慢性消化器疾患を有する猫における糞便微生物移植に対するマイクロバイオーム反応
慢性消化器疾患を有する猫における糞便微生物移植に対するマイクロバイオーム反応
Connie A. Rojas1,2、Zhandra Entrolezo3、Jessica K. Jarett3、Guillaume Jospin3、Dawn D. Kingsbury3、* Alex Martin3、Jonathan A. Eisen1,2、Holly H. Ganz3。Ganz3 1 Genome Center, University of California - Davis, Davis, California, USA 2 Department of Evolution and Ecology, University of California - Davis, Davis, California, USA 3 AnimalBiome, Oakland, CA, USA * Correspondence: Ganz, holly@animalbiome.com (corresponding author) 簡単な概要：糞便微生物叢移植が家猫の微生物群集に与える効果や潜在的な影響については、これまでほとんど研究されてこなかった。これまで、2匹の成猫の下痢と慢性大腸炎を解決するためのFMT治療を検討したケーススタディは2件のみである。ここでは、慢性的な嘔吐、下痢、便秘を経験している68匹の猫のグループにおいて、経口カプセルFMT治療に対する便中マイクロバイオームの反応を初めて解析した。FMT治療が臨床症状の解消に77％有効であることを示すだけでなく、糞便マイクロバイオームにもわずかながら有意な変化を検出した。FMTに対する糞便微生物相の反応は、宿主の臨床症状、IBDの診断、抗生物質の使用歴、食事によって調節される可能性があることを発見しています。また、FMTレシピエントの糞便マイクロバイオームを便ドナーおよび健常猫のものと比較し、FMTレシピエントにおけるドナー細菌の生着やFMT後のレシピエントと健常動物との糞便マイクロバイオームの類似性の増加に関する新しい知見について考察している。本研究は、FMT治療を受けた猫における糞便マイクロバイオームの変化に関する包括的な分析を提供するものである。引用元 Center, G.; California, U.o.; Davis; USA Connie A. Rojas1,2 , Zhandra Entrolezo3, Jessica K. Jarett3, Guillaume Jospin3, Dawn D. Kingsbury3, Alex Martin3, Jonathan A. Eisen1,2, Holly H. Ganz3. Animals 2022, 12, x. https://doi.org/10.3390/xxxxx Academic Editor(s): Received: date Accepted: date Published: date Publisher's Note: MDPIは出版地図や機関所属の管轄権主張に関して中立的な立場をとっています。要旨：小動物医療における糞便微生物移植（FMT）の応用に関心が高まっているが、家猫（Felis catus）における有効性を検証した発表研究はほとんどない。ここでは、経口カプセルで送達される凍結乾燥便を用いたFMT治療を受けた慢性消化器疾患の家猫68匹の糞便マイクロバイオームの変化を、16S rRNA遺伝子配列決定法を用いて検討します。糞便サンプルは、治療前と治療後2週間のFMT受診者と、その便提供者、および健康な動物から採取しました。その結果、飼い主によると、77％の猫が臨床症状の改善を示し（Responder）、23％が臨床症状の変化なしまたは悪化を示した（Non-Responder）と報告されている。FMTレシピエントの糞便微生物相の変動は、宿主の臨床症状、食事、IBD診断と最も強く相関していた。Collinsella、Negativacillus、Parabacteroides、Peptoclostridiumの相対量は、FMTレシピエントで異なる変化を示した。全体として，便提供者とFMTレシピエントの間で平均13％の細菌アンプリコン配列変異（ASV）が共有されていた（治療前にFMTレシピエントに既に存在したASVを除く）．最も多く共有されていたASVは、Prevotella 9、Peptoclostridium、Bac1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 teroides, Collinsellaおよび未分類のLachnospiraceaeに分類されていた。最後に、最近抗生物質を服用したFMTレシピエントは、年齢をマッチさせた健康な参照セットとのマイクロバイオームの類似性が増加した37 Copyright: © 2022 by the authors. Creative Commons Attribution (CC BY) license (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)の条件下でオープンアクセス出版の可能性があるため提出された。他の猫と比較した場合。下痢や嘔吐を伴う下痢をした猫は、他の臨床症状を示した猫に比べて、より健康な猫に近い状態になった。この結果から、経口カプセル型FMTはこのグループの猫に有効であり、マイクロバイオーム反応はFMTを受けた猫の最初の臨床症状、過去のIBD診断、最近の抗生物質の使用、および食事によって調節される可能性があることが示唆された40。キーワード FMT; 糞便移植; 腸内マイクロバイオーム; ディスバイオーシス; IBD; 下痢; 抗生物質; 猫 42 43 44 45 Animals 2022, 12, x. https://doi.org/10.3390/xxxxx www.mdpi.com/journal/animalsAnimals 2022, 12, x FOR PEER REVIEW 2 of 23 1. はじめに 正確な代用品ではないが、糞便マイクロバイオームは、消化管に生息する何兆もの微生物を反映している。この微生物は、宿主の消化46 47 48 トーション、免疫および病原体防御、腸管バリアの恒常性に集合的に寄与する[1]。糞便マイクロバイオームの構成は非常に動的であり、年齢 [2、3]、性 [4]、体調 [5]、食事 [6、7]、生息環境 [8、9]、抗生物質の使用 [10] といった様々なホスト因子と相関する一方で、構成におけるより持続的な変化も病気や感染症と関連してきた [11 、12]。健康な動物と比較して、病気や感染症の動物の糞便微生物53 は、微生物多様性が減少している可能性があり [13]、発酵性細菌または短鎖脂肪酸（SCFA）産生細菌のような機能的に重要な微生物の存在量が減少している [14] 、または病原性の分類群の存在量が増加している [15, 16]。糞便マイクロバイオーム組成のこれらの擾乱は、宿主の健康に直接影響を与える可能性がある。最近の研究では、健康なドナーからレシピエントの消化管に糞便微生物を移植する糞便微生物腔移植（FMT）が、様々な健康状態の治療や予防、健康状態の改善60に有望であることが示されている[17-19]。FMTは、マイクロバイオームの多様性を高め、有益な微生物の数を増やし、あるいは病原体に対抗することで、マイクロバイオームを再増殖させ、糞便中の微生物61 の組成、多様性および恒常性を回復させることができる[17-19]。FMT は、従来の治療法（特に効果がないことが証明されている場合）の代替となり得るし、臨床症状の解 消を促進するために既存の治療法を補完することも可能である。FMTは、少なくとも18世紀以降、牛、馬、羊、その他反芻障害、消化不良、食欲不振、大腸炎を患う動物の治療に使用されてきた [20、21]。最近では、犬の急性下痢、再発性慢性下痢、犬パルボウィルス、炎症性腸疾患の治療にFMTが使用されている[22-25]。糞便移植は予防策としても利用でき、病原体への曝露や疾患の発症前に投与することで動物の健康を向上させることができる[18]。哺育豚において、健康でパー71 73 イティの高い母豚の糞便を与えられた個体は、FMT治療を受けなかった個体と比較して、豚サーコウイルスに感染した際の死亡率の低下、体重増加、抗体の持続的産生74を経験した[26]。同様に、離乳期に母親の糞便を接種したイヌは、FMTを受けなかったイヌと比較して下痢の発生率が減少することが示された[27]。これらの一連の証拠は、微生物がドナーからレシピエントのマイクロバイオームに導入され、そこで長期間維持されることで、健康状態の改善につながる可能性があることを示唆している。また、疾患の解決にはマイクロバイオームの完全な生着が必要でない可能性があり、したがって、シナリオによっては、1回または数回のFMT治療が効果的であることが研究により示されている[26, 28]。FMTの応用、特に消化器系疾患の治療への関心が高まっている一方で、80 81 82 83 84コンパニオンアニマルにおけるFMTの有効性を評価した発表済みの研究はほとんどない。先行研究のほとんどは、単一個体または数個の個体における FMT 治療のケーススタディーに限られており、より大規模な分析、特にネコ科動物の86 分析は欠落している。家猫（Felis catus）のケーススタディでは、FMT治療により6歳の猫の嘔吐と下痢が長期に渡って消失し [29]、成猫の慢性潰瘍性大腸炎が消失した[30]。ここでは、この研究を発展させ、嘔吐、下痢、便秘を含む慢性消化器疾患に罹患した 68 頭の家猫において、16S rRNA 遺伝子配列決定法を用いて経口カプセル FMT 治療に対する糞便微生物群の反応を調べる（表 1）。まず、FMTの有効性を、治療により臨床症状の軽減が見られた個体数を報告することで評価した92。次に、FMTレシピエントの糞便マイクロバイオームの詳細な変化を説明し、これらの反応が5つの宿主因子（臨床症状、IBD診断、FMT治療への反応、最近の抗生物質使用、食事カテゴリー）と相関しているかどうかを判断します（図1A）。次に、FMTレシピエントとその便ドナーの間に移植された、あるいは共有された細菌アンプリコン配列バリアント（ASV）-種の後ろにある最も94 95 96 97精緻な分類学のレベル-を特定する（図1B）。また、FMT レシピエントの ASV 生着率にばらつきがあるかどうかも検討した。最後に、FMT治療終了後、FMTレシピエントの糞便微 生物99 100 オームが健康なペット猫にどの程度似ているかを評価した（Fig 1C）。また、FMT受診者の糞便中の微生物103 については、便の提供者や健康な愛猫との比較も行っている。104 105 図1．本研究では、主に3つの糞便マイクロバイオーム比較を実施した。A) 5つの宿主予測因子106 107 がマイクロバイオーム組成、α-多様性、β-多様性と有意に関連するかどうかを検証し、FMTレシピエントの糞便マイクロバイオームのシフトを調査した。B) 108 FMTレシピエントの糞便マイクロバイオームをFMT便ドナーのものと比較し、どのASVがFMTレシピエントに「移植」されたかを同定した。C) 110 最後に、治療後のFMTレシピエントの糞便マイクロバイオームが、健康な猫のマイクロバイオームと111 類似するようになったかどうかを調べた。2. 材料と方法 2.1. 研究動物、サンプル収集、および調査 ソーシャルメディア（主にIBDを持つ猫のケアに焦点を当てたFacebookグループで、Facebook、Instagram、Twitterに投稿）を利用し、慢性消化器疾患（下痢、嘔吐、および/または便秘など）の症状を示す猫を飼っていて、経口FMTカプセルをケアに加えることに興味がある人を募集しました。参加者全員112 113 114 115 116 117 118 (N=68) がインフォームドコンセントに署名し、パイロット試験キットを送付された。キットには、FMTカプセル50個、健康調査票、糞便サンプル2個を採取するための資料が含まれていた。参加者は、25 日間、毎日 1～2 カプセルを餌と一緒に飼い猫に経口投与した。また、糞便中のマイクロバイオーム組成の変化を正確に評価するため、カプセルの投与前と投与2週間後に猫の糞便サンプルを採取するよう依頼された。また、飼い主は、1（硬い便秘）から7 125（水のような下痢）までの糞便スコアリング尺度を用いて、カプセル開始前およびFMT治療後の飼い猫の典型的な糞便の粘度を記録した（3および4は通常の粘度と考えられる）[31]。各猫の人口統計学的、身体的、およびライフスタイルの情報を収集するために、飼い主は、猫の年齢、品種、性別、避妊・去勢手術の状況、および食事について尋ねる健康調査票に記入した128。さらに、飼い主は愛猫の体調を1（体重が著しく少ない）から10（体重が著しく多い）までの尺度で採点し、5を健康な体調と見なした。この調査では、飼い猫の一般的な健康状態に関する質問と、獣医師から受けた診断の有無も尋ねている。重要なことは、飼い主が FMT カプセルで軽減させたいと考えている具体的な臨床症状を記録していることである。FMTカプセルの投与後、飼い主は治療に対する猫の反応を記述するよう求められ、その反応を成功、中程度に成功、成功しなかった（例：被検者が症状の変化を感じなかった、または悪化した）に分類した。FMT 受診者の特徴の要約は表 1 を参照のこと。138 試験計画書およびインフォームド・コンセントは、動物福祉法に準拠している。カプセルは、慢性消化器疾患に対して獣医師が提供する標準治療に追加して投与された。参加者は試験に参加する前に 139 140 獣医師に相談するようアドバイスされ、いつでもいかなる理由でも 142 試験から脱落することができることを知らされた。143 表 1. 経口カプセル FMT 治療を受けた 68 頭の猫の要約的特徴。特徴 年齢（年） ボディコンディション（1-10） 性別 品種 小分類 女性 男性 ドメスティックショートヘア その他の品種 ウェット ドライ ローダイエット ウェット＆ドライ ウェット＆ロー その他のダイエット（ウェット＆ドライ＆ローを含む。
Raw & Dry) 避妊・去勢済み 抗生物質 IBD FMT への反応 初期症状 Yes No Yes No Unknown Yes No Maybe Improved No Change Wensened Constipation (only) Diarrhea (only) Vomiting & Diarrhea Other, including None, Vomiting & Constipation, Diarrhea & Condipation FMT 受診者 (N=68) 9.35 ± 4.92 4.90 ± 1.0. 57 30 (44%) 38 (56%) 30 (44%) 8 (12%) 7 (10%) 16 (24%) 20 (29%) 9 (13%) 8 (12%) 67 (98%) 1 (2%) 34 (50%) 33 (48%) 1 (2%) 35 (51%) 20 (30%) 13 (19%) 52 (77%) 5 (7%) 11 (16%) 31 (46%) 17 (25%) 9 (13%) 146 144 145動物 2022年, 5 of 23 慢性的な消化器系の症状（例：下痢、嘔吐）を示している猫。 本調査では、下痢、嘔吐、便秘などの慢性的な消化器疾患の症状を示す猫を募集した。飼い主は、飼い猫の健康状態および人口統計調査に協力し、経口カプセルFMT治療前および治療後2週間の糞便サンプルを採取した。2.2. FMTカプセルの調製。健康な室内飼いの猫10匹から糞便を採取した：6匹の個人ドナーおよび2組のドナーから（同居する2匹の猫147 148 149 150 151 152 153の糞便を合体させたもの）。ドナーは、過去1年間に抗生物質による治療を受けておらず、薬も飲んでおらず、既知の健康状態、現在の感染症、最近の手術はなく、155 行動上の問題もなかった。年齢も2歳から9歳（平均4.73±4.56歳）と幅広く、16S rRNA遺伝子配列決定による糞便中のマイクロバイオーム組成は、参照データベース中の健康な猫と同程度であった。糞便の一貫性が適切であった（スコア3-4）すべてのドナーサンプルは、qPCRと培養の両方を用いた病原体スクリーニングのために、カリフォルニア大学デービス校のリアルタイムPCRおよび診断コア施設に提出された。サンプルは、Clostridiodes difficile toxins A and B、Cryptosporidium spp、Salmonella spp、Giardia spp、Feline Coronavirus、Feline Parvovirus (Panleukopenia) および Tritrichomonas foetusについてスクリーニングされた。また、ドナーは定期的に糞便浮遊法（IDEXX社）により蠕虫寄生虫と原虫オーシストのスクリーニングを行った。ドナー動物は平均4.93±3.43歳で、ほとんどがウェットフードとドライフードの両方の食事を摂取するドメスティックショートヘア（75％）であった（50％；表S1）。6人のドナー個体と2組のドナーの糞便サンプルは、レシピエント動物に投与されるFMTカプセル（表S1）の材料となった。ドナーの材料は毎日採取された。糞便の粘度が最適でないもの、過剰な粘液、カビ、ハエ、不快な臭い、または色のついた便はすべて廃棄された。便は、20%グリセロール（湿重量）と混合し、-40℃から-50℃で凍結乾燥する前に、ごみ、毛、およびあらゆる異物を除去した。便を完全に凍結乾燥した後、158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172は、微粉砕してサイズ4のカプセルに入れるまで-20℃で保管された。我々は、厳格な品質管理ガイドラインと標準作業手順書に従った。カプセルのバッチは、ドナーおよびロット番号でラベル付けされ、FMTレシピエントにランダムに割り当てられた。175 176 Ganz ら[3]のデータ（表 S2）を用いて、健康な猫 166 頭と慢性消化器疾患を持つ FMT レシピエントとの比較のために、参照セットを比較した。これらの 178 猫は、既知の健康状態、臨床症状、診断を持たず、ボディコンディションスコアが 3 から 6（平均 5.14 ± 0.47） または計算上の BMI が 50 以下で、180 飼い主から再入力された情報によると、過去 12 ヶ月以内に抗生物質を摂取していない。猫の年齢は1～12歳（平均4.99±3.23歳）であったが、統計解析のために、FMTレシピエントは健康な参照セットの猫と年齢を一致させた（「統計解析：FMTレシピエントと健康な愛猫との糞便マイクロバイオームの類似性」参照）。これらの166匹の猫のうち、55%が女性で、約半数が185匹のドメスティックショートヘア（52%）で、ほぼ全員が避妊または去勢されていた（91%）（表S2）。186 食事内容は、ウェットフードとドライフード（30％）、ドライフードのみ（12％）、生食のみ（11％）の2種類が主流であった。188 2.3. DNA 抽出および 16S rRNA 遺伝子配列の決定。189 飼い主は、FMT治療前後の猫（n=68）の糞便を、100%エタノールとシリカビーズを含む2mLスクリューキャップチューブに入れた。これらはAnimalBiome社（カリフォルニア州オークランド）に送られ、さらなる分析が行われるまで48℃で保管された。糞便は遠心分離により保存用緩衝液から分離し、QIAGEN DNeasy PowerSoil Kits (Germantown, MD) を用いてゲノムDNAを抽出した。194 簡潔に言えば、サンプルを C1 溶液を含むビーズチューブに入れ、65°C で 10 分間インキュベートし、ビーズビーターに 2 分間入れ、その後は製造者のプロトコルに沿って記述された通りに行った。健康なペット（n=166）およびドナー動物（n=20）の糞便サンプルから、同様の方法でDNAを抽出した。ドナー動物には、4匹の猫195 196 197 198Animals 2022, 12, x FOR PEER REVIEW 6 of 23がそれぞれ1つの糞便サンプルを、1匹の猫が2つのサンプルを、そしてもう1匹の猫が6つのサンプルを有していた。また、2組のドナー（2匹の猫が同居し、その糞便を合わせたもの）には、それぞれ3匹と5匹の糞便サンプルがあった。このように、10匹のドナー動物から合計20個の糞便サンプルを採取し、マイクロバイオーム解析を行った。202 16S rRNA遺伝子のV4領域のアンプリコンライブラリーは、Pichlerら2018［33］に詳述されているように、Illumina Miniseqプラットフォーム用に適合させた複数のバーコード（indices）を有する完全融合プライマー204（505F／816R）（Ultramers、Integrated DNA Technologies）によるデュアルインデックスの1段階PCRを用いてex203 tracted DNAから生成された。PCR reac206 tionsは、0.3-30 ngのテンプレートDNA、0.1 µlのPhusion High-Fidelity DNA Polymerase 207 (Thermo Fisher), 1X HF PCR Buffer, 0.2 mM each dNTP, および10 μMの正逆接合プライマー208 を含んでいた。PCR条件は以下の通り：98°Cで30秒間の変性、98°Cで10秒、55°Cで30秒、72°Cで30秒のサイクルを30回繰り返した。最終伸長は 72℃、4 分 30 秒で行い、回収まで 6℃で静置した。PCR 211産物の増幅は、SYBR Safe (Ther212 moFisher)を用いて2%E-Gel上で行うことにより評価した。PCR産物はSequalPrep Nor213 malization Kit (Thermo Fisher)を用いて精製し、標準化した。PCR産物は最終的なライブラリにプールされ、各214は95サンプル（この研究のすべてではない）と1ネガティブコントロール（ブランクサンプルex215 traction）を含んでいた。最終ライブラリーはQUBIT dsDNA HS assay (Thermo Fisher) で定量し、1.8 pMに希釈し、イルミナのMiniSeqの仕様に従って変性させた。同一に処理されたphiXは、15%で配列決定反応に含まれた。ペア218エンドシーケンス（150bp）は、最終ライブラリーごとに1つの中間出力Illumina MiniSeqフローセルで実施された。2.4.16. S rRNA配列処理。レシピエント動物（68個体、136糞便サンプル）、ドナー動物（10個体、20糞便サンプル）、健常参照動物（166個体、166糞便サンプル［3］）の糞便サンプルから生の16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンスを入手した。R (v3.6.2) の Divisive Amplicon De225 Noising Algorithm (DADA2 v1.14.1) パイプライン [34, 35] を用いて Se219 220 221 222 223 224 quences をトリミング、品質フィルター、dereplicated を行った。具体的には、フォワードリードを 145 bp に、リバースリードを 140 bp にトリミングした。エラーレートを計算した後、DADA2 のコアなノイズ除去アルゴリズムを用いて ASV を推定し、カイ228 メラを除去した。DADA2パイプラインは、より高い精度を達成するために、ASV呼び出し後にペアエンドリードをマージする[34]。全体として、FMT治療を受けた動物からのサンプルは、DADA2での処理後に平均56,615 ± 26,134配列を含み、231ドナー動物からのサンプルは平均62,299 ± 23,558配列を含み、健康参照セット232からのものは平均45,786 ± 27,918配列を含んでいた。Silva reference data234 (v138) [36, 37] に対して DADA2 のナイーブベイズ分類器を用いて ASV の分類を行い、Eukarya、Chloroplasts、Mitochondria と分類された ASV はデータセットから削除されました235。受信者糞便マイクロバイオームデータセットには3099個のASVが、ドナーデータセットには2060個のASVが、そして健常者参照データセットには2718個のASVが含まれていました。レシピエント、ドナー、健常動物のすべての糞便サンプルのASV相対存在量表、ASV分類名リスト、メタデータは、補足資料として公開しています（表S3-S5）。2.5. 統計解析：宿主の説明変数の定義 241 特に断らない限り、すべての統計解析および図はR（v3.6.2）[35]で実施した。解析中、サンプルは、FMTカプセルコース治療に参加した猫に由来する場合は「レシピエント」サンプル、166匹の健康な猫に由来する場合は「健康」サンプル、10人の便ドナーのいずれかに由来する場合は「ドナー」に分類された245。また、「レシピエント」サンプルは、採取時期により「PreFMT」と「PostFMT」に分類された。246 247 レシピエントサンプルについて、5つのホスト予測因子（治療への反応、初期臨床症状、IBD 診断、抗生物質使用、食事カテゴリー）を含む様々な統計分析を行った（図 1A）。治療への反応の変数では、レシピエントの動物が FMT 治療後に臨床症状の改善を報告した場合は「反応者」、FMT 治療後に臨床症状の変化なしまたは悪化を報告した場合は「非反応者」として分類された。臨床症状は、下痢のみ、便秘のみ、下痢を伴う嘔吐に分類された（表1）。その他の症状の組み合わせはすべて「その他」のカテゴリーに分類された。IBDの診断については、獣医師からIBDと診断された動物（「はい」）、IBDの疑いがあるが正式な診断を受けていない動物（「たぶん」）、IBDと診断されていない動物（「いいえ」）をカテゴリーに分類しています。最近（2週間以内）抗生物質を投与された猫を「はい」、それ以外を「いいえ」と分類した。259 最後に、宿主の食事は6つの個別カテゴリーで構成された。ドライフードのみ、ウェットフードのみ、生食のみ、ウェットとドライフード、ウェットと生食、その他である。表1は、各宿主因子とそのサブカテゴリのサンプルサイズを示している。また、猫の品種、ボディコンディションスコア、避妊・去勢手術の有無などの情報もあったが、サンプル間で十分なばらつきがなかったため、解析用の変数として選択しなかった（表1）。例えば、98％の猫が不妊手術を受けていたため、この変数は統計分析に適さない。2.6. 統計解析
糞便微生物群のα-多様性とβ-多様性。FMTレシピエントからのサンプルの糞便マイクロバイオームα-多様性を算出した。262 263 264 265 266 267 268 269は、マイクロバイオーム解析において統計的に不適切であることが示されているため、同数の配列にサブサンプリングしてサンプルを希薄化することはしなかった[38]。すべてのサンプルは、270 少なくとも8600リードを有していた。ASVの豊富さはphyloseq (v1.30.0) [39]、Pielouの均等性はmicrobiome (v1.15.2) [40]、Faithの系統的多様性は picante (v1.8.2) [41]で計算し、後者はDECIPHER (v2.14.0) [42] とphangorn (v2.5.5) [43] でASV配列から作った系統樹で供給後に計算しました。線形混合モデルは、lme4（v1.1-29）［44］パッケージを使用して、FMT受信者の糞便マイクロバイオームの豊富さ、均一性、または系統的多様性に違いがあるかどうかを評価した。すべてのモデルは、3つのアルファ多様性指標のうちの1つを従属変数として含んでいた。モデル#1では、FMT前のサンプルとFMT後のサンプルを比較し、個体識別をランダム効果として設定した。モデル#2は、FMT前（またはFMT後）のアルファ多様性値を5つの宿主予測因子（IBD診断、臨床症状、抗生物質使用、治療への反応、食事）に対して回帰し、宿主の年齢と性別をランダム効果として設定した（図1A）。独立変数の統計的有意性は、car 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 package (v3.0-13) [45] を用いた尤度比検定 (LRT) により、a=0.05 と設定した。糞便微生物群のα多様性の箱ひげ図は、ggplot2（v3.3.6）[46]を用いて作成した。284 FMTレシピエントにおける糞便マイクロバイオームβ多様性を解析するために、phyloseqを用いて未照合データから2種類の距離行列を構築した。この2つの距離は、286サンプル間の組成の非類似性を捉えるBray-Curtis非類似度指数と、288細菌ASV間の系統的関係を考慮したWeighted Unifrac距離であった。FMT受診者の糞便マイクロバイオーム構造（β多様性など）が異なるかどうかを調べるために、veganパッケージ（v2.6-2）[47]を用いてPer289 MANOVA（変量解析）モデルを構築した。すべてのモデルは、2つの距離のうち1つを従属変数として含み、999通りの順列を使用した。モデル#1 292 は、FMT 前サンプルと FMT 後サンプルを比較し、この変数をモデルの第 1 項に含めることで、個人差を制御した 293。モデル#2は、FMT前（またはFMT後）のβ多様性を、5つの宿主予測因子（IBD診断、臨床症状、抗生物質使用、治療への反応、食事）と、さらに2つの説明すべき変数（年齢、性別）に対して回帰させた（図1A）。PERMANOVA検定で統計的に有意な関係（a=0.05）が得られた場合、Permutational Analyses Of Multivariate Dispersions（PERMDISP）［47］を用いて、グループ間のマイクロバイオーム分散の差異を検定した。主座標分析（PCoA）の順序付けは、ggplot2で行った。2.7. 統計解析：細菌属の相対的存在量 298 299 300 301Animals 2022, 12, x FOR PEER REVIEW 8 of 23 我々は、レシピエント動物においてコアまたは潜在的病原性分類群の相対存在量が変化したかどうか、そしてこれらの変化が5 303 宿主予測因子と関連するかどうかを調査した。この結果、健康なネコの集団から採取したサンプルの少なくとも55%で検出された属レベルの細菌分類群をコア属（N=21）と定義した（表S8）。305 病原性の可能性のある分類群は、ネコ科動物に病原性を有する可能性のある5つの細菌属とした（表S9）[48-51]。試験したすべての分類群は、307 FMTレシピエントからのサンプルの少なくとも10％において検出されたものでなければならない。一般化線形モデルは、細菌分類群iの相対的存在量（FMT後FMT前）の変化（Δ）を従属変数とし、5つの宿主予測因子（治療に対する宿主反応（反応者対非反応者）、初期提示症状、抗生物質の使用、IBD状態、および食事）を独立変数として指定した。これらのモデルは、宿主の性別や年齢を予測変数として含まない。なぜなら、どちらも糞便マイクロバイオームのαまたはβ多様性を有意に予測しなかったからである。線形モデルにはstatsパッケージ[35]を使用し、統計的有意性は前述のように尤度比検定を用いて評価した。統計的に有意な属の相対存在度の変化（Δ）のプロットは、ggplot2を用いて作成した。2.8. 統計解析 FMTレシピエントとその便ドナーの間で共有されるASV。本研究の第二の目的は、どのドナー微生物がFMTレシピエントにおいて生着（すなわち移行）しうるかを特定し、FMTレシピエントとその便ドナーの間でASV共有率を計算することであった（図1B）。我々は、Ianiroらによるメタアナリシス2022[52]を参考に、8つの異なる疾患にわたるヒトコホートでFMT後の菌株生着を調べた計算を使用した。この研究では、ASV共有率は、FMT後のサンプルとその便ドナーの間で共有されたASVの数（FMT前のサンプルとドナーの間で共有された分類群を除く）を、ドナーサンプル中のASVの総数（FMT前のサンプルと共有された分類群を除く）で割って算出した309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 320 321 322。線形混合モデルは、FMTレシピエントのASV生着率が、関心のある5つの宿主予測因子と相関しているかどうかを評価し、宿主の年齢と性別をランダム効果として設定したものである。別の一般化線形モデルは、ASV生着率が便提供者間で異なるかどうかを検証した。ASV 分与率のプロットは、ggplot2 で作成した。2.9. 統計解析：FMT レシピエントと健康なペット猫との間の糞便マイクロバイオームの類似性。最後に、FMTレシピエントの糞便マイクロバイオームが、年齢をマッチさせた健康な動物の糞便マイクロバイオームと近似しているか、あるいは「より似てきた」かを検証した（図1C） 329 330 331 332 333 [3]. 例えば、IBDの猫の糞便マイクロバイオームが、IBDでない猫と比較して、健康な動物と似てくるのか、似てこなくなるのかを調べたいと考えた334。335 これらの分析には、2つのベータダイバーシティ距離を使用し、レシピエント動物と健康な動物とのペアワイズ比較のみを保持した（例えば、レシピエント対レシピエント比較や健康対健康比較は除外した）。年齢が1年以内の猫同士のペアワイズ比較のみを保持した。糞便マイクロバイオーム類似度の変化（Δ）は、以下のように算出した。[猫iのFMT後サンプルと健常動物iiとの類似度 ] [ 猫iのFMT前サンプルと健常動物iiとの類似度 ]。これらの計算を、年齢をマッチさせた健常者と比較した68人のFMTレシピエントすべてについて行い、得られたデータフレームを統計解析に使用した。一般化線形モデルは、糞便マイクロバイオーム類似度の変化（Δ）が、5つの宿主予測因子（治療に対する宿主反応、最初の存在336 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347の症状、抗生物質の使用、IBD状態、食事）と相関しているかどうかを検定した。統計的有意性は、前述のように尤度比検定（LRT）を用いて評価した。糞便マイクロバイオーム類似度（Bray-Curtis）のΔのプロットは、ggplot2を用いて作成した。350 351Animals 2022, 12, x FOR PEER REVIEW 9 of 23 3. 結果 3.1. FMT の臨床的成功およびレシピエントにおけるマイクロバイオーム反応 合計 68 頭の猫が経口カプセル FMT 治療を受け、本研究のためのデータを提供した。参加者の約半数は獣医師からIBDと診断されており、かつ/または抗生物質を服用していた（表1）。治療前、FMT受診者の46％が下痢のみ、16％が便秘のみ、25％が下痢を伴う嘔吐、13％がその他の臨床症状の組み合わせを経験していました。FMT治療から2週間後、約77％の参加者が飼い主の言うとおりに体調の改善と臨床症状の軽減を経験し（「応答者」）（表1）、23％の参加者が目立った変化なし、または体調の悪化を経験した（「非応答者」）。このように、FMTカプセルの経口投与により、大多数の参加者が臨床的成功を収めた。352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362 363 「応答者」は、「非応答者」と比較して、女性、生食とウェットフードを併用する 364 猫、便秘を経験している猫がやや多く（図 365 S1）、代わりに IBD または IBD の疑いがある猫の割合が多く、嘔吐と下痢の猫の 366 割合がやや多く、ドライフードとウェットフードを併用する猫の割合が多くなっている。反応した動物は、非反応した動物（10.30年±4.57年）よりもわずかに若かった（8.96年±5.02年）（表1）。また、応答者、非応答者ともに約50％の猫が最近抗生物質を服用していた（図S1）。369 370 次に、FMT の臨床的成功のパターンがマイクロバイオームレベルでも観察可能であるかどうかを検討した。FMT受診者の糞便微生物相にばらつきはあったのか？応答者と非応答者の糞便マイクロバイオームは異なっていたのか、IBDを持つ猫とIBDを持たない猫の糞便マイクロバイオームは異なっていたのか。そこで、便中微生物のαおよびβ多様性を、治療への反応、初期の臨床症状、抗生物質の使用歴、IBDの診断、食事という5つの主要な宿主因子と相関させた（図1A）。結果は、FMT治療前に、レシピエント動物の糞便マイクロバイオームα-多様性は、食事カテゴリーによって最もよく予測されることを示した（表S6）。生食または生食とウェットフードの組み合わせを摂取していた猫は、他の食事を摂取していた猫よりも、わずかに均一な糞便マイクロバイオームを保有する傾向があった（図2A）。FMT治療後、糞便マイクロバイオームの発散度374 375 376 377 378 379 380は、個体の治療前の臨床症状と有意な相関があった（表381 S6）。嘔吐と下痢の両方に罹患した猫の細菌群集は、下痢、便秘、またはその他の症状の組み合わせの猫の細菌群集よりも均一性が低かった（図2B）。FMT前とFMT後のサンプルの豊かさ、均等性、系統的多様性に違いは検出されなかった（GLM LRT ASV Richness χ2=0.49, 384 P=0.48; Pielouの均等性 χ2=0.013, P=0.48; PD χ2=0.58, P0.44）ため、FMT前のサンプルはFMT後のサンプルと比べて多様性に劣ったり大きくなったりしない 386 ことが確認できた。387 FMT治療前の糞便マイクロバイオームβ多様性は、臨床徴候と食事カテゴリーによって最もよく予測され、それぞれが個人間の糞便マイクロバイオームの変動の10〜11％を占めた（図2C、表S7）。治療への反応、抗生物質の使用、390 IBD診断、年齢（年）、または性別は、FMT前の糞便マイクロバイオームの変動と有意な関連はなかった（表S7）。異なる臨床症状を経験したホストの糞便マイクロバイオームの分散は、差がなかった（PERMDISP Bray-Curtis F=1.45、P=0.23。
Weighted Unifrac F=2.05, P=0.11）、ホストの食事についても同様であった（PERMDISP BrayCurtis F=0.64, P=0.66; Weighted Unifrac F=1.70, P=0.14）。FMT前のマイクロバイオームと同様に、FMT後のマイクロバイオームも、IBD診断に加えて、臨床症状および食事カテゴリーと強い相関があった（図2C-F）。宿主の臨床症状はマイクロバイオームの変動の12％を占め、宿主の食事はさらに変動の11％を説明した（表S7）。IBDの診断は、個人間のばらつきの約5％を占めた（図399の2D、表S7）。さらに、糞便マイクロバイオームがどの程度異質であるかに違いはなかった400。したがって、異なるIBD診断、臨床症状、食のサンプル間の違いは、その分散ではなく、マイクロバイオーム構造の違いに完全に起因すると考えられる（IBD PERMDISP Bray-Curtis F=1.72、P=0.18;体重:1.8、P=1.8、P=1.9）。 72, P=0.18; Weighted Unifrac F=2.55, P=0.08） 402 403Animals 2022, 12, x FOR PEER REVIEW 10 of 23 (Clinical signs PERMDISP Bray-Curtis F=1.47, P=0.23; Weighted Unifrac F=1.10, P=0.35) (Diet PERMDISP Bray-Curtis F=0.42, P=0.83; Weighted Unifrac F=0.35, P=0.87) とした．最後に、FMT前のサンプルの糞便マイクロバイオームはFMT後のサンプルの糞便マイクロバイオームと非類似であり、観察されたパターンは我々のサンプリングの人工物や偏りではないことを示唆した（PERMANOVA Bray-Curtis catID R2 404 405 406 407 =0.82、P=0.001、サンプル）。 82, P=0.001, サンプルタイプ R2=0.002, P=0.53; Weighted Unifrac catID R2 =0.84, P=0.001, サンプルタイプ R2 =0.001, 409 P=0.48） (Fig S2). 興味深いことに、猫の個体識別は、糞便マイクロバイオームの分散の83%を説明し、治療前後の同一個体のサンプルの糞便マイクロバイオームには顕著な一貫性があることが示された410。このことは、FMT前とFMT後のマイクロバイオームの違いは、グローバルなものではなく、特定の細菌分類群の相対的な存在量に特有である可能性をも示唆している。414 415Animals 2022, 12, x FOR PEER REVIEW 11 of 23 Figure 2. 図 2. FMT レシピエントにおける糞便マイクロバイオームのアルファおよびベータ多様性の宿主予測因子。図 2：FMT受診者における糞便マイクロバイオームのαおよびβ多様性の宿主予測因子 A）FMT受診前サンプルにおける食事カテゴリー別マイクロバイオームの均等性（Pielouの均等性）および 417 B）FMT受診後サンプルにおける臨床徴候の箱416プロット。C) PERMANOVA 検定による宿主予測因子で説明される分散の割合（Bray-Curtis および Weighted Unifrac 距離の平均；厳密値については表 S7 を参照）。D) IBD 診断、E) 臨床症状、F) 食事のカテゴリーによる FMT 後サンプルのクラスタリングを示す Bray-Curtis 距離に基づく PCoA 順位図。3.2. FMT 受診者における中核細菌属と病原性細菌属の相対存在量の変化 421 432 次に、FMT 治療後 2 週間の糞便マイクロバイオームの変化の基礎となっている可能性のある特定の細菌分類群を識別するため、より 細かい分析を実施した。425 個体によっては、FMT治療期間中に特定の分類群の相対量が減少または増加した可能性がある 426 。具体的には、コア属または潜在的病原性属の相対存在量の変化（FMT後-FMT前）が、治療に対する宿主の反応（反応者 vs. 非反応者）、初期の提示症状、抗生物質の使用、IBD状態、食事と相関428があるかどうかを検証した（図1A）。健康なペット猫[3]の糞便マイクロバイオームで中核を構成する21の細菌属（表S8）のうち、3つの属（Blautia、Collinsella、Negativacillus）の相対存在量は、臨床症状と関連した432。特に、下痢を伴う嘔吐に苦しむ猫では、3つの分類群すべての相対量が減少する傾向があった（Fig 3A-C, Fig S3）。また、パラバクテロイデスおよびペプトクロストリジウムの相対現存量は、IBDの診断によって変化し、IBDを発症していない猫に比べて、パラバクテロイデス相対現存量が増加し、ペプトクロストリジウム相対現存量が減少しました（図3E-F、図S3、表S8）。2つの細菌属の存在量は、レスポンダー動物と非レスポンダー動物で異なっていた（Fig 3H-I、Table S8）。特に、PeptococcusとRumi437 439 nococcusの相対量は、非レスポンダー動物でわずかに増加し、レスポンダー動物では主に同じままであった（図S3）。抗生物質を服用したことがある猫とない猫では、中核となる属の相対量に統計的に有意な変化は認められなかった（Table S8）。Lachnoclostridiumの相対存在量は、ドライキブルの缶詰ウェットフードを食べた猫では、他の調査対象の猫と比較して減少した（図S3、表S8）。病態の可能性がある 5 種類の属の相対量の変化を調べたところ、他の症状447 と共に便秘を示した FMT レシピエントは、下痢だけの動物448 と比較して、Desulfovibrio 負荷がわずかに増加した（図 3G、図 S3、表 S9）。さらに、IBDの可能性があるネコは、他の調査対象ネコと比較して、ヘリコバクター相対量が増加する傾向があった（Fig 3D、Fig S3）。最後に、100%ドライキブルを与えた動物は、他の飼料を与えた猫と比較して、Veillonellaの相対量が増加する傾向があった（Fig S3、Table S9）。453Animals 2022, 12, x FOR PEER REVIEW 12 of 23 図3. FMT 治療を受けた猫における細菌属の相対存在量の変化。454 455 線形混合モデルにより、10細菌属の相対存在度の変化が、A-D) 宿主の臨床症状、E-G) IBD診断、または H-I) 治療への反応 456 と有意に関連していることが示された。Tukey linear contrasts を用いた posthoc 検定の統計的出力は、Fig S3 を参照。458 3.3. FMT レシピエントとその便ドナーの間で共有される ASV 本研究のもう一つの目的は、FMT レシピエントとそのドナーの糞便マイクロバイオームを比較し、FMT レシピエントで共有または生着する可能性がより高い細菌 ASV を特定することにあった（図 1B）。また、ASVの生着効率に個人差があるかどうかを検証し、その値を宿主の予測因子と相関させた。このため、FMT前のレシピエントとそのドナーの間で共有されていたASVを除いて、FMT後のFMTレシピエントとその特定の便ドナーの糞便マイクロバイオーム間で共有されていたASVを解析した。ASV生着率は、生着能力を持つドナーASVの総数に対する、FMTレシピエントに生着したドナーASVの割合である。FMTレシピエント全体のASV生着率は3.25％～36.56％で、平均13.26％（±6.24％）だった（図4A、表S10）。すなわち、FMT便ドナーに存在し、生着または共有する能力を有する細菌ASV（×̅：538 ASV、範囲：189-1086 471 ASV）のうち、平均で約13％（×̅：65 ASV、範囲：14-172 ASV）がFMTレシピエントに正常に生着した（Table S10）。したがって、この猫のコホートでは、完全なマイクロバイオーム生着は観察されなかった473。FMTレシピエントのASV生着率は、治療への反応、初期臨床症状、IBD診断、抗生物質の使用歴、食事との有意な関連は認められなかった（LMM LRT Response χ2=0. 63, P=0.42; 臨床症状 χ2=0.52, P=0.91; IBD χ2=1.5, P=0.47; 抗生物質 χ2=0.09, P=0.76; 食事 χ2=5.37, P=0.37)．ASV共有率はドナーのアイデンティティによって有意に予測され（クラスカルテスト χ2=16.84, P=0.018）、特に2人のドナー（D3およびD7）は、他のドナーのASVよりも共有頻度が高い細菌性ASVを有していた（図4B、表S10）。ASV生着率が最も低かったのは、2匹の同居猫の糞便を合わせて1人のドナーとした2人のドナーD1およびD4であった。これらのドナーはもともと多様な糞便マイクロバイオームを持っていたが、他のドナーと比較して高いわけではなかったため、これら2人のドナーから移植されたASVが非常に少なかった理由は完全には不明である。最もよく共有されているASV（68人のFMTレシピエントのうち12人以上に生着したASV）は、Bacteroides、Clostridium、Lachnospira、Oscillibacter、Subdoligranulum、Fusobacterium、Clostridium、Blautia、分類不明Butyricoccaceae、分類不明Oscillospiraceaeおよび分類不明Lachnospiraceaに分類された（図4D、表S11）。FMTレシピエントの糞便マイクロバイオーム全体に移植された細菌性ASVのうち、14.56%はPrevotella 9、10.74%はPeptoclostridium、7.54%はBacteroides、7.33%は未分類のLachnospiraceae、そして 5.29% Collinsellaとして区分されていた（図4C）。移植された ASV の最も一般的な属は、FMT 後および FMT 前のレシピエントの糞便マイクロバイオーム全体でも最も豊富な細菌属であったことは驚くことではな 4 い。プレボテラは、FMTレシピエントのサンプル全体で平均14.08％の相対存在度、バクテロイデスは12.1％、コリンセラは6.2％、ペプトクロストリジウムは5.07％で見つかった(表S12)。このことは、FMTレシピエントが必ずしも分類学的に新規な微生物を獲得しているわけではなく、ゲノム上の変異はあるにせよ、分類学的に類似したASVを獲得していることを示している。495 496 497Animals 2022, 12, x FOR PEER REVIEW 14 of 23 498Animals 2022, 12, x FOR PEER REVIEW 15 of 23 図4. FMT レシピエントとその便ドナーの間で共有された ASV。A) FMT レシピエントまたは B) 便ドナーの ASV 生着率または共有率のプロット（星印は、同居猫 2 頭の糞便マ 499 500 テリアルが 1 ドナーであることを示す）。ASV共有率は、FMTレシピエントのFMT後サンプルとその便ドナーの間で共有されたASVの数（FMT前サンプルとドナーの間で共有された分類群を除く）を、ドナーサンプル中のASVの総数（FMTレシピエントのFMT前サンプルと共有した分類群を除く）で割ることによって算出されました。C) FMT レシピエントとその便ドナーの間で共有される ASV の分類学的内訳。D) FMTレシピエント間で最もよく移植されたASVを示すヒートマップ 505。タンカラーは、FMTレシピエントがそのASVをその便ドナーと共有していることを示す。3.4. FMTレシピエントと健常動物の糞便マイクロバイオームの比較 507 508 最後に、治療終了から2週間後のFMTレシピエントの糞便マイクロバイオームが、健常者参照セットの年齢適合個体と同様になっているかどうかを調べた（図1C）。おそらく、他の猫グループと比較して、糞便中のマイクロバイオームが健常動物のものに近づいた猫グループが存在したのだろう。このため、ある猫のFMT前のマイクロバイオームと健常者参照セットの糞便マイクロバイオームとの類似度、およびある猫のFMT後のマイクロバイオームとその同じ健常者の糞便マイクロバイオームとの類似度を計算した512。その後、2つの値（post - pre）を差し引き、FMTレシピエントと年齢をマッチさせた健常動物のダイアドごとに（Δ）類似性を求めた。516 FMT レシピエントと健常動物の年齢差は 1 歳を超えてはならない 517 。この類似度の変化（Δ）は、猫の糞便マイクロバイオーム全体が、健常者参照セットの糞便マイクロバイオームとの類似度が高くなった（正の値の場合）か、低くなった（負の値の場合）かを示すものである。我々は、線形モデルを用いて、FMTレシピエントの治療に対する反応、臨床症状、IBD診断、抗生物質の使用歴、または食事が、健康なペット猫のマイクロバイオームとの類似度と相関しているかどうかを検定した。我々は、治療に良好な反応を示さなかった猫の糞便マイクロバイオームは、治療に良好な反応を示した猫と比較して、健康な動物のマイクロバイオームとわずかに類似する（平均類似度x̅：0.01）ことを見出した（x̅ 0.0007）(Fig 5A, Table S13)．522 523 524 525 526 さらに、下痢（x 0.011）または嘔吐を伴う下痢（x̅ 0.006）の猫の糞便マイクロバイオームは、その他の症状（便秘のx -0.015, 「その他の」症状のx̅ -0.016） が生じた猫よりも健康体の参照セットとわずかに似ていた（図 5B、表 S13）。IBDを持つ猫の糞便マイクロバイオームは、IBDを持たない猫（x̅ -0.001）よりも健康な動物のものと同様に530似てきた（x̅ 0.009）（図5C531 D）。最近抗生物質を服用した猫の糞便マイクロバイオームは、抗生物質を服用していない動物（x̅ 0.01）と比較して、健康な動物（x̅ 0.016）に近い方向にシフトしていた。これらの分析における効果量は控えめであることに留意することが重要である。最後に、ドライフードのみ（x̅ -0.005）またはウェットと生食（x̅ -0.015）を食べた猫は、他の食事をした猫よりも健康な動物の糞便マイクロバイオームとの類似性が低かった（x̅ 0.011 536、生食、x̅ 0.014 6）（図 5E、表 S13）．この最後の発見は、単に我々のデータセットの属性である可能性がある：健康な動物の13％のみがドライフードまたはウェットと生食の食事を持っていた（表S2）。したがって、もし我々のデータセットで食餌がサンプルサイズ的にもっと均等に分布し、ある食餌が他の食餌より多くなかったとしたら、我々の発見は異なる可能性がある。538 539 540 541Animals 2022, 12, x FOR PEER REVIEW 16 of 23 図5. FMT治療を受けた猫の糞便マイクロバイオームは、健康な猫のマイクロバイオームと似てくるのだろうか？
FMTを受けた猫の糞便マイクロバイオームが、年齢をマッチさせた健常者参照セットの糞便マイクロバイオームとどれだけ類似しているかを定量化542 543 することで、FMTを受けた猫の糞便マイクロバイオームのシフトを調べた。2つの類似性スコアの差（FMT後の類似性、FMT前の類似性）を計算し、各FMT受診者と健常動物ダイアドについて類似性の変化（Δ）を生成した。次に、これらのΔ値を、ゲノム化線形モデルを用いて宿主の特性と相関させた。A-E) 各グループの平均類似度Δスコア（±標準誤差）。0の値は類似度の変化がないことを示す。Bray-Curtis 距離を使用した。モデル統計は表 S13 を参照。550 4.考察 4.1. FMT治療の効果 我々の研究では、慢性消化器疾患に対して経口カプセルFMT治療を受けた猫の77％が、FMT後2週間 554 に臨床症状が改善したと飼い主から報告された。これらの猫（「レスポンダー」と呼ばれる）は、年齢および性別が異なり、嘔吐、下痢、便秘を経験した 555 。このことは、この特定のFMT治療が、特定の症状だけでなく、様々な症状の緩和に有効である可能性があることを意味している556 557。興味深いことに、「非応答」群に比べ「応答」群では便秘の猫の割合がやや多く、便秘の猫が特に治療に反応しやすい可能性が示唆された559。先行研究では、FMTが1匹の猫の嘔吐と下痢を解決したことが示されており[29]、今回の研究ではこれを発展させ、68匹の猫のグループにおいて、FMT治療後2週間で、嘔吐と下痢に加えて、便秘も解決することが明らかになった563。犬では、FMTは急性下痢、再発性慢性下痢、犬パルボウイルス、炎症性腸疾患の治療に有効である[22-25]。特に経口カプセルの形態でのFMT治療は、16頭の犬のIBDの治療に有効であることが示されている[53]。さらに、慢性腸症（CE）に苦しむ9歳の犬において、FMTの2サイクルの経口治療は、すべての胃腸 568 内および全身症状を解決し、犬の食欲と体重を回復させることができた[54]。FMTカプセルで治療した56頭のCEを含むより大規模な研究では、臨床的な改善徴候（犬慢性腸症臨床活 571 動指数の変化で決定）が、投与者の74％で観察された［55］。このように、経口カプセル FMT 治療は、コンパニオンアニマルの胃腸の問題を治療できる可能性を示してい 572 る。これは、経口カプセルは、内視鏡、大腸内視鏡、または経鼻胃の経路で FMT を投与するよりも、投与が容易で、侵襲性が低く、おそらくコストが低いため、重要である [56]。4.2. 糞便マイクロバイオームのαおよびβ多様性の宿主予測因子 FMTレシピエントの糞便マイクロバイオームは、最初の臨床症状574 575 576 577、IBD診断、および個体の食事によって変化した。具体的には、生食578 を摂取している猫は、生食579 を一切取り入れていない猫よりも、糞便マイクロバイオームが多様であった。骨格筋、脂肪、組織、軟骨、骨からなる生食は、ドライキブルや缶詰のウェットフードに比べ、一般的にタンパク質と脂肪が豊富で炭水化物が少ない[57]。我々の発見は、生肉食を与えた個体は市販の食品を与えた個体よりも多様な糞便微生物群を示したと報告した、犬で行われた先行研究582の結果と一致する[58]が、他の研究では対照的な発見が報告されている[59]。食餌は、食餌成分を代謝できる微生物がそうでない微生物に勝ることを考えると、動物の糞便マイクロバイオーム組成の主要な決定要因である585。しかし、特にローフード食が、なぜより多様な微生物を腸内に共存させることができるのか、その理由は明らかではない。また、FMTレシピエントの糞便中微生物のβ多様性は、宿主の食事と強い相関があることがわかった589。これは、猫が食べている食物の種類（生食 vs 缶詰ウェットフード vs ドライキブル）により、そのタンパク質、脂質、炭水化物、繊維、多量栄養素組成に応じて、異なるマイクロバイオーム組成を選択するため、予想されることである[60-63]。また、嘔吐や下痢を伴う猫は、他の臨床症状を呈する猫よりもマイクロバイオームの多様性が低いことが分かった593。宿主の臨床症状全般で、個体間の糞便マイクロバイオームのばらつきの12％を説明することができた。嘔吐、下痢、便秘は、通常、単独の症状ではなく、異なる障害や疾患を反映している場合がある。例えば、下痢はネコ科動物では極めて一般的であり、細菌、原虫またはウイルス感染の症状である可能性がある[64]。また、炎症性腸疾患（IBD）や低悪性度リンパ腫の臨床的徴候である場合もある[65]。嘔吐は、猫においても極めて一般的であり [66] 、食物不耐性、炎症性腸疾患、肝臓疾患、pan595 596 597 598 599 600 creatitis、甲状腺機能亢進症、および尿毒症によって引き起こされることがあります [67-69] 。歴史的に、猫の便秘は脱水と結びついており、慢性腎臓病（CKD）、糖尿病メ リ602 タス、甲状腺機能亢進症と関連している[70]。猫が示す臨床症状は、猫の健康状態や生理機能と強く結びついていることが明らかであり、このことは、猫の糞便微生物相の違い603 604を部分的に説明できるかもしれない。下痢の猫は、便秘や嘔吐の猫と比較して、胃腸の生理学、消化、腸管通過時間[71]、または全体的な健康状態がわずかに異なっている可能性がある。また、症状の治療のために、それぞれ異なる抗生物質や医学的治療を受けたかもしれない。これらの違いはすべて、FMT受診者間の糞便マイクロバイオームの乖離に寄与している可能性がある。全体として、我々の研究は、猫の糞便マイクロバイオームがIBDの診断[72]や腸内ディスバイオシスまたは腸症の程度によって異なるという先行研究結果と一致する[73, 74]。興味深いことに、我々の研究では、最近抗生物質を服用したFMT受信者608 609 610 611 612の糞便マイクロバイオームは、他の調査対象猫よりも健康な参照セット613にわずかに似ていることも報告されている。多くの研究が、コンパニオンアニマルにおける糞便マイクロバイオーム組成と抗生物質の使用との関連性を示している[75-77]。他の研究でも、FMT治療が、抗生物質による混乱後に糞便マイクロバイオームの位置を回復させる可能性があることが強調されているが[78]、ここでは、FMTが抗生物質の投与前にもかかわらず有効である可能性について論じている。おそらく、抗生物質の投与は糞便マイクロバイオームをある程度破壊し、FMTカプセルまたは糞便スラリーからの微生物のコロニー形成を促進する619Animals 2022, 12, x FOR PEER REVIEW 18 of 23. β-ラクタマーゼ産生菌やアシネトバクターに汚染されたヒト患者において、抗生物質による口腔内汚染除去はFMTの有効性を高めると考えられる[79, 80]。しかし、これらの知見は広く普及しているわけではなく、抗生物質の使用は病原性細菌の増殖を可能にする可能性もある。猫において、抗生物質投与後のFMT治療の有効性を実験的に比較した研究はない623。4.3. FMTレシピエントにおけるASV生着率 625 627 FMTの効果は、FMT治療後にどのドナー微生物がレシピエントの腸内に定着できたかを調べることでも 評価できる。我々の研究では、FMT受信者の腸内内容物を直接採取することはできなかったが、受信者とその便の提供者の間でASVを共有する度合いを定量化した。その結果、便ドナーは、治療後にFMTレシピエントとASVの約13％（範囲3〜36％）を共有していた（FMT前にドナーとFMTレシピエントの間で共有されたASVを除く、54 ASVから349 ASVの範囲であった）。この所見から、このグループの猫では完全なマイクロバイオーム生着は起こっておらず、FMT の成功に は必要ない可能性があることがわかるが、それでも FMT レシピエントの大部分では FMT が成功している。生着率を定量化した FMT 研究は多くないが、先行研究では、抗レトロウイルス薬を服用している HIV のヒトで、大腸内視鏡による FMT 広告 638 投与後に緩やかなマイクロバイオーム生着が観察されたと報告されている。レシピエントの糞便微生物叢は、FMTの8週間後にもドナーから有意に離れたままであった639]。軽度から中等度の潰瘍性大腸炎患者12人を対象とした小規模な臨床試験では、ドナーからFMT受診者への移行菌の割合は15％から85％であったと報告されている[82]。移された菌は、ドナーの菌の系統的多様性にまたがっていた642。さらに、ASV 生着率は、IBD の診断、食事、抗生物質の使用などの宿主要因とは相関がなかったが、これらはド ナーの身元と強く結びついていた。言い換えれば、ASV生着率は、ドナーの糞便微生物相に依存していた。これは、現在C. difficile（rCDI）感染している患者に対する菌株移植が、ドナーの細菌の量と系統性、およびFMTレシピエントに既に存在する細菌によって大きく予測された先行研究［83］と呼応しています。rCDI患者におけるFMT治療を検討した別の研究では、ドナーやレシピエントに存在しない新規の未検出株よりも、ドナー由来の650株がFMT後の微生物叢の大きな割合を占めていることが明らかになった[84]。これらの知見は、FMT便ドナーがFMTレシピエントの糞便微生物叢に大きな影響を与える可能性があることを考えると、FMT便ドナーの可能性を厳格にスクリーニングする必要があるという考え方を補強するものである651 652。しかし、FMTレシピエントの潜在的な影響も無視することはできない654。あるメタアナリシスでは、rCDI、過敏性腸症候群、クローン病、腎臓がん、トゥレット症候群など8種類の疾患について、ヒト患者の腸内における菌株の生着状況を調査した。彼らは、菌株レベルの保持の最も重要な予測因子は、FMTレシピエントにおける細菌種の多様性と存在量であると報告している[85]。これらの同じヒト集団のいくつかを使用した同様のメタ分析では、複数のルート（例えば、カプセルと大腸内視鏡の両方を介して）からFMTを受けた個人で、移植率の増加が観察されたことが分かった[52]。また、感染症や疾病のために抗生物質による治療を受けていた個体でも、生着率の増加が観察された[52]。さらに、Danneら（2022）［86］が指摘するように、FMTレシピエントの遺伝学、免疫、微生物叢、およびライフスタイルも、細菌の生着と臨床効果に影響を与える可能性がある。最もよく共有されているASVは、Prevotella属、Collinsella属、Bacteroides属、Peptoclostridium属に属していることが分かりました。興味深いことに、これらの属はすべて、健康なペットの猫におけるコアマイクロバイオームの一部を形成しています[3]。これらの4つの細菌属は、哺乳類の腸におけるSCFA（プロピオン酸、酢酸、酪酸）産生とも相関している[87]。SCFAは、宿主の結腸細胞にとって不可欠なエネルギー源として作用し、結腸の血流と運動性を刺激し、常在菌や定着菌の増殖を促進する可能性がある[88- 671 90]。また、SCFAsのような腸内微生物の代謝産物が、遺伝子発現の調節因子として、あるいはシグナル伝達分子として作用する可能性があるという証拠も増えてきている[91]。このように、我々の猫コホートでは、便提供者とFMTレシピエントの間で、潜在的に有益な微生物が共有されているようである673。rCDIに対してFMTを行ったヒトの菌株移植を調べた研究では、FMT後のFMTレシピエントの糞便マイクロバイオームもバクテロイデス（およびアリスティペス、パラバクテロイデス）が豊富であった[92]。677 5.限界 678 我々の研究にはいくつかの限界があり、読者は我々の知見を慎重に解釈することを勧める。第一に、FMT の有効性に関するデータは、ペットの飼い主から提供された情報のみから 得られたものである。獣医師による診断検査は行われず、確立された指標（例：慢性腸疾患臨床活動指数、腸内細菌症指数）に基づく臨床症状の改善がみられたかどうかが検証された。したがって、FMTの有効性は飼い主が認識した有効性を反映するものであり、偏りや不正確さがある。しかし、このような制約があるにもかかわらず、本研究は、慢性消化器疾患を有する猫におけるFMT経口カプセルの有効性に関して貴重な知見を提供するものである。第二に、我々はメタゲノムシークエンシングを実施せず、細菌生着率を決定する際に株レベルのパターンを測定しなかった。細菌の共有に関する我々の分析は、代わりに細菌のASVのレベルで行われた684 685 686 687 688。また、消化管から直接微生物を採取したわけではありません。
糞便サンプルは、腸の下部の細菌を反映している可能性が高い。したがって、どの細菌が便提供者からFMT受診者に「移植」されたのか、あるいは実際に移ったのかを確実に言うことはできない。692 最後に、我々の糞便マイクロバイオーム調査は、FMT治療後2週間におけるFMTレシピエントの糞便マイクロバイオームを反映している。この2週間後にマイクロバイオームがどのように変化したかはわからないし、FMT後1、3、4、8週目にどの細菌のASVが保持されていたかを言うこともできない695。我々の分析は、特定の時間帯の猫の糞便マイクロバイオームに焦点を当てたものであり、今後、FMT後の異なる時間帯の糞便マイクロバイオームを調査する研究を推奨する697。698 6.結論 我々の研究は、経口カプセルの形態によるFMT治療が、68匹の家猫グループにおいて下痢、便秘、および/または嘔吐の解消に有効であることを示した最初の研究である。FMTに対する糞便マイクロバイオーム反応は、個体の臨床症状、IBD診断、抗生物質の使用歴、および食事によって調節される可能性があり、これらはすべて、猫の糞便マイクロバイオームを研究する際に考慮すべき要因である699 700 701 702 703。FMTレシピエントでは、便ドナーの細菌が部分的に移植されていることが観察され、便ドナーとそのレシピエントの間で微生物が共有されていること、およびFMTの効果に完全なマイクロバイオームの移植は必要ないことが示されている。また、FMTレシピエントの特定のサブセットの糞便マイクロバイオームは、年齢をマッチさせた健常者のものとより類似しており、FMTの有効性をさらに裏付けている707。709 補足資料 www.mdpi.com/xxx/s1 Figure S1 Characteristics of "Responder" and "Non-Responder" FMT recipients, Figure S2 Fecal microbiomes of recipient animals do not cluster by timepoint (preFMT vs. PostFMT), Figure S3 Fecal microbiomes of recipient animals don't be cluster by timepoint (preFMT vs. PostFMT), Figure S3 FMTの効果を裏付ける補足情報については、以下のサイトでダウンロードできる。postFMT）、図S3 線形モデルに従って宿主予測因子と有意に相関することが判明した細菌属のポストホックテスト、表S1 ドナー動物の特徴、表714 S2 健常動物の特徴、表S3 サンプルのメタデータ。表S4 ASV存在量表、715 表S5 ASV分類学、表S6 微生物α多様性〜宿主予測因子（レシピエント動物）、表S7 微生物β多様性〜宿主予測因子（レシピエント動物）、表S8 22コア属の一般化線形モデル〜宿主予測因子（レシピエント動物）, 表S9 病原性5属の一般化線形モデル716 717 718 els ~ host predictors (recipient animals), 表S10 FMT受信者とその便提供者間のASV共有率 719, 表S11 FMT受信者とその便提供者間で共有されるASVの分類法 720, 表S12 FMT前またはFMT後サンプル間の細菌分類群の平均存在量、表S13 健康なペット猫722のマイクロバイオームに対するFMTマイクロバイオームの類似性のPERMANOVA 723Animals 2022, 12, x FOR PEER REVIEW 20 of 23 Author Contributions: Z.E.、J.K.J.、G.J.、H.H.G.はFMT参加者の募集、糞便サンプルの収集と配列決定、関連メタデータのキュレーションを担当した。C.A.R.はデータを解析し、原稿を執筆した。著者全員が原稿に対するフィードバックを行い、最終版を承認した。Conceptualization, H.H.G., A.M., D.D.K. and J.K.J.; Methodology, H.H.G., C.A.R., Z.E., J.K.G, とG.J.；ソフトウェア、C.A.R.とJ.G.；検証、C.A.R.とJ.G.；形式分析、C.A.R.とH.H.G.；調査、C.A.R.；資源、H.H.GとA.M；データキュア、Z.E, J.G., J.K.J. and C.A.R.; Writing - Original Draft Preparation, C.A.R.; Writing - Review & Editing, all authors; Visualization, C.A.R.; Supervision, H.H.G. and C.A.R.; Project Administration, H.H.G.; Funding Acquisition, H.H.G. and A.M.". 資金提供 本研究は、AnimalBiome 社から全額資金提供を受けた。724 725 726 727 728 729 730 731 732 733 Institutional Review Board Statement: 研究計画書およびインフォームド・コンセントの様式は、動物福祉法に 734 準拠していた。カプセルは、慢性消化器疾患に対して獣医師が提供する標準的なケアに追加して投与された。参加者は、本試験に参加する前に獣医師と相談するよう助言され、いつでもいかなる理由でも本試験から脱落することができることを知らされた。738 インフォームド・コンセントの記述。該当なし。データの利用可能性 データ入手： 生のアンプリコン配列は、対応する 740 名の著者にメールで問い合わせることにより入手可能である。ASV相対存在量表、ASV分類、および対応するサンプルのメタデータは、補足資料として入手可能である。本論文で紹介したすべての統計解析を行い、すべての図を生成するための R コードは、公開の GitHub リポジトリ 743 (https://github.com/AnimalBiome/MicrobiomeResponsestoFMT_inCats) に保存されています。744 謝辞を述べる。我々の研究に参加してくれた FMT 受診者とその所有者に感謝する。746 利益相反。H.H.G., J.K.G., G.J., D.D.K., A.M., Z.E. は全員、カリフォルニア州オークランドに本社を置く AnimalBiome, 747 社の社員でストックオプションを持っている。C.A.R.はAnimalBiome社のコンサルタントである。748 J.A.E.はAnimalBiome社の顧問であり、ストックオプションを保有している。749 参考文献 750 1.瀧石哲也、Fenero CIM、Câmara NOS. 腸管バリアと腸内細菌叢。腸内バリアと腸内細菌叢：生涯を通じた免疫反応の形成。Tissue 751 Barriers. 2017;5:e1373208. 752 2. 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