくなった（Fig.9c）。腸管障害に関しては、FMT-N＋Lig群はFMT-Abs＋Lig群に比べ、組織学的スコアが低く、杯細胞の面積が大きく、タイトジャンクション蛋白の陽性発現が多かった（図9a,b,d)。これは、正常なマウスの糞便のFMTが、抗生物質で破壊された腸内細菌叢を再構築し、その病原性を低下させたためと考えられる。それでもなお、腸管組織には病理学的な損傷が観察され、これは4週間の抗生物質使用による悪影響で説明できる。さらに、歯槽骨損失、好中球浸潤、TRAP陽性破骨細胞は、FMT-N＋Lig群ではFMT-Abs＋Lig群よりはるかに少なかった（図10b-d）。免疫組織化学的染色により、FMT-N＋Lig群ではFMT-Abs＋Lig群に比べ、Treg関連転写因子およびサイトカイン（Foxp3、IL-10）の発現が増加し、Th17関連サイトカイン（IL-17A、IL-6）の発現が減少した（図10A）。以上の結果から、正常マウス糞便のFMTは、抗生物質投与マウスの腸管障害および歯周炎による歯槽骨の減少を緩和することが明らかとなった。
図9
図9
a 回腸、盲腸、結腸の HE 染色と組織学的スコア（Scale bar = 200 μm） b 結腸の AB-PAS 染色と杯細胞の相対面積（Scale bar = 200 μm） c マウスの体重記録 d オクルディンおよび ZO-1 の免疫組織化学分析（Scale bar = 200 μm, ROI: 200 μm × 200 μm）. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001
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図10
図10
正常マウス糞便のFMTは実験的歯周炎マウスの歯槽骨損失を軽減した。 a IL-17A、IL-6、Foxp3、IL-10の免疫組織化学分析（スケールバー＝250μm、ROI：80μm×80μm）。 b 上顎のHE染色（スケールバー＝250μm）とCEJ-ABC測定および好中球数分析。 c トラップ染色と分析（スケールバー＝250μm）。d マイクロCT分析。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001
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考察
腸内細菌叢と口腔内細菌叢は、人体で最も大きく、最も多様な細菌集団である。歯周炎は、口腔内細菌叢の崩壊に関連する一般的な口腔内炎症性疾患である。歯周炎に関連した口腔内細菌叢の異常は、腸内細菌叢や腸内疾患に影響を与える可能性がある34。本研究では、マウスに4週間抗生物質を投与し、抗生物質投与により腸内細菌叢の多様性が低下し、明らかなディスバイオシスが認められたが、これまでの報告とも一致するものであった。興味深いことに、Abs群の腸内細菌叢の群集の豊かさはN群に比べ増加していた。これは、抗生物質使用後に抗生物質耐性菌が増殖し、総微生物量が増加する可能性があるためと考えられる36。実験的歯周炎を誘発した後、抗生物質を投与したマウスでは、抗生物質を投与しなかったマウスに比べて歯槽骨吸収が増悪していた。動物実験やヒトでの臨床試験を含め、歯周炎の補助療法として全身性抗生物質治療を行い、歯槽骨の減少や治療効果の増強が見られる研究は多いが、本研究では、全身性抗生物質の長期使用により生じる微生物叢の異常が歯周炎に悪影響を及ぼすかどうかに焦点を当てた。マウスには、セフォキシチン、ゲンタマイシン、メトロニダゾール、バンコマイシン（各1 mg/ml）を含む抗生物質飲料水を4週間与えた。抗生物質の種類、投与量、投与期間は、これまでの研究とは異なっていた。正常な腸内細菌叢は、腸管バリアの構造的完全性の維持に重要な役割を担っている。抗生物質は、正常な腸内細菌叢を崩壊させ、タイトジャンクションタンパク質の発現を減少させ、腸管上皮細胞のアポトーシスを低下させる可能性がある。この混乱は、上皮組織の損傷や盲腸の腫脹など、腸管バリアの炎症や損傷につながる可能性がある37。今回の研究では、抗生物質投与群で腸管構造の深刻な損傷とタイトジャンクションタンパク質の発現低下が観察され、4週間の抗生物質飲料水への曝露が腸管バリアを破壊したことが示唆された。腸管バリアの破壊は、腸管透過性を高め、循環する病原体や微生物産物を増加させ、歯周組織などの遠隔組織に影響を与える可能性がある。逆に、腸管バリアを保護することで、抗生物質による骨量減少を改善できるかもしれない。ある研究では、プロバイオティクスやMDY-1001（高分子ポリマー）が腸内細菌叢を改善し、腸管バリアの破壊から保護することにより、抗生物質投与後の大腿骨吸収を防ぐことができると報告されている38。
実験的歯周炎発症後，抗生物質を投与したマウスの口腔内細菌叢の病原性は，抗生物質を投与していないマウスのそれよりも高いことが示された．このことから、歯周炎の状態下では、抗生物質による腸内細菌叢の異常が口腔内細菌叢に影響を与えることが示唆された。しかし，マウスが抗生物質水を飲むと，必然的に口腔内が抗生物質にさらされることになり，口腔内細菌叢にある程度の影響を及ぼしている可能性がある．そこで、抗生物質を投与されたマウスの乱れた腸内細菌叢を回復させるために、口腔内細菌叢と接触せずに腸内細菌叢に直接影響を与えるFMTを実施した。実験的に歯周炎を誘発したところ、正常なマウスの糞便を用いたFMTを受けたマウスは、口腔内細菌叢の病原性が低く、歯槽骨の減少も少なかった。この知見の説明として、次のようなことが考えられる。まず、健康な腸内細菌叢は、免疫系を刺激して炎症を抑制し、腸のホメオスタシスを維持することができる。抗生物質による腸内細菌の異常は、腸の恒常性を崩し、細菌やその代謝物が血流に入り込み、全身性の炎症を引き起こす可能性がある 39,40,41 全身性の炎症は、さらに局所の炎症環境に影響を与え、Abs+Lig群では、歯周組織において炎症因子の発現が増加し、抗炎症因子の発現が減少していたことが観察されている。健康なドナーマウスのFMTは、抗生物質によって乱れた腸内細菌叢を部分的に再構築し、上記の全身性炎症と炎症性歯周病局所微小環境を改善する可能性がある。
歯周病変部では、Th17細胞関連サイトカイン（IL-17A、IL-6、IL-23、IL-21）や破骨細胞形成メディエーター（RANKL）が有意に増加している44。Treg細胞は、免疫抑制性CD4 + T細胞の重要な亜集団であり、抗炎症性サイトカイン（IL-10、IL-4、TGF-β）を分泌し、RANKL発現を低下させ、歯周炎における歯槽骨の吸収を抑制する。45 Th17細胞とTreg細胞は、骨代謝において相反する免疫制御機能を有する。本研究では、結紮後、抗生物質により腸内細菌が異常になったマウスは、結紮のみのマウスと比較して歯槽骨吸収が大きく、破骨細胞も多く見られた。歯周組織では、IL-17A、IL-6の発現量が多く、Foxp3、IL-10の発現量が少ないことが観察された。正常マウス糞便のFMTにより、抗生物質治療にさらされたマウスの腸内細菌叢が回復し、歯周組織におけるTh17関連因子とTreg関連因子の発現が回復した。これらの結果から、歯周炎状態では、抗生物質による腸内細菌の異常が歯周組織におけるTh17/Tregのアンバランスを誘発し、歯槽骨の減少につながる可能性が示唆された。腸内細菌叢を再構築することで、Th17/Tregのアンバランスが解消され、歯周炎が緩和された。また、抗生物質治療により、炎症性因子と抗炎症性因子がより多く存在する炎症性歯周微小環境が形成された。歯周炎は、炎症反応と微生物叢の双方向のアンバランスが特徴である。また、微生物叢の異常は、宿主反応と制御不能な炎症を引き起こす。17 今回の結果から、抗生物質の使用は、歯周病炎症性微小環境を引き起こし、口腔内微生物叢における歯周炎関連菌の存在量を増やし、歯槽骨損失をさらに悪化させることが示唆された。本研究では，歯周組織における Th17 関連および Treg 関連のサイトカインを免疫組織化学染色により検出した．より正確に免疫細胞の変化を探るために、今後の研究ではフローサイトメトリーやハイスループットシーケンスを用いることが推奨される。
興味深いことに、結紮のみを行ったマウス（N＋Lig群）でも、何もしていないマウスに比べ、高い組織学的スコアが得られています。歯周炎がこのような腸管障害を引き起こす仕組みは、実験的歯周炎が全身の炎症に及ぼす影響によって説明できるかもしれない。実験的歯周炎では血漿中の炎症性サイトカインが高値となり、骨髄中の単球が増加することが報告されている46。結紮糸誘発歯周炎による全身性炎症は、歯周炎のみのマウスにさらなる腸管障害を引き起こすと考えられる。また，歯周病菌が口腔内から腸管に移行することも，抗生物質を投与して歯周炎を誘発したマウスの腸管バリアー障害の根底にある理由の一つである可能性がある．しかし、口腔内細菌が腸まで到達してコロニー化するかどうかについては、まだ議論が残っている。健康な腸内細菌叢にはコロニー形成抵抗性があり、外来菌の侵入を防ぐことができる。47 さらに、健康な成人では口腔内細菌叢と腸内細菌叢は完全に区別されることが分かっている。例えば、アンピシリン治療により、口腔内のKlebsiella属菌が腸内に定着することがあります48。同様に、炎症性腸疾患がある場合、口腔内の病原性細菌KlebsiellaとEnterobacterが異常増殖して腸内に定着し、腸の炎症を悪化させることがあります15。そこで、我々は、抗生物質投与マウスにおいて、実験的歯周炎による全身性炎症と口腔内細菌叢の異所性コロニー形成が、歯周炎が腸に影響を与えるメカニズムの一部である可能性を仮定している。具体的なメカニズムについては、今後の研究によって解明される必要がある。
一方、本研究で行った抗生物質投与は、複合型広域抗生物質飲料水を4週間摂取させるものであり、ヒトの臨床治療と全く同じではないことを認識する必要がある。さらに、本研究で使用した16S rRNA遺伝子シーケンスと比較して、ショットガン次世代シーケンスメタゲノミクスは、マイクロバイオームの複雑性をより包括的に特徴付けることができ、各サンプルでより多くの種を同定できるなど、いくつかの利点を持っている49。さらに、歯周組織における局所的な炎症性変化の他に、全身的な炎症性反応についても将来的に調査する必要がある。
以上より、本研究は、全身性抗生物質が腸内細菌の異常を引き起こし、歯周組織における Th17/Treg のアンバランスを引き起こすことを明らかにした。この結果は、全身性抗生物質が口腔内細菌叢と歯周炎に悪影響を及ぼす可能性を強調するものである。全身性抗生物質を臨床的に使用する場合、特に既に歯周炎を発症している患者に対しては、患者の歯周状態の評価が重要である。
材料および方法
動物実験
4 週齢の雄 C57 マウスを重慶医科大学口腔医学病院重点実験室で SPF 環境下で飼育した。これらを無作為に2群（n = 24）に分けた。N群とAbs群に無作為に分けた。Abs群にはcefoxitin, gentamicin, metronidazole, vancomycin（各1 mg-mL-1; Solarbio, China）を含む抗生物質飲料水を供給した。一方、N群のマウスには通常の飲料水を与えた。各マウスの体重は2日おきに記録した。4週間後、抗生物質入り飲料水を除去した。その後、腸内細菌叢と口腔内細菌叢を分析するために、両群から糞と口腔スワブを採取した。糞サンプルは直ちに-80℃で保存し、口腔スワブサンプルは口腔スワブ保存液（Sangon Biotech、中国）で保存した。その後、N群およびAbs群のマウスをそれぞれ2群に分けた（n = 12）。N＋N群、N＋Lig群、Abs＋N群、Abs＋Lig群に分けた。N＋Lig群およびAbs＋Lig群では、実験的歯周炎モデルを構築した。左上顎第一大臼歯と第二大臼歯の間に絹の結紮具（5-0；Ethicon，America）を設置した。N＋N群およびAbs＋N群のマウスには結紮具を装着しなかった。2週間後、全マウスを安楽死させる前に各群の糞と口内スワブを採取し、上顎と腸（回腸、盲腸、結腸）組織を採取した。Abs＋Lig群、N＋Lig群、Abs＋N群、N＋N群の最終サンプルサイズは、11、9、11、11匹である。
また、別の30匹のマウスには、Abs群と同じように抗生物質入りの飲料水を4週間提供した。その後、抗生物質飲料水を通常の飲料水と交換し、マウスを2群に分けた。FMT-NとFMT-Absの2群に分けた。N＋N群およびAbs＋N群のマウスの糞便微生物叢は、それぞれFMT-N群およびFMT-Abs群に移した。FMTから2週間後、両群の糞便と口腔スワブを採取し、全てのマウスに結紮を行った。さらに2週間後、再び糞と口スワブを採取してから全マウスを安楽死させ、上顎と腸（回腸、盲腸、結腸）組織を採取した。FMT-N＋Lig群およびFMT-Abs＋Lig群における最終的なサンプルサイズは12匹および15匹である。
動物実験は、中国重慶医科大学口腔医学院倫理委員会の許可を得た（承認番号：CQHS-REC-2022 LSNo.003）。
糞便微生物叢の移植
N＋N群およびAbs＋N群のマウスの糞便を、それぞれシステイン（Solarbio、中国）およびNa2S（Solarbio、中国）と遠心管内でボルテックス混合した（3mLの無菌PBS中に500mgの糞便、2.5mgのシステインおよび1mgのNa2Sを含む）。その後、各群の混合物を遠心分離し（500 r-min-1、1分間）、上澄み液を回収した。FMT-N群およびFMT-Abs群のマウスには、それぞれN＋N群およびAbs＋N群の上澄み液を胃内投与した（マウス1匹あたり100μL）。
16S rRNA遺伝子配列およびDNA解析
糞便サンプルおよび口腔スワブは、Shanghai Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd（中国・上海）により処理された。濃度はNanoDrop2000（Thermo Scientific, America）を用いて評価した。そして、アガロースゲル電気泳動は、DNAの品質を推定するために使用された。16S rRNA遺伝子配列のV4-V5領域は、プライマー338F（5′-ACTCCTACGGAGGCAGCAG-3′）および806R（5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′）で増幅させた。その後、アガロースゲルからアンプリコンを抽出し、精製したアンプリコンを等モル量でプールし、Illumina MiSeqプラットフォームでのシークエンスに供した。
歯槽骨のマイクロCT解析
各群の上顎骨を、マイクロCT（Skyscan1172、Skyscan、ベルギー）を用いて走査した。3次元再構成と組織形態学的解析には、Amiraソフトウェア（Amira 6.0.1、ドイツ）を使用した。歯槽骨吸収を解析するために，歯槽骨堤（ABC）からセメントエナメル接合部（CEJ）までの距離を測定した．
歯槽骨および腸管組織の組織学的解析
マウスの上顎骨は 19% EDTA で 30 日間脱灰した。その後、上顎骨と腸管組織の 6 μm スライドを作成し、追跡染色を行った。大腸のスライドには，alcin-blue and periodic acid-schiff staining kit (Bioss, China) を使用した．上顎と腸のスライドには、歯槽骨の減少と腸の損傷を調べるために、HE染色キット（Solarbio, 中国）を使用した。歯槽骨の減少を分析するために、CEJ と ABC 間の距離を測定した（3 回／スライド）。Yuanらのプロトコールに従って、各スライドの歯間部から6つの関心領域（ROI、80μm×80μm）を選んで好中球をカウントし、全体の平均量を記録した。そして、その結果を関心領域あたりの細胞数として報告した。破骨細胞の検査には，TRAP 染色キット（Nanjing Jianchen Bioengineering Institute, China）を使用した．各スライドは3回ずつカウントした。IL-17A、IL-6、Foxp3、および IL-10 は、免疫組織化学染色で調べた。上顎骨スライドを10％ヤギ血清でブロックし、IL-17A、IL-6、Foxp3、またはIL-10に対する一次抗体（1：400）（Bios、中国）で4℃、一晩インキュベートした。その後、二次抗体（Bioss, 中国）で染色した。半定量的な方法で、Image-Pro Plus 6.0を使用して陽性発現を解析した。そして、その結果を平均積算光学密度として表示した。上記のスライドの画像収集には、スライドスキャナー（VS200、Olympus、日本）を使用した。
統計解析
本研究では、すべてのデータの解析にSPSSソフトウェア（SPSS 19.0、アメリカ）を使用した。データは一元配置分散分析およびStudentのt検定により分析した。有意差はP < 0.05で示した。
データの入手方法
原著データは、対応する著者から入手可能である。
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参考文献のダウンロード
謝辞
本研究は、中国国家自然科学基金からの助成金31971282、U22A20314（J.S.へ）、82170968（T.Z.へ）により支援されました。また、本研究は、2019年重慶大学院チューターチーム建設プロジェクトのdstd201903（J.S.へ）、中国国家重点研究開発プログラムの2022YFC2504200（J.S.へ）からも支援されました。
著者情報
著者と所属
重慶医科大学口腔医学病院口腔疾患及び口腔医用科学重点実験室，重慶市高等教育口腔医用工学重点実験室，重慶市，中華人民共和国
徐蕾園、周富源、王和、徐信信、徐世涵、張壮維、張延安、盧妙、張楊、周夢焦、李漢、張西夢、張廷威、宋錦麟
貢献
X.Y. は実験デザイン、データ解析、原稿執筆、改訂に貢献した。F.Z., H.W., X.X. はデータ取得に貢献し、原稿を批判的に改訂した。 S.X., C.Z., Y.Z., M.L. はデータ解析に貢献し、 Y.Z., M.Z., H.L., X.Z. はデータ解釈、 T.Z., J.S. は着想、実験デザイン、データ解析、原稿の改訂に貢献した。すべての著者がこの研究に対する責任に同意している。
対応する著者
Tingwei Zhang または Jinlin Song にご連絡ください。
倫理的宣言
利益相反
すべての著者は、競合する利益を宣言していない。
補足資料
補足資料
権利と許可
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この記事の引用
Yuan, X., Zhou, F., Wang, H. et al. Systemic antibiotics increase microbiota pathogenicity and oral bone loss. Int J Oral Sci 15, 4 (2023)。https://doi.org/10.1038/s41368-022-00212-1。
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受理日
2022年7月15日
改訂版
2022年11月12日
受理
2022年11月24日
発行
2023年1月12日発行
DOI
https://doi.org/10.1038/s41368-022-00212-1
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