微生物由来のプリオン様タンパク質と認知機能障害を引き起こす可能性
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微生物由来のプリオン様タンパク質と認知機能障害を引き起こす可能性
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.10.19.563052v1.full
Jofre Seira Curto, Adan Dominguez Martinez, Paula Sotillo Sotillo, View ORCID ProfileMartina Serrat Garcia, Maria Rosario Fernandez, View ORCID ProfileNatalia Sanchez de Groot
doi: https://doi.org/10.1101/2023.10.19.563052
この論文はプレプリントであり、査読の認証を受けていません。
00010014
要旨全文情報/履歴メトリクスプレビューPDF
要旨
私たちの生命は、感染や共生関係を通じて微生物と複雑に関係している。プリオン様タンパク質の種間伝播は十分に確立されているが、マイクロバイオームにおけるその存在と宿主への影響についてはまだほとんど解明されていない。この問題を解決するために、我々はin silico、in vitro、in vivoの解析を統合した系統的研究を行い、消化管マイクロバイオームの63％がプリオン様配列をコードしていることを明らかにした。これらの配列は、アミロイドβペプチドの凝集を阻害し、Sup35プリオンの凝集と増殖を促進するアミロイド線維を形成することができる。最後に、線虫に我々のプリオン候補のキメラを発現するバクテリアを与えたところ、アルツハイマー病モデルの表現型を再現し、感覚記憶の喪失をもたらした。我々のモデルでは、記憶障害は凝集体の断片化とその分解されやすさに関連している。これらの知見を総合すると、腸内細菌叢がプリオン様配列の潜在的リザーバーとして機能していることが示され、微生物産物が神経変性疾患の発症に影響を及ぼす可能性があるという考えが支持される。
はじめに
多くの神経変性疾患に共通する特徴の一つは、ミスフォールディングタンパク質の不溶性凝集体の存在である。これらの凝集体はしばしばアミロイドで構成され、その特徴は明確なクロスβ構造である。これらのアミロイド形成タンパク質の一部はプリオンのような性質を示し、細胞間の伝達を可能にする。この現象はアルツハイマー病（AD）やパーキンソン病（PD）で顕著に観察され、アミロイド関連タンパク質（ADではアミロイドβペプチド（Aβ）とタウ、PDではαシヌクレイン）が神経細胞系内を伝播する1。
従来、研究者は神経変性疾患の引き金として、主に遺伝因子と環境因子に注目してきた。しかし、ここ数十年の間に、腸内細菌叢という、宿主と共生しながら腸管内に生息する数兆個の微生物の生態系が、これらの疾患の発症や進行に極めて重要な役割を果たしている可能性を示唆する、新たな研究分野が出現した3。
脳-腸内細菌叢軸は、内分泌シグナル伝達、免疫系、直接的な神経細胞伝達という3つの重要なメカニズムを通じて、消化管と中枢神経系を双方向につなぐ役割を果たすと考えられている4。迷走神経は双方向に信号を伝達する役割を担っており、消化管と脳の神経細胞接続を仲介している5。以前の研究では、消化管からアミロイドタンパク質やその他の代謝産物が迷走神経に沿って脳へ運ばれることが提唱され6、神経変性疾患の発症や進行に影響を及ぼす可能性が示唆された3,7。さらに最近では、腸内細菌が迷走神経を通って脳へ移動する可能性があることが報告されている。これは、腸内細菌異常症や腸管透過性が誘発された場合だけでなく、神経疾患の結果としても同様である8。
このような背景から、過去10年間に行われたさまざまな研究が、腸内細菌叢の組成や機能の変化と、ADやPDのような神経変性疾患とを関連付けている。腸内細菌異常症は、食事、抗生物質の使用、ストレスなどの要因によって引き起こされる可能性があり、これらの変化は宿主の健康に重大な影響を及ぼし、胃腸障害から代謝障害に至るまで様々な疾患の一因となる可能性がある3,9。しかし、腸内細菌叢が神経変性疾患に関する潜在的なバイオマーカーおよび疾患修飾因子として認識されるようになったのは、ごく最近のことである。
この関連性は、抗生物質治療や微生物叢移植が病態を変化させるという動物モデル研究における因果関係の証拠によって裏付けられている10。したがって、微生物由来のアミロイドタンパク質は、宿主タンパク質の凝集を横断的に促進する可能性がある。大腸菌でアミロイドタンパク質curliを発現させると、PDマウスモデルにおいてαシヌクレインの凝集が促進される11。
宿主タンパク質の凝集と相互作用し、その凝集に影響を与えることができる他の細菌タンパク質の存在を評価するために、われわれは計算機解析を行った。その結果、腸内細菌叢の63％の種がプリオン様配列をコードしていることが明らかになった。私たちのベンチ調査では、プリオンがアミロイド形成コアを介してアミロイド凝集体を形成・増殖し、線虫の感覚記憶障害を引き起こすことが確認された。
これらの結果から、微生物叢と神経変性疾患との複雑な関連性についての洞察が得られ、これらの有害な疾患の予防と治療に必要な知識を得ることができた。
結果と考察
腸内細菌叢におけるプリオン様配列のスクリーニング
これまでの発表では、細菌領域ではゲノムあたり平均0.3%のプリオン様配列が存在すると報告されている12-19。このことから、腸内細菌叢におけるプリオン様配列の有病率を調べることは興味深い。この目的のため、NIH Human Microbiome Project（NIH-HMP）20,21で収集された遺伝子を、3つの異なるアルゴリズムを用いてスクリーニングした： PAPA17（プリオン凝集予測アルゴリズム）、PLAAC（プリオン様アミノ酸組成）16、pWALTZ18である（図1A；Methods）。これらのアプローチは、プリオン様組成を持つ無秩序配列を同定し、配列がプリオンとして振る舞う確率を反映するスコアを提供する。
図1.
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図1.
腸内細菌叢におけるプリオン様配列のスクリーニング。
A) 腸内細菌叢におけるプリオン様配列のスクリーニングとアミロイド形成コア候補の選択の手順を示すフローチャート。B) 腸内マイクロバイオームで同定された914のプリオン様配列の注釈付き記述の分布を表した円グラフ。少なくとも2％の頻度で見つかった注釈だけを示す。C) 腸内マイクロバイオームで検出された914のプリオン様配列に関連する系統の分布を示す円グラフ。少なくとも1％の頻度で見つかったものだけを示している。D) 本研究で研究された10個のペプチド配列とコンセンサス配列を表示した配列アラインメント。E) 神経変性疾患の発症に対する、腸内細菌叢から選択したプリオン様候補の潜在的影響を解析するために用いた実験方法の概要：i) アミロイド形成能、ii) 宿主タンパク質への干渉、iii) 細胞毒性能、iv) 生体内での機能的伝播、v) 細菌内での凝集、vi) 摂取時の認知機能への影響。
NIH-HMP20,21から得られたオリジナルのリストには、457の生物種、2,540,626の配列が含まれ、そのうち1,468,777がユニークエントリーである（図1A、補足表1）。PAPAアルゴリズムを用いると、16,498配列（1.12%）のプリオン凝集傾向陽性配列が得られたが、よりストリンジェントなPLAACスコアを用いると、2,978配列（0.20%）のプリオン様ドメイン陽性配列が得られた（Methods）。これら2つのセットを統合し、両方の基準を満たす914配列（0.06%）を同定し、これをプリオン様陽性セットと呼ぶ（補足データ1）。我々のアプローチで得られたプリオン様配列の割合（0.06%）は、細菌ドメインにおけるプリオン様配列の過去の報告と一致している12-19。これらの914の配列は284の生物種で見つかっており、腸内細菌データセット内の生物種の63％がプリオン様配列をコードしていることを示している。プリオン様タンパク質が種を超えて拡散する能力を考えると、この発見は、感染力を持つこれらのタンパク質のリザーバーとしての腸内細菌叢の役割に光を当てるものである。
腸内細菌叢におけるプリオン様タンパク質
914の陽性プリオン様配列の顕著な特徴の一つは、仮説的タンパク質（未特性）の割合が高いことである20,21。NIH-HMPに集められた配列のほとんどはゲノムショットガン配列決定によって同定されたもので、仮説的と同定されたものはタンパク質データベースに特徴的なホモログを持たないオープンリーディングフレームである。MobiDB-lite（UniProt）20,21によって予測されたそれらの障害領域を単純に調べるだけで、繰り返されるパターンを検出することができる（補足図1および補足表1）。このことは、これらのタンパク質が、プリオン様組成を必要とする、保存された、類似の、まだ特定されていない細胞内役割を持つ可能性を示唆している。このことは、ヒトの微生物叢によって産生される分子をさらに調査することの重要性を強調している22-24。
相同性が推定された残りの60％の陽性プリオン様配列は、注釈の記述に従って10のカテゴリーに分類することができる（図1B、補足表1）。膜関連タンパク質（31.8%）とトランスポータータンパク質（30.2%）の2つの主要なカテゴリー（図1B）は、細菌細胞と細胞外環境の相互作用を促進する直接的な役割を果たす。これらのカテゴリーには、膜レセプター、トランスポーター、アドヘシンなどの機能が含まれ、これらはプリオン様ドメインの粘着性が重要となりうる接点の形成を必要とする22-24。例えば、いくつかのトランスポータータンパク質は、膜を介した分子の輸送を可能にする足場構造を形成するために、他のタンパク質と相互作用する必要がある（10.3389/fmicb.2018.01737）。同様に、他の膜タンパク質は、接着タンパク質のように、外部環境の感知や表面への細胞接着に貢献している。鞭毛に関連する配列は、細菌の移動や遊走に関与している可能性があり、これらも外部空間との相互作用に関連する機能である25,26。その他の豊富な機能は、タンパク質の品質管理機構（DnaJやプロテアーゼ）やヌクレオチド結合（ヘリカーゼや一本鎖結合など）に関連しており、これらはプリオン様タンパク質と広く関連している12-19。
膜関連タンパク質も凝集や伝達現象に関与している可能性がある。実際、膜との相互作用は構造変化や凝集の重要な原因となっている27。さらに、アミロイド前駆体タンパク質（APP）自体が膜タンパク質であることを考えると28-30、まだ発見されていない細菌タンパク質も同様の運命をたどるという興味深い可能性が出てくる。細菌の膜タンパク質の多くは、宿主細胞や環境との相互作用に関与しており、病気の発生につながる一連の事象の引き金になったり、邪魔になったりする可能性がある。例えば、大腸菌を含むある種の細菌が形成するカーリーアミロイド繊維は、バイオフィルムの構成要素であると同時に、潜在的な病原性因子としての二重の役割を担っている31-35。カーリの接着特性は、細菌が多様な環境にコロニー形成する能力を高める。重要なことに、バイオフィルム形成タンパク質が神経細胞タンパク質の凝集に影響を及ぼし、神経変性の発症に影響を与えることを示す証拠が数多くある31,32,36,37。
プリオン様配列をコードする腸内細菌種
914の陽性プリオン様配列を解析した結果、そのほとんどが神経変性疾患、特にアルツハイマー病に以前から関係していた系統に属していることが明らかになった38。その半数以上はカンピロバクター門に属していた（53％）（図1C）。我々のリストでは、この門の大部分は、消化性潰瘍を引き起こし、世界人口の約50％に感染していることで知られるヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）属で構成されている39。驚くべきことに、アルツハイマー病患者の多くがヘリコバクター・ピロリ菌に感染していることから、この病原体がアルツハイマー病の発症に関与している可能性が示唆されている40,41。
プリオン様配列が2番目に多い門はBacillota門で、同定された配列の24％を占めた。この門には、Coprobacillus属（8%）、Eubacterium属（9%）、Ruminococcus属（9%）、Lactobacillus属（25%）、Clostridium属（17%）が含まれる。これと同様に、以前のBacteria Domain全体の解析13では、Clostridium属に属する細菌にプリオン様配列が多いことが観察された。さらに、Clostridium botulinum由来のRhoタンパク質は、細菌で実験的に確認された最初のプリオン様タンパク質であった42。
もう一つの重要な発見は、プリオン様配列の13％がバクテロイデーテス門に属していたことである。バクテロイデーテス門はヒトの腸内細菌叢で最も多く見られる門の一つである43。バクテロイデス門とプレボテラ門（この門に含まれる属）の割合の増加も、アルツハイマー病患者において観察されている38,44-46。したがって、これらの細菌の割合の増加とプリオン様配列の数の多さとの相関関係は、病態の発症にこれらの細菌が関与している可能性を示しているのかもしれない。
対照的に、ヒト腸内細菌叢のもう一つの主要な門であるファーミキューテス門では、プリオン様配列は検出されなかった43。ファーミキューテス門は健康な微生物叢と関連しているが、アルツハイマー病患者では変化し、減少するため、この観察は特に注目に値する38,44。
さらに、広く研究されている大腸菌だけでなく、主に非病原性株を含むプロテオバクテリアは、推定プリオン様タンパク質のかなりの割合と関連していることが判明した。最近の研究によると、大腸菌は検査した集団の90％以上に存在する47。また、大腸菌はアルツハイマー病患者においてもその割合が増加しており47、我々の予測因子により、この属に関連するいくつかのプリオン様配列が同定された。
腸内細菌叢におけるプリオン様候補の探索
我々の発見を検証するために、914個の陽性プリオン様タンパク質から10個の候補を選び、in vitroおよびin vivoでの神経変性疾患の引き金となる可能性を評価した（図1D-E）。まず、pWALTZスコアで全配列を並べ、値の高い候補を優先し、凝集に対する強固な素因を保証するために、最小スコアを73.518とした。実験手順を容易にするため、仮説的配列、システイン残基を含む配列、複数の膜貫通ドメインを持つ配列は除外した。従来のプリオンの構成に従って、アスパラギンとグルタミンの含有量が20％以上の配列を選択した（補足データ1）。プリオン予測アルゴリズム（補足表1）16-18と一致するように、AlphaFold48解析では、選択した10個の候補配列すべてに一貫して無秩序領域の存在が確認された（補足図2-11）。
また、アルツハイマー病患者40,4138で変化が見られることが報告されている属に関連する細菌株の配列を特に選択した。PSORTbツール47を利用して、主に細胞外に存在する可能性の高い候補を選び、宿主環境との相互作用の可能性を高めた。全体として、異なる属の両方のグラム群から、アノテーションが付された多様なタンパク質のコレクションを構築することを目指した（補足データ1、補足表2）。
アミロイド形成コアのin vitro凝集
選択されたプリオン様候補の凝集特性を評価するために、私たちはアミロイド形成コア、すなわち自己凝集能を持つが、タンパク質全体の凝集を促進する領域18,42に注目した。PAPAアルゴリズムとpWALTZアルゴリズムを組み合わせて、これらの配列を同定した（Methods）。このようにして、主要なプリオン様ドメイン13,18,19の中で最も凝集傾向の強い21アミノ酸セグメントを同定した。その後、これらの21アミノ酸セグメントを化学合成し、フィブリル凝集体に自己集合する能力を試験した。
合成ペプチドを凝集バッファーで希釈し、37℃の非凝集条件下でインキュベートした（Methods）。アミロイド凝集体の存在は、透過型電子顕微鏡（TEM）、フーリエ変換赤外分光法（FT-IR）、アミロイド色素チオフラビンTとコンゴレッドとの結合を用いて評価した。すべてのペプチドは、βシート構造に富んだ線維構造を形成する能力を示した（図2A）（図2B）。さらに、すべてのペプチドはアミロイド特異的色素の少なくとも1つに対して陽性結合を示した（図2C-Dと補足図2-11）。これらの知見を総合すると、腸内細菌叢から予測されるアミロイド形成コアには、アミロイド線維への自己核形成を触媒する能力があることが実証された。
図2.
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図2.
腸内細菌由来の配列のアミロイド凝集。
A) 選択したアミロイド形成コアによって形成された線維状凝集体を示すTEM画像。B) 凝集ペプチドのFTIRスペクトル。C) 凝集ペプチドと結合したときのチオフラビンT蛍光の増加（倍数変化）（N=3）。D) 凝集ペプチド存在下でのコンゴーレッド吸光度（個々のスキャンは補足図2-11参照）。
宿主タンパク質凝集体との干渉
前述したように、選択したペプチドはアルツハイマー病患者38で変化していることが発見された細菌のゲノムに由来する。このラインでは、アミロイドβペプチド（Aβ）の凝集プロセスを阻害する能力も研究したかった。凝集前ペプチドを可溶性Aβ40とインキュベートし、Th-T蛍光強度に従って凝集動態をモニターした（図3A、補足図12）。半減期（図3B）とラグタイム（図3C）は、試験した10ペプチドのうち9ペプチドで有意な影響を示した。ほとんどのペプチドは凝集速度を速めたが、C10は遅らせた（図3A-Cと補足図12）。全体として、この結果は腸内細菌叢にプリオン様配列が存在し、宿主タンパク質に干渉して病原に寄与する可能性があることを裏付けている11。
図3.
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図3.
腸内細菌叢からの配列の播種と毒性の可能性。
A) 腸内細菌叢由来のアミロイド形成コアによって播種されたAβ40ペプチドの凝集動態（分離動態については補足図12を参照）。すべての速度論的アッセイは3連で4回行った。B)播種凝集動態の半減期（一元配置分散分析、SEM）。C)播種凝集動態の遅相（一元配置分散分析、SEM）。D) ラグタイムと播種に用いたアミロイド形成コアの正味電荷との相関。C6を用いない場合、Rは0.95に増加する。E) 神経細胞を分化させたSH-SYS5細胞を10μMのペプチド凝集体とインキュベートし、MTTアッセイで生存率を評価した（N=3；低濃度については補足図16を参照）。エラーバーはSEMである。F) DCFDA/H2DCFDA細胞活性酸素アッセイ。異なるペプチドに4時間暴露した後、蛍光を観察した。棒グラフは陰性対照（Ctrl）と比較した蛍光の倍数変化を示す。コントロールアッセイに対する有意性は、対応のないt検定を用いて計算した（N=3）。
ペプチドの組成とAβ40凝集に対する効果との関係を調べたところ、C6を除いて、ペプチドの正味電荷とラグタイム動態との間に確固とした相関が観察された（図3D）。正電荷が大きいほどAβ40の凝集は速く、負電荷が大きいほど遅い。同様の所見は、pH7で負の電荷（-2.9）を持つAβ49-51に対する阻害ペプチドを調べた研究でも報告されている452,53。
アミロイド形成コアだけでなく、タンパク質全体が線維状凝集体を形成し、Aβ40の凝集速度に影響を与えることを示すために、C4ペプチドを含む親タンパク質（C9L6N5、DNAJドメインを持つタンパク質）も試験した。212アミノ酸からなるこのタンパク質は大腸菌で発現され、その後精製された（補足図15、Methods）。精製されたタンパク質は線維状構造に凝集できることが観察された（補足図13）。その後、Aβ40をあらかじめ凝集させたC9L6N5とインキュベートすると、アミロイド形成コアと同様に凝集速度が加速された（補足図13）。この結果は、アミロイド形成コアだけでなく、これらの配列に由来するタンパク質も線維状凝集体を形成し、宿主分子を播種できることを裏付けている。
ニューロン分化細胞に対する毒性と酸化ストレス
また、腸内細菌叢由来のペプチドが、神経細胞分化細胞（SH-SY5Y）において神経変性疾患に関連する表現型の特徴を誘発するかどうかも評価した（Methods）。細胞培養条件下での安定性を証明した後（補足図14-15）、MTTアッセイを用いて細胞死を誘導する可能性を、DCFDA/H2DCFDAアッセイを用いて酸化ストレスを誘導する可能性を評価した（図3E-F、補足図16）。
MTTアッセイの分析から、正味の電荷が0に近いペプチドは、電荷が高いペプチドに比べてより大きな毒性を示すことが示された（補足図17）。このことは、細胞毒性を防御する上で静電相互作用が果たす役割の可能性を示唆している。極性で電荷を持たないポリペプチドは、膜との相互作用を促進する両親媒性の性質を持つ傾向があり、抗菌ペプチドの場合と同様に、細胞毒性をもたらす可能性がある。すべての結果を考慮すると、これらのペプチドが存在すると、細胞生存率が全般的に70％以下に低下し（図3F）、腸内細菌叢から選択されたアミロイド形成コアには、凝集時に細胞障害を誘発する可能性があることが示された。
酸化ストレステストでは、すべてのケースでH2DCFDA蛍光の増加が見られ（図3F）、10ペプチド中6ペプチドで有意であった。このデータは、ペプチドの細胞毒性（図3E）が、部分的には酸化ストレスに起因することを示唆している。しかしながら、膜の破壊、オートファジーの機能障害、プロテアソームの機能障害など、他のメカニズムも27,56に寄与している可能性は否定できない。
試験したすべてのペプチドの中で、C1とC2の凝集体は特に高い毒性を示し（図3Eと補足図16）、10uMで細胞生存率を30％近くまで低下させた。興味深いことに、C1とC2は、胃がんの病因と関与している2つの液胞化細胞毒素（VacA）の断片である57,58。両者ともP33ドメインに位置しており、このドメインは哺乳類細胞に結合して内在化できるオリゴマー構造を形成するのに必要なセグメントである57,58。注目すべきことに、C1とC2は、その短い長さにもかかわらず、VacAの毒性のかなりの部分を保持している。この結果はまた、C1とC2のプリオン様組成が、親タンパク質のオリゴマー化と毒性の可能性に寄与している可能性を示唆している。
腸内細菌由来のアミロイド形成コアは酵母で機能する
10種類のアミロイド形成コア18,42が生体内でタンパク質の凝集と増殖を引き起こす能力を評価するために（図1E）、我々は一般的でよく知られたフレームワークである酵母プリオンタンパク質Sup35（図4A）を使うことにした53,59,60。その最初の40アミノ酸、核形成ドメイン61,62を除去し、アミロイド形成コアのコレクションに置き換えた（補足データ1）。得られたキメラの逐次解析から、元のSup35と同様の凝集とプリオン様特性が示された（補足データ2）。
図4.
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図4.
酵母における凝集と増殖の解析。
A) Sup35核形成領域（NQ）を腸内細菌叢由来のアミロイド形成コア10個で置換したことを示す図。B) 細胞内凝集体を示す蛍光画像。C) ノンセンス抑制アッセイによる白色／赤色コロニーの代表的画像。D) 分析した各酵母株の[PSI+]の割合。すべてのアッセイは少なくとも3連で行った。いずれもΔNMに関する[PSI+]が有意に多い（≤0.05、一元配置分散分析）。エラーバーはSEM。酵母の表現型の詳細については、補足データ4を参照のこと。
ナンセンス抑制アッセイを用いて、Sup35凝集体（[PSI+]）の形成と伝播を評価した61。この系では、ADE1遺伝子（ade1-14）が赤色色素（アデニン前駆体）の蓄積を引き起こし、Sup35が可溶性の場合（非プリオンコロニー[psi-]）はコロニーを赤色に着色し、不溶性になると白色またはピンク色に着色する（プリオンコロニー[PSI+]）。PSI+]への転換はまれな現象であるため、GPFと融合したSup35のNMセグメントを過剰発現させることで誘導した（補足データ3）；これはプリオンの転換率を高め、細胞内での凝集をモニターしやすくする。陽性および陰性対照として、それぞれ未修飾のSup35（Sup35NM）および最初の40アミノ酸を欠失したSup35（ΔSup35）を発現する細胞を用いた。
顕微鏡分析から、Sup35NMは蛍光が明るい病巣に集中するのに対し、ΔSup35は細胞質全体に均一な分布を示すことが明らかになった（図4B、補足図18）。加えて、腸内細菌叢から予測されるアミロイド形成コアを持つSup35変異体を発現する細胞はすべて、蛍光巣を示す。
一貫して、[PSI+]アッセイでは、Sup35NMでは100％の白色コロニーを示すが、ΔSup35では30％に低下する（図4C-D）。Sup35変異体を発現している細胞の場合、ΔSup35と比較して、全ての細胞で白色コロニー（[PSI+]）の数が有意に増加した（図4C-D）。
全体として、どちらのアッセイもSup35の凝集と増殖を促進する核形成ドメインの重要性を強調している。また、マイクロバイオームから選択されたアミロイド形成コアはすべて、酵母の生体内でSup35の核形成を誘発し、プリオン伝搬を複製できることも示している。
顕微鏡画像をより深く解析すると、Sup35変異体間でコロニーと凝集形態に違いがあることがわかった。PSI+]コロニーの一つの特徴は、その色の安定性であり、これはプリオン様タンパク質が異なる世代を通して凝集したコンフォメーションを維持する能力を示している。我々は、いくつかのSup35キメラが長いリング状の細胞内構造を形成することを観察し（図4B、補足データ4、補足図18）、リング状の形態を持つ細胞が10％以上存在することが、色復帰型コロニーの形成と関連していることを明らかにした。リングフォームは、HSP104シャペロンの断片化活性によって、成熟した点状コンフォメーションへと進行する初期の大きな凝集段階であると提唱されている63,64。私たちの結果と一致するように、長い細胞内線維の形成は、おそらくプリオンの種（プロパゴン）の量が少ないために、安定した[PSI+]が形成されないことと関連しており、一方、点状病巣は効率的な伝達性の[PSI+]の形成と関連している65-67。
Sup35の変異体C1、C2、C4、C7、およびC8は、[PSI+]変換の割合が最も高く、Sup35NMと同様に強固な安定性を示し、復帰コロニーが存在しないことから明らかである。これらのうち、C1、C2、C8は、Sup35NMで観察されたパターンを反映して、複数の蛍光点状病巣も示した（図4B、補足データ4、補足図18）。In vitroでは、SH-5YSYとインキュベートすると、これら3つのアミロイド形成コアは細胞生存率が最も低くなる。このラインでは、最近の研究で、複数の点状病巣の存在がハンチンチンタンパク質のより毒性の高い変異体と関連している61。興味深いことに、C1とC2はヘリコバクター・ピロリ由来の2つの異なる推定VacAのセグメントであり、C8はラクトバチルス・デルブルッキー由来の凝集促進因子のセグメントである（補足表2）。全体として、これらの結果は、これらの推定される細胞外微生物タンパク質に関連した毒性の増強を支持するものである。
バクテリアベースのC-DAGシステムにおける凝集
酵母で発現させたSup35NMキメラと同じセットを、細菌ベースのC-DAGシステムに導入した（図5A）。このシステムでは、CsgAss輸送シグナルにより、細胞外凝集体の形成を測定することでタンパク質の凝集傾向を研究することができる68。重要なことは、細菌内でのタンパク質凝集をシミュレートする手段を提供してくれることである。
図5.
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図5.
バクテリアにおける凝集
A) C-DAGコンストラクトを大腸菌細胞に組み込み、Sup35pキメラを発現させることで細胞外タンパク質凝集体が形成される様子を示す図。B) ImageJを用いたコロニー赤色強度の測定（最大値と最小値の間で正規化）。C3とC6を除く全ての株は、Sup35Mと比較して赤色の有意な増加を示した（一元配置分散分析、N=4）。C) 大腸菌細胞周囲の線維状凝集構造を示すTEM画像。D-H) 大腸菌C-DAGコレクションを与えた線虫N2の認知能力の解析。
細胞外凝集体の形成を検出するため、大腸菌C-DAG細胞をコンゴーレッド（CR）プレート上で培養した。その結果、C4とC5を除くすべての株が強固なシグナルを示し、特にMドメインのみからなるSup35Mが示すシグナルを上回った（図5B、補足図19参照）。また、透過型電子顕微鏡（TEM）で観察したところ、Sup35MとΔSup35を除くすべての株で、細胞を取り囲む大きな線維状の凝集構造が豊富に観察された（図5C）。酵母で観察されたように、これらの所見は、細菌においてもSup35の凝集を促進する核形成コアの重要な役割を示している。
細菌の細胞外線維は連合記憶の喪失を引き起こす
アミロイド線維を形成し、プリオン様様式で伝播することができる腸内細菌叢からの複数の配列が存在することを証明した後、さらに一歩進めて、これらのタンパク質が摂取によって神経変性疾患の表現型を刺激しうるかどうかを調べた（図1E）。これを評価するために、我々は線虫の2つの異なる系統、すなわち実験室での野生型N2（図6）と、Aβ42の汎神経細胞発現を有するアルツハイマー病モデルCL2355（補足図20）の感覚記憶における変化をモニターすることに焦点を当てた。
図6.
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図6.
線虫における認知効果。
A) STAMアッセイの3つの異なる条件を示す図。B) 測定した3つの走化性指標を示すプロット：ナイーブ（N）、学習（L）、記憶（M）。各データ点は400～600匹のワームの3反復に対応する。個々の測定と比較については、補足図22と23を参照。緑の破線はΔSup35（ΔNM）を摂取したときに測定された学習指標を示す。C) 解析したワームの腸顆粒の存在を示す蛍光画像（透過光画像については補足図24を参照）。蛍光強度は腸顆粒の活性を示す。D) 記憶指数と腸顆粒の数の比較。
まず、Sup35NMキメラを発現する大腸菌C-DAGコレクションを動物に与えた（図5A）。次に、餌の存在と化学誘引物質であるブタノン（揮発性臭気物質）を結びつける短期連合記憶アッセイ（STAM）を行った（図6A）。こうして、これらのミミズ69の認知状態を分析することができた。
STAMでは、約400～600匹の飢餓状態のミミズを3つの複製に分け、化学走性アッセイを行う前に3つの異なる条件下に置いた（図6A）。これらの条件には、(i)匂い物質で条件付けしていないナイーブな集団、(ii)条件付け直後にテストした集団（学習指数）、(iii)条件付け1時間後にテストした集団（記憶指数）が含まれる。走化性アッセイ自体は、異なる処理を施した各集団を、ブタノン（走化性誘引物質）を含むスポットと、ワムシが以前に曝露されたことのない化合物であるエタノールを含む別のスポットの間に等距離に配置したプレート上で行った69。
細胞外凝集体を形成する大腸菌C-DAG株が神経変性疾患の表現型を誘導する能力をSTAMアッセイで測定できるかどうかを調べるため、まずN2とCL2355の表現型を比較した（補足図20）。両方の線虫モデルに、Sup35のΔNM変異体またはNM変異体のいずれかを発現する大腸菌を与えた。N2と比較すると、CL2355は常に低い指標を示した。興味深いことに、凝集体を形成する細菌（Sup35NM）を与えたN2は、細胞外凝集体を形成できない細菌（ΔSup35）を与えたCL2355と同様の記憶指数を示した。両者の細菌は同じ遺伝子型であることから、これらの結果は、Sup35NMが産生する細胞外凝集体の摂取が、アルツハイマー病モデルに関連するものと同様の認知障害を野生型動物に引き起こすことを示唆している。さらに、このアッセイは、CL2355の疾患表現型が、Sup35NM細菌を餌に含むと悪化することも示した。
N2における神経変性表現型を測定するSTAMアッセイを検証した後、腸内細菌叢由来のアミロイド形成配列を含むSup35NM変異体を発現する大腸菌を動物に与えた。コントロールとして、まず条件付けしていないワーム（ナイーブ）を比較したところ、予想通り、Sup35NMを与えた動物と細胞外凝集塊を形成する菌株を与えた動物の間に有意差は観察されなかった（補足図21）。このことは、事前の条件付けがなくても、すべての動物が化学誘引物質に対して同様の反応を示すことを示している。しかしながら、学習アッセイ（図4E）では、C1、C2、C5、C6、C10を発現する細菌を与えられた動物は、ΔSup35またはSup35NMで測定された指数の半分以下を示した。このことは、これらの細菌株とその細胞外凝集体の消費による学習能力の低下の可能性を示唆している。
10個のメモリーアッセイのうち8個は、ΔSup35と比較して走化性指標が有意に低下した（図6Bおよび補足図22）。このことは、腸内細菌叢から選択されたアミロイド形成ペプチドのほとんどが凝集体の形成を促進し、それを摂取するとワームの認知能力の低下につながる可能性があることを示唆している。すべてをまとめると、これらのアッセイは、異なる凝集体がミミズの認知能力に異なる影響を与える可能性も示している（図6Bと補足図23）。この点で、学習により顕著な影響を与えるもの（C1、C2、C5、C6、C10）もあれば、主に記憶に影響を与えるもの（C7、C8、C9）もある69。興味深いことに、認知能力に関するこれらの解析は、微生物叢のアミロイド生成配列が認知機能に及ぼす広範囲な影響を浮き彫りにしている。
凝集体の性質が神経変性の重症度を規定する
認知機能低下の原因を分析するために、我々は腸のリソソーム関連小器官である腸顆粒に注目した70,71（図6C、補足図24）。これらの小器官は消化と栄養貯蔵に関与し、摂取した毒素や病原体を隔離・中和して損傷を防ぐことができる72-74。また最近では、ストレス応答やハンチントン病モデルにおけるタンパク質凝集の抑制にも関係している75。
腸顆粒は自家蛍光を発し、その強度は酸化ストレスや細胞障害によって変化する76,77。我々の場合、大腸菌C-DAGコレクションを摂取すると、バイオフィルム欠損変異体である大腸菌OP50株を摂取した場合と比較して、腸顆粒の数が増加し（補足図25）、その蛍光強度も増加した（補足図26）78。この観察は腸内顆粒活性の上昇を示しており79、大腸菌C-DAG菌がOP50株よりも消化を妨げている可能性を示唆している。
腸顆粒の数を記憶指数と比較すると、記憶指数が低いワムシは腸顆粒の数も多いことが観察された（図6D）。この結果は、大腸菌C-DAGの摂取による腸顆粒への成分の蓄積が、記憶喪失の重症度に関係している可能性を示唆している。しかし、この効果はC4を摂取したワムシではそれほど検出されず、有意な認知効果は認められなかった。
同様に、われわれの結果は、著しく淡い赤色を生じたC5を除き、強烈に赤いコロニーを形成した大腸菌細胞を摂取したワームは、より低い記憶指数を示したことも明らかにした（補足図27）。さらに、酵母の豊富な環構造の形成に関連するタンパク質は、大腸菌で発現させ線虫に摂取させると、より低いメモリー指数を示した（補足図28）。
ここでは、3つの異なるアッセイ法（腸顆粒の数、赤いコロニーの強度、酵母のリング状凝集体）と記憶喪失の測定値の間に、並行した進行が観察された（図4H、補足図27-28）。大腸菌コロニーの赤色の強度は、細胞外凝集体のCR結合能と関連している。リング状構造物は病巣の前駆体であり、その断片化の障害は細長い構造物の蓄積と伝播性の悪さに関連している65,67,80。同様に、腸顆粒の蛍光の増加は、これらのオルガネラの活性の亢進と関連している79。これらの3つのアッセイを総合すると、凝集体の特異的な性質がミミズの認知表現型と関連している可能性が示唆される。ひとつの仮説は、CR強度によって示される凝集体の数に関連している可能性がある。これはまた、酵母や腸顆粒の結果から示唆されるように、これらの凝集体の分解・除去の困難さとも関連しているかもしれない。我々は、弾力性のある凝集体の数が多いほど、ミミズの連合記憶が減少する可能性があるという仮説を立てた。
われわれの研究は、腸内細菌叢の中に、線維状凝集体を形成し、宿主タンパク質に干渉し、プリオン様様式で増殖し、宿主の認知能力に影響を与える可能性のある配列が存在することを示している（図1E）。重要なことに、我々の計算機解析は、これらの配列の多くが、神経変性疾患における潜在的な意義があるにもかかわらず、謎のままであることも明らかにしている（補足図S1）。さらに、認知機能への影響を解析した結果、異なる配列から形成された凝集体が、連想学習や記憶に異なる影響を与えることが明らかになった。このことは、これらの有害な影響のメカニズムを理解するために、さらなる実験を行うことの重要性を強調している。このような観点から、今回の結果から、これらの凝集体を分解・断片化する能力の違いが、病気の表現型の悪化に関係しているのではないかという仮説が導かれた。従って、今回得られたデータは、微生物と宿主の関係に対する理解を深めるだけでなく、神経変性疾患の治療における新たな標的の可能性を明らかにするものである。
研究方法
アミロイド形成コアを持つプリオン様タンパク質のスクリーニング
腸内細菌ゲノムにコードされているタンパク質は、NIH Human Microbiome Project20,21から入手した。重複エントリーを削除するためにリストを精製した後、457の異なる生物名と1,468,778のタンパク質配列を同定した。このタンパク質のコンパイルは、3つの異なるアルゴリズムを用いてプリオン様タンパク質を同定するためのスクリーニングを受けた： PAPA17、PLAAC16、pWALTZ18である。これらのアプローチは、プリオン様ドメインを持つタンパク質を探し、それぞれにプリオンとして振る舞う確率を示すスコアを割り当てる。
先行研究と我々の専門知識13に基づき、我々は3つの異なるアルゴリズムの基準を組み合わせてプリオン様タンパク質の可能性を同定した。具体的には、PAPAスコアの閾値を0.05とし、プリオン凝集傾向が陽性であることを示した。さらに、PLAAC PRDスコアが0以上であれば、凝集プロセスを開始することができる連続的なドメインが存在することを示すと考えた。その後、プリオン様配列をpWALTZスコアに従ってランク付けし、実験的検証のために10個の候補を選んだ。このスコアは、21アミノ酸配列がアミロイド形成コアとして働き、タンパク質全体の凝集を引き起こす可能性を評価するものである（補足表1）。pWALTZアルゴリズムは、以前にPAPA13によって予測された80アミノ酸領域に適用された。
タンパク質のアラインメントとコンセンサス配列
10種類のアミロイド形成コア候補とコンセンサス配列の間のアラインメントは、配列可視化用のUnipro UGENEソフトウェアv43.081を用いて得られた。
PSORTbを用いたタンパク質位置予測
タンパク質の位置予測にはPSORTb v3.082を用いた。これにより、タンパク質候補の潜在的な位置を予測することができた。このアルゴリズムは、生物の種類として「Bacteria」を選択し、各生物について適切なグラム染色を選択して実行した。最良のLocalization Scoresは、Supplementary Table 2の作成に使われた。
ペプチドの調製
すべてのサンプルは低タンパク質結合微量遠心チューブ（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA）で調製した。
アミロイド形成コアは、Universitat Pompeu Fabra (UPF)のDepartment of Experimental and Health SciencesのPeptide Synthesis Facilityから凍結乾燥したものを入手した。その後、ペプチドを1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）に可溶化し、異なるアリコートに分けた。その後、室温でヒュームフード下でO/N乾燥させた。その後、アミロイド凝集体の形成に最適な条件を見つけるために、異なる緩衝液と濃度をテストした（補足表1）。最良の結果は、ペプチドをDMSOで再溶解して単量体を維持し、50mMリン酸緩衝液（PB）pH7.4で希釈することで得られた。
合成Aβ40（DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV-NH2）はGenScript社（オランダ、Rijswijk）から購入した。ストック溶液は、1mgのペプチドを最終濃度250μMになるように溶解し、20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.04％NH3、NaOHを加えて最終pHを11に調製した。その後、スイープモードなしで10分間超音波処理し（Fisherbrand Pittsburgh, PA, USA, FB15051）、必要な時まで-80℃で保存した。毒性実験と播種実験では、ペプチドを24時間RTで凝集させた。
コンゴーレッドのタンパク質凝集体への結合
凝集ペプチドへのコンゴーレッド（CR）結合は、Cary 300分光光度計（Varian）を用いて400-650 nmの吸光度スペクトルを取得することにより分析した。アッセイは、総容量150μL（凝集ペプチドサンプル15μL、CR 200μM15μL、50mM PB pH 7.4120μL）で行った。色素を添加する前に、すべてのサンプルを超音波バスで5分間超音波処理した。色素添加後、測定前に室温で5分間インキュベートした。ペプチドスペクトルは、ペプチドを含まないCR単独のスペクトルと比較した。緩衝液の干渉を避けるため、分析前にすべての測定値から緩衝液の吸光度スペクトルを差し引いた。CR の最大吸光度ピークが高波長側にシフトした場合、結果は陽性とみなされる。
チオフラビンTの結合および凝集速度論
チオフラビンTは5mMのストックとしてMilli-Q水に溶解し、0.2μmのフィルターでろ過し、0.5mMに希釈し、使用前に-20℃で保存した。凝集動態のためのThT蛍光は、プレートリーダー（TECAN Infinite+ NANO）のボトムオプティクスを用い、440 nmの励起フィルターと480 nmの発光フィルターを用いて、10分ごととペプチドのThT結合の終点で測定した。サンプルは、平底の黒色非結合96ウェルプレート（Greiner bio-one）に入れた。ウェルあたり合計100μLのサンプルを加えた。各条件は3連で測定した。
ThT結合実験では、最終濃度10μMのペプチドを72時間凝集させた後、ペプチドの蛍光を測定した。その後、測定値を陰性対照と比較し、ThT蛍光強度の1倍変化を求めた。
播種実験では、最初はpH11のAβ40ペプチドストックをリン酸ナトリウム緩衝液20mMと100mM NaClで25μMに希釈し、5分間の超音波処理の後、対応する凝集前ペプチドを2.5μMで加えた。Aβ40とペプチドを含まないコントロール、およびAβ40とペプチドの両方を含まないコントロールも、同じ条件で、同じ容量の対応する緩衝液を加えて調製した。すべてのサンプルとコントロールは3連で調製した。ウェル内のpHは、凝集過程を通してpHが安定していること、および異なる条件のpHに差がないことを確認するため、実験の開始時と終了時の両方で測定した。ThTは最終濃度20 mMになるように添加した。凝集反応は37℃、静止条件下で行った。独立した4反復を行った。t1/2は、ある条件下で、最終蛍光シグナルの50%に達するのに必要な時間である。ラグフェーズは、最終蛍光の10%に達した時点を終了とみなして計算した。各条件について、それぞれ3つのテクニカルレプリケートで4つの実験的複製を測定した。
透過型電子顕微鏡
凝集ペプチドまたは大腸菌（REF）の10μlサンプルをカーボンコート銅グリッド上に置き、1分間インキュベートした後、ワットマン紙で乾燥させた。グリッドを蒸留水で洗浄し、2%(w/v)酢酸ウラニルで1分間ネガティブ染色し、乾燥させた。透過型電子顕微鏡（TEM）JEM-1400（日本電子、東京、日本）を用い、加速電圧80keVで顕微鏡写真を得た。
赤外分光法
FT-IR スペクトルは、Bruker Tensor 27 FT-IR spectrometer (Bruker Optics Inc) と Golden Gate MKII ATR アクセサリーを用いて収集した。各スペクトルは、1400-1800cm-1の範囲内で4cm-1のスペクトル分解能で測定された256の独立したスキャンで構成されている。ペプチドの赤外スペクトルを得るために、溶媒のスペクトルをサンプルから差し引き、大気中の水蒸気の寄与を補正した。各実験は3回繰り返した。その後、結果を正規化し、2階微分を計算した。すべてのデータ取得と解析はOPUS MIR Tensor 27ソフトウェアで行った。
In vitroでのペプチドのSR-μFTIRは、ALBAシンクロトロン（スペイン、カタルーニャ）のMIRASビームラインで、倍率36倍の対物レンズを装備したHyperion 3000 MicroscopeとVertex 70スペクトロメーター（Bruker）を用いて行った。測定範囲は650-4000cm-1で、スペクトルの収集は透過モードで4cm-1分解能、10μm×10μmのアパーチャー寸法で行われ、128-256スキャンで加算された。ゼロフィリングは高速フーリエ変換（FFT）で行い、最終スペクトルでは2cm-1ごとに1点が存在するようにした。バックグラウンドスペクトルは、CaF2ウィンドウのクリーンエリアから15分ごとに収集した。水銀-カドミウム-テルル化物（MCT）検出器を使用し、顕微鏡と分光計は窒素ガスで連続的にパージした。
フーリエ変換赤外（FTIR）スペクトル分析
スペクトルは2つの異なる方法で取得した：(a) 所定のサンプル領域で、各サンプルについて少なくとも50個の単一細胞のスペクトルを取得；(b) 最小50μm×50μm、ステップサイズ6μm×6μmのマップ。単一の独立した細胞のフーリエ変換赤外（FTIR）スペクトル、異なる細胞マップからのスペクトル、および細胞を含まないアミロイド凝集体の独立したスペクトルを、Thermo Omnic 7.1（Thermo Scientific, Inc.）およびOpus 7.5（Bruker） ソフトウェアを用いて解析した。低S/N比を示すスペクトルは除去した。データ処理では、ベースラインの寄与を除去するため、9点フィルタと多項式次数2のSavitsky-Golayアルゴリズムを用いてスペクトルの2次微分を計算した。Unscrambler Xソフトウェア（CAMO Software, Oslo, Norway）を使用して、データセットのPCAを実行した。PCA解析はスペクトルの2次微分に対して適用された。PCA分析のために、二次導出後に単位ベクトルの正規化を適用した。主成分(PC)は、平均中心化されたデータに対して非線形反復部分最小二乗法(NIPALS)アルゴリズムを用いて計算された。PCA 手法では、個々の変数に相対的な重み付けをすることができるので、推奨値として、すべての変数（650-4000 cm-1 領域の異なる波数）に一定の値（1.00、等しい重み）を割り当てた。以下の注目ピークについて比を計算した： アミドIのβシート構造については1627 cm-1（A1627と記す）、アミロイドペプチドと細胞の両方が（微分スペクトルにおいて）ゼロとは明らかに異なるシグナルを持つ波長として1665 cm-1（A1665と記す）、 1740cm-1はν(C傤O)(カルボニル)(A1740と記す)、2925cm-1はCH2非対称伸縮振動(A2925と記す)、2960cm-1はCH3非対称伸縮振動(A2960と記す)。微分スペクトルの1657 cm-1のペプチド単独のシグナルはゼロに近いので（図SX）、1665 cm-1の波長を選ぶと、ペプチドの凝集をA1627/A1665の比として推定できることを強調しておきます。比の計算、t検定分析、グラフ表示にはOrigin 9.1ソフトウェアを使用した。
細胞毒性アッセイ
神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞は、10%(v/v)熱不活性化ウシ胎児血清および1%(v/v)ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地、グルタミン酸添加F-12(DMEM/F12 Glutamax)で培養した。細胞は75cm2の細胞培養フラスコ内で37℃、5% CO2に保たれた。分化培地は、DMEM/F-12 Glutamaxに2.5%の不活化FBSと10μMのレチノイン酸を添加したものであった。分化は形態学的評価により顕微鏡的にモニターした。
細胞毒性アッセイでは、細胞を96ウェルプレートに播種し、1×104細胞/ウェルの密度で処理した。異なるペプチドを決められた濃度（10-0.25μM）で添加し、24時間培養後、細胞生存率をMTTアッセイで検出した。培地を除去した後、10μLの3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) solution (5 mg/mL)と培地100μLを各ウェルに加え、37℃で4時間インキュベートした。その後、各ウェルに150μLのジメチルスルホキシドを加え、上清を捨てた後、ホルマザンを溶解した。吸光度は、プレートリーダー（TECAN Spark）を用いて波長580 nmで定量した。各pHについて、データは非処理細胞に対する生存率のパーセンテージで表した。非処理細胞は、対応するpHで同量の緩衝液を含む培地で培養したが、Aβ40も対応するペプチドも含まなかった。
活性酸素アッセイでは、細胞を96ウェルプレートに播種し、1×104細胞/ウェルの密度で処理した。異なるペプチドを10μM添加し、4時間培養後、活性酸素をDCFDA/H2DCFDAアッセイで検出した。
発現と精製
C9L6N5（C4）の全塩基配列とC末端Hisタグを含むpET21bベクター（Novagen）を大腸菌BL21に導入した。菌はLB中で37℃で培養した。OD600が0.5の時点でIPTG 1mMを添加し、22℃でO/N培養した。その後、細胞を遠心分離し、ペレットを5mMのイミダゾール、RNAse A、DNAse Iを加えたPBSに懸濁し、超音波処理した。そして溶解液を超遠心し、上清をHis-Trap FF（Cytiva、バルセロナ、スペイン）カラムに加えた。カラムはイミダゾールバッファーを含むPBSのグラジエントで洗浄され、イミダゾールの最大濃度は200mMに達した。その後、SDS-PAGEゲルとウェスタンブロットでタンパク質の純度を評価し、目的のタンパク質であることを確認した。
精製したサンプルをSDS-PAGEゲルで二重に分離し、一方をクマシーブルーで染色し、もう一方をニトロセルロース膜に転写した。転写後、膜を4%ウシ血清アルブミンでブロックした。次に、膜を抗Hisウサギ一次抗体（Thermo Scientific, Massachusetts, United States）とインキュベートした（1:1000）。二次抗体は抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（Bio-Rad）（1:3000）であった。反応はECLキット（Thermo Scientific）で現像した。
酵母株とノンセンス抑制系
このプロジェクトで用いた酵母株は、74D-694 MATa, ade1-14UGA, trp1-289, his3Δ-200, ura3-52, leu2-3,112 sup35::loxP [pYK810])（REF）由来である。N末端Sup35p修飾キメラ（最初の40残基が21残基のペプチドに置換されている）は、HIS3選択マーカーを持つセントロメアpUCK1620プラスミドにコードされている。
我々のアッセイでは、完全長Sup35バージョンとそのペプチド含有キメラ（図3A）は、必須ターミネーター因子活性を維持するために、それぞれのプロモーター下で生理的レベルで構成的に発現される。凝集を促すために、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下で、GFPと融合したNおよびMドメインのみの追加コピーを一過性に過剰生産する。この戦略により、必要な時にプリオン転換を誘導し、同時に蛍光顕微鏡を用いてタンパク質の凝集をモニターすることができる。Sup35pの初期40残基とGFPと融合したNMドメインは、異なる選択されたアミロイドコアに置換された（図3A）。
酵母における蛍光病巣の検出
SD培地プレート上で3-5日間増殖させた酵母細胞を、グルコースの代わりにラフィノースを用い、ヒスチジンもウラシルも含まない合成培地（SRaf -His, -Ura）に接種し、その後30℃で3日間激しく攪拌しながら増殖させた。NM-GFPキメラの発現を誘導するため、GFPアッセイの1日前に、酵母を（グルコースの代わりに）2％ガラクトースと2％ラフィノースを含む合成培地に接種した（これらはGAL10プロモーター下にある）。実験当日、96ウェルプレート上で蛍光顕微鏡（EVOS M5000）を用いて細胞を観察し、記録した。
ノンセンス抑制アッセイ
このアッセイでは、2％グルコースを炭素源とするSD -His -Ura培地で、30℃で3日間、前培養を開始した。この3日間のインターバルは、アッセイを開始する前に発現を抑制する役割を果たす。その後、酵母細胞をPBS緩衝液で洗浄し、2％ガラクトースと2％ラフィノースを含む新鮮な培地を接種してNMGFP融合体を発現するように誘導し、30℃で2日間培養した。すべての培養物をOD600が1になるように調整し、1/1000希釈で¼YPDプレート（1%バクトイーストエキス、2%バクトペプトン、2%グルコース、2%バクトアガー）にプレーティングし、30℃で4～5日間培養した。この培養後、プレートを4℃に移してさらに5～7日間培養し、その後、赤コロニーと白コロニーの表現型を調べた。画像は実体顕微鏡Leica MZFLIII（Leica Microsystems GmbH, Mannheim, Germany）を用い、8倍の倍率で各プレートを撮影した。すべてのアッセイは最低でも3連で行い、コロニー数はプレートあたり200を超えた。各アッセイでコロニーカウントを行い、陰性対照との比較のためにt-student分析を行った。赤色のコロニーは[psi-]表現型を示し、白色のコロニーは細胞間の効率的な伝達を特徴とする安定した[PSI+]表現型を示した。ピンク色のコロニーは不安定な[PSI+]表現型を示すものとして観察され、これは細胞間の伝達が低いこと、および／またはSup35pの凝集型と可溶型の間の復帰が高いことなどの要因によるものであった。
細胞外凝集体を検出するためのコロニーカラー表現型アッセイ
Sup35pキメラの発現と細胞外凝集のために、我々は大腸菌VS39株（Ann Hochschildの好意により提供された）を利用した。この菌株はcurli遺伝子（csgA、csgB、csgC）を欠損し、カナマイシンに耐性で、pVS76というpACYC由来のプラスミドを含んでいる。このプラスミドは、IPTG誘導性プロモーターによって制御される外膜カリータンパク質CsgGの合成を制御する。さらにVS39は、構成的に転写されるcat遺伝子を持ち、クロラムフェニコールに対する耐性を提供する。
Sup35NM遺伝子は、インタクトなSup35NMを保有するpEXPORTプラスミドpVS72を改変することによって得られた。このプラスミドをVS39株に形質転換した。最終構築物の詳細な配列情報は、補足資料に記載されている。この研究では、Sup35培地領域（Sup35M）遺伝子をコードするpEXPORTプラスミドpVS105も組み込んだ。
様々なSup35p変異体の細胞外凝集体形成能を測定するために、細菌細胞をCR誘導プレート上にスポットした。これらのプレートは、100 µg/mlカルベニシリン、25 µg/mlクロラムフェニコール、0.2% w/v L-アラビノース、1 mM IPTG、および10 µg/mlコンゴーレッド（REF）を添加したLB寒天培地からなる。22℃で5日間のインキュベーション後、CRの結合の程度を評価するため、プレートをイメージングに供した。定量的データを得るために、ImageJを用いて四重反復サンプルから赤色強度値を導出し、Brunquell, et al. 201875のようにSup35ΔNMに対して正規化した。
線虫系統と維持
本研究では、Caenorhabditis Genetics Center（CGC）から入手した野生型N2株を利用した。線虫は、餌として大腸菌OP50を播種した標準的な線虫増殖培地（NGM）プレート上で20℃の温度で維持した。線虫集団を同期化させるため、5%次亜塩素酸処理に供した後、餌を与えずにM9緩衝液中で80rpmで24時間回転させるという従来の方法を採用した。この手順の後、若成虫の段階に達するまで、各群をそれぞれの細菌株とともに培養した。
線虫ブタノン関連学習アッセイ
ブタノン関連学習アッセイは確立された方法（REF-6）に従って行った。若齢成虫をM9で洗浄し、15mLのコニカルチューブに重力沈降で集め、バクテリアを除去した。一部の動物は、ナイーブ条件（CI (naïve)）をアッセイするための走化性プレートに直ちに移した。残りはM9で1時間飢餓させた。飢餓後、動物は対応する大腸菌株を播種し、絶対エタノールで希釈した10%ブタノンを2μL滴下したNGMプレート上で1時間コンディショニングした。
コンディショニングしたワーム（コンディショニング直後、学習指数（LI）、または1時間の飢餓後、記憶指数（LI））をM9で洗浄し、走化性プレートに移した。走化性アッセイには、10cmの播種していないNGMプレートを用い、プレートの底と両側の3つの円（それぞれ直径1cm）に印をつけた。そして、左側のスポットには1Mのアジ化ナトリウム1μLと10%のブタノン1μLを加え、右側のスポットには同量のアジ化ナトリウムと純粋なエタノールコントロールを加えた。動物は一番下のスポットに入れた。1時間後、ブタノンとエタノールのスポット、および元のボトムスポットにいるワムシの数を数えた。各走化性アッセイは3連で行い、約400-600匹のワムシを含んだ。
走化性指数（CI）を算出するための標準的な式は以下の通りである：
CI = [(ブタノンゾーンのワムシ数) - (エタノールゾーンのワムシ数)] / (総ワムシ数) / （総ワムシ数）
条件付けしていないワムシで、CI（ナイーブ）を計算した：
CI（ナイーブ）＝［（試験ブタノンゾーンのワムシ数）-（エタノールゾーンのワムシ数）］／（ワムシ総数）。/ （総ワムシ数）
条件付け直後に、学習指数（LI）を以下のように計算した：
学習指数 (LI) = CI (条件付け直後) - CI (ナイーブ)
そして、条件付け後に1時間の飢餓を行った後、記憶指数（LI）を次のように計算した：
記憶指数（LI）： 記憶指数（LI）：CI（条件付け・飢餓後）-CI（ナイーブ）。
線虫腸顆粒の自家蛍光検出
EVOS顕微鏡（EVOSTM M5000 Imaging System）を用いて、緑色蛍光タンパク質（GFP）フィルターと透過フィルターを用いて線虫の自家蛍光画像を撮影した。画像は走化性アッセイで使用したものと同じ処理をした動物から取得した。腸顆粒を可視化するために、蛍光強度が最も高い領域に対応する最初の2つの腸リングを中心に画像を配置した。その後、ImageJソフトウェアを用いて画像解析を行った。解析のために選択した領域は、生殖腺が存在しないように注意深く選び、潜在的な干渉を緩和した。
統計
統計は、GraphPad PRISM 8ソフトウェアを用いて、得られたデータに対応する統計解析を実現した。一般に、データは普通の一元配置分散分析（One-way ANOVA）で分析された。統計学的有意性はp値が0.05より小さいこととし、データは平均値±SEMで示した。
著者貢献
NSGが研究アイデアを考案し、研究デザインを作成した。MRF、JSC、ADM、MSGは本研究のための一次データを収集し、まとめた。NSG、MRF、JSCが統計解析を行い、結果を解釈した。NSG、MRF、JSCは原稿の初稿を執筆した。NSG、MRF、JSC、ADMは研究方法の改良に協力した。NSGとMRFは研究プロジェクトを通して監督と指導を行った。
利害関係
著者らは、競合する利害関係はないと宣言している。
資金提供
本研究は、Ministerio de Ciencia e InnovaciónよりRYC2019-026752-IおよびPID2020-117454RA-I00/AEI/10.13039/501100011033、L'Oréal-UNESCO For Women in Science Programmeより助成を受けた。
謝辞
以下の方々に感謝の意を表します：
Ann HochschildとPadraig Deighanには、SV39大腸菌株とプラスミドpVS105とPVS72を提供していただいた。
74D-694 S. cerevisiae株を快く提供してくれたRafael Giraldo。
Antonela Lavatelli：基本的な実験的問題の解決に協力してくれた。
Julian CerónとAntonio Miranda-Vizueteには、問い合わせに貴重な回答をいただいた。
Anna Laromaine：線虫実験室の専門知識を共有し、初期ピッカーの構築に協力してくれた。
Esther Dalfo：線虫実験室の要件について教えていただき、線虫に関する連絡先やデータベースに関する貴重な情報を共有していただいた。
Gian G. Tartaglia：プロジェクト開始のために計り知れない支援をしてくれた。
Nuria Benseny：マイクロFTIR実験に協力してくれた。
Josep Cladera：調査に関する彼の反応と議論に感謝する。
線虫N2と大腸菌OP50は、NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440)の助成を受けたCGCから提供された。
μFTIR実験はALBAシンクロトロンのMIRASビームラインでALBAスタッフの協力を得て行った。
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2023年10月20日掲載
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