湛水ストレス下におけるダイズの窒素吸収と根圏原核生物群集との関連性
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公開：2023年7月11日
湛水ストレス下におけるダイズの窒素吸収と根圏原核生物群集との関連性
https://www.nature.com/articles/s43705-023-00282-0
テンシァン・リアン
ラン・チェン
...
マーティン・ハートマン
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ISME Communications 第3巻 記事番号： 71 (2023) この記事を引用する
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メトリクス詳細
要旨
土壌中の湛水は、脱窒を促進し、窒素固定と硝化を減少させることにより、植物への窒素の利用を制限する可能性がある。根と土壌の界面における窒素の利用可能性を決定する根関連微生物は、植物の遺伝子型や土壌の種類によって影響を受ける可能性があり、湛水土壌における植物の窒素吸収能力を変化させる可能性がある。温室実験では、湛水ストレスに抵抗する能力が対照的な2つのダイズ遺伝子型を、それぞれウディック・アルゴゾル土壌とハプリク・アリゾル土壌で栽培した。同位体標識、ハイスループットアンプリコンシークエンシングおよびqPCRを用いて、湛水はダイズの収量および肥料、大気、土壌からの窒素吸収に悪影響を及ぼすことを示した。これらの影響は土壌に依存し、耐性遺伝子型よりも湛水感受性遺伝子型において顕著であった。耐性遺伝子型では、アンモニア酸化剤が多く、亜酸化窒素還元剤が少なかった。嫌気性、窒素固定性、脱窒性、鉄還元性の細菌であるジオバクター/ジオモナス、スフィンゴモナス、コリバクター候補、デスルホスポロシナスは、湛水条件下で耐性遺伝子型に比例して濃縮された。このような根圏マイクロバイオームの変化は、最終的には、湛水、貧酸素条件下での植物の窒素吸収改善に役立つ可能性がある。本研究は、湛水ストレス下におけるダイズ遺伝子型の適応性についての理解を深めることに貢献し、ダイズの窒素利用効率を向上させる施肥戦略の策定に役立つ可能性がある。
土壌の種類とダイズ遺伝子型に依存した、窒素吸収と根圏微生物叢に対する湛水の影響の模式図。
はじめに
近年、豪雨やそれに伴う土壌の湛水現象（数時間から数日間）を含む異常気象の頻度が増加している [1, 2]。マメ科植物では、窒素（N）吸収と作物収量は、共生的なN2固定と土壌中のN利用可能量によって大きく左右され、これらは湛水ストレスによって悪影響を受ける[3,4,5]。これまでの研究で、N吸収効率の高い植物は湛水の悪影響を軽減できることが示されている [5]。ある種の植物遺伝子型は、抗酸化酵素や糖の生産、根系におけるより多くの不定根や畦の形成など、湛水中の窒素吸収を増加させる様々なメカニズムを発達させてきた [6,7,8]。
根関連微生物は、湛水土壌における植物の窒素吸収を制御する上で重要な役割を果たしている [9, 10]。湛水によって水が満たされた間隙が増加し、酸素の利用可能性が低下し、従属栄養呼吸、共生N2固定、硝化が減少する [11,12,13]。湛水土壌の低酸素状態は、アンモニア酸化細菌（AOB）と古細菌（AOA）の活性を低下させ、硝化速度の低下につながる [13]。対照的に、湛水は、流出、浸出、脱窒のような嫌気的プロセ スを通じて土壌Nのシステムからの損失を促進し、最終的に作物 生産性を低下させる［2, 13］。湛水ストレスに敏感な遺伝子型と耐性のある遺伝子型の違いによって、これらの窒素循環ギルドとそれに関連する根圏のプロセスが異なって形成されるかどうかは、まだよくわかっていない。
テクスチャー、空隙率、pHを含む土壌の物理化学的特性は、土壌が湛水に対してどのように反応するかを決定する重要な要素である [14, 15]。土壌の質感は保水能力を決定し、粘土質の土壌は保水能力が高く、透水性が遅いため、湛水しやすくなる [14]。土壌の空隙率は、水の移動と通気性を決定するが、空隙率の高い土壌は、水はけが良く、通気性が高い [16]。最後に、pHは土壌中の養分の利用可能性に影響し [17]、湛水ストレスに対する植物の反応を調節する可能性がある。したがって、これらの特性の違いは、湛水が植物や関連する微生物群に及ぼす影響を大きく形成する可能性がある。
さらに、耐性のある植物遺伝子型は、特定の微生物を利用して生物・生物ストレスに抵抗することができる [18, 19]。例えば、耐病性トマトの根圏から分離されたフラボバクテリウムのような微生物は、感受性のある遺伝子型の病徴を抑制できることが示されている[18]。我々の以前の研究では、アルミニウム耐性を持つ大豆は、アルミニウム毒性を緩和するのに役立つTumebacillus、Burkholderia、Penicillium、Cladosporiumなどの微生物分類群をリクルートする可能性があることが示された[20, 21]。湛水耐性に関する研究は、これまでのところ、植物の遺伝的要素の理解と改良に主眼が置かれており、根圏微生物、特に窒素循環に関与する微生物の役割についてはほとんど研究されていない [22]。湛水に対する植物の耐性を向上させる上で、根圏微生物が果たす潜在的な役割を探ることは、作物のストレス管理に新たな道を開く可能性がある。
本研究では、3日間の湛水ストレスに対する感受性の異なるダイズ遺伝子型が、Udic Argosol土壌およびHaplic Alisol土壌のN獲得量および根圏微生物群に及ぼす影響を評価することを目的とした。大気中のN2、N肥料および土壌の無機化に由来する植物のN量は、15N希釈法を用いて評価した［23, 24］。硝化剤と脱窒剤の量は、amoA、nirS、nirK、およびnosZ遺伝子の定量的PCR（qPCR）を用いて推定し、根圏原核生物群集構造は16S rRNA遺伝子の塩基配列決定によって決定した。Udic ArgosolはHaplic Alisolよりも空隙率が低く、粘土含量が高いことから、Haplic Alisolと比較して、Udic Argosolでは湛水効果がより顕著であり、その結果、ダイズ植物による窒素吸収がより強く低下するという仮説を立てた。さらに、湛水耐性ダイズ遺伝子型は、湛水ストレス下で特定のN循環微生物を濃縮し、Nの利用可能性と吸収を高めるのに役立つ可能性があるという仮説を立てた。
方法と材料
土壌の種類と植物材料
土壌は、中国広東省の綏西県（110°25′N, 21°32′E）と英徳県（113°40′N, 24°18′E）の 2 つのダイズ栽培地から 15cm の深さまで採取した。土壌の化学的特性は、Udic Argosol（U）がpH 5.3、空隙率40.2％、粘土含有率40.2％、Haplic Alisol（H）がpH 7.1、空隙率55.4％、粘土含有率13.6％であった。さらに、本研究では、湛水ストレスに対して耐性（Qihuang34）または感受性（Jidou17）であることが示された2つの異なるダイズ（Glycine max L.）遺伝子型を調査した[25]。Qihuang34は、嫌気条件下で植物が生存するためのアデノシン三リン酸（ATP）を生産するために、解糖および糖新生に関連する酵素経路を活性化し、湛水下で植物の軟化につながるリグニン生合成経路をダウンレギュレートすることが示されている[25]。さらに、感受性の高い系統と比較して、湛水耐性ダイズ遺伝子型は畦や不定根が多く [26]、スクロース [8]や内因性アブシジン酸（ABA）が少ないことから、解糖系を介したエネルギー保存の制御によって湛水耐性を高めている可能性がある [27]。
温室実験と15N標識
中国広州にある華南農業大学の温室で、各処理（土壌タイプ、ダイズ遺伝子型、湛水ストレス） を 9 回反復するランダム化ブロック計画を用いたポット実験を行った。各ポットには 8 kg の土壌を入れ、均一な大きさのダイズ種子 8 粒を播種した。播種から10日後、苗の一部を取り除き、1ポットあたり3株の生育のよいダイズを残した。窒素肥料として、15Nで5原子％標識したCa(NO3)2を100 mg N kg-1の割合で土壌に添加した。生物学的窒素固定量を算出するため、大気中の窒素を固定する能力を持たないダイズ 変異体を、湛水条件と土壌の種類を変えて植えた[23, 28]。生育条件は、光周 期を14/10時間の明暗サイクルとし、昼夜の平均気温をそれぞれ28 °C、20 °Cとした。大豆が開花期に達した時点で、3日間、土壌から4cmの高さまで水を加え、湛水ストレスを誘発した。湛水の短期的な影響を評価するために、3日間の期間を選んだ。実験計画を補足図S1に示す。
根圏土壌サンプルは、3日間の湛水期間の直後に、ポット当たり3株を1つのサンプルにまとめ、収穫した根系を穏やかに振盪し、細根（～20 g）を残りの付着土壌とともに、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を満たした50 ml遠心チューブに移すことによって採取した。2分間振盪した後、13,000rpmで10分間遠心分離し、根圏土壌ペレット5gをDNA抽出用に-80℃で保存し、残りのペレットは土壌理化学分析用に4℃で保存した。その後、バイオマス測定のためにダイズのシュートと根を採取した。各処理区9ポット中3ポットのダイズ苗を保管し、R8ステージ（成熟期、播種後120日）で収穫し、収量を測定した。
本研究では、大気中の天然 15N 量（0.3663 atom% 15N）を参照して、atom% 15N を算出した[29]。肥料由来の植物Nの含有量（Nf）、大気由来のN2（Na）、土壌由来のN（Ns）は、以下のように計算した[28, 30]：
{{{{{{{\mathrm{atom}}}}}}}}% ^{15}{{{{{{{\mathrm{N}}}}}}}},{{{{{{{\mathrm{excess}}}}}}}},{{{{{{{\mathrm{in}}}}}}}},{{{{{{{\mathrm{plant}}}}}}}}/{{{{{{\rm{N}}}}}}},{{{{{{{\mathrm{atom}}}}}}}}%$$
{{{{{{{\mathrm{ }}}}}}}}\left[ {{{{{{{{\mathrm{atom}}}}}}}}% ^{15}{{{{{{{\mathrm{N}}}}}}}},{{{{{{{\mathrm{excess}}}}}}}},,\left( {fs} \right)/{{{{{{{\mathrm{atom}}}}}}}}% ^{15}{{{{{{{\mathrm{N}}}}}}}},{{{{{{{\mathrm{excess}}}}}}}}\left( {nfs} \right)} \right]}
ここで、fsはN2固定系、nfsは非固定系(ダイズ変異体)、Nplantは各植物のN含量である。
$${{{{{{{{{\rm{N}}}}}}}}}}{{{{{{{\mathrm{s}}}}}}}} = {{{{{{{{{\rm{N}}}}}}}}}}{{{{{{{{\mathrm{plant}}}}}}}}}\left( {{{{{{{{\mathrm{mg}}}}}}}},{{{{{{{\mathrm{plant}}}}}}}}^{ - 1}} \right) - {{{{{{{{{\rm{N}}}}}}}}}}{{{{{{{\mathrm{f}}}}}}}} - {{{{{{{{{\rm{N}}}}}}}}}}{{{{{{{\mathrm{a}}}}}}}}$$
植物および土壌の化学分析
植物根のN含量は、Vario EL III Elemental Analyzer（Elementar Scientific Instruments, Hanau, Germany）を用いて測定した。土壌の pH は、FE20-FiveEasy™ pH meter（Mettler Toledo, Giessen, Germany）を用いて水溶液中で測定した。15N/14N比は、Deltaplus同位体比質量分析計（Finnigan MAT GmbH, Bremen, Germany）を用いて測定した。土壌有機炭素（SOC）は、SSM-5000A分析装置（島津製作所、京都、日本）を用いて燃焼により測定した。利用可能K（AK）は、ICPS-7500誘導結合プラズマ発光分光分析装置（島津製作所、日本）を用いて定量した。土壌全リン（TP）、利用可能リン（Olsen-P）、硝酸塩（NO3-）およびアンモニウム（NH4+）は、San++連続フロー分析システム（Skalar, Breda, The Netherlands）を用いて測定した。
DNA 抽出および 16S rRNA 遺伝子配列決定
Fast DNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA）を用い、0.5 g の土壌から製造者の説明書に従って全核酸を抽出し、Nanodrop 2000 spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）で定量した。16S rRNA遺伝子のV4領域を増幅するために、可変12 bpバーコード配列を持つ515Fと909Rのプライマーを使用した[31]。PCR増幅は、15 µl PCR SuperMix (Takara, Dalian, China)、20 µMフォワードおよびリバースプライマー、10 ngの鋳型DNAを含む20 µlの反応容量で行った。サーモサイクルの条件は、95 °Cで60秒間の初期変性、94 °Cで1分間の変性、55 °Cで1分間のアニーリング、75 °Cで2分間の伸長を30サイクル行い、最後に75 °Cで5分間の伸長サイクルを行った。V4アンプリコンは、Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd（中国、上海）でIllumina MiSeq PE250プラットフォームを使用して塩基配列を決定した。生の配列データはNCBI sequence read archive (SRA)のアクセッション番号PRJNA723464で入手可能である。
細菌および古細菌マーカー遺伝子の定量的PCR
細菌および古細菌の16S rRNA遺伝子、細菌および古細菌のamoA遺伝子、nirS、nirKおよびnosZ clade IおよびII遺伝子の遺伝子コピーは、ABI 7900システム（Thermo Fisher Scientific）を用いたSYBR GreenベースのqPCRアッセイによって決定した。プライマー配列およびサーモサイクル条件の詳細は、補足表S1に記載されている。濃度既知のプラスミドを土壌 DNA 抽出物に添加し、ベクター特異的プライマー SP6 および T7 を用いて qPCR 増幅を行い、抽出物間の増幅阻害の潜在的なばらつきを評価した。細菌および古細菌の 16S rRNA 遺伝子は、それぞれプライマー 515F/909R [31]および 967F/1060R [32]を用いて増幅した。細菌および古細菌のamoA遺伝子は、それぞれamoA-1F/amoA-2RおよびCrenamoA23f/CrenamoA616rのプライマーを用いて増幅した[33]。nirSとnirK遺伝子はそれぞれnirS-efF/nirS-efR [34]とnirKC2F/nirKC2R [35]のプライマーで増幅し、nosZ-IとnosZ-II遺伝子はそれぞれNosZ2f/NosZ2r [36]とnosZIIF/nosZIIR [37]のプライマーで増幅した。109から102に希釈した標的遺伝子を含むプラスミドDNA[33]を10倍連続希釈して標準曲線を作成した。増幅効率は、細菌 16S rRNA 遺伝子で 98.6 (R2 = 0.997)、古細菌 16S rRNA 遺伝子で 97.4 (R2 = 0.995)、細菌 amoA 遺伝子で 97.2 (R2 = 0.995)、古細菌 amoA 遺伝子で 98.7 (R2 = 0.997)であった。 997）、nirS遺伝子は96.4（R2 = 0.994）、nirK遺伝子は95.8（R2 = 0.992）、nosZ clade I遺伝子は95.5（R2 = 0.998）、nosZ clade II遺伝子は96.5（R2 = 0.994）であった。これらの遺伝子のPCR増幅は、15μlのSYBR Green Master Mix（Takara、大連、中国）、20μMのフォワードおよびリバースプライマー、10ngの鋳型DNAを含む20μlの反応容量で行った。プライマーの特異性を確認するため、融解曲線解析を行った。
バイオインフォマティクスと統計
配列データは、VSEARCH v.2.21.1[38]をベースにカスタマイズしたパイプラインを使用して処理した。Bowtie2 v.2.4.2 [40]を用いてPhiXゲノム(NC_001422.1)にアライメントし、PhiXコンタミを除去した。PCRプライマーは、Cutadapt v.3.4を用いて1ミスマッチを許容してトリミングした[41]。ペアエンドリードをマージし、VSEARCHに実装されているfastq_mergepairsとfastq_filterという関数をそれぞれ用いて、予想される最大誤差が1になるように品質フィルターをかけた[42]。VSEARCHに実装されているderep_fulllength関数とunoise3関数を用いて、リードをアンプリコン配列バリアント（ASV）に分割した[43]。キメラの可能性があるリードは、VSEARCHに実装されているuchime3_denovo関数[44]を用いて同定・除去した。その後、Metaxa2 v.2.2.3 [45]を用いてリボソームの特徴を検査した。VSEARCHに実装されているusearch_global関数を用いて、同一性閾値を97%として、quality filtered readsを検証済みのASV配列とマッピングし、最終的なASVテーブルを得た。ASV配列の分類学的分類は、SILVA v.138データベースに対して、ブートストラップカットオフ値0.8を用いて、VSEARCHに実装されているSintaxアルゴリズム[46]を用いて実施した。ドメインレベルで割り当てられていないASV、またはオルガネラ構造（葉緑体およびミトコンドリア）に割り当てられていないASVは、最終的なASVテーブルから削除された。
統計解析はR v.4.2.1 [47]で行った。土壌タイプ、湛水ストレス、ダイズ遺伝子型が土壌特性、植物特性、および単変量原核生物特性 （すなわち、遺伝子コピー数およびアルファ多様性指標）に及ぼす影響は、要因分散分析（ANOVA）後にテュー キーの HSD を用いて評価した。Rのstats v.4.2.1およびcar v3.1.0パッケージに実装されているShapiro-Wilk検定およびLevene検定により、残差の正規性および後方散逸性を確認した。アルファ多様性（観察された豊かさ、Pielouの均等性およびシャノン多様性）およびベータ多様性（Bray-Curtisの非類似度）特性は、Rパッケージvegan v.2.2[48]のdiversity関数およびvegdist関数を用いて計算した。 .6.2[48]のdiversity関数とvegdist関数を用い、vegan[49, 50]のrrarefy関数によるASV行列の反復（100反復）サブサンプリングアプローチに基づいて算出した。β多様性の違いは、veganのcmdscale関数とBiodiversityR v.2.14.2.1のCAPdiscrim関数を用いて、それぞれ主成分分析（PCoA）[51]と有意な因子で制約された正準分析主座標（CAP）[52]によって評価した[53]。土壌タイプ、湛水ストレス、ダイズ遺伝子型がベータ多様性に及ぼす影響は、vegan の adonis2 関数と 9999 回の並べ替えを用いた多変量並べ替え分散分析（PERMANOVA）によって定量化した。因子レベル間の一対検定は、RパッケージpairwiseAdonis v.0.4[54]を用いて行った。分散の均一性は、veganのbetadisper関数として実装された多変量分散の並べ替え分析（PERMDISP）[55]を使用してチェックした。データはRで可視化した。
個々のASVおよび上位分類群に対する湛水の遺伝子型依存効果は、100倍サブサンプリングしたASV行列の平均値について単変量PERMANOVAを用いて評価した [39, 56]。多重検定の調整は、Rパッケージqvalue v.2.16.0[58]を用いてq値[57]を用いて行った。反応したASVを表示する分類樹は、veganパッケージのtaxa2dist関数とade4 v.1.7.20パッケージのhclust関数[60]をそれぞれ用いて、分類表から取得した樹行列に基づいてiTol v6.1.2[59]で生成した。
結果
植物のパフォーマンスと土壌化学的性質に対する湛水の影響
湛水は、収穫期の植物乾燥バイオマスおよび種子収量に有意な（p < 0.0001）、遺伝子型依存的な影響を及ぼした（図1および補足表S2）。湛水は、耐性のある遺伝子型（QH34）と感受性のある遺伝子型（JD17）の種子収量を、Haplic Alisolではそれぞれ13.4％（±1.3 SE）と24.5％（±3.7 SE）、Udic Argosolではそれぞれ20.4％（±3.3 SE）と32.3％（±4.7 SE）減少させた（図1A）。両遺伝子型を合わせると、種子収量は湛水によって有意に減少し、Udic Argosolでは平均18.9％（±3.3 SE）、Haplic Alisolでは平均26.3％（±4.5 SE）であった（p＜0.05、図1A）。植物の乾燥バイオマスは、湛水によって、Udic ArgosolとHaplic Alisolでそれぞれ平均14.1％（±3.2 SE）と12.2％（±2.5 SE）減少した（p < 0.0001）（図1B）。
図 1：湛水が植物の特性に及ぼす影響。
ダイズの乾燥重量種子収量（A）および収穫時の乾燥重量バイオマス（B）、根の結節数（C）および結節新鮮重 量（D）、ならびにシュートの総窒素含量（E）および共生窒素固定（F）、窒素肥料（G）、土壌の窒素無機化（H）に由来する分画の、両遺伝子型（耐性 vs 感受性）および土壌（Udic Argosol 対 Haplic Alisol）における変化。異なる文字は、Tukey's HSD による有意差（p < 0.05、収量とバイオマスについては n = 3、その他については n = 6）を示す。U Udic Argosol、H Haplic Alisol、C control、W waterlogging、S sensitive genotype、T tolerant genotype。
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湛水は根の結節数には影響しなかったが、結節新鮮重は両土壌とも全体的に減少した（補表 S2）。耐性遺伝子型は、湛水ストレスがなくても一貫して、より多くの結節を形成し（p < 0.0001）、結節重量も高かった（p < 0.0001）（図1C, D）。これらの変化は遺伝子型に依存しなかった（補足表S2）。さらに、ダイズ両遺伝子型の植物体総窒素含量および共生固定、施肥、土壌無機化に由来す る窒素分画は、湛水によってどちらの土壌でも減少したが（図 1E～H、補表 S2）、土壌無機化に由来する窒素分画を除けば、ハプリッ クアリゾルの方が高い値を示した（図 1H）。湛水ストレスは、共生固定に由来する植物のNに、遺伝子型に依存した有意な影響を与えた（図1Fおよび補足表S2）。湛水ストレス下では、ウディックアルゴゾルの肥料由来および無機化されたNを除き、耐性遺伝子型はこれらの異なる画分においてN含量が高かった（図1F-H）。
湛水ストレス下では、いくつかの土壌特性が変化した（図2および補足表S3）。一般に、Haplic Alisolでは、湛水によって感受性遺伝子型の根圏土壌のNH4+濃度が30.7%（±3.9 SE）減少し、耐性遺伝子型と感受性遺伝子型の根圏土壌のNO3-濃度が50.9%（±6.6 SE）と45.7%（±3.8 SE）減少した（図2）。さらに、Udic Argosolでは、湛水によって土壌pHが耐性遺伝子型で6.6％（±1.7 SE）、感受性遺伝子型で6.4％（±3.0 SE）上昇した。根圏のNH4+濃度の変化のみが遺伝子型に依存した。土壌有機炭素、全窒素、全リン、利用可能カリウムなど、その他の土壌化学パラメータは、湛水の影響を受けなかった（図2および補足表S3）。
図2：土壌化学的特性に対する湛水の影響。
土壌有機炭素（A）、全窒素（B）、アンモニウム（C）、硝酸塩（D）、全リン（E）、利用可能リン（F）、利用可能カリウム（G）、pH（H）の遺伝子型（耐性 vs 感受性）および土壌（Udic Argosol vs. Haplic Alisol）間における変化。異なる文字はTukey's HSDによる有意差（p < 0.05, n = 6）を示す。A酸性土壌、N中性土壌、C対照、W湛水、S感受性遺伝子型、T耐性遺伝子型。
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根圏マイクロバイオームに対する湛水の影響
土壌タイプ、湛水および遺伝子型は、リボソームおよびNサイクリング遺伝子のコピー数に有意な影響を与えた（補足表S4）。湛水によって、根圏土壌の細菌および古細菌の16S rRNAとamoA遺伝子（AOBとAOA）のコピー数が減少し、nirSとnirK、およびnosZ IとII遺伝子のコピー数が増加した（図3）。古細菌のamoAおよびnosZ遺伝子は、遺伝子型に依存した湛水の影響を示し（補表 S4）、感受性遺伝子型に比べて耐性遺伝子型の根圏土壌では、一般にamoA遺伝子のコピー数が多く、nosZ遺伝子のコピー数が少なかった（図3）。細菌のamoA遺伝子コピー数はHaplic Alisolで高かったが、古細菌のamoA、nirS、nirKおよびnosZ遺伝子コピー数は逆の傾向を示した（図3）。
図3：原核生物の遺伝子コピー数に対する湛水の影響。
細菌性（A）と古細菌性（B）の16S rRNA遺伝子、細菌性（C）と古細菌性（D）のamoA遺伝子、nirS（E）とnirK（F）遺伝子、nosZクレードI（G）とクレードII（H）遺伝子のコピー数の遺伝子型（耐性 vs 感受性）および土壌（Udic Argosol vs. Haplic Alisol）間における変化。異なる文字はTukey's HSDによる有意差（p < 0.05, n = 6）を示す。U Udic Argosol、H Haplic Alisol、C control、W waterlogging、S sensitive genotype、T tolerant genotype。
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メタバーコーディングにより、16,442 ASVにクラスター化された合計1,886,813（範囲37,183～40,741）の高品質16S rRNA遺伝子配列が得られた。レアファクション曲線は、その後のαおよびβ多様性の評価に十分なカバレッジを示した（補足図S2）。湛水はアルファ多様性に遺伝子型依存的に有意な影響を与えた（表1）。湛水は、Udic Argosolでは感受性遺伝子型に比べて耐性遺伝子型の根圏土壌のα多様性を減少させる傾向があったが、Haplic Alisolではそうではなかった（図4A-C）。α多様性は、ストレスのない対照区では遺伝子型間で差がなかった。湛水によって根圏のβ多様性も変化した（表1および図4D、E）。原核生物群集構造の主な違いは土壌タイプ（説明された分散の68%）に起因し、湛水（4%）と遺伝子型（1%）で説明される量は少なかった。土壌タイプによる影響を排除するために、湛水と遺伝子型によって制約されたベータ多様性の変動から、これらの根本的な影響が明らかになった（図4E）。各土壌を個別に試験したところ、いずれの土壌もベータ多様性に対して、湛水ストレスとダイズ の遺伝子型が有意な（p＜0.05）影響を示したが、湛水に対して遺伝子型依存的な反応（＝有意な交互 作用項）を示したのはウディックアルゴゾルだけであった。
表1 因数分解分散分析（アルファ多様性）およびPERMANOVA（ベータ多様性）により評価した土壌微生物のアルファ多様性およびベータ多様性に対する土壌タイプ、湛水、遺伝子型およびそれらの相互作用の影響。
原寸表
図4：根圏原核生物の多様性に対する湛水の影響。
ダイズ根圏における原核生物のアルファ多様性とベータ多様性の変化、すなわち、観察されたリッチネス（A）、ピエルーの均等性（B）、シャノン多様性（C）、ブレイ・カーティス非類似度に基づく主座標分析（PCO）（D）、処理と遺伝子型によって制約された主座標の正準分析（CAP）（E）、および主要フィラの相対存在量（F）。すべての指標は、反復的に希薄化されたASVカウントに基づいている。(A-C)中の異なる文字は、Tukey's HSDによって決定された有意差（p < 0.05, n = 6）を示す。各PCO軸の説明された分散の割合（D）および各CAP軸の群間変動の割合（E）を括弧内に示す。CAP再分類成功率（すなわち、各処置×遺伝子型グループの頑健性の定量的推定値）は、データ雲（E）の横に示した。相対存在量が最も多い12種が表示され、相対存在量が少ない種は「その他」に分類されている。門レベルで分類されていないASV（未分類の細菌と古細菌）は "unclassified "に分類されている。U Udic Argosol、Haplic Alisol、C control、W waterlogging、S sensitive genotype、T tolerant genotype。
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プロテオバクテリア（相対存在量23.8±0.9％）、アシドバクテリオータ（同18.3±2.2％）、クロロフレキシ（同6.4±0.6％）、ベルーコミクロビオータ（同6.4±0.7％）、アクチノバクテリオータ（同6.2±2. 1%）、Bacteroidota（5.7±0.8%）、Planctomycetota（5.6±0.5%）、およびMyxococcota（5.1±0.3%）が、相対存在率が5%以上の優勢な細菌門であった（図4F）。合計25の菌門が片方または両方の土壌で湛水に有意に反応し（q < 0.1）、10菌門は両方の土壌で一貫して反応し、湛水土壌で減少（Bacteroidota、Bdellovibrionota、Dependentiae、Elusimicrobiota、FCPU426、Nitrospirota、Planctomycetota）または増加（Desulfobacterota、Myxococcota、WS4）した。アシドバクテリオータとプロテオバクテリオータも湛水によって有意に変化したが、湛水したUdic Argosolでは増加し、湛水したHaplic Alisolでは減少するという対照的な反応を示した。
以下では，湛水が遺伝子型に依存する有意な（q < 0.1）影響を示した分類群に焦点を当て，β多様性解析で湛水と遺伝子型の間に有意な（p < 0.05）交互作用項を示したUdic Argosolに限って明確に述べる。しかし、検出されたすべての分類群の門からASVレベルまでの応答は、補足データ1として入手可能である。配列の3.2%に相当する115のASVが湛水に対する遺伝子型依存的な応答を示し、これらのASVは分類樹に広く分布していた（図5）。湛水下で濃縮され、主に耐性遺伝子型に関連したASVは、Mucilaginibacter（Bacteroidota）、Citrifermentans（Desulfobacterota）、Thermincola、Fonticella、Desulfosporosinus、Heliobacteriaceae（Firmicutes）、Azospira、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderiaに分類された、 Dyella、Magnetospirillaceae、Sphingomonas（Proteobacteria）、Lechevalieria、Amycolatopsis（Actinobacteriota）、Luteolibacter（Verrucomicrobiota）、Haliangium（Myxococcota）、Vicinamibacterales（Acidobacteriota）、Candidatus Koribacter（Actinobacteriota）、Gracilibacteria（Patescibacteria）。
図5：遺伝子型に依存した湛水に対する反応を示す原核生物分類群。
Udic Argosolにおいて、遺伝子型と湛水の相互作用に有意に反応した原核生物ASVを最後の共通割り当てレベルで示した分類樹（PERMANOVA, q < 0.1, n = 6）。棒グラフは、ウディックアルゴゾルにおける感受性の高い遺伝子型と耐性の高い遺伝子型の根圏において、対照処理と湛水処理で比例的に濃縮されたASVの相対量をスケールで表したものである。外側の円は、ASVの最後の共通割り当てレベル情報を示す。Cコントロール、W湛水、S感受性遺伝子型、T耐性遺伝子型。
フルサイズ画像
考察
本研究は、2 種類の土壌で 3 日間の実験的湛水後、湛水ストレスに耐性または感受性を示すダイズ の異なる遺伝子型が、窒素吸収とそれに関連する根圏マイクロバイオームをどのように変化させるかを明らかにした。その結果、植物の窒素吸収、種子収量および濃縮微生物分類群は、ウディックアルゴゾル土壌とハプリクアリゾル土壌の間で異なる湛水に対する遺伝子型依存的な応答を示した。このことから、耐性遺伝子型はより高いレベルの窒素吸収を維持し、根圏において窒素循環に関係する特定の原核生物群集と会合するという仮説が確認された。
植物の窒素起源および収量に対する湛水の影響
湛水ストレスは、ダイズの収量増加にとって重要な窒素源である共生 N2 固定および肥料由来の N の吸収を減少させた（図 1F、G）。総 N 吸収量の減少は、最終的にはどちらの土壌タイプでもダイズ収量を減少させた（図 1）。これは、部分的に 2 つの理由によると考えられる。第一に、湛水土壌では酸素利用能が急激に低下するため、根の呼吸と結節が減少し、窒素取り込みに直接影響する。第二に、湛水によって脱窒速度が上昇し、窒素がN2OとN2の形で土壌から放出されるため、植物にとっての窒素利用率が低下する。本研究では、3日間の湛水によって、硝化のような好気性プロセスに関与する原核生物の存在量が減少し、脱窒のような嫌気性プロセスに関与する原核生物の存在量が促進された（図3）。これは、微生物プロセスに対する湛水効果を調べた先行研究 [61,62,63]と一致する。植物による窒素吸収の減少は、Haplic AlisolよりもUdic Argosolで顕著であった（図2）。Udic Argosolは、Haplic Alisolに比べて空隙率が低く、粘土含 有率が高いため、土壌中の水と空気の移動が制限され、酸素不足と炭酸ガス の蓄積が生じ、湛水の影響を悪化させる可能性がある [64,65,66]。これらの結果から、湛水はハプリッ ク・アリゾルよりもウディック・アルゴゾルにおいて、種子収量により 顕著な悪影響を及ぼすことが明らかになった（図 1B）。
湛水による窒素吸収の減少の程度はダイズの遺伝子型によって異なり、感受性遺伝子型は耐 性遺伝子型よりも低い窒素吸収を示した（図 1E）。耐性遺伝子型の結節新鮮重が高いことが、この効果の一因であると考えられる（図 1D）。根粒菌の負荷が高ければ、共生窒素固定も高くなり、湛水下でも窒素供給を維持できる可能性がある[67]。実際、湛水条件下で共生固定によって得られる窒素は、感受性遺伝子型に比べて耐性遺伝子型 で高かった（図 1F）。
さらに、ダイズの根における一次代謝および二次代謝は、湛水ストレスの影響を強く受ける可能性がある [8]。以前の研究では、変化した代謝の多くが一般的な炭素と窒素の代謝、特にダイズ の品質に重要なフェニルプロパン経路に関連しており、これらの代謝パターンは湛水ストレスに耐 性のあるダイズ遺伝子型と感受性のあるダイズ遺伝子型とで異なっていた[8]。注目すべきは、湛水による植物バイオマスへの影響は両遺伝子型間で変わらなかったが、成熟期 の収量には有意な差があったことである。このことは、開花期の湛水が、窒素の吸収に遅滞的な 影響を与えた可能性が高いことを示唆している。この現象は、鉢植えでストレスを受けた植物は、圃場でストレスを受けた植物よりも回復能力が低いことが多いことに一因があると考えられる[68]。さらに、本研究では、ダイズがノジュール形成に重要な開花期に湛水を行った。この時期の短期的な湛水は、ダイズの受粉、落花、根粒菌感染、結節形成に悪影 響を及ぼし、ひどい場合には結節が死滅し、生物学的窒素固定と収量を低下させる可能性さえある [69]。これは、2日間の湛水が形態学的発達（草丈と葉面積）の停滞を引き起こし、長期的にワタ収量を減少させることを観察したWangら[70]の研究と同様である。さらに、以前の研究では、湛水に耐性のあるダイズ遺伝子型は、感受性のある遺伝子型よりも早く代謝物濃度を湛水前のレベルに回復させ、酵素活性を回復させることができることがわかった[71]。
湛水がアンモニア酸化および脱窒ギルドに及ぼす影響
湛水によって植物の窒素固定化が低下するのは、根圏微生物を介した系からの無機態窒素の損失が増加するためかもしれない。本研究では、土壌のタイプやダイズの遺伝子型にかかわらず、湛水によってアンモニア酸化細菌 （細菌および古細菌のamoA遺伝子）が減少する一方で、脱窒細菌（nirS、nirK、nosZ IおよびII遺伝子） については逆の傾向が観察された。この知見は、土壌水分の増加下でアンモニア酸化剤の減少を報告した先行研究と一致している[13, 72]。土壌の硝化微生物は酸素の利用可能性に依存しており、通常、湛水によって悪影響を受ける [73]。対照的に、土壌の脱窒微生物は硝酸塩を必要とし、通常、湛水条件下で活性化される [74]。感受性の高い遺伝子型と比較して、耐性の高い遺伝子型の根圏土壌は、アンモ ニウム酸化剤の負荷が高く、脱窒微生物の負荷が低かった（図 3）。これらの結果は、耐性遺伝子型がより多くの植物利用可能な硝酸塩を獲得し、その結果、植物の栄養状態がより良くなることを示している [13]。これらの観察結果は、湛水ストレス後の耐性遺伝子型の根圏土壌中のNH4+およびNO3-レベルが高いことと一致している（図2）。
根圏原核生物群集に対する湛水の影響
植物はストレスを緩和するために有益な微生物と会合することができる[75, 76]。本研究では、湛水は根圏環境の変化を引き起こし、根圏微生物の多様性と構造に影響を与えた。Nサイクリング・ギルドのような微生物のキーパーソンの変化は、2つの土壌における2つの遺伝子型のN吸収に異なる影響を与える可能性がある。
Udic Argosolの湛水条件下では、Citrifermentans（以前はGeobacterとして知られ、後にGeomonas [77, 78]として知られる）やDesulfosporosinusなどの嫌気性属に属するASVが、耐性遺伝子型の根圏で濃縮された（図5）。これらの結果は、圧縮された耕地 [39]や森林 [79]、水稲土壌 [80、81]、湛水農地 [82]などの酸素が制限された土壌で、これらの分類群が増加することを示した先行研究と一致している。植物の窒素固定能力の喪失は、潜在的なジアゾ栄養性ジオバクター種の比例的減少に関連することが研究で示されている [83, 84]。大豆に関する別の研究では、ジオバクターはN2固定と正の相関関係があることが示された [85]。ジオバクター種は、水田における優勢なN固定菌である可能性がある [86]。さらに、ジオバクター／ジオモナスおよびデスルホスポロシヌス種は、嫌気性環境において重要な生態学的ニッチを占めており、微生物による鉄（III）の還元を担っていると考えられている [87, 88]。例えば、硝酸塩に依存した嫌気的なアンモニウムの鉄酸化還元循環は、アンモニアを生成する可能性があり、このアンモニアは植物生産のための栄養素として利用されることがある [90]。乾燥条件下では、Fe(II)は酸化されてFeOOH（Fe[III]の一形態）を生成し、Pを結合することができる。しかし、貧酸素条件下では、Fe[III]は嫌気性呼吸によってFe(II)に還元され、FeOOHに結合したPを土壌中に放出する[89]。
湛水条件下で耐性遺伝子型と関連して濃縮されたその他の分類群には、Candidatus Koribacter、Lechevalieria、Mucilaginibacter、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、およびAzospiraが含まれた（図 5）。逆に、感受性の高い遺伝子型では、ウディックアルゴソルの湛水条件下でコマツナ科の微生物が濃集した（図5）。これらの属に属する微生物の中には、窒素循環に関係しているものがある。例えば、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia [91]、Azospira [92]、Sphingomonas [93]は、N固定菌として知られている。Mucilaginibacter [94]、Haliangium [95]、Lechevalieria [96]は、大量の細胞外多糖類を産生し、植物の生長に有益な植物成長促進細菌として報告されている。Geobacterと同様に、Candidatus Koribacterは発酵性の鉄還元菌である可能性がある[97, 98]。さらに、コマツナ科は脱窒に使用される微生物コンソーシアムに含まれることが以前に報告されている [99]。注目すべきことに、根粒菌は湛水によって悪影響を受けたが、根粒菌、Bradyrhizobium、Mesorhizobiumのような根粒菌に関連する分類群は、耐性遺伝子型と感受性遺伝子型の間で差のある反応を示さなかった（補足データ1）。全体として、湛水条件下で、主に耐性または感受性の遺伝子型に関連する上記の分類群 が強く濃縮されたことは、N-固定が促進され、N2Oの排出が減少し、その結果、植物へのNおよびそ の他の栄養供給が改善されたことを示しているのかもしれない。
結論
湛水期間が 3 日と短かったため、ダイズの窒素吸収と根圏微生物叢の構造が変化し、収量が 13～32％減少した。これは、共生固定、肥料、土壌無機化に由来する窒素の吸収が減少したことが一因であると 考えられる。耐性を示したダイズ遺伝子型 Qihuang34 は、耐性を示したダイズ遺伝子型 Jidou17 と比較してストレス症状が軽減され、結節と窒素吸収が増加し、窒素循環ギルドの絶対量と相対量を含む根圏マイクロバイオーム構造が変化した。湛水条件下では、耐性遺伝子型は感受性遺伝子型に比べてアンモニア酸化酵素を多く保有し、亜酸化窒素還元酵素は少なかった。さらに、嫌気性、窒素固定性、脱窒性、鉄還元性の細菌であるGeobacter/Geomonas、Desulfosporosinus、Sphingomonas、Candidatus Koribacterは、湛水条件下で耐性遺伝子型に比例して濃縮された。このような根圏微生物群の変化は、湛水条件下や貧酸素条件下での植物の窒素吸収を改善するのに役立つ可能性がある。これらの効果は土壌タイプに依存しており、より普遍的で妥当な結論を得るためには、より広範な調査が必要である。最終的に、本研究は、異なるダイズ遺伝子型の根圏におけるアンモニア酸化剤および脱窒剤の湛水に対する反応について新たな証拠を提供し、湛水下での窒素利用効率の改善における根関連微生物群集の重要性について理論的根拠を与えるものである。
データの利用可能性
生の配列データはNCBI sequence read archive (SRA)のアクセッション番号PRJNA723464で入手可能。
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謝辞
本研究は、中国国家自然科学基金（32170115）、ダブルファーストクラス分野促進プロジェクト（助成金番号2021B10564001）、およびチューリッヒ工科大学での1年間の海外留学のためにTLに授与された中国奨学委員会フェローシップの支援を受けた。大豆品種を提供してくださったXu Ran教授とZhang Mengchen教授に深く感謝する。
著者情報
著者および所属
中華人民共和国広東省広州市、華南農業大学、亜熱帯農業生物資源保存利用国家重点実験室
テンシャン・リアン、ラン・チェン、チー・リュー、タオビン・ユー、ザンドン・カイ、ハイ・ニアン
華南農業大学農業学院広東省植物分子育種重点実験室（中国広東省広州市
テンシャン・リアン、ラン・チェン、チー・リュー、タオビン・ユー、ザンドン・カイ、ハイ・ニアン
スイス・チューリッヒ工科大学農業科学研究所
Tengxiang Lian & Martin Hartmann
貢献
TLとHNは本実験の構想・設計を行った。TLとLCが実験を行った。MHとTLは、バイオインフォマティクス、統計、データの可視化を行った。TLが第1稿を執筆し、MHが原稿を修正・編集した。LC、QL、TY、ZCはサンプルの収集と処理を行った。すべての著者が結果について議論し、原稿の内容を読み、承認した。
対応する著者
Tengxiang Lian、Hai Nian、Martin Hartmannのいずれかにご連絡ください。
倫理申告
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
追加情報
出版社注：シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
補足情報
補足情報
補足データ1
権利と許可
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転載と許可
この記事について
この記事の引用
Lian, T., Cheng, L., Liu, Q. et al. 湛水ストレス下におけるダイズの窒素吸収と根圏原核生物群集の潜在的関連性. ISME COMMUN. 3, 71 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00282-0
引用文献のダウンロード
2023年2月24日受領
改訂2023年6月28日
2023年7月3日受理
2023年7月11日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s43705-023-00282-0
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