宿主と環境因子がヒトの生涯にわたって上気道微生物叢と呼吸器の健康を形成する
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宿主と環境因子がヒトの生涯にわたって上気道微生物叢と呼吸器の健康を形成する
オープンアクセス掲載:2024年08月01日DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.07.008
ハイライト
-ヒトの生涯に渡る鼻咽頭（NP）および口腔微生物叢のアトラス
-NP微生物叢のバイオマス、多様性、組成は年齢と強く関連している
-ライフスタイル因子は口腔微生物叢に、環境はNP微生物叢に関連する。
-NP微生物叢は呼吸器症状および肺炎の（最近の）既往歴と関連する。
まとめ
ヒトの生涯における上気道（URT）微生物叢の正常変動と、それらが宿主、環境、健康とどのように関連しているかについての理解は限られている。我々は、16S-rRNA配列決定を用いて、集団横断研究（PIENTER-3）に参加した0～87歳のオランダ人3,160人の唾液（10歳未満）／口腔咽頭（10歳以上）3,104サンプルおよび鼻咽頭2,485サンプルの微生物叢を研究した。微生物叢組成は年齢と強く関連しており、特に鼻咽頭では小児期から青年期にかけて成熟が見られた。微生物叢組成と宿主／環境因子および健康転帰との間には、ニッチおよび年齢特有の明確な関連が認められた。なかでも、社会的相互作用、性別、季節が上咽頭微生物群集と関連していた。対照的に、口腔微生物叢は抗生物質、タバコ、アルコールの使用との関連が強かった。我々は、環境と健康との関連における生涯にわたる口腔内細菌叢のアトラスを提示し、今後の研究のためのベースラインを確立する。
グラフィカル抄録
キーワード
はじめに
ヒトの健康は、人体内および人体上に存在する生理的に活性な微生物群集の影響を強く受けている。腸内細菌叢に比べるとあまり研究されていないが、上気道（URT）微生物叢は、呼吸器感染症に対する感受性や重症度など、（呼吸器系の）健康転帰と関連している、
,
喘息などの慢性呼吸器疾患
および慢性閉塞性肺疾患（COPD）、
および心血管疾患。
呼吸器は生態学的に異なる複数のニッチから構成されており、多様な微生物群集に多くの生息環境を提供している。これらの微生物群集は、粘膜免疫系と相互作用し、有害微生物に対するバリアとなることで、呼吸器系を保護する重要な役割を担っている。
,
,
URTの微生物叢は下気道へのゲートキーパーと考えられており、有害な病原体の侵入を防ぎ、呼吸器系を健康に保つために重要である。
URTは外部環境に直接さらされており、宿主と環境の両方の特性の変化に絶えず対応しなければならない。したがって、一般集団におけるURT微生物叢の構成と、これらの因子が健康に及ぼす影響を理解することは、微生物叢が急性および慢性の呼吸器疾患にどのような影響を及ぼし、あるいは予防しうるかについての理解を深める上で不可欠である。
これまでのところ、人工呼吸器内細菌叢の研究は主に乳幼児を対象としており、その結果、微生物叢の発達を支配する因子、例えば出生様式
や摂食形態などである、
,
であり、幼少期のマイクロバイオームの発達と健康上の転帰との関連性が指摘されている。
,
急性感染症に罹患した幼児を対象とした研究でも、URTマイクロバイオータと下気道感染症（の重症度）との間に明確な関連があることが判明している。
,
URT細菌叢が小児期の健康にどのような影響を及ぼすかについてはある程度わかっているが、これらの関係が成人になってどのように持続するのか、あるいは変化するのかは不明である。利用可能な限られた研究では、成人の尿路内細菌叢と社会的接触などの因子との関連を示している
,
やタバコの使用などの因子との関連を示した研究は限られている。
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それでもなお、生涯を通じてのURT微生物叢の自然変異や、その後の宿主、環境、健康特性との関連性については、理解が不足している。ここでは、2016/17年にオランダで実施された全国横断研究の一環として収集された、オランダの人口（0～87歳）を代表する3,160人の鼻咽頭および口腔サンプルを調査した。
我々は、(1)生涯にわたるオランダの一般集団のURT微生物叢の特徴と、(2)宿主、環境、健康特性との関連を明らかにすることを目的とした。最終的に、本研究は、URT微生物叢組成の自然変動の要因およびこれが健康転帰にどのように関連するかに関する今後の研究の参考となる。
研究結果
研究集団の特徴
2016年1月から2017年12月にかけて、3,175人からなるオランダの集団ベースのサンプルから、URT微生物叢（上咽頭および口腔サンプル）を横断的に特徴付けた。実用的な理由から、10歳未満の人からは唾液サンプルを、10歳以上の人からは口腔ニッチを代表する口腔咽頭サンプルを得た。鼻咽頭サンプルは全年齢で入手した。前処理と品質管理の結果、5,930検体（94％）のうち、3,160人（口腔3,104検体、上咽頭2,485検体）から得られた5,589検体のURT検体が、さらなる解析の対象となった。
研究集団には、乳児319人（0歳：10％）、小児611人（1～14歳：19％）、青年／成人2,230人（図1A；15歳以上：71％）が含まれていた。2,429人（77％）について、上咽頭と口腔の両方から一致する検体が得られた。参加者は全国に居住し（図1B）、年齢は0～87歳（平均36歳）、51％が女性で、86％がオランダ生まれであった（表1）。合計82％が健康状態は良好または非常に良好であった（表S1）。宿主、環境、健康の特徴を分類した（図1C；一般、季節・症状、家庭・接触者、社会経済的状態・生活様式、薬の使用、病気、食事、幼少期）。
図1標本集団とデータ選択の概要
表1サンプルの前処理後に保持された参加者の特徴
年齢カテゴリー
0歳 1～4歳 5～9歳 10～14歳 15～24歳 25～39歳 40～64歳 ≧65歳 全年齢
n= 319n= 264n= 128n= 219n= 444n= 332n= 784n= 670n= 3,160
女性 151 (47%) 133 (50%) 64 (50%) 111 (51%) 238 (54%) 173 (52%) 409 (52%) 319 (48%) 1,598 (51%)
オランダ生まれ
315 (99%) 256 (97%) 110 (86%) 203 (93%) 422 (95%) 292 (88%) 608 (78%) 525 (78%) 2,731 (86%)
教育レベル
低 43 (15%) 46 (18%) 15 (12%) 49 (24%) 169 (41%) 45 (15%) 271 (37%) 364 (56%) 1,002 (34%)
ミドル 112 (38%) 105 (41%) 54 (45%) 73 (36%) 204 (49%) 125 (41%) 237 (33%) 130 (20%) 1,040 (35%)
高 138 (47%) 103 (41%) 51 (42%) 82 (40%) 44 (11%) 136 (44%) 220 (30%) 160 (24%) 934 (31%)
喫煙状況
受動喫煙者（屋内） N/A N/A N/A 36 (8.9%) 8 (2.7%) 26 (3.8%) 25 (3.9%) 126 (6.1%)
過去に喫煙したことがある N/A N/A N/A 22 (5.4%) 67 (22%) 270 (39%) 334 (52%) 693 (34%)
現役喫煙者 N/A N/A N/A 90 (22%) 58 (19%) 117 (17%) 65 (10%) 330 (16%)
アルコールを飲む
286 (69%) 241 (81%) 525 (75%) 476 (74%) 1,528 (74%)
サンプリングの季節
夏 58 (18%) 64 (24%) 38 (30%) 40 (18%) 89 (20%) 69 (21%) 195 (25%) 150 (22%) 703 (22%)
秋 77 (24%) 70 (27%) 30 (23%) 77 (35%) 113 (25%) 90 (27%) 166 (21%) 158 (24%) 781 (25%)
冬 101 (32%) 53 (20%) 18 (14%) 40 (18%) 119 (27%) 67 (20%) 165 (21%) 139 (21%) 702 (22%)
春 83 (26%) 77 (29%) 42 (33%) 62 (28%) 123 (28%) 106 (32%) 258 (33%) 221 (33%) 972 (31%)
最近1ヵ月間の呼吸器症状
鼻水 206 (66%) 181 (69%) 53 (43%) 105 (49%) 276 (64%) 174 (53%) 276 (36%) 228 (34%) 1,499 (48%)
咳 140 (45%) 128 (49%) 33 (26%) 55 (25%) 161 (38%) 84 (26%) 188 (24%) 164 (25%) 953 (31%)
発熱 114 (36%) 93 (36%) 17 (14%) 12 (5.6%) 42 (9.9%) 29 (9.0%) 48 (6.3%) 34 (5.2%) 389 (13%)
過去3年間に肺炎にかかったことがある
肺炎1回 N/A N/A N/A 11 (2.5%) 17 (5.3%) 45 (5.9%) 49 (7.4%) 122 (5.6%)
複数の肺炎 N/A N/A N/A 8 (1.8%) 8 (2.5%) 22 (2.9%) 21 (3.2%) 59 (2.7%)
過去3ヵ月間に抗生物質を使用
22 (9.4%) 21 (11%) 5 (5.3%) 7 (4.3%) 26 (9.1%) 18 (8.3%) 68 (12%) 93 (17%) 260 (11%)
作業中の接触
動物 N/A N/A N/A 30 (11%) 21 (9.7%) 62 (11%) 42 (7.7%) 155 (9.6%)
子ども N/A N/A N/A 59 (21%) 46 (21%) 105 (18%) 81 (15%) 291 (18%)
老人ホーム入居者 N/A N/A N/A 35 (12%) 24 (11%) 91 (16%) 74 (14%) 224 (14%)
患者 N/A N/A N/A 40 (14%) 35 (16%) 72 (13%) 14 (2.6%) 161 (10.0%)
5歳未満の子供がいる
108 (38%) 66 (28%) 46 (42%) 17 (9.0%) 17 (4.3%) 100 (39%) 32 (5.3%) 0 (0%) 386 (16%)
より詳細な情報は表S1に描かれている。
ヒトの生涯にわたるURT微生物叢
このデータセットには、少なくとも2つのサンプルにおいて相対存在量が0.1％以上の4,096個のアンプリコン配列変異体（ASV）が含まれており、22門、40綱、96目、176科、441属、660種を網羅している。生涯を通じた群集組成全体の変動とURTニッチ間の差異を評価するため、主座標分析（PCoA）を行った。その結果、鼻咽頭ニッチと口腔ニッチ（唾液と口腔咽頭）の間で強い分離が観察され、ニッチによって説明される全分散（R2）は30％であった（図2A-2C；PERMANOVA p値＜0.001）。唾液サンプルは10歳未満の個体に対してのみ収集されたにもかかわらず、口腔咽頭サンプルとほぼ連続性を形成していた（図2D）。年齢は微生物群集の最も重要なドライバーであり、上咽頭（全年齢）、唾液（10歳未満）、口腔咽頭（10歳以上）の群集において、それぞれ分散の10％、11％、1％を説明した（図2Eおよび2F；p値＜0.001）。上咽頭については、24歳以下と24歳以上でさらに2回の層別PERMANOVA検定を行ったところ、0～24歳の個体では24歳以上の個体に比べて年齢で説明できる分散がかなり大きく（それぞれ12％と0.7％、p値＜0.001）、加齢に関連した変化は成人期までほとんど起こることが明らかになった。392属中）15の中核属を同定した（有病率75％以上）。
を同定し、全体の94％を占めた。これらの属は、他の年齢区分においても微生物群集全体の89％～95％を占め、必須（中核）微生物が早期に定着したことを示している。しかし、Staphylococcus属、Peptoniphilus属、Finegoldia属、Lawsonella属、Anaerococcus属を含むいくつかのコア属は、10歳以降になって初めて出現した（図S1A）。成人の口腔咽頭については、22のコア属（115属中）が同定され、口腔咽頭の群集組成全体の96％～97％を占め、唾液サンプルの群集の92％～97％をも占めた（図S1B）。上咽頭サンプルは、唾液（＝0.53）および口腔咽頭（＝0.63）サンプルよりも高い不均一性（平均Bray-Curtis非類似度＝0.76）を示し（図2G）、特に高齢者において顕著であった（図S1C）。ほとんどの年齢カテゴリーにおいて、個体内の一致するサンプル間の一致率は、一致しない鼻咽頭および口腔サンプル間の一致率と比較して高く、個体内のニッチ間の生態学的連続性が強調された。乳児は、一致したサンプル間で最大の一致を示し、ニッチの分化の程度が低いことを示した（図S1D; = 0.91;q値 = 0.01）。
図2年齢を超えた上気道微生物叢
図S1 図2に関連する年齢 層別の上気道微生物叢
次に、ニッチごとのサンプル内（α-）多様性を調べたところ、上咽頭ニッチと口腔ニッチの両方で、年齢と多様性の間に強い関連が認められた（図2H）。上咽頭では、0歳、1～4歳、5～9歳の各年齢区分で安定したシャノン指数が見られたが（すべての比較；q値＞0.05）、その後、10～14歳で多様性が段階的に増加した（β＝0. 4；q値＜0.001；基準5-9歳）と15-24歳（表S3；β＝0.3；q値＜0.001；基準10-14歳）で段階的な多様性の増加が見られ、上咽頭微生物叢は若年成人期（15-24歳）まで発達し続けることが示された。対照的に、全体の細菌密度は年齢とともに、特に5～14歳では強く減少することがわかった（図2I；表S3；q値＜0.05）。ピースワイズ回帰を用いて、5～24歳および40歳以上の個体で年齢を連続変数として検討し、これらの年齢範囲における潜在的なブレークポイントを同定した。5～24歳では、5～8歳において細菌密度の顕著な減少が観察され、その後減少がわずかに弱まった（p値＝0.044）。その他の比較では、ブレイクポイントの前後で有意な勾配の差は認められず、年齢層を超えてバイオマスと多様性が緩やかに変化していることが示唆された（図2Jおよび2K）。
鼻咽頭とは対照的に、唾液では0歳から1〜4歳の間で多様性の強い増加が見られた（図2H；β= 0.6；q値 < 0.001）。乳幼児（0歳）を詳しく調べると、多様性の増加は生後5ヶ月目まで観察された（図S1E；q値＜0.001）。口腔咽頭微生物叢は、成人期を通じて微生物多様性の漸減を示し、成人（40～64歳）と比較して高齢者（65歳以上）では多様性が有意に低かった（図2H；β＝-0.132；q値＜0.001）。区分回帰分析により、口腔咽頭の微生物多様性は69歳まで着実に減少し、それ以降は減少が顕著になった（図2Jおよび2K；p値＝0.001）。口腔ニッチにおける細菌密度は、年齢を問わず比較的一定であった（図2I、2K、およびS1F）。
年齢を超えた微生物クラスターとASVの動態
年齢カテゴリーにまたがる鼻咽頭および口腔ニッチにおける微生物群集構造に関する知見を得るために、Bray-Curtis非類似度行列を用いて完全連鎖階層クラスタリングを行った。その結果、鼻咽頭では10個の微生物クラスターが同定され、一般に単一または少数のASVの存在によって典型化された（図S2A；表S4）。口腔ニッチ内では、8つのクラスターが同定され、2つの微生物クラスターはレンサ球菌（2および4）に支配され、6つの微生物クラスターはASVの混合によって表された（図S2B；表S4）。
図S2Bray-Curtis非類似度行列に基づく鼻咽頭（n= 2,485）および口腔（n= 3,104）サンプルの完全連鎖階層クラスタリング（ 図3に関連
次に、ロジスティック回帰を用いて、年齢を予測変数とし、クラスターに属するかどうかを結果とし、性別とサンプリングの季節で調整して、年齢特有のパターンを検討した。その結果、年齢と、モラクセラ属（1および17）とヘモフィルス属（10および19）の相対的存在量が高いことを特徴とする4つの鼻咽頭微生物クラスター（Mor1、Mor17、Hae10、Hae19）との間に負の関連が観察され、これらのクラスターは若年者ほど頻度が高いことが示された（OR < 1;q値 < 0.001）。対照的に、Corynebacterium（6および7）、Dolosigranulum pigrum（3）およびStaphylococcus（5）が支配的な4つのクラスター（Cor6、Cor7、Dol/Cor、Sta5）は、高年齢と正の相関があった（図3Aおよび3B；OR＞1；q値＜0.001）。年齢区分（すなわち、0歳、1～9歳、10～24歳、25～64歳［参考］、65歳以上）を比較すると、25～64歳と比較して、0歳および1～9歳では最も顕著な違いが観察され、若い参加者では上咽頭クラスターMor1、Mor17、およびHae19のメンバーシップが顕著に高く、クラスターSta5およびDol/Corのメンバーシップが低かった（図3C）。さらに、総細菌密度（定量的PCR法で測定）とサンプルごとの各ASVの相対存在量を掛け合わせることにより、最も存在量の多いASVの絶対存在量の動態を調べた、
を掛け合わせ、線形モデルを作成した。これらの解析から、これらのクラスターは成人においてより一般的であったにもかかわらず、40～64歳と比較して10歳未満の鼻咽頭ではD. pigrum（3）とCorynebacterium（6）の絶対量が多いことが示された（図S3A；表S5；q値＜0.05）。さらに、上咽頭ASVであるAnaerococcus octavius（66）、Anaerococcus（97）、Corynebacterium（46）、Finegoldia magna（39）、Lawsonella clevelandensis（45）、Peptoniphilus（29）と高齢との間に強い関連が確認された。微生物多様性および細菌密度の結果と同様に、前述のASVの絶対量は15～24歳まで増加し、その後は横ばいとなった（図S3A）。
図3上気道微生物クラスター
図S3 図3に関連する、上気道微生物叢に最も多く存在するASVの年齢に関連したパターン
口腔サンプルについては、唾液中に4つの微生物クラスターが観察された（＜10歳）。乳幼児（0歳児）ではレンサ球菌を主体とするクラスターが優勢であったが（Str4：81.8％、Str2：3.5％）、1～4歳児では有意に低く、次いで5～9歳児であった（図3D）。3番目に大きなクラスターであるナイセリア（13）とヘモフィルス（9）を主体とするクラスター（Nei13/Hae9）は、乳児から年長児にかけて相対的な増加を示した（OR > 1;q値 < 0.001）。ASVレベルでは、乳幼児では年齢とともにHaemophilus（9および10）とNeisseria（13）の増加が確認された（図S3C）。口腔咽頭サンプル（10歳以上）では、口腔クラスターの分布は年齢を問わず比較的安定していた。溶連菌(2)が支配的なクラスターは、生後間もないころに減少した後、年齢が高くなるにつれて正の相関を示した（OR＞1；q値＜0.001；10～14歳では19.8％、65歳以上では31.6％）。層別解析では、Str2クラスターのクラスター構成率は、25-64歳と比較して65歳以上で有意に高いことが確認された（図3F；q値＝0.002）。さらに、3つのクラスターが年齢と負の相関を示し（図3D-3E；Vei8/Pre11、Str4、およびStr4/Mix、OR＜1；q値＜0.05）、Str4クラスターのメンバー数は、1-9歳と比較して0歳のカテゴリーで高いことがわかった（図3F）。存在量の差分分析を用いると、Haemophilus属（10）、Alloprevotella属（49および65）、Actinobacillus属（52）、Pasteurellaceae属（77）、およびVeillonella massiliensis属（78）を含む多くのASVについて、10歳以降、絶対存在量が徐々に減少することが確認され（図S3B）、これはシャノン多様性の結果と一致した。
URT微生物叢と宿主・環境・健康特性との関連性
宿主／環境因子および健康転帰が、URT微生物群集組成の変動にどの程度寄与しているかを明らかにするため、年齢層を分けて単変量PERMANOVA検定を行った（図4）。最も強い関連は、6/8年齢区分において、サンプリングの季節と上咽頭微生物叢組成に観察された（R2＝1.2％～5.6％）。季節と上咽頭細菌叢との関連は、乳児（0歳；R2＝1.3％-1.6％）でより頻繁に発生した最近の症状（鼻水、咳、または少なくともサンプリングの1ヵ月前の発熱）と一致していた。同様に、固形食の摂取（R2＝2.0％）および保育所への通園（R2＝1.4％）は、乳児の微生物変動と強く関連していた。さらに、幼児と25～39歳の参加者（R2＝1.7％）において、世帯構成、特に5歳未満の子どもと同居していることと、上咽頭微生物叢の構成との間に関連がみられ、後者は両親である可能性が最も高かった。中咽頭については、社会経済的地位／ライフスタイル、最近の抗生物質使用、過去3年以内の肺炎に関する報告が、特に高齢者（40歳以上）において、微生物叢組成と強く関連していることがわかった（図4）。中でも、都市化の度合い（R2＝0.5％～4.0％）および市町村の規模（R2＝0.2％～0.6％）は、ほとんどの年齢カテゴリーで、特に15～64歳の参加者において、URTの微生物叢組成に大きな影響を及ぼすことが観察された。食事、特に果物の摂取量（R2＝4.0％-6.0％）は、唾液中の微生物叢組成に有意な影響を与えた。また、乳児の授乳タイプ（母乳のみR2＝3.2％；固形食R2＝5.3％；p値＜0.001）は、上咽頭微生物叢よりも唾液微生物叢に顕著な影響を与えることがわかった（図4）。ここでも、最近の呼吸器感染症の症状は、他の年齢区分と比較して、乳児の口腔微生物叢と最も強く関連していた。
図4宿主／環境／健康特性と上気道微生物群集組成との年齢層別関連性
これらのパターンをより深く理解するために、宿主・環境・健康特性と上気道微生物叢との関係を、(1)多様性、(2)密度、(3)ASV/属レベルでの存在量の差の観点から検討した。線形モデル（MaAsLin2）を用いて、鼻咽頭をASVレベルで、口腔ニッチを属レベルで解析した。我々の目的は、観察された変異の原因となる特定の分類群を特定することであった。口腔ニッチについては、ASVレベルではなく属レベルでズームインすることにした。同じ属に属する多くのASVが以前の解析で同様の反応を示しており、このアプローチによって口腔微生物叢をより広く表現することができるからである。上咽頭と口腔ニッチそれぞれについて、上位31のASVと27の属（すべて少なくとも100サンプルにおいて相対存在量が1％を超える）に注目し、合わせて上咽頭サンプルでは相対存在量の83％、口腔ニッチでは98％をカバーした。各モデルについて、年齢、性別、サンプリングの季節を補正した。PERMANOVAの結果と相関の程度に基づいて、さらに補正を加えた（表S2）。
URT微生物叢と性との関連性
最初に、腸内細菌叢と男女間のホルモン格差との間に発見された関連性に促されて、URT微生物叢の性関連傾向を調査した。
コミュニティレベルでは、性差は上咽頭の全分散の0.3％という控えめなものであった（表S6；多変量PERMANOVAp値＜0.001）。年齢カテゴリーごとに線形モデルを実行したところ、10～24歳の男性および0歳の乳児の上咽頭微生物叢では、同年齢の女性と比較して高い微生物多様性が検出された（図5Aおよび5B；q値＜0.05）。15歳以上の男性では、A. octavius(66)、Anaerococcus(97)、Corynebacterium(46)、F. magna(39)、L. clevelandensis(45)、Peptoniphilus(29)などの低濃度のASVが多く認められた。(図5Cと5D；少なくとも3つの年齢カテゴリーでq値＜0.1）。興味深いことに、これらのASVは、前述の高年齢とも独立して関連していた（図S3A）。多変量線形回帰モデルを用いて感度分析を行い、性差に関連する影響が喫煙や飲酒を含む生活習慣要因の変化のみに影響される可能性を排除した（データは示さず）。両方の口腔ニッチの微生物叢について、性によって説明される0.1％の分散という同様の緩やかな効果が観察されたが、これは口腔咽頭サンプルでのみ有意であった（図4；表S6；p値＝0.002）。その結果、ビフィズス菌は高齢男性（40歳以上）の口腔咽頭で特に豊富であった（図5Eおよび5F；q値＜0.1）。
図5上気道微生物叢の性関連パターン
上気道細菌叢と社会的接触の関連性
次に、効果的な疾患の予防と管理には、個人的接触による微生物の潜在的伝播を理解することが重要である、
我々は、世帯構成と仕事関連の接触（子供、動物、患者、高齢者に関わる仕事）が、25～64歳の成人の尿路細菌叢に及ぼす影響を調べた。接触タイプごとに独立したシグナルを抽出するため、各モデルを他のすべての接触変数で調整した。上咽頭微生物叢に関連する特に強いシグナルは、家庭内の子どもとの個人的接触（表S6；R 2＝1.2％；p値＜0.001）および職場環境（R2＝0.6％；p値＝0.005）に起因することが観察された。子どもと同居または仕事をしている成人では、微生物の多様性が低く、細菌密度が高く、モラクセラ（1および17）とD. pigrum（3）の絶対量が高いことがわかった（図S4A～S4C）。Bray-Curtisの非類似度を比較すると、子どもと接触したことのある成人の上咽頭微生物叢は子どものそれに酷似していることが確認された（図S4D）。対照的に、口腔咽頭微生物叢は、子どもと同居（R2＝0.3％；p値＝0.029）または就労（R2＝0.2％；p値＝0.019）することによる影響は少なかった。したがって、我々の結果は、中咽頭微生物叢と比較して、子どもとの接触が成人の上咽頭微生物叢の形成に大きな役割を果たしていることを示唆している。
図S4上気道細菌叢における社会的接触と生活習慣に関連したパターン（ 図4関連
上気道微生物叢とタバコおよびアルコールの使用との関連
タバコの使用は気道感染症や慢性呼吸器疾患と関連しているため、15歳以上の現役喫煙者（16％）、元喫煙者（33.6％）、受動喫煙者（6.1％）を対象に、タバコの使用と上気道微生物叢との関連を調べた。教育水準（Pearson r= -0.09、q値 < 0.001）と飲酒量（表S2、Pearson r= 0.09、q値 < 0.001）で補正した。上咽頭微生物叢では、変動の0.3％が喫煙状態によって説明された（表S6；p値＜0.001）。中でも、D. pigrum(3)の絶対量は、喫煙歴のない人から、喫煙歴のある人、喫煙歴のある人、喫煙歴のある人へと段階的に減少した（図S4G；q値＜0.25）。逆に、Peptoniphilus(29)、F. magna(39)、Corynebacterium(46)、Campylobacter ureolyticus(163)を含むまれな分類群は、喫煙歴のない人と比較して、活動的喫煙者においてより豊富であり（q値 < 0.1）、Peptoniphilus(29)とF. magna(39)は週に吸うタバコの本数と正の相関があった（図S4H）。上咽頭と比較して中咽頭では、活発な喫煙に起因する微生物叢の変動が大きかった（表S6；R2＝0.6％；p値＜0.001）。ここで、過去および現在の喫煙者の微生物多様性は、喫煙経験のない人に比べて低かった（図S4EおよびS4F；q値＜0.05）。現役喫煙者の口腔咽頭微生物叢は、ビフィドバクテリウムの絶対量が高かった（coef = 3.0;q値 < 0.05)
の絶対量が高く、他の17属、特にナイセリア属の絶対量が低かった（図S4G；coef＝-4.0；q値＜0.05）。感度分析により、喫煙の影響は性別に依存しないことが確認された。
さらに、学歴（表S2；Pearson r = 0.2；q値 < 0.001）および積極的喫煙を対照として、アルコール摂取（表S1；25.7％が禁酒）とURT微生物叢との関連を検討した。アルコール摂取の影響は、上咽頭（表S6；R2＝0.1％；p値＝0.021）と比較して、中咽頭（R2＝0.3％；p値＜0.001）でより明らかであった。中でも、ヘモフィルス属菌（9）（coef = 0.8、q値 < 0.05）とレンサ球菌（4）（coef = 0.7、q値 < 0.05）の絶対量は、アルコールを摂取する人の上咽頭では、飲まない人に比べて高かった（図S4G）。口腔咽頭では、非飲酒者と比較して、アルコールを摂取する個体では微生物の多様性が高く（q値＝0.005）、TM7xを含む14属の絶対量が多いことが観察された（図S4EおよびS4G；q値＜0.25）。これらの結果は、タバコの使用とアルコール摂取の両方がURTの微生物叢構造に（異なる）影響を与えていることを示している。
URT細菌叢と抗生物質の使用との関連
抗生物質は一般にあらゆる臓器系から細菌性病原体を排除するために使用されるが、抗生物質の使用は体全体のマイクロバイオーム構造の崩壊をもたらしている可能性が高い。
この年齢層では抗生物質の使用がより一般的であったため（過去3ヵ月間に抗生物質を使用したのは12.7％）、我々は15歳以上の個人を対象に、URTマイクロバイオータに対する抗生物質使用の潜在的影響を調査した。過去3ヵ月以内の抗生物質の使用は、上咽頭微生物叢（p値＝0.011）および口腔咽頭微生物叢（p値＜0.001）の分散のそれぞれ0.2％および0.4％を説明した（表S6）。上咽頭では、抗生物質の使用によって微生物の多様性が低下し（図S4E；q値＝0.045）、それに伴ってD. pigrum（3）、Peptoniphilus（29）、L. clevelandensis（45）の絶対量が低下した（図S4G；q値＜0.05）。同様に、口腔咽頭においても、抗生物質の使用により、微生物の多様性（q値＜0.001）、細菌密度（q値＝0.034）、および19属の絶対量（q値＜0.25）が有意に低下することが観察された（図S4E～S4G）。幼児（5歳未満）でも同様の結果が得られ、上咽頭ではD. pigrum(3) (coef = -3.0;qvalue = 0.007)とCorynebacterium(7) (coef = -1.8;qvalue = 0.13)の絶対量が低かった。この結果から、抗生物質の使用は、口腔咽頭でより顕著ではあるが、両方のURTニッチの微生物叢に変化をもたらすことが確認された。
口腔内細菌叢と季節、呼吸器症状、肺炎との関連性
サンプリングの季節、呼吸器症状の有無、およびURT微生物叢の関係を調べるために、呼吸器症状の有無（すなわち、サンプリングの少なくとも1ヶ月前に鼻水および/または咳があった）、または発熱を伴う呼吸器症状の有無による微生物叢の違いを評価した。我々のデータセットでは、4つの季節は、冬（22％）、春（31％）、夏（22％）、秋（25％）で表され、呼吸器症状は、5歳未満（発熱を伴わない呼吸器症状：39％、発熱を伴う呼吸器症状：32％）と冬の季節（発熱を伴わない呼吸器症状：48％、発熱を伴う呼吸器症状：17％）でより一般的であった。季節は上咽頭微生物叢の分散の0.4％を占めることがわかった（表S6；p値＜0.001）。上咽頭の詳細な解析により、夏季と比較して冬季はシャノン多様性が減少し（図6A；q値＝0.005）、細菌密度が高い（図6B；q値＜0.001）ことが明らかになった。その結果、Moraxella（1）とHaemophilus（10と19）は夏季と比較して冬季に絶対量が多いことが示された（図6C；q値＜0.05）。異なる年齢層（0歳、1～14歳、15歳以上）における季節的パターンを分析した結果、ヘモフィルス（10）の存在量の季節変動は、特に小児（1～14歳）と青年／成人（15歳以上）で顕著であることが示された（図6D）。唾液（10歳未満）および口腔咽頭（10歳以上）の微生物叢では、サンプリングの季節はそれぞれ分散の0.9％および0.5％を説明した（p値＜0.001）。口腔咽頭微生物叢では、微生物多様性（図6A；q値＝0.003）、細菌密度（図6B；q値＜0.001）、および15属の絶対存在量（図S5A；q値＜0.25）は、夏と比較して冬と春で高かった。
図6上気道微生物叢における季節、呼吸器症状、肺炎関連パターン
図S5 図6に関連する上気道微生物叢の季節、呼吸器症状、肺炎関連パターン
図S6STAR Methodsに関連する、コンタミネーションと低品質サンプルを除去するために使用されたすべての品質管理とフィルター工程の概要
図S7 STAR法に関連するすべてのデータ解析のフローチャート
最近呼吸器感染症に罹患した人は、一般的に症状が軽いと報告されているが、これはおそらく一般的なウイルス感染症を反映していると思われる。上咽頭については、全体的に高い細菌密度が検出され（図6B；q値＝0.004）、また、最近の呼吸器症状を有する個体、特に発熱を伴う感染症に罹患した個体では、既知の潜在的病原体の絶対量が高いことが検出された（図6C；q値＜0.05）。これらの潜在的病原体には、Haemophilus属（10および19）、Moraxella属（1および17）、Streptococcus属（14）が含まれていた。BLASTn-alignmentに基づいて、我々はStreptococcus(14)がStreptococcus pneumoniae（表S7；同一性＝100％；E値＝2.73×10-131）を反映していると疑い、piaBおよびlytA特異的qPCRアッセイを用いてこれを確認した。我々は、小児（10歳未満；陽性的中率[PPV]は0.78から0.81の範囲）ではレンサ球菌(14)の存在が肺炎球菌キャリアの高い予測因子であったが、10歳以上では低かった（PPVは0.21から0.56）ことを見出した（図S5B；Χ2検定p値＜0.05）。さらに、レンサ球菌(14)の絶対量とpiaBおよびlytAの濃度との間に強い相関が観察された（図S5CおよびS5D；それぞれピアソンr＝0.78およびr＝0.75；p値＜0.001）。溶連菌の結果（14）と同様に、肺炎球菌と乳幼児における最近の軽い上気道感染症状（発熱の有無）との間に統計学的に有意な正の関連が検出された（図S5E）。同時に、コリネバクテリウム（Corynebacterium）（7）およびD. pigrum（D.ピグラム）（3）を含む重要な常在菌が呼吸器症状を患っている患者で減少した（図6C；q値＜0.05）。年齢層別解析によると、これらの差は乳児（0歳）と小児（1～14歳）で最も顕著であった（図6E；q値＜0.05）。上咽頭と比較して、唾液および口腔咽頭の微生物叢の変動は、呼吸器症状に起因する程度が小さかった（それぞれR2= 0.7％および0.1％；p値 < 0.05）。唾液微生物叢（10年未満）については、症状のない参加者と比較して、呼吸器症状および発熱のある参加者では、微生物の多様性が高く（図6A；q値＝0.002）、13属の絶対存在量が高いことが観察された。(図S5A；q値＜0.25）。
また、15歳以上（15歳未満はデータなし）の個人における肺炎の発生とURT微生物叢の関係を、過去3ヵ月以内の抗生物質の使用で補正して調べた（ピアソンr= 0.15；q値 < 0.001）。参加者のうち、5.6％（N=122）が過去3年以内に肺炎を1回経験しており、2.7％（N=59）がこの期間に肺炎を複数回経験していた。肺炎を複数回経験した人の鼻咽頭では、肺炎に罹患していない人に比べて、溶連菌（14）の絶対量と存在率が高かった（図6Fおよび6G；q値＜0.05）。これらの所見は、S. pneumoniae（piaB濃度）と過去3年間の複数回の肺炎エピソードとの間の緩やかな関連（図S5E；p値＝0.20）と一致しており、Streptococcus（14）と過去の感染負担との関連は、これらの個人の少なくとも一部における肺炎球菌キャリッジを反映していることを再度示唆している。さらに、感度分析により、肺炎の既往歴は、抗生物質による治療歴の有無にかかわらず、肺炎球菌量の増加と関連していることが示された。口腔咽頭では、肺炎を1回経験した人（q値＝0.02）または再発した人（q値＝0.005）において、シャノンの多様性はそれぞれ段階的に減少した（図S5F-S5H）。上咽頭で観察されたのと同様に、肺炎の既往のある人では、中咽頭微生物叢にレンサ球菌（14）の有病率が高いことがわかった（図6G）。
考察
この全国規模の集団研究は、ヒトの全寿命にわたる口腔内細菌叢の包括的な解析を提供し、年齢が微生物叢の主要なドライバーであることを明らかにし、異なる口腔内細菌叢ニッチについて明確なパターンが観察された。若年者の鼻咽頭は、多様性が低く、総細菌密度が高いが、高齢者では逆の傾向が観察された。微生物の多様性と総細菌密度は15歳から24歳の間で安定したことから、上咽頭の微生物叢は成人初期まで発達・成熟し続けることが示唆された。これはこれまで報告されておらず、2～5歳頃にすでに安定する腸内細菌叢の発達とは対照的である。
上咽頭の必須常在菌であるD. pigrumと コリネバクテリウム属の絶対量は、しばしば疾患の有無と関連している。
および潜在的な病原体の抑制と頻繁に関連している。
我々は、これらの細菌の存在量が年齢によって異なり、D. pigrumは若い人ほど多いが、すべての年齢層に共通して存在することを発見した。さらに、Anaerococcus（octavius）、Corynebacterium、Finegoldia magna、Lawsonella clevelandensis、Peptoniphilusなどのまれな分類群が、青年期および成人期（15歳以上）の上咽頭プロフィールを特徴づけていることも明らかになった。これらの分類群は、特に思春期には男性に多く、喫煙行動など他の要因で層別化しても、これらのパターンは一貫していた。我々は、年齢と性別による微生物叢組成の変動は、ホルモンの変動に関連している可能性があると推測している。ホルモンの変動は、以前にマウスの腸内細菌叢組成の変化と関連していた。
加えて、年齢を超えた微生物叢の発達は、年齢による免疫の発達と（相互に）関連している可能性があるという仮説を立てた、
上皮の変化
解剖学的発達に関連している可能性がある、
および生涯にわたる環境暴露の違いである。鼻咽頭と比較すると、口腔ニッチは細菌密度と多様性が高い一方で、個人間のばらつきが小さく、年齢による違いがより微妙であった。
微生物群集組成と宿主および環境特性との間には、ニッチおよび年齢特有の明確な関連が観察され、とりわけ社会的接触が上咽頭微生物叢組成の強力なドライバーであることが示された。小児と同居または就労している成人の上咽頭は、小児にみられる典型的な上咽頭微生物叢に近く、モラクセラの絶対量が多かった。先行研究では、乳児の上咽頭は母親と類似していることが判明しているが31、
我々のデータは、幼児も両親のマイクロバイオームに影響を与える可能性があることを示唆している。
最近の呼吸器症状、抗生物質の使用、積極的な喫煙は、上咽頭常在菌であるD. pigrumおよびCorynebacteriumの絶対量と負の相関を示した。興味深いことに、大部分が肺炎球菌であることが確認された連鎖球菌とヘモフィルス属菌の絶対量は、小児では上気道感染症を含む最近の軽症感染症、青年・成人では肺炎を含む下気道感染症と関連していた。これらの所見は乳幼児と小児で最も明らかであり、鼻咽頭の細菌群集がウイルス感染の重症度を調節し、また、真菌症が再確立する前に回復期を必要とする可能性を示唆する文献の拡大に加わった。
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我々のデータから、口腔微生物叢は主にタバコやアルコールの使用などの生活習慣によって左右されることが示唆される。なかでも、喫煙習慣のある人や過去に喫煙習慣のあった人では、微生物の多様性が低いことがわかり、喫煙が口腔微生物叢に及ぼす影響が強調された。最近のエビデンスは、腸内細菌叢とのよく確立された関連に加えて、心血管疾患と口腔内細菌叢との関連を示唆している。
しかし、現段階では、心血管疾患のリスクに寄与する直接的または媒介的因子としての口腔微生物叢の変化を解明するためには、さらなる研究が必要である。
様々なURTニッチにおける微生物叢に関するこれまでの研究は、主にサンプルサイズが小さいか、ヒトの寿命内の特定の段階に焦点を当てたものであり、その範囲は限られている。
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我々は、一般集団における呼吸器内細菌叢の加齢に伴う動態に光を当て、ヒトマイクロバイオームに関する数多くの研究にもかかわらず残っている知識のギャップを埋めた。本研究の大きな長所は、データの信頼性を確保するために、低バイオマス呼吸器サンプルの特徴を明らかにするための標準化された操作手順を備えた管理された実験室環境を用いたことである。研究室の手順はまず、低バイオマスの鼻咽頭サンプルに対応するために慎重にベンチマークされた。
さらに、コンタミネーションに対処し、低品質サンプルの使用を避けるため、広範な前処理工程を採用した。
環境を通して微生物が伝播する可能性を理解することは、効果的な疾患の予防と管理に不可欠である。そのため、大気汚染や集約的畜産などの環境要因の影響も考慮する必要がある43、
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は、さらなる調査が必要な研究分野である。全体として、我々は大規模なオープン集団研究において、異なる年齢カテゴリーにわたるURT微生物叢を包括的に記述し、URTの微生物群集組成に影響を与える最も重要なニッチおよび年齢特異的因子を強調した。URT微生物叢は、様々な短期的および長期的な呼吸器系の健康転帰に関与しているため、我々の結果は、ヒトの寿命全体にわたって呼吸器系の健康を促進するための将来の予防策の指針となり、URT微生物叢に関する今後の研究のベースラインとなる可能性がある。
研究の限界
本研究では、宿主、環境、および健康の特徴を含む情報を収集するために広範な質問票を利用したが、歯磨きの頻度や口腔洗浄剤の使用などの口腔衛生習慣に関する具体的なデータは収集していない。
このような情報のギャップは、口腔衛生習慣がURT微生物叢の構成、特に唾液微生物叢と口腔咽頭微生物叢にどのような影響を及ぼすかについての理解に影響を及ぼす可能性がある。さらに、質問票による自己報告データに依存することで、参加者が自分の病歴に関する情報を不正確に記憶または報告する可能性があり、想起バイアスが生じる可能性がある。本研究では横断的デザインを採用したため、因果関係の立証や変数間の時間的関係の決定には限界がある。サンプルは診察時間帯に採取されたため、時間帯などの要因によるばらつきが生じる可能性があり、これらのばらつきに関連した微生物プロファイルの相違が生じる可能性がある。
さらに、マイクロバイオームのプロファイリングに用いた16S-rRNAアンプリコンシークエンシング法には固有の限界がある。この手法では、16S-rRNA遺伝子が保存されているため、属内の近縁種を区別できない可能性があり、機能的な読み出しもできない。将来的には、このような限界に対処するために、メタゲノミックアプローチを取り入れることも考えられる。さらに、URT微生物叢の正常な変異を完全に把握するために、今後の研究には、多様な地理的場所やライフスタイルにわたって実施される縦断的研究を含めるべきである。
STAR★方法
主要リソース表
試薬またはリソース・ソース IDENTIFIER
細菌およびウイルス株
ZymoBIOMICS 微生物群集標準 Zymo Research, CA, USA Cat#D6300
ZymoBIOMICS 微生物群集 DNA 標準 Zymo Research, CA, USA Cat#D6306
生物学的サンプル
鼻咽頭、口腔咽頭、および唾液サンプル 主に近隣のコミュニティセンター、市保健サービス（GGD）、または Saltro の検査場所から収集。
COPAN eSwab, 482CE（経鼻咽頭スワブ） Copan Diagnostics Inc.
COPAN eスワブ、484CE（経鼻上咽頭スワブ） Copan Diagnostics Inc.
COPAN eSwab、480CE（口腔咽頭スワブ） Copan Diagnostics Inc.
Oracol 唾液採取システム S10 Malvern Medical N/A
化学物質、ペプチド、リコンビナントタンパク質
ジルコニウムビーズ（0.1mm） Biospec Products, OK, USA Cat#11079101z
フェノール VWR, PA, USA Cat#108-95-2
マスターミックス Universal taqman 5×5 mL Thermo Fischer Scientific, MA, USA Cat#10437304
HPLC グレードの水 Instruchemie, オランダ Cat#2195
10mM dNTP mix ロシュ、スイス Cat#11814362001
phiXコントロールv3 Illumina, CA, USA Cat#FC-110-3001
重要な市販アッセイ
Mini-Beadbeater-24 Biospec Products, OK, USA Cat#112011EUR
StepOnePlus RealTime PCR システム Thermo Fisher Scientific, MA, USA Cat#4376600
LightCycler 480 PCR システム Roche, オランダ N/A
Mag Mini DNA 抽出キット Immunosource, Belgium Cat#NAP40401
Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific, MA, USA Cat#F-549L
Quant-iT PicoGreen dsDNA アッセイキット Thermo Fisher Scientific, MA, USA Cat#P7589
Beckman Coulter Agencourt AMPure XP Thermo Fisher Scientific, MA, USA Cat#A63880
MiSeq 試薬キット V3（2x300 bp） 米国カリフォルニア州イルミナ Cat#MS-102-3003
イルミナMiSeq装置 米国カリフォルニア州イルミナ Cat#SY-410-1003
寄託データ
生の16S-rRNAシーケンスデータ 本論文；NCBI SRA Bioproject： PRJNA997934
Silva v138（バージョン2；2020年8月） Quast et al.
Zenodo:https://zenodo.org/record/3986799#.YfD5ti-iH0r
データを処理・解析するためのソースコード/スクリプト 本論文 GitLab:https://gitlab.com/Mari-Lee/URT_microbiota_baseline; Zenodo:https://doi.org/10.5281/zenodo.10854139
オリゴヌクレオチド
フォワードプライマー 16S-F1 5'-CGA AAG CGT GGG GAG CAA A-3' Bogaert et al.
該当なし
リバースプライマー 16S-R1 5'-GTT CGT ACT CCC CAG GCG G-3' Bogaert et al.
該当なし
プローブ 16S-P1 FAM-ATT AGA TAC CCT GGT AGT CCA-ZEN Bogaert et al.
該当なし
515F 16S V4フォワードプライマー 5'-GTGCCAGC MGCCGCGGTAA-3'（イルミナアダプターおよびバーコードを含む） Caporaso et al.
該当なし
806R 16S V4リバースプライマー 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'（イルミナアダプターおよびバーコードを含む） Caporaso et al.
該当なし
フォワードプライマーpiaB5'-CAT TGG TGG CTT AGT AAG TGC AA-3' Trzciński et al.
該当なし
リバースプライマーpiaB5'-TAC TAA CAC AAG TTC CTGA TAA GGC AAG T-3' Trzciński et al.
該当なし
プローブpiaB5'-FAM-TGT AAG CGG AAA AGC AGG CCT TAC CC-3'-TAMRA Trzciński et al.
該当なし
フォワードプライマーlytA5'-ACG CAA TCT AGC AGA TGA AGC A-3' Carvalho et al.
該当なし
リバースプライマーlytA5'-TCG TGC GTT TTA ATT CCA GCT-3' Carvalho et al.
該当なし
プローブlytA5'-FAM-GCC GAA AAC GCT TGA TAC AGG GAG-3'-BHQ52 Carvalho et al.
該当なし
ソフトウェアとアルゴリズム
R Statistical Software v4.3.2 R Core Teamhttps://www.r-project.org
RStudio Server v2023.3.0.386 RStudiohttps://posit.co
Adobe Illustrator v28.3 Adobehttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
DADA2 v1.26 Callahan et al.
https://benjjneb.github.io/dada2/
snakemake v5.18.1 Mölder et al.
https://snakemake.readthedocs.io/en/stable/
decontam v1.18.0 Davis et al.
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/decontam.html
phyloseq v1.45.0 McMurdieおよびHolmes
https://joey711.github.io/phyloseq/
Vegan v2.6-4 Oksanen et al.
https://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html
MaAsLin2 v1.15.1 Mallick et al.
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Maaslin2.html
segmented v2.0-3 Muggeo et al.
https://cran.r-project.org/web/packages/segmented/
リソースの有無
代表連絡先
詳しい情報や試薬のリクエストは、Debby Bogaert(D.Bogaert@ed.ac.uk)までご連絡ください。
材料の入手可能性
本研究で得られたサンプルはすべて、国立公衆衛生・環境研究所（RIVM）の感染症研究・診断・検査センター（Centre for Infectious Diseases Research, Diagnostics and Laboratory Surveillance）に保管されている。インフォームド・コンセントの条件により、サンプルはオープンなバイオリポジトリの一部ではありません。リソース共有のリクエストは、対応する著者に行うことができ、ケースバイケースで評価される。
データおよびコードの利用可能性
-16S-rRNAシーケンスデータを含むペアFASTQファイルはNCBI Sequence Read Archive (SRA)データベースに提出され、公開日現在アクセス可能である。アクセッション番号はkey resources tableで確認できる。
データの処理と解析に使用したコードはGitlab: https://gitlab.com/Mari-Lee/URT_microbiota_baseline。コードのバージョンはZenodoリポジトリにアーカイブされており、出版日現在、一般にアクセス可能である。DOIは主要リソースの表に記載されている。
-本論文で報告されたデータを再分析するために必要な追加情報は、要求があれば主担当者から入手可能である。
実験モデルと被験者の詳細
研究集団とデザイン
TRIuMPHプロジェクトの第I期において、オランダ国立公衆衛生・環境研究所（RIVM）における微生物相研究の技術的能力構築が実現し、全国規模のコホートの微生物相データセットが作成された。上気道（URT）サンプルは、以前に記載された大規模な集団横断研究（PIENTER-3、2016/2017）の文脈で収集された。
PIENTER-3は、RIVMによって実施された3番目の血清疫学研究であり、全国予防接種プログラム（NIP）対象疾患の血清有病率のモニタリングに使用されている。0～89歳のオランダ住民の人口統計学的横断面を抽出するために、2段階のクラスター・サンプリング法が採用された。5つの地域から40の市町村がその規模に比例して選ばれた。選ばれた各自治体において、89歳を最高年齢として年齢別に層別化された人口登録からサンプルが抽出された。その結果、年齢層は0歳、1～4歳、5～9歳......と75～79歳、80～89歳まで区分された。さらに、このコホートには、非西洋からの移住者、ワクチン接種率が低い地域に居住する人、スリナム、アルバ、旧オランダ領アンティル諸島で生まれた人のサンプルを意図的に追加した。この研究の参加者は、問診票、血液サンプル、口腔・鼻咽頭スワブ、糞便サンプル、唾液サンプルなど、診察時間中にさまざまなデータを提供し、同時に接触パターン日誌をつけた。さらに、ワクチン接種記録と病歴もデータセットの一部として収集された。参加者の性別は自己申告制で、アンケートを通じて収集された。参加者のうち51％が女性であった（表1；表S1）。
資料収集
深い表現型データは、0～14歳および15歳以上の参加者を対象とした4つの質問票（初回質問票2つ、フォローアップ質問票2つ）によって収集された。アンケートには、社会人口統計、ワクチン接種、健康状態、疾病状態、行動、食事に関するデータが含まれた。初回アンケートは全員が回答し、追跡アンケートの回答率は73％であった。研究集団を形成するために、診察時間中に鼻咽頭ぬぐい液、口腔咽頭ぬぐい液、唾液サンプルを採取した。幼児の場合、純粋な口腔サンプルを採取することは技術的に困難であるため、代わりに唾液を採取した。唾液は非侵襲的で採取が容易であり、信頼性が高く、幼児の場合、口腔サンプルと高い類似性を示したからである。
唾液サンプルは、スポンジ綿棒を用いて採取した。スポンジ綿棒を頬と顎の間にそっと当て、1分間唾液を十分に吸収させた。その後、唾液をスポンジからクライオチューブに絞り出し、速やかに採取した。これらのチューブは、採取時に直ちにドライアイスの上に置かれ、-80℃で保存された。上咽頭からのサンプル採取は、コパン・スワブを片方の鼻孔に挿入し、鼻腔の底に沿って上咽頭の奥壁に向かって戻し、その後優しくブラッシングした。一方、口腔咽頭からのサンプル採取では、口腔内の構造物に触れないようにしながら、綿棒を静かに口腔内に挿入し、喉の奥に向けた。口腔咽頭および鼻咽頭のスワブは、液体アミーズ培地に入れ、ドライアイス上で直接保存した。
インフォームド・コンセント
実施されたすべての手順は、機関および/または国の研究委員会の倫理基準に従っていた。本研究はオランダ国家倫理委員会（METC Noord-Holland；M015-022）の承認を得た。すべての成人参加者、および研究に参加した未成年者の両親または法定後見人から、書面によるインフォームド・コンセントを得た。
方法の詳細
DNA分離
研究室での手順は以前に記述されている。
Agowa Mag DNA抽出キット（LGC Genomics社、ベルリン、ドイツ）を用い、低バイオマスDNA抽出の信頼性を確保するために若干の調整を加え、以前に確立された方法に従って、合計5,930のURTサンプルからDNAを抽出した。
各単離ランには、ポジティブコントロールとして103倍に希釈したZymoモックの200μlアリコートと、溶解バッファーだけを含む2つのネガティブコントロール（DNA単離ブランクと呼ぶ）が含まれた。サンプルは氷上で解凍し、10秒間ボルテックスした。その後、ジルコニウムビーズ（直径0.1mm、Biospec Products、Bartlesville、OK、USA）およびフェノール（VWR International、Amsterdam、Netherlands）550μlを含む溶解バッファー600μlを、各サンプルごとにコニカル1.5mlスクリューキャップエッペンドルフチューブに加えた。サンプルは、Mini-Beadbeater-24（Biospec Products社製）を用いて、3,500振動/分で2分間、機械的に2回破砕した。その後、チューブを4500×gで10分間遠心した。透明な水相を、1.3mlの結合バッファーと10μlの磁気ビーズを含む2mlのエッペンドルフチューブに移した。30分間振とうした後、チューブを磁気分離ラックに入れた。上清を捨て、磁気ビーズを洗浄バッファー1と2で洗浄し、55℃で15分間風乾した。出発物質に応じて35μlまたは50μlの溶出バッファーで、55℃で15分間振とうしてDNAを溶出した。溶出したDNAを含む上清を1.5mlのEppendorf LoBindチューブに移し、-20℃で保存した。
16S-rRNA配列決定
標準プロトコールに従い、16S-rRNA遺伝子の超可変領域4（V4）を、PCRとイルミナアダプターおよびサンプル特異的バーコードを含む515F/806R-プライマーペアを用いて増幅した。
各25μlのPCR反応は、0.5μlのPhusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase、5μlの5× Phusion HF Buffer（Thermo Fisher Scientific, MA, USA）、7μlのHPLCグレードの水（Instruchemie, Delfzijl, the Netherlands）、2. 5 μlの2 mM dNTP mix (Roche, Mannheim, Germany)、5 μMのバーコード付きプライマー515Fとバーコード付きプライマー806R、および5 μlの鋳型DNA。PCR反応は特定のプロトコールに従った：98℃で30秒の初期変性；98℃で10秒、55℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを30回；そして72℃で5分間の最終伸長。16S rRNA遺伝子のDNA濃度が20 pg/μl未満のサンプル（100 pg未満の入力DNAに相当）は希釈せずに使用し、それ以上の濃度のサンプルはHPLCグレードの水で適切に希釈した。アンプリコンの断片サイズはアガロースゲル電気泳動で評価し、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Thermo Fisher Scientific, MA, USA）を用いて定量した。バーコード化したアンプリコンを等モル比でプールした。0.9×AMPure XP磁気ビーズを用いて2回連続精製を行い、合計23のアンプリコンプール（5-27）を精製した。4つのプール（1-4）は、アガロースゲルと0.9×AMPure XP磁気ビーズを組み合わせて精製した。精製されたプールはMiSeq試薬キットv3を用いてシーケンスされ、サンプルは27回のIllumina MiSeqラン（Illumina Inc.） さらに、シーケンスプロセスを検証し、潜在的なコンタミネーションを同定するために、陽性および陰性コントロールを組み込んだ。テクニカルコントロールには、DNA分離ブランク（n= 351）、シーケンスブランク（n= 80）、Zymoモック細菌（ZMCB、n= 189）およびZymoモックDNA（ZMCD、n= 80）が含まれた。モックコミュニティは注意深く検査され、MiSeq-run全体で不規則な微生物プロファイルがないかチェックされた。
細菌DNA定量
StepOnePlus Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州）と16S rRNA遺伝子を標的とするユニバーサルプライマーおよびプローブを用いた定量的PCR（qPCR）を用いて細菌量を定量した。使用したプライマーとプローブは、16S-F1（フォワード）、16S-R1（リバース）、16S-P1（プローブ）である。(IDT、Leuven、ベルギー）。
,
qPCRの再現性を最適化し、DNA濃度の信頼できる比較を可能にするため、16S rRNA遺伝子の合成断片（gBlocks Gene Fragment、IDT社製）を用いて標準曲線を作成した、 5′-cgg tgc gaa agc gtg ggg agc aaa cag gat tag ata ccc tgg tag tcc acg ccg taa acg atg tct act agc tgt tcg tct tgt act gtg agt agc gca gct aac gca cta agt aga ccg cct ggg gag tac gaa cgc aag-3′）。
分類学的割り当て
社内のバイオインフォマティクスパイプラインを用いて、ペアエンドリードをDADA2
(v1.16.0; maxEE = 2; truncLen = 200/150)を用いて処理した、
アンプリコン配列バリアント(ASV)の推定を可能にした。キメラは「コンセンサス」法を用いて検出、除去した。分類は、ナイーブベイズ分類法とSilva v138 (Version 2; August 2020)参照データベースを用いて行った。
DADA2の実施は、Snakemakeワークフロー管理システム（バージョン5.18.1）を用いて管理した。
DADA2の出力は、"phyloseq"Rパッケージを使用して1つのオブジェクトに統合され、その後の解析に利用された。
qPCRによる肺炎球菌の検出
肺炎球菌DNAは、肺炎球菌鉄取り込みABCトランスポーター リポ蛋白質piaBをコードする遺伝子内の配列を標的としたプライマーとプローブを用いたシングルプレックスqPCRで検出した。
および主要な肺炎球菌オートライシンlytA
および総qPCR反応容量12.5μl中の核酸抽出容量1.4μl相当を検査した。piaBと lytAの肺炎球菌負荷量は、それぞれStepOnePlus Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific, MA, USA）とLightCycler 480 PCR System（Roche, Almere, The Netherlands）を用いて定量した。いずれのアッセイもTaqman Universal Master mix（Thermo Fisher Scientific, MA, USA）を用いて行った。両方の標的遺伝子のシグナルがサイクル閾値（CT）＜40であった場合、検体はS. pneumoniae陽性とみなされた。
肺炎球菌の絶対量は前述の方法で決定した。
つまり、S. pneumoniaeHungary 19A-6株の10倍連続希釈液と、S. pneumoniaeHungary 19A-6株の10倍連続希釈液の2種類を用いた。
核酸を所定のDNA濃度で10倍連続希釈して標準曲線を作成し、各CT値に対する（マーカー特異的）肺炎球菌DNA濃度を算出した。
データの前処理
コンタミネーションや低品質のサンプルを除去するために、いくつかのフィルター処理を行った（図S6A）。我々のデータセットには、合計206,867,690の生配列が含まれ、サンプルあたりの平均シーケンス深度は29,696であった。Off-targetリードは、通常の長さ+3/-3bpの範囲外（すなわち250-256bp）のリードと定義し、データセットから除去した。
Mitochondria'、'Chloroplast'、'Archaea'、'Eukaryota'の系統群に属する分類群はデータセットから除外され、その結果、ASVは2%、リードは0.22%除外された。ASVは、既知の分類学的ランクのうち最も低いランクを使用して名前を変更し、ランク番号（平均相対存在量に基づく）を括弧内に示しました。
DNA分離ブランクを使用し、デフォルトパラメータを使用した "decontam"R-packageの "combined "メソッド（"isContaminant"関数）で、3つのニッチ（唾液、口腔咽頭、鼻咽頭）について、潜在的な汚染ASVを個別に検出した。
要するに、「複合」法には「有病率」と「頻度」の両方の方法が組み込まれている。頻度法では、生物学的シグナルを汚染から識別するために、サンプルとDNA分離コントロールにおけるASVの有病率を比較する。頻度法では、DNA密度（qPCR）とASVの相対存在量との逆相関を用いて、汚染ASVを検出します。この方法を用いて、唾液、口腔咽頭、鼻咽頭の各サンプルから、それぞれ18、213、262の潜在的な汚染物質を同定し、1つのリストにまとめました。さらに、少なくとも2つのDNA単離対照で相対存在量が1％以上であり、MiSeqラン全体で相対存在量が不規則であった17の汚染物質を手動で同定した。サンプル全体の平均相対存在量が0.01%以上の汚染物質を手動でスクリーニングし、18の「偽陽性」ヒット（アルゴリズムで汚染物質とみなされたものの、URT微生物叢にも生息していることが知られているASV）を同定した。特に、3つのニッチのうち1つのみで汚染物質と同定されたASVに注目した。全サンプルから合計441個の汚染ASVを除去しました。これらの汚染物質は、分離ブランクでも相対存在量が高かった（図 S6B）。4つのDNA分離ランでは、汚染ASVの平均割合が高く（10%以上）、データセットから除去されました。これらのDNA分離ランには、1回目の分離後に細菌密度が低く、2回目のDNA分離を試みたサンプルが含まれていた。
最後に、qPCRによって決定されたDNA濃度が0.095 pg/μl未満の4つのURTサンプルと、10,000リード未満の148のURTサンプルを除外し（図S6C）、前処理後に合計5,589のURTサンプルを保持した。下流の解析では、α多様性指標を計算する場合を除き、少なくとも2サンプルで検出率0.1%のASVを考慮した。その後のすべての解析の概要を図S7に示す。
定量化と統計解析
すべての解析はRstudio Server v2023.3.0.386内のR v4.3.2で行った。統計学的検定はすべて両側検定とし、p値は特に指定がない限り、Benjamini-Hochberg（BH）を用いて多重検定用に補正した。すべての統計解析において一貫して両側検定法を採用した。
変数の選択
2016/2017年に成人（15歳以上）と小児（1～14歳）の両方について初回調査と追跡調査を実施した。成人の初回調査は67の主要質問項目からなり、追跡調査は22の主要質問項目からなった。子どもについては、初回調査は55の主な質問で構成され、追跡調査は21の主な質問で構成された。これら4つの質問項目から、マイクロバイオームの相互作用に関する文献や専門家のコンセンサスに基づいて、47の要因を手作業で分類した。これらの因子は、4つの一般的因子、5つの季節・症状因子、6つの家庭・接触因子、12の社会経済状態・生活習慣因子、14の薬剤使用・疾患因子、3の食事因子、6の初期生活因子に分類した（表S1）。Pearson/Phi相関係数を用いて共線性を評価し、有向非循環グラフ（DAG）を用いて特性間の関係を視覚的に表すことで交絡因子を同定した。中程度から強い相関（ピアソンrが0.1～0.25）を有する特性
をモデルで調整するために考慮した。また、年齢の非線形効果を明らかにするために、8つの年齢カテゴリー（0歳、1～4歳、5～9歳、10～14歳、15～24歳、25～64歳、65歳以上）を定義した。
細菌密度と微生物多様性
アルファ多様性を解析するために、カウントデータを希釈して配列深度の違いを正規化した（最小リード数＝10,040）。Rパッケージ"microbiome"を用いてアルファ多様性指標を計算し、年齢を超えた3つのニッチの微生物多様性を評価した。また、細菌密度をlog10変換して、サンプル中の全体的な細菌量を可視化した。仮定を確認した後、年齢カテゴリー間の差異を決定するために線形モデルを使用した。鼻咽頭と口腔咽頭については年齢区分「40～64歳」を、唾液については「1～4歳」を基準群として用いた。多重検定を補正した。さらに、上咽頭では5～24歳および40歳以上、中咽頭では15歳以上の年齢群を連続変数とした。segmented"Rパッケージを使用、
を使用して、これらの年齢範囲内でブレークポイントを同定し、これによって、年齢によるシャノン指数および細菌密度の変化が緩やかであるか急激であるかを評価することができた。あるブレークポイントの前後における傾きの差の有意性を評価するために、Davies検定を用いた。
ニッチと年齢特有の関連
Bray-Curtis非類似度行列は、ASVの相対存在量を用いて "vegan"Rパッケージを実装することによって作成した。
主座標分析（PCoA）プロットを作成し、URT微生物叢組成のニッチおよび年齢特異的パターンを評価した。adonis」関数を使用し、ニッチと年齢の説明分散（R2）を決定するために、並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA）を実施した。合計365の単変量PERMANOVAを実施し、異なる宿主および環境特性と、年齢およびニッチごとのURT微生物叢との関連を決定した。PERMANOVAは、調査対象の各カテゴリーに少なくとも10人の参加者がいる場合にのみ実施した。この分析では、多重検定の補正は行わなかった。分散の均質性は、「permdisp2」関数を用いた並べ替え多変量分散分析を用いてチェックした。
最も多い属と中心的な属
3つのニッチの組成を比較するため、7～10歳の個体における最も豊富な属の平均相対存在量（平均相対存在量10%以上）を求め、棒グラフで可視化した。さらに、上咽頭微生物叢と口腔微生物叢の両方について、40～64歳の年齢カテゴリー内のサンプルの少なくとも75％に存在する属を同定することにより、中核微生物叢の存在を調べた。そして、これらの中核属の平均相対存在量を、残差（非中核属）とともに、年齢カテゴリーにわたって可視化した。
クラスター分析
Bray Curtis距離行列を用いて、完全連鎖階層クラスタリングを行い、類似した微生物プロファイルを持つ参加者の上咽頭および口腔微生物叢のクラスタを作成した。Calinski-Harabasz指標とSilhouette指標を用いて、ニッチごとの最適なクラスター数を決定した。例外的に大きなクラスターはさらに層別化した。モザイクプロットを用いて、8つの年齢カテゴリーを通してクラスター構成比を視覚化した。ロジスティック回帰を用いて、連続変数としての年齢とクラスター構成員との関連を統計的に検定した。さらに、成人（25～64歳）を参照群として、年齢区分（0歳、1～9歳、10～24歳、≧65歳）とクラスター構成員との関連を評価した。サンプリングの季節と性別で補正した。
ASVと属特異的関連
上咽頭検体について、少なくとも100検体中の相対存在量が1％以上のASVと宿主および環境特性との関連を、Rパッケージ "MaAsLin2"を用いた一般線形モデルを用いてさらに調査した。
特徴数を減らすため、また同じ属のASVで同様の反応が見られたため、口腔ニッチについては属レベルで検討した。ASVの絶対量はqPCR測定値と相対量を掛け合わせることで算出し、モデルの結果変数として使用した。宿主および環境特性の各サブセットについて、他の変数も適宜補正した。
感度分析
上咽頭微生物叢に対する性別の影響が、喫煙および飲酒状態の交絡効果によって不明瞭になっていないことを確認するために、多変量解析において追加の調整を行った。これらの調整は、観察された性差が15～24歳の喫煙や飲酒のばらつきのみによるものではないことを確認することを目的とした。モデル性能の指標として赤池情報量規準（AIC）を用い、AIC値が低いほどモデルの適合性と複雑性のバランスが良いことを示した。異なるモデル間でも性別の影響が一貫しているかどうかを確認するため、元の分析による推定値と追加調整による推定値の比較を行った。さらに、ホルモンの変化が上咽頭微生物叢に及ぼす潜在的な影響を調べるために感度分析を行った。閉経の可能性が高い女性（60～74歳）および若い女性（30～44歳）と、対応する年齢層の男性を比較し、交絡効果を最小化するために非喫煙者に焦点を当てた。
ローカルアラインメントの検出
基本ローカルアラインメント検索ツール（BLAST）と16SリボソームrRNAデータベースを利用し、デフォルトのパラメータを使用し、100％の同一性を条件として、最も存在量の多いASV（少なくとも100サンプル中の相対存在量が1％を超えるもの）について、より具体的な分類学的ランクを求めた。
謝辞
本研究は、国立公衆衛生・環境研究所（RIVM）の戦略的プロジェクトTRIuMPHに協力して実施された。オランダ（PIENTER-3）およびカリブ海オランダ（HSCN）における血清調査は、RIVMが地元の公衆衛生局（GGD）およびオランダ統計局（CBS）と緊密に協力して実施した。本研究に参加したすべてのボランティアに感謝する。本研究の一部は、Netherlands Organization for Scientific Research（NWO-VIDI、助成金番号91715359、受益者：D.B.）およびChief Scientist Office/NHS Research Scotland Scottish Senior Clinical Fellowship award（SCAF/16/03、受益者：D.B.）の助成を受けた。
著者貢献
M.-L.O.がデータの前処理、解析、可視化を行った。M.-L.O.、W.A.A.d.S.P.、E.F.、R.P.、L.A.M.S.、R.M.、K.T.、D.B.は、統計解析と結果の解釈に協力し、原案の執筆を担当した。E.F.、F.R.M.v.d.K.、E.A.M.S.、D.B.、T.B.は研究の構想および資金獲得に責任を持った。M.L.J.N.C.、J.A.G.、E.M.v.L.、R.H.、S.K.およびR.M.が実験室作業の実施と品質管理に責任を負った。すべての著者が結果の解釈に貢献し、重要な知的内容について批判的に原稿を修正し、最終原稿を承認した。