微生物相-耳-脳の相互作用は炎症性サイトカイン反応の活性化を介して全般性不安障害と関連する

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ORIGINAL RESEARCHの記事
Front. 免疫学、2023年3月9日
第2部 微生物免疫学
第14巻～2023年｜https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1117726
微生物相-耳-脳の相互作用は炎症性サイトカイン反応の活性化を介して全般性不安障害と関連する

Microbiota-ear-brain interaction is associated with generalized anxiety disorder through activation of inflammatory cytokine responses

Renyi Feng1,2、Qingyong Zhu1,2、Qingchen Li1,2、Yanping Zhai1,2、Jiuqi Wang1,2、 Chi Qin1,2、Dongxiao Liang1,2, Rui Zhang1,2、 Haiyan Tian1,2, Han Liu1,2, Yongkang Chen1,2, Yu Fu1,2, Xuejing Wang1,2* and Xuebing Ding 1,2*
1中国河南省鄭州市鄭州大学第一附属病院神経科
2鄭州大学パーキンソン病・運動障害研究所（中国河南省鄭州市
はじめに 全般性不安障害（GAD）は、最も永続的な不安障害の一つであり、全身性炎症の亢進と関連している。しかし、GADにおける炎症性サイトカイン反応の活性化の引き金とそのメカニズムは、まだ十分に解明されていない。
材料と方法 16S rRNA遺伝子配列決定およびメタゲノム配列決定により、GAD患者の外耳道マイクロバイオームを特徴付け、GAD患者の血清炎症マーカーを同定した。微生物叢の変化と全身性炎症の関係を検証するために、スピアマン相関を適用した。
結果は以下の通りです： その結果、GAD患者の外耳道では、年齢と性別をマッチさせた健常対照者（HC）と比較して、微生物の多様性が高く、プロテオバクテリアの存在量が有意に増加し、ファーミキューテスの存在量が減少していることが示された。メタゲノム配列解析の結果、GAD患者では緑膿菌が種レベルで有意に増加していることがわかった。さらに、緑膿菌の相対的な存在量は、全身性の炎症マーカーの上昇や疾患の重症度と正の相関があることが観察され、これらの外耳道細菌叢の変化は、炎症反応を活性化することでGADと相関する可能性が示唆されました。
結論 これらの結果は、炎症反応の上昇を介した微生物叢-耳-脳の相互作用がGADの発症に関与することを示すとともに、外耳道細菌群集が治療介入のターゲットとなる可能性を示唆している。
1 はじめに
全般性不安障害（GAD）は、最も一般的な不安障害であり、世界人口の約4％から7％が罹患し、その発症率は世界中で増加しています（1、2）。慢性的な衰弱性精神疾患であるGADは、患者さんに大きな負担をかけ、生活の質だけでなく、仕事や社会的な機能を損ないます（3、4）。また、GADは、他の精神疾患、特にうつ病や、自律神経失調症、胃腸、心臓血管、呼吸器、神経疾患などの身体疾患としばしば併存しています（5-7）。
不安障害の病因に炎症経路が関与していることを示唆する証拠が増えてきています(8)。炎症性変化は、持続的な不安状態に代表される慢性的なストレスによって引き起こされる視床下部-下垂体-副腎（HPA）軸反応の調節不全につながり、それによって過剰な全身性炎症のリスクを高めるとされています（9）。GAD患者を対象とした研究では、健常者と比較して、炎症性サイトカインが増加し、抗炎症性サイトカインが減少することが報告されています（10、11）。一方、炎症性サイトカインの血清レベルは、不安の重症度との間に有意な正の相関があった(12)。Campylobacter jejuniやTrichuris murisの病原性感染にさらされると、大腸の炎症が起こり、不安様行動が増加するという報告がいくつかあります（13、14）。さらに、抗生物質やプロバイオティクスを投与することで、炎症に関連した不安様行動の増加を回復させることができます（15-17）。上記の研究は、炎症の増加が不安様行動の増加と関連していることを示唆しています。
さらに最近の研究では、マイクロバイオームが人間の健康や病気、特に精神障害に影響を与える重要な環境因子として浮上してきたという証拠が示されました（18、19）。これまでの研究で、腸内細菌叢は、微生物叢-腸-脳軸を通じて不安障害に中心的な役割を果たすことが明らかにされています（15、20）。GAD患者の糞便微生物叢では、短鎖脂肪酸（SCFA）産生菌が減少し、Escherichia-Shigella、Fusobacterium、Ruminococcus gnavusなどの細菌が過剰に増殖していた（21）。GAD患者におけるSCFA産生の低下は、腸管バリア機能不全をもたらし、適切な免疫反応を損ない、最終的に脳機能障害につながる可能性があります（22）。腸内細菌叢組成だけでなく、口腔内細菌叢組成や血清細菌叢組成も不安症状と関連していた（23-25）。
今回のパイロット研究では、健常対照者（HC）と比較したGAD患者における外耳道マイクロバイオームの組成を特徴付けました。さらに、GAD患者における微生物叢の変化、全身性炎症マーカー、GADの重症度との関係を調査しました。本試験は、炎症反応のアップレギュレーションによるGADの発症における微生物叢-耳-脳の相互作用の役割について新たな知見を提供します。
2 材料と方法
2.1 試験デザインおよび患者募集
GAD患者47名とHC33名を鄭州大学第一附属病院神経科から募集した。参加者全員が書面によるインフォームドコンセントを提供し、鄭州大学第一付属病院倫理委員会（2022-KY-0851-002）から倫理的承認を得た。GAD患者は、当科の経験豊富な神経科医と精神科医の2名が、精神障害の診断と統計マニュアル（DSM-V）の構造化臨床面接（26）によるGADの診断基準を満たし、この疾患の一貫した結論に到達したものとする。除外基準は以下の通りである： (i）重度の大うつ病、双極性障害、パニック障害、精神病性障害、心的外傷後ストレス障害、物質乱用・依存、著しい自殺念慮等を有する、（ii）心臓、肺、腎臓、肝臓、血液、自己免疫疾患、悪性腫瘍を合併する、（iii）脳血管障害、神経変性疾患または脳の構造および機能に影響を与える可能性がある他の疾患を合併する、（iv）サンプル採取前3ヶ月以内に免疫抑制剤および抗生物質を使用する、等。参加者は、4週間以内に向精神薬を服用していないか、6週間以上安定した用量を服用していた。さらに、年齢と性別が一致する33名の対照者を、生活習慣が似ていて同じ地域に住むGAD患者の配偶者または同伴の友人から登録した。健常対照者については、現在または過去の精神疾患および精神作用薬の服用、全身疾患または併存疾患の既往、サンプル採取前3ヶ月以内の抗生物質の使用、既知の活性細菌、真菌、寄生虫、ウイルス感染などを除外基準とした。
2.2 サンプル収集と臨床データ収集
本試験に登録された被験者から、入院後2日目に両耳のスワブを採取した。外耳道の深さは平均27mm、範囲は20～34mm（27）、安全性を確保するために20mmのセーフバーを使用した。外耳道サンプルは、滅菌綿棒により、個体が許す限り鼓膜に近い外耳道に挿入し、180°回転させて5秒間採取した。綿棒は、保存媒体なしで保存（乾燥）し、そのまま滅菌容器に入れ、氷上に移して、2時間以内に-80℃で保存した。自覚症状の評価には14項目のHamilton Anxiety Scale（HAMA）と自己評価不安尺度（SAS）を用いた。非特異的な身体的・心理的症状の評価には、ピッツバーグ睡眠質指数（PSQI）、複合自律神経症状スコア（COMPASS31）、胃腸症状評価尺度（GSRS）、疲労度尺度（FSS）、めまいハンディキャップ目録（DHI）を使用した。
すべての参加者から10mlの試験管を用いて静脈血を採取し、3000rpm、4℃で10分間遠心分離を行った。上清は血清サイトカイン分析用に採取された。血清は、すべての参加者が回収されるまで-80℃で保存された。血清中の炎症性サイトカイン［インターロイキン（IL）-6、インターフェロン（IFN）-γ、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、IL-1β．リポポリサッカライド（LPS）およびLPS結合タンパク質（LBP）］レベルは、製造者の指示に従って酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を用いて測定した［Human IL-6 ELISA Kit (E-EL-H0192c), Human IFN-γ ELISA Kit (E-EL-H0108c), Human TNF-α ELISA Kit (E-EL-H0109c), Human LBP ELISA Kit (E-EL-H6108), Elabscience； Human LPS ELISA Kit (CSB-E09945h), CUSABIO]を使用し、血清サンプルは二重に処理した。血清サンプルの完全性は、内部コントロールによって確認した。各サイトカインの検量線は、4パラメータロジスティックカーブフィット回帰を用いて算出した。アッセイ内係数変動は、すべてのサイトカインで一貫して<10%であった。
2.3 DNA抽出と16SリボソームRNA遺伝子配列決定
製造元の指示に従って、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）とドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（CTAB/SDS）法を用いて、外耳道スワブサンプルから微生物DNAを分離した。DNAの完全性と濃度は、1％アガロースゲル電気泳動でモニターした。16S rRNA遺伝子のV3-V4超可変領域は、特定のプライマー（341F、5′-CCTACGGRSGCAGCAG-3′；806R、5′-GGACTACVVGGTATCTAATC-3′）とバーコードを使ってPCR増幅した。PCR反応は、Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix（New England Biolabs）15μL、各プライマー0.2μM、ターゲットDNA10ngからなり、反応条件は次の通りである： 反応条件は、98℃で1分間、98℃で10秒間、50℃で30秒間、72℃で30秒間を30サイクル行い、最後に72℃で5分間伸長する。精製したDNAをNovaSeqプラットフォームでシーケンスし、250 bpペアエンドリードを生成した。QIIME2ソフトウェア（バージョンQIIME2-202006）のDADA2またはdeblurモジュールを用いてノイズ除去を行い、初期のAmplicon Sequence Variants（ASVs）を得た。種のアノテーションは、Silva Databaseに基づきQIIME2ソフトウェアを用いて行った。α多様性とβ多様性はQIIME2で計算し、Rプログラム（http://www.R-project.org）のggplot2パッケージを使って可視化した。外耳道スワブサンプルの16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスデータは、Beijing Novogene Biotechnology Co., Ltd., Chinaから入手した。
2.4 メタゲノムシーケンス
メタゲノムショットガンシーケンスは、北京Novogene Biotechnology CorporationのIlluminaプラットフォームで実施した。ショットガンメタゲノムシーケンスから生成された生データは、Bowtie2（バージョン2.2.4）を用いて、低品質の塩基を持つリードを除去するための品質フィルタリングとトリミングを行い、潜在的なヒト汚染物質が除去されました。その後、MEGAHITソフトウェア（v1.0.4-beta）を用いてクリーンデータのアセンブル解析を行った。メタゲノム分類学的アノテーションは、DIAMOND (V0.9.9.110) を用い、NCBI NRデータベースを用いて、ユニゲンを細菌、真菌、古細菌、ウイルスの配列にアライメントした。MEGAN ソフトウェアの最小公倍数祖先（LCA）アルゴリズムを適用してシステム分類を行い、各サンプルの各分類法（王国、門、クラス、目、科、属、種）における存在量と対応する遺伝子存在量テーブルを取得しました。すべてのサンプルを相対的存在量で比較・解析した。遺伝子機能アノテーションを得るために、DIAMONDソフトウェア（v0.9.9.110）を用いて、機能データベース（eggNOG、CAZy、KEGG）に対してユニゲインをブラストした。アライメント結果に応じて、異なる機能レベルでの相対的な存在量を算出した。
2.5 統計解析
臨床データは、Graph Pad Prism 8.0 ソフトウェア（Graph Pad software, lnc., San Diego, CA, USA）により分析した。正規分布に合致するデータは、平均値±標準偏差（SD）で表した。2群間の差の有意性の判定にはStudent's t-testを用い、データが正規分布を満たさない場合はノンパラメトリックなMann-Whitney U testを比較した。微生物組成の群間差の有意性は、vegan Rパッケージのadonis関数を用いた順列多変量分散分析（PERMANOVA）検定により評価した。主座標分析（PCoA）プロットは、Rバージョン4.0.2（http://www.R-project.org/）のggplot2を使って作成した。線形判別分析効果量（LEfSe）を用いて、グループ間で有意に豊富な分類学的特徴および機能的特徴を特定した。スピアマンの順位相関は、臨床パラメータとマイクロバイオームの特徴との間の相関を分析するために使用された。微生物マーカーは、ランダムフォレストモデルの10重クロスバリデーションにより同定した。最適なバイオマーカーの診断性能は、受信者動作特性（ROC）曲線とROC曲線下面積（AUC）を用いて評価した。P < 0.05は統計的に有意であるとみなした。
3 結果
3.1 参加者の基本的な特徴
本研究に参加した人々の人口統計学的および臨床的特徴を表1にまとめた。安定期のGAD患者47名とHC33名の合計が評価された。両群の参加者は、同様の年齢、性別、BMI分布を示した。先行研究(26)と同様に、GAD患者は女性(61.7%)が多いことが観察された。各参加者は、自己評価不安尺度（SAS）（27）およびハミルトン不安評価尺度（HAMA）（28）を用いて不安症状の重症度を分析した。その他の併存症状の評価には、Pittsburgh Sleep Quality Index (PSQI) (29), Composite Autonomic Symptom Score 31 (COMPASS 31) (30), Gastrointestinal Symptom Rating Scale (GSRS) (31), Fatigue Severity Scale (FSS) (32), Dizziness Handicap Inventory (DHI) (33) が使われた。患者コホートの臨床的な詳細は、表1にまとめられている。その結果、GAD患者の68.1%はDHIスコアが高く、めまいを併存していることがわかった（表1）。
表1
表1 登録された参加者の臨床的特徴。
3.2 外耳道マイクロバイオーム組成の実質的な変化
GAD患者における外耳道微生物群集を調査するため、まず、GAD患者19名とHC12名の合計31名の外耳道スワブサンプルについて16S rRNA遺伝子配列を決定した。グループ間の細菌多様性の違いを評価するため、配列をα-diversityでアライメントした。多様性のシンプソン指数はグループ間で有意差はなかったが、シャノン指数はGADグループで有意に高かった（図1A、P = 0.035）。サンプル間のマイクロバイオーム空間を表示するため、Bray-Curtis距離に基づいてβ多様性を算出し、主座標分析（PCoA）プロットにより可視化しました。その結果、順列多変量分散分析（PERMANOVA）分析を用いて、グループ間で有意に異なる分布を示しました（図1B、P < 0.05）。GAD群とHC群で最も異なる存在量の分類群を探索するため、16S rRNA遺伝子配列に基づく外耳道微生物相組成について、線形判別分析と効果量分析（LefSe）アルゴリズムを併用した。16の細菌分類群は、GAD群とHC群の間で異なる相対存在量を示した（線形判別分析（LDA）スコア＞4.0、P＜0.05）。GAD群では、Pseudomonas、Vibrio、Castellaniella、Pseudoalteromonasなど、皮膚常在菌や腸内細菌であるProteobacteria門の属の存在量が有意に増加した。GAD群で減少したのは、Staphylococcus属、Bacillus属で、Firmicutes門に属します。さらに、GAD群とHC群では、それぞれPseudomonasとStaphylococcusが主要な微生物相であることを属レベルで確認した（図1C、D）。
図1
図1 16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスを用いたGAD患者における外耳道微生物叢の変化。(A) シャノン多様性とシンプソン多様性で測定したα多様性の箱ひげ図。要素は中央値、最小値、最大値を示す。(B) 加重UniFrac距離に基づく全サンプルの主座標分析。加重UniFrac距離に基づくβ多様性のP値は、順列多変量分散分析（PERMANOVA）を用いて算出した。円は95%信頼区間を示す。(C）線形判別分析（LDA）効果量（LEfSe）分析により、GAD群（ポジティブスコア）とHC群（ネガティブスコア）の間で外耳道微生物相に有意な細菌差が認められた。LDAスコア（log10）＞4、P＜0.05を示す。これらの解析により、細菌の門（p）、綱（c）、目（o）、科（f）、属（g）のレベルで、最も差分量の多い分類群が明らかになった。(D）GAD群とHC群の外耳道微生物相をMann-Whitney U testにより統計解析した。NSP ≥ 0.05。
外耳道微生物叢の種をさらに特定するために、種レベルの分類学的解像度を持つメタゲノム配列決定を行った（GAD、n = 28; HC、n = 21）。その結果、HC群ではStaphylococcus属が主要な微生物叢であったのに対し、GAD群ではBrevundimonas属がLEfSe解析を用いて支配的な微生物叢であることが示されました（図2A、LDAスコア＞4.0、P＜0.05）。次に、種レベルの微生物マーカーも、WelchのT検定により、GAD患者とHCの間で特徴づけられました。HC群と比較して、GAD群ではSalmonella enterica、Klebsiella aerogenes、Escherichia coli、Bacillus cereus、Streptococcus dysgalactiae、Pseudomonas sp. M30-35およびPseudomonas aeruginosaの細菌種が有意に増加した。HC群では、16S rRNA遺伝子とメタゲノム配列の両方から、Staphylococcus sp. HMSC066C03とStaphylococcus capraeの種が常に優勢な集団として検出された（図2B）。これらの結果は、GAD患者の外耳道マイクロバイオームの組成と種間関係において、HCのそれと比較して大きな不均衡があることを示しています。次に、外耳道マイクロバイオータをバイオマーカーとして利用することの潜在的価値を評価しました。予測精度を推定するために、疾患コホートを90%のトレーニングセットと10%のディスカバリーセットに分け、10倍のクロスバリデーションを実施しました。予測モデルで最大の効果量を持つ上位20分類群のうち、緑膿菌からなるものを選んでテストした結果、AUC平均は0.95となった（図2C、D；95％CI：0.88-1.00）。緑膿菌は最も重要な種として頻繁に選択され、AUC 0.78（図2E、95%CI:0.65-0.90）で特異的にGADを予測した。総じて、外耳道微生物叢はGAD診断のための最も有望なバイオマーカーの1つであると考えられることが示唆されました。
図2
図2 メタゲノムシークエンスに基づくGAD患者の外耳道微生物叢の探索。(A）LEfSe解析により、GAD群（ポジティブスコア）とHC群（ネガティブスコア）の間で外耳道微生物叢に有意な細菌差があることがわかった。LDAスコア（log10）＞4、P＜0.05を示す。これらの解析により、細菌の門（p）、綱（c）、目（o）、科（f）、属（g）、種（s）のレベルで最も差のある豊富な分類群が明らかになった。(B）GAD群とHC群の外耳道細菌叢をMann-Whitney U testで統計解析した。(C）GAD患者28名とHC21名の間で、ランダムフォレストに基づき、上位20個の差次量属マーカーを最適マーカーセットとして選択した。X軸は各マーカーに対する平均減少精度を示し、モデルの精度への寄与度を示している。(D)上位20種の異なる遺伝子マーカーに基づく10重クロスバリデーションを用いて算出したモデルの予測精度を表すROC（Receiver Operating Characteristic Curve）。エラーバーは、AUC値の95%信頼区間を示す。(E) 緑膿菌の相対存在量に基づいて計算されたモデルの予測精度を表すROC。エラーバーはAUC値の95%信頼区間を示す。
3.3 GAD患者における全身性炎症の増加と関連する外耳道マイクロバイオームの変化
GADにおける全身性炎症の役割を確認するため、まず、GAD患者とHCの血清中の炎症性サイトカインと炎症性アゴニスト（LPS）の濃度を測定した。GAD患者ではHCと比較して、IL-6、IFN-γ、TNF-α、LPSのレベルが高く検出された（図3A）。しかし、グラム陰性感染症に対する自然免疫応答に重要な急性期タンパク質であるLBPの血清レベルは、HCと比較してGAD患者で低下していた（図3A）。さらに、HAMAスコアとSASスコアはDHIスコアと正の相関があることがわかりました（図3C、r = 0.693, P < 0.001; 図3D、r = 0.654, P < 0.001 ）。さらに、IL-6、IFN-γ、TNF-α、LPSの各レベルは、HAMAスコア、SASスコアと有意な正の相関があることがわかった。また、TNF-αとLPSのレベルは、DHIスコアと有意な正の相関があった（図3B）。
図3
図3 GAD患者における全身性炎症性サイトカインの変化と、臨床症状と外耳道微生物叢の分類学的差異の存在量との相関。(A）GAD群とHC群の血清サンプルからの全身性炎症バイオマーカーレベル（IL-6、IFN-γ、TNF-α、LPS、LBP）を比較した。結果は中央値および範囲として表現されている。(B）臨床パラメータと炎症性サイトカインのグループ間におけるスピアマンの相関を示すヒートマップ。赤は正の相関を、青は負の相関を示す。(C）DHIスコアとHAMAスコアのスピアマンの相関関係。(D）DHIスコアとSASスコアのスピアマン相関。(E）臨床パラメータと群間差分属間のスピアマンの相関を示すヒートマップ。赤は正の相関、青は負の相関を示す。(F)臨床パラメータとグループ間で異なる豊富な種とのスピアマンの相関を示すヒートマップ。赤は正の相関、青は負の相関を示す。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0. 001；IL-6、インターロイキン-6；TNF-α、腫瘍壊死因子-α；IFN-γ、インターフェロン-γ；LPS、リポ多糖；LBP、リポ多糖結合タンパク質；HAMA、ハミルトン不安尺度；SAS、自己評価不安尺度； COMPASS 31, Composite Autonomic Symptom Score 31; GSRS, Gastrointestinal Symptom Rating Scale; DHI, Dizziness Handicap Inventory; PSQI, The Pittsburgh sleep quality index; FSS, Fatigue Severity Scale. NSP≧0.05とした。
次に、GADの外耳道マイクロバイオームの変化が、特異的なサイトカイン反応やGADの重症度と相関しているかどうかを確認しようとした。16S rRNA遺伝子配列とメタゲノム配列に基づき、GAD群とHC群でそれぞれ異なる存在量の属・種を検出するために、スピアマン相関を適用した。その結果、Pseudomonas属、Paracoccus属、Vibrio属、Uruburuella属は、血清LPS値およびHAMA、SASスコアと有意に正の相関があることがわかった。緑膿菌の相対量は、TNF-αおよびLPSレベルと有意に正の相関があった。さらに、PseudomonasとParacoccusはDHIスコアと有意な正の相関を示した。一方、BacillusとBifidobacteriumの相対量は、FSSスコアと有意に負の相関を示すことが観察された（図3E）。さらに、GAD群では、Pseudomonas aeruginosa、Streptococcus dysgalactiae、Clostridioides difficile、Bacillus pseudomycoides、Chalmydia trachomatis、Bacillus toyonensis、Escherichia coliなどの増加種がDHI、SAS、FSS、HAMAスコアと有意な正の相関、GSRSスコアと逆相関があることが判明しました。さらに、Staphylococcus sp. HMSC066C03と疾患重症度の間には負の相関が認められた（図3F）。これらの結果から、GAD患者における外耳道微生物叢の変化は、GAD発症の一因となる全身性の炎症反応と関連していることが示唆されました。
3.4 GAD外耳道マイクロバイオームにおける機能的変化
微生物叢のディスバイオシスは代謝経路を変化させ、代謝機能障害は微生物叢の組成を変化させることができる（34, 35）。外耳道微生物群集の機能的・代謝的変化を調べるため、未集合のメタゲノムに対して遺伝子中心の解析を行うため、メタゲノムリードに、利用可能なデータベース［Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), Carbohydrate-Active enzymes Database (CAZy), evolutionary genealogy of genes: non-supervised orthologous groups (eggNOG)］ とのアライメントに基づいて予測機能を注釈した。その結果、すべてのサンプル（GAD, n = 28; HC, n =21）において、最も豊富なKEGGオルソログとeggNOGアノテーションを解析した。最も豊富なKEGGオルソログは、糖質代謝、アミノ酸代謝、補酵素とビタミンの代謝、エネルギー代謝などの代謝に関与していた（図4A）。eggNOGアノテーションによると、最も豊富なNOGは、アミノ酸輸送と代謝；複製、組換え、修復だった（図4B）。しかし、すべてのアノテーションドメインのグローバル比較では、GAD群とHC群の間で全体的な予測機能能力に有意差はなかった。CAZy-enrichment解析では、いくつかの注釈付き機能が両群間で区別された。LEfSe解析の結果、GAD群ではGlycoside Hydrolases family 28 (GH28)が、HC群ではGH73、GH25、Glycosyl Transferases (GT15), GT8が過剰発現していた（図4C、LDA score > 3.0, P < 0.05 ）。
図4
図4 GAD患者の外耳道マイクロバイオームに対する機能予測。(A）京都遺伝子百科事典（KEGG）データベースに基づく機能分類に従ってアノテーションされた遺伝子の異なる存在量レベル。(B）遺伝子の進化的系譜：非教師付きオルソロググループ（eggNOG）データベースに基づいて機能分類された遺伝子の存在量の違い（Evolutionary genealogy of genes: non-supervised orthologous groups）。(C) LEfSe解析により、GAD群（プラススコア）とHC群（マイナススコア）の間で、糖質活性酵素（CAZy）データベースとのアライメントに基づく有意な予測機能が認められた。LDAスコア（log10）＞3、P＜0.05を示す。
4 ディスカッション
不安における微生物叢-腸-脳軸の重要な役割を明らかにする証拠が増えてきている（15、36、37）。しかし、不安症患者における外耳道マイクロバイオームプロファイルは、これまで特徴づけられていませんでした。ここでは、GAD患者における外耳道マイクロバイオームの解析について紹介する。その結果、GAD患者の外耳道マイクロバイオームは、HCのそれと有意に異なることが示された。さらに重要なことに、微生物叢の組成の変化は、GAD患者におけるTNF-αおよびLPSの血清濃度の上昇、ならびに不安症状の重症度と高い相関がありました。さらに、動物実験では、消化管内の病原性細菌にさらされると、外毒素を産生し、炎症状態を促進することで不安様行動を増加させることが示されています（14、38）。これらのことから、外耳道細菌叢の特定の属は、炎症性シグナルを調節する経路をアップレギュレートすることによって、疾患のリスクや重症度に関連する可能性があると推察されます。
めまいは、GADで最も多く見られる身体症状の一つである（39, 40）。我々の知見では、GAD患者の耳のマイクロバイオームにおいて、HCと比較して緑膿菌の相対存在量が増加し、緑膿菌の相対存在量とDHIスコアの間に最も強い相関があることを示した。我々は、GADの外耳道微生物叢の変化が前庭欠損に寄与している可能性があると仮定した。これまでの研究で、前庭系は、背側ラペ核、小円筋、偏桃核、視床下部を含む無数の不安関連脳領域と相互に関連していることが示されている（41、42）。緑膿菌は一般的な日和見病原体であり、主に免疫不全の人に感染する(43)。慢性化膿性中耳炎患者では、緑膿菌の増加が観察されている（44、45）。さらに、慢性化膿性中耳炎患者の70％近くが前庭症状を有していた(46)。全体として、我々の知見は、耳のマイクロバイオームにおける緑膿菌の相対的存在量の増加が、GAD患者においてめまいを誘発する可能性を示唆している。
緑膿菌はγ-プロテオバクテリアに属する好気性グラム陰性菌で、環境中に広く分布している（47）。LPSはグラム陰性菌の外膜の主要成分であり、炎症反応の活性化に重要な役割を果たすことが多い(48)。本研究では、GAD患者において血清LPSのレベルが上昇し、緑膿菌の存在量と正の相関があることが示された。また、これまでの研究で、緑膿菌はTLR4/MyD88/NF-κBシグナル伝達経路の活性化を通じて、マクロファージから様々な炎症性サイトカインやケモカインの放出を誘導することが報告されています（49、50）。今回の結果は、全身性の炎症反応と外耳道異常の関連性を示す証拠となる。緑膿菌に対する抗生物質の投与が、GADによる炎症反応を改善するかどうかは、今後の研究でさらに検討する必要がある。
GADがHPA軸のようなストレス経路に大きく影響されることを示す証拠が増えてきている。ストレスがHPA軸に影響を与える経路の1つとして、ディスバイオシスが考えられます。いくつかの細菌の調節障害は、精神疾患と関連しているという仮説がある(51, 52)。我々の研究では、耳のマイクロバイオームにおいて、神経伝達物質を産生する細菌が明らかに変化していることを確認した。例えば、ノルエピネフリンとドーパミンを産生するEscherichia coliとBacillusの増加、ガンマ-アミノ酪酸（GABA）を産生するBifidobacteriumの減少が挙げられる（51）。これらの知見は、外耳道マイクロバイオームの変化がHPA軸を介して不安行動に影響を与えるという見解の手がかりとなるが、これには動物実験による検証が必要であると考えられる。
本研究により、外耳道マイクロバイオータがGADの発症に不可欠なenv.1環境的役割を果たす可能性があることが明らかになりました。しかし、この探索的研究には、言及し議論すべきいくつかの限界がある。まず、外耳道マイクロバイオームプロファイルの個人差や生活環境などの交絡因子が、GADの重要な分類学的バイオマーカーを検出する能力を制限する可能性がある。また、同一人物を繰り返しサンプリングするようなデザインであれば、個人間のばらつきの問題を克服するのに役立つと思われます。第二に、本研究の参加者はすべて単一施設からの参加であり、サンプルサイズが小さいことである。今後、この予備的な結果を確認するためには、大規模なサンプルと多施設での研究が必要である。最後に、本研究では外耳道のマイクロバイオームの変化を示したに過ぎず、腸、皮膚、口腔、膀胱など、他の部位のマイクロバイオームも考慮する必要がある。他の臓器の微生物叢の変化は、GADの病因に寄与する炎症性サイトカインの変化を誘導することも可能であった。これらの限界にもかかわらず、16S rDNAおよびメタゲノミックデータセットの両方において、GADの疾患バイオマーカーの供給源として外耳道を支持する識別シグナルが存在する。これらの候補は、確立された動物モデルを用いて、GADにおけるメカニズムおよび因果関係をさらに評価する必要がある。
データの利用可能性に関する声明
本研究で発表したデータセットは、NCBI SRA BioProjectリポジトリ（アクセッション番号 PRJNA930499; PRJNA929308）で見ることができます。
倫理に関する声明
ヒトが参加する研究は、鄭州大学第一附属病院倫理委員会の審査と承認を受けた。患者/参加者は、この研究に参加するために書面によるインフォームドコンセントを提供した。
著者貢献
XDは実験の構想と設計、XDとXWはプロジェクト全体の調整、RF、QZ、QLは患者の初期評価と診断、CQ、YZは患者の健康情報の評価と文書化、JWはデータの記録と確認にあたった； DL、RZ、HT、HL、YC、YFは参加者のサンプルを収集し、XWとXDは統計解析と技術サポートを行い、RF、QZ、XD、XWは最終データ解析と解釈に参加し、RF、XD、XWは他の著者から意見を聞きながらほとんどの執筆を行い、著者全員が結果について話し合い、原稿についてコメントしました。すべての著者が論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。
資金提供
本研究は、中国国家自然科学基金（82122022号、82171248号、81873791号）および河南省自然科学基金特別青年奨学生（222300420017号）の助成を受けたものである。
謝辞
本研究に参加したすべての被験者、鄭州大学第一附属病院神経科およびパーキンソン病・運動障害研究所のスタッフに感謝する。
利益相反について
著者らは、本研究が潜在的な利益相反と解釈され得る商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。
出版社からのコメント
本記事で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。
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    キーワード：全般性不安障害、外耳道マイクロバイオーム、マイクロバイオータ-耳-脳の相互作用、炎症反応、不安感
    引用します： Feng R, Zhu Q, Li Q, Zhai Y, Wang J, Qin C, Liang D, Zhang R, Tian H, Liu H, Chen Y, Fu Y, Wang X and Ding X (2023) Microbiota-ear-brain interaction is associated to generalized anxiety disorder through activation of inflammatory cytokine response. Front. Immunol. 14:1117726. doi: 10.3389/fimmu.2023.1117726
    Received（受理）された： 06 December 2022; Accepted： 2023 年 2 月 03 日；
    発行：2023年03月09日
    編集者
    マーティン・ジェームズ・ホランド（イギリス・ロンドン大学
    レビューした人
    Wondwossen Amogne Degu, Addis Ababa University, Ethiopia（エチオピア）。
    Linxiang Yin（ハーバード・メディカル・スクール、米国
    Copyright © 2023 Feng, Zhu, Li, Zhai, Wang, Qin, Liang, Zhang, Tian, Liu, Chen, Fu, Wang, Ding. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文です。原著者および著作権者のクレジットを記載し、本誌の原著を引用することを条件に、一般的な学術慣行に従って、他のフォーラムでの使用、配布、複製が許可されます。本規約を遵守しない使用、配布、複製は許可されません。
    *Correspondence： Xuebing Ding, fccdingxb@zzu.edu.cn; Xuejing Wang, fccwangxj2@zzu.edu.cn
    免責事項：本記事で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。
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