高齢者のヒト肺胞ライニング液は結核菌の細胞内増殖を促進し、肺胞上皮細胞の細胞質に移行する

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高齢者のヒト肺胞ライニング液は結核菌の細胞内増殖を促進し、肺胞上皮細胞の細胞質に移行する

https://www.mucosalimmunology.org/article/S1933-0219(24)00001-1/fulltext

アンジェリカ・M・オルモ＝フォンタネス
ジュリア・M・スコルド
アリッサ・シャミ
ジョアン・ターナー
ラリー・S・シュレシンジャー
ジョルディ・B・トレレス
すべての著者を表示
オープンアクセス掲載:2024年1月27日DOI:https://doi.org/10.1016/j.mucimm.2024.01.001

高齢者は、結核を含む呼吸器疾患に罹患しやすい。結核は、空気感染病原体である結核菌（Mycobacterium tuberculosis：M.tb）によって引き起こされ、18秒に1人が死亡する壊滅的な疾患である。M.tbが肺胞空間に到達すると、肺胞ライニング液（ALF）と接触し、宿主細胞間の相互作用を規定する。我々は以前、ヒトALFにおける加齢に伴う可溶性自然免疫成分の機能障害が、ヒト肺胞マクロファージ内でのM.tbの増殖を加速させることを明らかにした。ここで我々は、感染におけるもう一つの重要な肺細胞決定因子である肺胞上皮型細胞（AT）のM.tb感染に対するヒトALFの影響を明らかにした。その結果、高齢者ALF（E-ALF）に感染したM.tbは、成人ALF（A-ALF）に感染したM.tbと比較して、肺胞上皮細胞における細胞内増殖が著しく促進され、急速な複製を示した。ATにおけるこの加速増殖の根底にある可能性のあるメカニズムは、細菌の複製に有利なコンパートメントである細胞質への細菌の移動の増加が観察されたことである。これらの知見は、我々のこれまでの研究と照らし合わせると、高齢者の肺粘膜の酸化的および機能不全の状態が、肺胞内で最も豊富な常在細胞型であるATを含む肺胞常在細胞集団において、免疫応答を弱め、細菌の複製を促進するなど、M.tb感染に対する感受性をどのように決定しているかを浮き彫りにするものである。
はじめに
結核に罹患しやすく死亡率が高いのは、65歳以上の高齢者である1, 2, 3, 4。結核は空気中に浮遊する結核菌（M.tb）によって引き起こされ、主に吸入によって感染し、気道の遠位部や肺胞に沈着する。この環境において、結核菌は肺粘膜、すなわち肺胞内膜液（ALF）と遭遇する。ALFには、サーファクタントタンパク質AおよびD（SP-A/SP-D）、加水分解酵素、補体、脂質などの可溶性自然界因子が含まれており、これらの因子はその後の自然免疫反応および適応免疫反応を活性化する5, 6, 7。
加齢に伴い、ALFにおける自然免疫系の可溶性成分の変化は、高齢者集団の結核感受性の上昇に寄与すると予想される8, 9。われわれの研究グループの発表によると、高齢のヒトや高齢のマウスのALFは、炎症性・酸化性メディエーターのレベルが上昇しており8,10、in vitroおよびin vivoでの結核感染の結果に影響を及ぼしている11。高齢のヒトALF（E-ALF）に曝露したM.tb感染ヒトマクロファージは、感染制御能が低下し、ファゴソーム-リソソーム融合イベントが減少して細胞内輸送が変化した。これらの観察結果は、E-ALFに機能的なSP-A/SP-Dを補充すると逆転し、M.tbの制御におけるALFの生得的構成要素の機能の重要性を支持した11。同様の結果はin vivoでも観察され、E-ALFに暴露されたM.tbは幼若マウスの肺内で増殖が速くなり、免疫病理が増加した11。
ほとんどの研究は、M.tbと貪食細胞の相互作用を変化させるALFの役割に焦点を当てている5, 12, 13；しかしながら、ALFが非専門的な貪食細胞、特に肺胞上皮型細胞（AT）のM.tb感染に及ぼす影響を理解することは極めて重要である14, 15。ATは肺胞環境の内部表面領域を覆う最も一般的な細胞集団である16。ATは非専門的な食細胞であることから、M.tbの複製を可能にし、さらには自然免疫反応を回避するのに適したニッチを提供すると考えられている17。それにもかかわらず、ATは炎症性サイトカイン（TNF（腫瘍壊死因子）、IL-8（インターロイキン）、GM-CSF（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）など）を産生することによって、M.tb感染を制御する免疫反応にも関与しており、それによって細胞のクロストークを増強し、肺胞マクロファージの活性化を促して抗マイコバクテリア活性を高めている18。さらに、ATの宿主防御機構として、自然免疫分子、例えばSP-A、SP-D、補体成分3、抗菌ペプチド、抗体、ヒドロラーゼなどがALFに分泌され、細胞の動員、微生物の殺傷19を促進し、ATにおけるM.tb感染の結果に差をつけるのに重要な役割を果たしている15。我々は最近、健康な成人のALFに暴露されたM.tbは、AT内での増殖速度が異なり、それはALFタンパク質の酸化レベルと機能に依存していることを発見した15。ここでは、高齢者の肺粘膜がATのM.tb感染に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。E-ALFにM.tbが暴露されると、ATにおけるM.tbの複製が増加し、その結果ATで増殖すること、ATの免疫応答が減弱すること、そしてインフラマソーム、オートファジー、細胞死プロセスに変化がないことを示す証拠が得られた。しかし、M.tbがE-ALFに暴露されると、AT内でのM.tbの輸送が変化し、エンドソームの損傷が促進され、その後M.tbはATの細胞質コンパートメントに移動した。これらの所見から、E-ALFはAT細胞質をM.tbの良好な複製ニッチとして利用することで、AT内でのM.tbの増殖を促進する可能性が示唆された。
結果
M.tbが高齢ヒトALFに曝露されると、in vitroでAT内での細菌の細胞内増殖が促進される。
我々の先行研究では、高齢者のALF（E-ALF）にM.tbを暴露すると、ヒト肺胞マクロファージおよび単球由来マクロファージ内でのM.tbの増殖が促進されることが示されている11。ここで我々は、E-ALFに暴露されたM.tbは、A-ALFに暴露されたM.tbと比較して、ATでの細胞内増殖も有意に増加することを観察した（図1）。E-ALF暴露M.tbのこの細菌増殖の増加は、使用した接種液の違いやATによる取り込みによるものではなかった（図1Aおよび1B）。相対発光単位（RLU）は、早い時点［感染後24時間（hpi）］から増殖の違いを検出するためのより感度の高い方法であった。コロニー形成単位(CFU)のデータも同じ傾向を示し、E-ALFに暴露されたM.tbの72時間後の増殖が増加していることを裏付けている（図1Bおよび1C）。AT内でのこれらの細胞内増殖の違いは、感染時間（120時間）にわたってA-ALFまたはE-ALFのいずれかに暴露されたM.tbに感染した後のAT細胞の生存率の変化によるものではなかった（補足図1）。感染期間を通じて調査した全グループで、AT上のe-カドヘリン（CD324）の表面発現が高かったことから（補足図2）、AT間の細胞間界面は安定しており20、観察された高い細胞生存率と一致していた。これらのデータを総合すると、E-ALFに暴露されたM.tbは、A-ALFに暴露された細菌と比較してATでの細胞内増殖が促進されたことを示す証拠となる。
図サムネイルgr1
図1高齢者ヒトALFへのM.tbの曝露は、ATにおける細菌細胞内増殖の亢進と関連している。ATにALF曝露M.tb（H37Rv-Lux）をMOI10:1で2時間感染させた後、ゲンタマイシンで細胞外M.tbを1時間死滅させた。(B)96ウェルプレート中の感染単層膜について、GloMax®読み取りシステムを用いて、指示された時点における発光の増加（ATにおけるM.tb H37Rv-Luxの細胞内増殖を示す）を読み取った。4つの異なるA-ALFとE-ALFを用いた3連のn=4（平均±SEM）の累積データ。(C）ATにおけるM.tb細胞内増殖をコロニー形成単位（CFUs）で評価した。2つの異なるA-ALFとE-ALFを用い、3連のn = 2（平均±SEM）の累積データ。各時点におけるAdult対ElderlyのStudent's unpaired t test分析、*p< 0.05、**p< 0.01。n」の値は、異なる成人または高齢者ヒトドナーからの個々のALFサンプルを用いた生物学的レプリカの数を表す。A＝成人ALF曝露M.tb（白棒）；ALF＝肺胞ライニング液；ATs＝肺胞上皮型細胞；CFUs＝コロニー形成単位；E＝高齢者ALF曝露M.tb（黒棒）；MOI＝感染多重度；M.tb＝結核菌；ns＝有意差なし；RLUs＝相対軽単位；SEM＝平均値の標準誤差。
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次に、この観察された細胞内増殖の増加が、AT感染中のA-ALF曝露M.tbとE-ALF曝露M.tbの細菌複製速度の変化によって説明できるかどうかを、蛍光複製レポーターSSB-GFP（一本鎖DNA結合-緑色蛍光タンパク質）、smyc'::mCherry M.tb株を用いて調べた。その結果、E-ALFに暴露されたM.tbは24時間後にすでに複製が亢進しており（図2）、これはAT内でのE-ALF M.tbの経時的な増殖の増加を裏付けるものであった（図1B）。この複製増加は72 hpiまで維持されたが、この時点ではA-ALF曝露M.tbと同等であった（図2）。
図のサムネイルgr2
図2高齢ALF曝露M.tbはATs感染時に初期複製を増強した。ATsにレポーターSSB-GFP, smyc'::mCherry M.tb株を10:1のMOIで感染させ、共焦点顕微鏡により指定された時点での細菌の複製率を測定した。(A）24時間後および72時間後にA-およびE-ALFに曝露されたSSB+M.tbの割合、2種類のA-ALFと4種類のE-ALFを用いた複製でn＝2-4（平均±SEM）。(B）72時間後のA-およびE-ALF-M.tbに感染したATの代表的共焦点画像。灰色の破線で示した領域を右側に拡大して示す（上段はA-ALF、下段はE-ALF）。複製されたSSB+M.tbは白矢印で示され、融合した（黄色の）病巣を示している。イベントは、少なくとも50の独立したイベント（≧50菌）をカウントすることによって列挙した。<スケールバーは10μmを表す>。成人対高齢者のStudent's unpaired t test分析、*p< 0.05。n」の値は、異なる成人または高齢者ヒトドナーからの個々のALFサンプルを用いた生物学的レプリカの数を表す。A＝成人ALF曝露M.tb、ALF＝肺胞ライニング液、ATs＝肺胞上皮型細胞、E＝高齢者ALF曝露M.tb、GFP＝緑色蛍光タンパク質、hpi＝感染後数時間、MOI＝感染多重度、M.tb＝結核菌、ns＝有意差なし、SEM＝平均値の標準誤差、SSB＝一本鎖DNA結合タンパク質。
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E-ALFとA-ALFを比較すると、AT内の後期エンドソームおよびエンドリソソームへの結核菌の輸送が減少する。
AT内でのM.tbの輸送の差は、細胞内の位置に応じて、細菌の殺傷回避を可能にするか、あるいは宿主殺傷機構15として機能する可能性がある。GFPを発現したM.tbを用い、共焦点顕微鏡でA-ALFとE-ALFに曝露したM.tbのAT細胞内コンパートメントマーカーとの共局在事象を定量した。E-ALFに暴露されたM.tbは、後期エンドソームマーカーであるRab7（Rab5+と共に、あるいは単独で）の共局在イベントが6時間後の時点で減少し、72時間後の時点では統計的に有意であった（図3）。従って、このデータは、E-ALFに暴露されたM.tbがRab5+および/またはRab7+液胞から離れて移動することを示していた。この傾向はLAMP-1+リソソーム液胞でも観察され、調査期間中、E-ALF曝露M.tbとA-ALF曝露M.tbでは、最大50％の減少が観察された（図4）。その他の細胞内液胞［オートファゴソーム（LC3+）、多胞体（ABCA1+）、ラメラ小体（ABCA3+）］については、E-ALF曝露M.tbとA-ALF曝露M.tbの位置関係に有意差は認められなかった（図4、補足図3）。全体として、我々のデータは、E-ALFへのM.tbの曝露が細胞内輸送を変化させ、その結果、後期エンドソームおよびエンドライソソームコンパートメントに関連しない細菌の数が増加することを示している。
図サムネイルgr3
図3E-ALFに曝露したM.tbは、AT内の後期エンドソームへの輸送が減少した。ATをA-ALFまたはE-ALFに曝露したGFP-M.tbに100:1のMOIで2時間感染させた後、細胞外M.tbを死滅させるためにゲンタマイシンを1時間投与した。単層膜は、指定した時点（6時間後、12時間後、24時間後、72時間後）で異なる細胞内マーカーで染色した。(A) M.tbとRab5+Rab7+（初期エンドソームから後期エンドソームへのM.tbの移動を示す）またはRab7+（すでに後期エンドソームにあるM.tbを示す）とのコンパートメント融合を示す共局在事象。(B)E-ALFに曝露したM.tbの、A-ALFに曝露したM.tbに対する共局在化の減少率。(C）細胞内マーカーRab5およびRab7で染色した、A-ALF暴露およびE-ALF暴露M.tbに感染したATの代表的な共焦点画像。イベントは少なくとも200の独立したイベント（200-300菌）をカウントすることで列挙した。灰色の破線で示した領域は右側に拡大して示し、共局在化イベントは白矢印で示した。開いた矢頭は二重共局在イベント（Rab5+Rab7+）を示す。<スケールバーは10μmを表す。成人対高齢者のStudent's unpaired t test analysis, *p < 0.05, **p < 0.01。n」の値は、異なる成人または高齢者ヒトドナーからのALFサンプルのプーリングを用いた生物学的レプリカの数を表す。A＝成人ALF曝露M.tb；ALF＝肺胞ライニング液；ATs＝肺胞上皮型細胞；DAPI＝4'，6-ジアミノ-2-フェニルインドール（ATs核DNA）；DIC＝微分干渉コントラスト；E＝高齢ALF曝露M. tb; GFP = green fluorescent protein; hpi = hours post-infection; MOI = multiplicity of infection; M.tb = Mycobacterium tuberculosis; ns = no significant differences; Rab = Ras-associated binding protein; SEM = standard error of the mean.
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図サムネイルgr4
図4E-ALFに暴露されたM.tbは、AT内でのエンドリソソーム輸送が減少した。ATをA-ALFまたはE-ALF-GFP-M.tbに100:1のMOIで2時間感染させた後、細胞外M.tbを死滅させるためにゲンタマイシンを1時間投与した。単層膜は、指定された時点（6時間後、12時間後、24時間後、72時間後）で異なる細胞内マーカーで染色した。(A) M.tbとLAMP-1+（リソソーム内のM.tbを示す）またはLC3+（オートファゴソーム内のM.tbを示す）のコンパートメント融合を示す共局在事象。(B) A-ALFに曝露したM.tbに対するE-ALFに曝露したM.tbの共局在の減少率。(C）A-ALFとE-ALF-M.tbに感染したATを、細胞内マーカーLAMP-1とLC3で染色した代表的な共焦点画像。イベントは少なくとも200の独立したイベント（200-300菌）をカウントすることにより列挙した。灰色の破線で示した領域は右側に拡大して示し、共局在化イベントは白矢印で示した。開いた矢印は二重共局在イベント（LAMP-1+LC3+）を示す。<スケールバーは10μmを表す。成人対高齢者のStudent's unpaired t test analysis, *p < 0.05, **p < 0.01。n」の値は、異なる成人または高齢者ヒトドナーからのALFサンプルのプーリングを用いた生物学的レプリカの数を表す。A＝成人ALF曝露M.tb；ALF＝肺胞ライニング液；ATs＝肺胞上皮型細胞；DAPI＝4'，6-ジアミノ-2-フェニルインドール（ATs核DNA）；DIC＝微分干渉コントラスト；DNA＝デオキシリボ核酸；E＝高齢ALF曝露M. tb; GFP = green fluorescent protein; hpi = hours post-infection; LC3 = microtuble-associated protein light chain 3; LAMP = Lysosomal-associated membrane protein; MOI = multiplicity of infection; M.tb = Mycobacterium tuberculosis; ns = no significant differences; SEM = standard error of the mean.
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E-ALFに暴露されたM.tbはエンドソーム膜の損傷を増加させ、AT細胞質への細菌の脱出を引き起こす。
M.tbが貪食細胞内でエンドソーム経路を通過することはよく知られているが、ATのような非貪食細胞内でのM.tbの細胞内局在についてはあまり知られていない。M.tbを含む細菌はファゴソームから宿主細胞の細胞質へと移行し、食細胞内での生存に有利であることを示唆する証拠がいくつかある21, 22。そこで我々は、E-ALFに暴露されたM.tbの後期エンドソームやエンドリソソームへの細胞内輸送が減少することで、生存に有利に働くかどうかを調べた。透過型電子顕微鏡（TEM）観察の結果、72 hpiの時点で、A-ALFに暴露されたM.tbとは対照的に、E-ALFに暴露されたM.tbは主に細胞質に存在していた（56.3％対16.9％）（図5）。細胞質に存在する細菌は、細菌を取り囲む液胞（エンドソーム）膜の欠如によって決定された（図5B）。TEMデータを補足するために、E-ALFに曝露したM.tbは、エンドリソソーム損傷マーカーであるガレクチン3との共局在が有意に増加することをさらに示した（図6A）23, 24。このことは、M.tbがE-ALFに暴露されると、膜損傷によってエンドリソソームから脱出し、その後細胞質に移行することができることを示唆している。ガレクチン8単独あるいはガレクチン3との組み合わせでも、有意ではないが同じ傾向が見られた（図6B、補足図4）。ガレクチンに加えて、損傷したファゴソーム膜はユビキチン化タンパク質（FK2+）25, 26によってもマークされる。このマーカーは、E-ALFに暴露されたM.tbとA-ALFに暴露されたM.tbの間で共局在化の違いを示さなかったにもかかわらず（図6A）、Gal-3との二重染色により、120hpiでE-ALFに暴露されたM.tbの共局在化が増加した（補足図4）。TEMとガレクチン共焦点顕微鏡の結果を合わせると、E-ALFに暴露されたM.tbの大部分は細胞質に存在するようになったが、A-ALFに暴露されたM.tbはエンドソームコンパートメントに留まっており、膜損傷がE-ALFに暴露されたM.tbの所見の潜在的なメカニズムであることを示している。
図サムネイルgr5
図5ALFに暴露されたM.tbはAT内の細胞内局在に違いをもたらした。ATをA-ALFまたはE-ALF暴露M.tbに100:1のMOIで2時間感染させた後、細胞外M.tbを死滅させるためにゲンタマイシンを1時間投与した。膜結合小胞内に存在する細胞内細菌と細胞質内に遊離して存在する細胞内細菌の割合をTEMで観察した。(A)72時間後のA-ALF曝露M.tbとE-ALF曝露M.tbの液胞(エンドソーム/リソソーム)または細胞質コンパートメントに位置するM.tbを定量するため、盲検分析によりコード化したサンプルをスコア化した。 (B)ALF曝露M.tbのTEM顕微鏡写真。A-ALF暴露およびE-ALF暴露M.tbは、膜に囲まれていない場合は「細胞質、C」、液胞膜に囲まれている場合は「液胞、V」とスコア付けした。液胞膜は青い矢印で示す。細菌はアスタリスクで示す。値は少なくとも100の独立したイベント（バクテリア）をカウントして決定した。A-V対E-V、A-C対E-CのStudent's unpaired t test解析；*p< 0.05。A-V：液胞コンパートメント内のALF曝露M.tb（サイズバー：それぞれ400 nmおよび800 nm）、A-C：細胞質コンパートメント内のALF曝露M.tb（サイズバー：それぞれ400 nm）、E-V：液胞コンパートメント内のALF曝露M.tb（サイズバー：それぞれ600 nmおよび200 nm）、E-C：細胞質コンパートメント内のALF曝露M.tb（サイズバー：それぞれ400 nmおよび600 nm）。n "値は、異なる成人または高齢者ヒトドナーからの個々のALFサンプルを用いた生物学的複製数を表す。A＝成人ALF曝露M.tb、ALF＝肺胞ライニング液、ATs＝肺胞上皮型細胞、E＝高齢者ALF曝露M.tb、hpi＝感染後数時間、MOI＝感染多重度、M.tb＝結核菌、SEM＝平均値の標準誤差、TEM＝透過型電子顕微鏡。
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図サムネイルgr6
図6E-ALF暴露はAT内のM.tbエンドソーム膜損傷を増加させる。ATをA-ALFまたはE-ALFに曝露したTd-トマトM.tbに100:1のMOIで2時間感染させた後、細胞外M.tbを死滅させるためにゲンタマイシンを1時間投与した。単層膜を72時間後に異なる細胞内マーカーで染色した。(A-B）Mtb-Galectin-3+、Mtb-Galectin-8+、およびM.tb-FK2+（ユビキチン化タンパク質の蓄積）のコンパートメント融合を示す共局在イベント。(C-D）細胞内マーカーGal-3とFK2（C）またはGal-8とGal-3（D）で染色したA-ALF感染およびE-ALF感染M.tb感染ATの感染後72時間における代表的な共焦点画像。イベントは、100-300の独立したイベント（バクテリア）をカウントすることにより列挙した。灰色の破線で示した領域は右側に拡大して示し、共局在化イベントは白矢印で示した。開いた矢印は二重共局在イベント（Gal-3+FK2+またはGal-8+Gal-3+）を示す。<スケールバーは10μmを表す>。成人対高齢者のStudent's unpaired t test analysis, p< 0.05。n」の値は、異なる成人または高齢者ヒトドナーからのALFサンプルのプーリングを用いた生物学的レプリカの数を表す。A＝成人ALF曝露M.tb；ALF＝肺胞ライニング液；ATs＝肺胞上皮型細胞；DAPI＝4'，6-ジアミノ-2-フェニルインドール（ATs核DNA）；DIC＝微分干渉コントラスト；E＝高齢者ALF曝露M. tb；FK2＝ユビキチン化タンパク質（クローンFK2）；Gal＝ガレクチン；hpi＝感染後数時間；MOI＝感染多重度；M.tb＝結核菌；ns＝有意差なし；SEM＝平均値の標準誤差。
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免疫メディエーターの産生に対するA-ALFおよびE-ALF M.tbの影響
M.tbがE-ALFに暴露されるとATの細胞内細菌の増殖が促進されることを考慮し、次にE-ALFに暴露されたM.tbがATの炎症性サイトカインおよびケモカインのレベルを増加させ、ATの活性化を反映するかどうかを調べた。我々は、感染部位への免疫細胞の浸潤、および／またはAT培養における免疫細胞の増殖と成熟を促進する免疫メディエーターの産生を定量した17。その結果、E-ALFに暴露されたM.tbは、A-ALFに暴露されたグループと比較して、いくつかの成長因子、ケモカイン、インフラマソームメディエーター、インターフェロン、Th1分析物を含むAT免疫メディエーターの産生を減少させることが示された（図7）。A-ALFおよびE-ALFに感染したM.tbは、感染していないATと比較して、主に炎症性サイトカインをATに誘導したが、そのレベルは最新の時点で有意に異なっていた（補足図5）。E-ALFに暴露されたM.tbに感染したAT培養物からは、A-ALFに暴露されたM.tbと比較して、増殖因子とケモカインの産生が有意に減少していることが観察された（補足図5Aおよび5B）。これは特に以下の分析物、成長因子で顕著であった： G-CSF、GM-CSF、FGF-2、FGF-1、TGF-α、IL-17、ケモカイン： VEGF、MDC、MIP-1a、MIP-1b、IP-10は、感染後の遅い時点で減少した（補足図5Aおよび5B）。また、感染後120時間では、IFNγ（補足図5D）と、TNF、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-2、IL-15（補足図5E）を含むTH1炎症性メディエーターの産生が減少した。A-ALFまたはE-ALFに暴露されたM.tb.の間で、感染中のほとんどのインフ ラマソームおよびTH2/Th17メディエーター産生に有意差は認められなかった （補足図5Cおよび5F）。ただし、E-ALFに暴露されたM.tbでは、120時間後のIL-1βのレベルが低下しており、このことはインフラマソームの活性化が低下していることを示唆している（補足図5C）。実際、M.tb感染により、最新の時点ではATのインフ ラマソーム活性化が低下したが、ALF群間に差はなかった（補足図6）。全体として、A-ALFとE-ALFがM.tbに感染した後の時点では、感染中のATにおけるいくつかの免疫メディエーターの産生に有意差が認められた。
図のサムネイルgr7
図7E-ALFに暴露されたM.tbはATs免疫メディエーターの産生を減少させる。ATをA-ALFまたはE-ALF曝露M.tbに100:1のMOIで2時間感染させた後、細胞外M.tbを死滅させるためにゲンタマイシンを1時間投与した。A-ALFまたはE-ALFに曝露したM.tbに感染したATの上清を、成長因子、サイトカイン、ケモカインの産生を評価し、72時間後と120時間後にマルチプレックスバイオマーカーアッセイにより、製造元の指示に従って測定した。グラフは、A-ALFに対するE-ALF曝露M.tb感染ATの上清のlog2倍変化を示し、以下のグループに分類した：成長因子、ケモカイン、インフラマソーム、インターフェロン、Th1およびTh2/Th17メディエーター。値は、3つの別々の実験から得られた4つの異なるA-ALFまたはE-ALFドナーのプーリングを用いたn = 4のlog2（総[pg/ml]の中央値E-ALF / 総[pg/ml]の中央値A-ALF）に対応する。A＝成人ALF曝露M.tb；ALF＝肺胞ライニング液；ATs＝肺胞上皮型細胞；E＝高齢ALF曝露M.tb；hpi＝感染後数時間；MOI＝感染多重度；M.tb＝結核菌；Th＝Tヘルパー細胞メディエーター。
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考察
もともと免疫力が低下している高齢者（65歳以上）は、活動性結核を発症するリスクが高い2。ヒトALFの肺内における生理的濃度とM.tbとの相互作用が、in vitroおよびin vivoにおける感染の結果を決定することは、我々の研究により証明されている11。また、高齢者のE-ALFはかなりの酸化ストレスを受けており、これらの成分の一部（例えばSP-D）が機能不全に陥り、in vitro（食細胞）およびin vivo（マウスモデル）でM.tb感染に有利であることも証明された8, 10, 11。しかし、E-ALFに暴露されたM.tbが、肺胞の主要な常在細胞であるATの感染にどのような影響を与えるかは不明であった。ここで我々は、E-ALFに暴露されたM.tbもA-ALFに暴露されたM.tbも同様にATに侵入することを明らかにした。しかし、E-ALFに暴露されたM.tbはAT内でより速く複製され、より増殖した。このことは、エンドソーム膜の損傷と細胞質コンパートメントへの細菌の移動によって示されるエンドソーム輸送の変化と関連しており、この場所がM.tbにとって初感染を確立するのに有利なニッチであり、肺胞の局所的な宿主免疫応答を回避できることを示唆している（図8）。この所見は、高齢になるとALFの構成や機能状態が変化する結果、ALFの機能が変化することの重要性を支持するものである8, 11。最後に、我々の結果は、E-ALFに暴露されたM.tbは肺胞細胞の生存率を有意に変化させないため、E-ALFに暴露されたM.tbが長期にわたって肺胞内で細胞内増殖を続けることが可能であることを示している。
図のサムネイルgr8
図8本研究で得られた主な知見の概略。高齢者のE-ALFにさらされたM.tbは、AT内での初期複製とそれに伴う細胞内増殖を促進した。さらに、E-ALFに曝露したM.tbをATに感染させると、細菌のエンドソーム輸送が変化し、ガレクチンのリクルートメントが増加する。これは、エンドソーム膜の損傷が増加し、細菌の細胞質への移行が促進されることを示唆している。E-ALFに暴露されたM.tbは、宿主細胞の生存率に影響を与えることなく、いくつかの炎症性メディエーター（サイトカインとケモカイン）の産生にも変化を示した。全体として、A-ALFに暴露されたM.tbは主にエンドソーム／リソソーム（液胞）に存在するのに対し、E-ALFに暴露されたM.tbは液胞と細胞質の両方のコンパートメントに存在する。つまり、E-ALFへの暴露はAT内でのM.tbの増殖を促進し、ATの免疫応答を低下させ、宿主細胞の活性化と死を防ぐ。E-ALFに暴露されたM.tbは、AT細胞質を細菌の生存のためのニッチとして利用している。この図はBioRender (https://biorender.com/)で作成した。A＝成人ALF曝露M.tb；ALF＝肺胞ライニング液；ATs＝肺胞上皮型細胞；E＝高齢者ALF曝露M.tb；M.tb＝結核菌。
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マクロファージにおけるM.tbファゴソームは、EEA1およびRab7のリクルートメントが阻害されることにより、初期エンドソームと共通の特徴を持つ27, 28。一方、M.tbは上皮細胞では後期エンドソーム（Rab7+）にトラフィックすることが判明している29。A-ALFに暴露したM.tbを用いた我々の結果は、M.tbが主にATのRab7+後期エンドソームに存在するという先行研究と一致している29, 30。しかし、E-ALFに暴露すると、ATのRab7+後期エンドソームとM.tbエンドソームの会合は減少した。この結果は、使用した感染量とは無関係であった（データは示さず）。さらに、M.tbをE-ALFに暴露すると、LAMP-1との会合が有意に減少した。予想通り、M.tbをA-ALFに曝露しても、オートファゴソーム、多胞体、ラメラ小体など、小胞ネットワークの他のコンパートメントへの細菌の輸送は変化しなかった15。これはE-ALFに暴露したM.tbでも同様であった。全体的な細胞内分布を評価すると、E-ALFに暴露されたM.tb桿菌は液胞と細胞質コンパートメントの両方に存在するのに対し、A-ALFに暴露されたM.tb桿菌は主に液胞に存在し、ATが複製とそれに伴う増殖を制限する可能性があることが示された。E-ALFに暴露されたM.tbの細胞質への脱出が多いことは、エンドリソソーム膜損傷の重要な指標と考えられているガレクチン（3および8）の蓄積によってさらに裏付けられている23, 24, 25。
M.tbがファゴライソソームから細胞質へと移行できることを示す証拠もあり、マクロファージではESAT-6分泌複合体-1（ESX-1 VII型分泌システム）によって促進されている31。M.tbのESX-1タイプVII分泌系が、非専門的な食細胞においてM.tbの細胞質への移行を媒介するかどうかを解明するには、さらなる研究が必要であるが、ESAT-6タンパク質をコードするM.tb遺伝子は、ATのM.tb感染時にアップレギュレートされる32。E-ALFがAT内でのM.tbの複製と増殖を促進し、細胞質への移行を促進したことから、M.tbのESX-1タイプVII分泌系が関与していると推測される。全体として、M.tbが細胞質に移行する際のAT内でのM.tbの代謝状態をさらに明らかにし、この過程に関与する細菌のメカニズムを解明することが重要であろう。
ATは、主要組織適合性複合体IおよびII（MHCI/II）の表面発現を通じて抗原提示細胞として働くことにより、浸潤した骨髄系細胞やリンパ球を活性化することができる33, 34。ちなみに、E-ALFに暴露されたM.tbまたはA-ALFに暴露されたM.tbがATに感染した場合、ATにおけるMHC表面マーカー（HLA-ABCおよびHLA-DR/DP/DQ）の発現が類似していることが観察された（補足図7）。興味深いことに、E-ALFに暴露されたM.tbは、ATにおけるいくつかの免疫学的メディエーターの産生を減少させた、 G-CSF、GM-CSF、FGF-2、IL-12など）、局所炎症反応の開始（TNF、IL-1β）、宿主細胞のリクルートメント（G-CSF、GM-CSF、FGF-2、MDC、GRO）、宿主肺胞自然免疫細胞の活性化（IFNγ、IL-7、MIP-1a、MIP-1b）、細胞媒介免疫の誘導（IL-2、IL-12、IP-10、IL-15）に重要なものがある。 tb感染後35, 36, 37, 38, 39, 40。したがって、E-ALFに暴露されたM.tbによるAT免疫応答の減少は、感染の初期段階において肺胞組織応答の活性化（細胞の活性化、浸潤、分化など）が変化することで、効果的な局所免疫が低下し、M.tbの感染と伝播が促進される可能性を示している41。
ATはM.tbに対する宿主の反応に関与する重要な役割を担っており、これには細胞間のクロストークを増強したり（肺胞マクロファージの活性化を制御する）、抗M.tb活性を促進する自然免疫分子を分泌したりすることが含まれるが、これらに限定されない17, 42。さらに、M.tbが感染や疾患の際に肺胞に侵入することを示す証拠も増えてきている18, 30, 43, 44, 45, 46, 47。例えば、感染したヒトやマウスの肺組織で肺胞上皮細胞がM.tb DNA陽性であったという報告がある43, 44, 48。また、感染したマウスの肺切片の肺胞上皮にM.tbが存在することを電子顕微鏡で示した報告18や、lung-on-chipモデルを用いた報告46, 47もある。ここでは、感染後15日目のマウス肺46, 47（図9）、および結核患者の生体外ヒト肺組織（図10）において、肺胞上皮内のM.tbが可視化されたことを追加的に示す。最後に、A549細胞株を用いたin vitroのM.tbシステムを用いたTEM研究49, 50, 51では、これらの上皮細胞内にM.tbが存在することが示されている。
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図9マウスモデルにおける感染初期のM.tb感染AT。(A)拡大正断面図、(B)感染後15日目にTd-Tomato（オレンジ色）を構成的に発現するM.tb Erdmanに感染したC57BL/6マウスの肺のAT細胞内に細胞内存在するM.tb桿菌の3D像。ポドプラニン、PDPN（I型AT陽性、緑）、CD45（白血球マーカー、ピンク）、DAPI（DNA/核マーカー、パネルAのみ青）。<スケールバー（A）15 µm、（B）5 µm＞。3D＝3次元；ATs＝肺胞上皮型細胞；DAPI＝4'，6-ジアミノ-2-フェニルインドール；DNA＝デオキシリボ核酸；M.tb＝結核菌；PDPN＝ポドプラニン。
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図サムネイルgr10
図10ヒト肺における肺胞および肺胞上皮内のM.tbの可視化。(A)微生物学的に結核と確定された患者の肺実質の複数の切片のZiehl-Neelsen(ZN)/CD68染色と(B)ZN/Heme Oxygenase-1(HO-1)染色の組み合わせ：低倍率画像と高倍率画像では、肺胞上皮細胞内のAFB（黒矢印）を含め、細胞外および細胞内における抗酸菌（AFB）（黄色矢印）を示す。赤い点線は、複数のAFBを持つM.tb感染細胞を示す。ZN法はM.tbのAFBを赤色に染色し、その断面は赤い点状の構造として見える。CD68はマクロファージの免疫マーカーである。希釈HO-1免疫組織化学染色により、細胞の輪郭がより鮮明に可視化された。B）の（i）、（ii）、（iii）は拡大図。AFB = 酸菌; HO-1 = ヘムオキシゲナーゼ1; M.tb = 結核菌; TB = 結核; ZN = ジール-ニールセン。
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以上より、炎症性および酸化的なE-ALF環境8, 11にさらされた結核菌は、細胞内輸送を変化させ、結核菌の細胞質への移行を促進し、結核菌の細胞内複製とATでの増殖を促進する。我々の研究は、高齢者の肺粘膜の状態と構成が、結核だけでなく他の呼吸器感染症にも影響を及ぼす重要な非専門的食細胞であるATのM.tb感染に影響を及ぼすことを明らかにした。これらの知見は、加齢に伴って肺環境の酸化状態が上昇し、これが呼吸器感染症に対する感受性の上昇に関係している可能性を示唆する我々の過去の発表を支持するものである8, 10, 11, 52。したがって、加齢に伴う肺の酸化状態を軽減することは、結核やその他の呼吸器感染症に対する有効な宿主指向の治療プラットフォームとなる可能性がある。肺に抗酸化物質を直接投与することで、肺の酸化バランスを回復させ、ALFに存在する可溶性自然免疫成分のレベルと機能を再確立し、その結果、高齢者の呼吸器感染症に対する抵抗性を高めることができる。我々の最近の研究では、老齢マウスのCD4+ T細胞に若いミトコンドリアを移入することで、T細胞の酸化ストレスが減少し、免疫機能が高まり、その結果、老齢マウスはM.tb感染とインフルエンザA感染の両方をよりよく制御できるようになることが示された52。
材料と方法
倫理声明と被験者
ヒトを対象とした研究は、米国連邦規則および地方規則（The Ohio State University Institutional Review Board番号2012H0135および2008H0119、Texas Biomedical Research Institute/UT-Health San Antonio/South Texas Veterans Health Care System Institutional Review Board番号HSC20170673H）に厳格に従って実施された。参加者は、成人（18～45歳、n＝8）および高齢者（60歳以上、n＝9）で、気管支肺胞洗浄液を得るためのインフォームド・コンセントを文書で行った後、人種や民族の差別なく男女から登録された。ヒトドナーの人口統計学的および臨床的特徴を補足表1に示す。合併症のある参加者はすべて除外し、登録しなかった（詳細は補足資料を参照）。肺切除標本は、University of KwaZulu-Natal Biomedical Research Ethics Committee（クラス承認研究番号：BCA 535/16）の承認を得た研究コホートから選んだ。結核のために肺切除を受けた患者（研究識別子：BE019/13）は、南アフリカのダーバンにある結核患者のための3次センターであるKing Dinizulu Hospital Complexから募集した。研究参加者全員から書面によるインフォームドコンセントを得た。
AT培養
すべての実験手順において、ヒトAT II型様細胞株A549（ATCC® CCL-185™）を利用した。この細胞株は、多くのAT II型細胞の特徴を示し、ATのモデルとして確立されている肺がん細胞株である。細胞培養は、若干の変更を加えて、以前に記載した15と同様に調製した。簡単に述べると、A549細胞株は、10％FBS（Atlas Biologicals, Fort Collins, CO）と1％PenStrep（Sigma, St. 細胞はM.tb感染の1週間前から抗生物質を含まない増殖培地で維持した。
ヒトALFの単離
ALFは、以前に詳述した5, 10, 11, 12, 13, 15, 53, 54.のように、ヒト肺内の生理的濃度（リン脂質1 mg/mL）で取得、濃縮、標準化した。
M.tb培養
M.tb H37Rv-Lux（27294）（Texas Biomedical Research InstituteのAzad博士とSchlesinger博士の好意により提供された）を記載55, 56のように増殖させた。SSB-GFP、smyc'::mCherry M.tb Erdman、およびTd-Tomato M.tb Erdman (Cornell UniversityのRussell博士の好意により提供)は、記載57と同様に増殖させた。GFP-M.tbエルドマン（カリフォルニア大学ロサンゼルス校、Horwitz博士の好意により提供）は前述5と同様に増殖させた。単一菌懸濁液は我々が記述したように調製した11, 15。マウスモデルに感染させるため、Td-Tomato46を構成的に発現しているWT M.tb株Erdmanを、0.5％アルブミン、0.2％グルコース、0.085％NaCl、0.5％グリセロール、0.02％タイロキサポールを添加したMiddlebrook 7H9ベース（Difco社製）中、37℃で100mLローラーボトルで指数期まで液体培養した。
ヒトALFへのM.tb菌の曝露
成人および高齢者ALF曝露M.tbの調製は、詳細5, 12, 13, 15, 53に記載したように、単一菌懸濁液（1×108菌/曝露）を用いて行った。新鮮なALF曝露M.tbを穏やかに洗浄し（ALFの痕跡を除去するため）、直ちに細菌の接種とその後の感染に備えた。ALFに暴露されたM.tbの接種液を7H9ブロスで連続希釈し、AT感染に使用するか、7H11寒天培地にプレーティングしてM.tbの生存率を測定し、特にE-ALF暴露M.tbとA-ALF暴露M.tbの間で生菌数に差がないことを確認した。
ATのM.tb感染：相対光単位およびコロニー形成単位によるルシフェラーゼベースの細胞内増殖
ATへのM.tb感染は既述の方法で行った15。簡単に説明すると、DMEM/F12/FBS培地中のALF暴露M.tbの単細胞懸濁液（細菌接種片）を、様々な感染多重度（MOI）でATs培養に添加し、細胞を2時間インキュベートした。あるいは、細菌の内在化を促進するために低温同期化（同期化貪食）を行った58。感染後、未結合の細菌を洗浄により除去し、ゲンタマイシン（50μg/mL）添加培地を1時間加えて細胞外細菌を死滅させた。その後、感染したATを洗浄し、10μg/mLのゲンタマイシン添加培地で指示された時間インキュベートし、細胞内増殖を評価した。ルシフェラーゼに基づくM.tb増殖アッセイ56では、ATにM.tb H37Rv-LuxをMOI 10:1で感染させ、GloMax® Multi Detection System（Promega, Madison, WI）を用いて24時間ごとに最大120時間まで細菌の生物発光を測定した。CFUs法による細胞内M.tbの測定では、MOI 10:1の感染ATを溶解し、前述11,59のように計数した。CFU、細胞内トラフィッキング、および電子顕微鏡による実験では、図中の凡例に特に断りのない限り、ATをGFP-M.tb Erdman株に感染させた。M.tb複製率の測定には、ATをSSB-GFP, smyc'::mCherry M.tb Erdman株に感染させた。
AT細胞生存率アッセイ
感染後の指示された時間に、ATの細胞毒性をCellTiter-Glo® luminescent cell viability assay (Promega Cat. #G7570 )を用いて、製造元の指示に従って測定した。このアッセイは、培地中に存在するATPの定量に基づいて培養中の生存細胞数を決定するものである（ATP［アデノシン三リン酸］の量は、培地中に存在する生存細胞数に正比例する）。GloMax Multi Detection System（Promega, Madison, WI）を用いて、耐熱性ルシフェラーゼによって生成される発光シグナルを、感染後24時間（hpi）ごとに120hpiまで測定した。
免疫細胞化学および共焦点顕微鏡検査（in vitro研究）
ガラスカバースリップ上のATs単層を、A-ALF曝露またはE-ALF曝露したM.tbにMOI 100:1で2時間感染させ、記載15と同様に処理した。簡単に述べると、6時間後、12時間後、24時間後、72時間後に、ATを洗浄し、冷4％パラホルムアルデヒドで15分間室温で固定し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中0.1％Triton-X100で10分間室温で透過処理した。M.tbの細胞内輸送を評価するため、感染細胞と非感染細胞の細胞コンパートメントを染色し、共焦点顕微鏡で評価した15。特定の抗体に関する情報は、補足資料を参照されたい。核を50 ng/ml 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（Invitrogen Cat. 過剰のDAPI溶液を除去するために複数回洗浄した後、ProLong Gold Antifade Reagent（Invitrogen社製、商品番号P36934）を用いてカバースリップをスライドにマウントした。
ZEISS LSM 800顕微鏡を用い、適切なパラメーターに設定し、最終倍率を600倍にして、レーザー走査型共焦点顕微鏡で細胞を可視化した。M.tb複製率実験では、SSB-GFP, smyc'::mCherry M.tb Erdman株を、独立した研究者2名による盲検分析で定量し、1条件につき少なくとも50イベント（≧50菌）を重複してカウントした。細胞内輸送については、GFP-M.tb ErdmanまたはTd-Tomato M.tb Erdmanを含む異なる細胞コンパートメントの共局在化イベントを、独立した研究者2名によるブラインド解析によって定量した。すべての顕微鏡データは、Zeiss ZEN Softwareを用いて解析した。
透過型電子顕微鏡（TEM）
ATs monolayersにA-ALF-exposed M.tbまたはE-ALF-exposed M.tbをMOI 100:1で2時間感染させた。感染したATは、72時間後に2.5％グルタルアルデヒドと2％ホルムアルデヒド（0.1Mカコジル酸ナトリウムpH7.3中）で固定され、若干の変更を加えて既述のようにTEM分析された60, 61。簡単に説明すると、一次固定（一晩）の後、細菌を0.1Mリン酸緩衝液で洗浄し、1％Zetterqvist緩衝四酸化オスミウムで30分間後固定した。その後、段階的な一連のアルコールによる段階的な長時間の脱水操作を行い、100％アルコールで10分間を2回行った以外はすべて1回で10分間行い、最後にプロピレンオキシドで10分間ずつ2回脱水した。樹脂浸潤と包埋のために、細胞ブロックはプロピレンオキシドから3:1プロピレンオキシド:Eponで4時間インキュベートした後、ローテーターで1:1プロピレンオキシド:Eponと2:1プロピレンオキシド:Eponでさらに2回インキュベートした。細胞ブロックをニートEponに4時間移し、60℃で48時間硬化させた。超薄切片を切り出し、グリッド上で50％MeOH（メタノール）中1％酢酸ウラニルで暗所、室温で1時間後染色した後、クエン酸鉛で室温で3分間染色した。
サンプルは、TEMによるM.tbの細胞内コンパートメント化研究の専門家であるDaniel L. Clemens博士62, 63, 64に送付され、盲検下で解析された。膜結合小胞内に存在する桿菌と、細胞質コンパートメント（桿菌の周囲に膜二重層がない）に存在する桿菌の相対的な割合を定量化した。個々の宿主細胞は異なるコンパートメント内にM.tbを持つことが多いため、データは宿主細胞レベルではなく細菌レベルでスコア化した。各条件について、日本電子100CX透過型電子顕微鏡（Brain Research Institute Electron Microscopy Core Facility; Brain Research Institute, UCLA）を用いて、少なくとも100イベント（≧100菌）を画像化し、盲検下でスコア化した。
AT免疫メディエーター
感染（A-ALF-exposed M.tbおよびE-ALF-exposed M.tb）または非感染ATの24時間後の上清中のタンパク質レベルを、IL-6、CCL5/RANTES、GM-CSF、TNF、IL-1β、IL-18/IL-1F4、およびIL-12/IL-23のマルチプレックスパネルヒト磁気ビーズLuminex®アッセイを用いて測定した（R&D、Human 10-Plex Cat. #LXSAHM -10、ロット#L134898）；およびIL-8/CXCL8（希釈度1:5、R&D Cat.#DY208-05、ロット#P105639）およびCCL2/MCP-1（希釈度1:15、R&D Cat.#DY279-05、ロット#333900）のヒトELISAキットを、製造業者の指示に従って使用した。Human Luminex解析は、Luminex200（SN LX10009028406）を用い、Texas Biomed Molecular CoreによるxPONENT 4.3 Softwareバージョンを用いて、以下のパラメータに従って行った： DD gate 8000-16500、サンプル量50μl、ビーズ/リージョンあたり50-100イベント、Low PMT (LMX100/200: Default)。
感染（A-ALF-exposed M.tbおよびE-ALF-exposed M.tb）または非感染M. MIP-1b、GRO、IP-10、フラクタルキン、エオタキシン、IL-1β、IL-18、HMGB1、TNFα、IL-12（p40）、IL-12（p70）、IL-15、IL-2、IL-3、IFNγ、IFNα2、IL-6、IL-4、IL-17A（EMD MilliporeのMilliplex® Cat. #HCYTA -60K-11および#HCYP4MAG-64K-02）を、製造者の指示に従い、Luminex FlexMAP 3D装置、Milliplex Analystソフトウェアバージョン5.1（University of Texas Health Center at San Antonio's Bioanalytics and Single-Cell Core）を用いて分析した。解析ソフトウエアは、サンプル/ウェル100μL中、ビーズあたり平均50イベント、合計1000個のビーズを収集するように設定された。蛍光強度の中央値（MFI）を用いて生データを取得した。バックグラウンドの少なくとも3倍以上の最低標準物質を定量下限値とした。MFIと取得した標準曲線を用いて、各分析物の濃度を算出した。
AT インフラマソーム活性
AT インフラマソーム活性は、Caspase-Glo® 1 Inflammasome assay（Promega Cat. このアッセイは、他のカスパーゼの中でもカスパーゼ-1の活性を選択的に測定するものである。GloMax Multi Detection System（Promega, Madison, WI）を用いて、24時間後と72時間後に、耐熱性ルシフェラーゼによって生成された発光シグナルを測定した。
マウス感染
8週齢の雌性C57BL/6マウスを市販業者（Charles River社）から購入し、特定の病原体フリー施設で飼育した。動物プロトコールは、EPFLの主任獣医師、ヴォー州消費・獣疫局（Service de la Consommation et des Affaires Vétérinaires）、およびスイス獣疫局（Office Vétérinaire Fédéral）の審査と承認を受け、ライセンスVD3472に基づく。同性の同腹兄弟を無作為に実験群に割り付けた。
マウスは、前述47 のとおり、特注のエアロゾル装置を用いて、50～100 CFUの指数関数期M.tbをエアロゾル経路で感染させた。感染量は、MGITTM PANTATM抗生物質ミックス（BD）を含む7H11寒天プレート上でのCFUアッセイによる総肺細菌負荷の測定により確認した。
免疫蛍光およびイメージング（肺組織切片）
感染後2週目にマウスをCO2過剰投与により安楽死させ、肺を無菌的に摘出した。厚い感染組織切片の画像化のために、肺葉を20mLの4％中性緩衝パラホルムアルデヒド（PFA）溶液（Biosystems社製）に浸し、室温で2時間、続いて4℃で24時間インキュベートして固定した。その後、組織切片を30％スクロースで24～48時間平衡化し、切片作製のために凍結保存した。固定凍結した感染動物組織の150μm厚切片を、クライオスタット（Leica CM3050S）を用いて切り出した。PBS中1% Triton X-100を含む1% BSAで2時間ブロッキングした後、切片を蛍光色素で直接標識した一次抗体[CD45 (30-F11)]; 抗マウス; AF647コンジュゲート; ラットモノクローナル(Biolegend)およびポドプラニン(eBio 8.1.1)と72時間インキュベートした。 1.1）；抗マウス；AF488コンジュゲート；シリアンハムスターモノクローナル（Thermo Fisher Scientific）をPBS中0.1% Triton X-100を含む1% BSAで希釈したもの。DAPIでカウンター染色後、切片をフレーム（BioRad, Frame-Seal™ Slide Chambers, #SLF1201 ）とFluoromountG（Bioconcept, 0100-01）を用いてSuperfrost+スライドにマウントした。固定し、染色した切片をLeica SP8共焦点顕微鏡で40倍のグリセロール浸漬対物レンズ（NA = 1.25、Leica）を用いて画像化した。その後、Huygens Deconvolution Software（Scientific Volume Imaging）を用いてZ-スタックをデコンボリューションした。Imaris 9.9 (Bitplane)を使用して、3D画像と拡張オルソセクションをレンダリングした。
ヒト肺における肺胞、マクロファージ、肺胞上皮内のM.tbのZiehl-NeelsenおよびIHCによる可視化
ZN/CD68染色とZN/ヘムオキシゲナーゼ1（HO-1）染色を、選択した症例の代表的なヒト肺組織サンプルに対して行った。病理組織学的検査により、ATおよびマクロファージ内に細胞内アシッドファストバクテリア（AFB）が存在することが確認された。さらに、肺胞壁のすぐ近くを含む肺胞腔内に細胞外AFBが確認された。目的のヒト肺サンプルを無菌的に取り出し、10％中性緩衝ホルマリン（10％NBF）で固定した。これらのサンプルは、キシレンを含まないプロトコールを用いて、真空濾過組織プロセッサーでルーチンに処理された。組織切片をパラフィンワックスに包埋し、ブロックした。切片は4μmに切断し、56℃で15分間焼成し、キシレンを2回交換して脱脂し、アルコールから水への下降グレードで再水和した。ルーチンのH&E（ヘマトキシリン・エオジン）染色は、スライドをヘマトキシリンで5分間、水道水で2分間洗浄し、炭酸リチウムで1分間青色化し、水道水で2分間すすぎ、エオジンで5分間対比染色した後、水道水で2分間最終洗浄した。スライドをアルコールで脱水し、キシレンで洗浄し、ジスチレン、可塑剤、キシレンでマウントした。IHC（免疫組織化学）とZN染色を組み合わせるために、ヒト肺組織を2mmの厚さに切り出し、荷電スライドにマウントし、56℃で15分間加熱した。マウントした切片をキシレンで脱脂した後、100％エタノールですすぎ、SVR（95％）を1回交換した。その後、スライドを流水で2分間洗浄し、Tris-塩化ナトリウム（pH 6.0）中で30分間、熱誘導エピトープ検索により抗原を回収した。その後、スライドを15分間冷却し、流水で2分間洗浄した。内因性過酸化物活性を、3％過酸化水素を用いて室温（RT）で10分間ブロックした。その後、スライドをPBSTで洗浄し、プロテインブロック（Novolink）を用いて室温で5分間ブロックした。切片をCD68（M0814-CD68-KP1、DAKO、1:3000）またはHO-1（ab13248、Abcam、1:100）の一次抗体でインキュベートした後、洗浄し、ポリマー（Novolink）でRTで30分間インキュベートした。次にスライドを洗浄し、DABで5分間染色した後、流水で5分間洗浄した。その後、スライドを加熱したカルボルフクシン（carbol fuchsin）で10分間インキュベートし、水道水で洗浄した。3％酸性アルコールをスライドに塗布し、30秒間または切片が透明になるまで脱色した。その後、スライドを水道水で2分間洗浄し、メチレンブルーで対比染色した。その後、スライドを流水で洗い、脱水し、ジスチレン、可塑剤、キシレンでマウントした。
スライドのスキャン
組織標本は浜松ホトニクスのNDPスライドスキャナー（Hamamatsu NanoZoomer RS2, Model C10730-12）とそのビューイングプラットフォーム（NDP.View2）を用いてデジタル化した。赤、緑、色のバランスは100％に保たれ、ガンマ補正は0.7から2の間に保たれた。明るさとコントラストの設定はスライド間で非常に緩やかであり、染色の質に依存する。このプロセスで使用した試薬の詳細なリストは、補足資料を参照のこと。
統計解析
GraphPad Prism 8ソフトウェアを用いてグラフを作成し、実験群間の統計的有意性を決定した。両側Studentのt検定（非対）、一元配置分散分析、二元配置分散分析（多重検定のためのTukeyポストホック補正付き）を、該当する場合に適用し、図の凡例に記載した。本試験において、「n」値は、図中の凡例に記載されているように、異なる成人または高齢のヒトド ナーの ALF 試料を個別に（またはプールして）用いた生物学的レプリカの数を表す。群間の統計的差異は、p値が0.05以下の場合に有意（）と報告した。
著者貢献
研究デザインおよびコンセプト立案、AMO-FおよびJBT；実験手順、AMO-F、JMS、AS、AG-V、PP、AH、RMおよびVVT；データ取得および正式解析、AMO-FおよびJMS；BAL液採取、JIPおよびDJM；ヒトALF分離、AMO-F；盲検解析によるTB-TEM、DLC；動物モデル、RMおよびVVT；組織学、二重免疫組織化学およびZiehl-Neelsen染色、KNおよびTN； 病理組織学的鑑定、TN；執筆-原案、AMO-F、JBT；視覚化およびBioRender図、AMO-F；執筆-校閲および編集、JBT、LSS、JT、DLC、VVT、AJCS、BIR；資金獲得、AMO-F、JT、VVT、AJC、JBT すべての著者は、掲載された原稿を読み、同意した。
利益相反宣言
著者らは競合する利益を申告する必要はない。
資金提供
本研究は、米国国立加齢研究所（NIA）、米国国立衛生研究所（NIH）（JT、JBT、BIR、LSSには助成金番号P01 AG-051428、AMO-FにはF99 AG-079802）、NIH/国立アレルギー・感染症研究所（NIAID）R33 AI-138280、AJCSの助成を受けた； HFSP Long-Term Fellowship（LT000231/2016-L）、Holcim Stiftung zur Förderung der Wissenschaftlichenからの支援、およびVVTへの支援。JBTはまた、ロバート・J・クレーバーグ・ジュニア・アンド・ヘレンC. Kleberg財団からも一部支援を受けた。本研究はまた、NIH所長室から賞番号S10 OD-028653の一部支援を受けた。AMO-FはTexas Biomed社のDouglass Graduate Fellowshipから部分的な支援を受けた。本研究は、NIH/NIAIDの資金提供プログラム（P30 AI-168439）であるTexas Biomedical Research Institute Interdisciplinary NexGen TB Research Advancement Center（IN-TRAC）により提供されたインフラとリソースにより促進された。内容はあくまで著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を示すものではない。
データの利用可能性
本論文の結論を評価するために必要なすべてのデータは、本原稿または補足資料に記載されている。
謝辞
それぞれSSB-GFP smyc'::mCherry M.tb Erdman株、GFP-M.tb Erdman株、Lux-M.tb H37Rv株を快く提供してくださったDavid Russell博士（コーネル大学）、Marcus Horwitz博士（UCLA）、Abul Azad博士（Texas Biomed）に感謝する。ガレクチン染色について助言をいただいたMorwan Osman博士（University of Cambridge）に感謝する。Dr. Reagan Meredith（Texas Biomed）には生物統計学の助言を、Texas BiomedのBSL-3 Operations Programにはサービスとサポートをいただいた。
付録A. 補足データ
以下は本論文の補足データである：
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補足データ1
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論文情報
出版履歴
オンライン公開 2024年1月27日
受理済み 2024年1月3日
受理：2024年1月3日 受理：2023年7月6日
出版段階
インプレス校正
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.mucimm.2024.01.001

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図
図サムネイルgr1
図1高齢者ヒトALFへのM.tbの曝露は、ATにおける細胞内細菌増殖の増加と関連している。ALFに曝露されたM.tb（H37Rv-Lux）を10:1のMOIで2時間ATに感染させた後、細胞外M.tbを死滅させるためにゲンタマイシンを1時間投与した。(B)96ウェルプレート中の感染単層膜について、GloMax®読み取りシステムを用いて、指示された時点における発光の増加（ATにおけるM.tb H37Rv-Luxの細胞内増殖を示す）を読み取った。4つの異なるA-ALFとE-ALFを用いた3連のn=4（平均±SEM）の累積データ。(C）ATにおけるM.tb細胞内増殖をコロニー形成単位（CFUs）で評価した。2つの異なるA-ALFとE-ALFを用い、3連のn = 2（平均±SEM）の累積データ。各時点におけるAdult対ElderlyのStudent's unpaired t test分析、*p< 0.05、**p< 0.01。n」の値は、異なる成人または高齢者ヒトドナーからの個々のALFサンプルを用いた生物学的レプリカの数を表す。A＝成人ALF曝露M.tb（白棒）；ALF＝肺胞ライニング液；ATs＝肺胞上皮型細胞；CFUs＝コロニー形成単位；E＝高齢者ALF曝露M.tb（黒棒）；MOI＝感染多重度；M.tb＝結核菌；ns＝有意差なし；RLUs＝相対軽単位；SEM＝平均値の標準誤差。
図サムネイルgr2
図2高齢のALFに曝露されたM.tbは、ATs感染時に初期複製を増強した。ATsをレポーターSSB-GFP, smyc'::mCherry M.tb株で10:1のMOIで感染させ、共焦点顕微鏡により指定された時点での細菌の複製率を測定した。(A）24時間後および72時間後にA-およびE-ALFに曝露されたSSB+M.tbの割合、2種類のA-ALFと4種類のE-ALFを用いた複製でn＝2-4（平均±SEM）。(B）72時間後のA-およびE-ALF-M.tbに感染したATの代表的共焦点画像。灰色の破線で示した領域を右側に拡大して示す（上段はA-ALF、下段はE-ALF）。複製されたSSB+M.tbは白矢印で示され、融合した（黄色の）病巣を示している。イベントは、少なくとも50の独立したイベント（≧50菌）をカウントすることによって列挙した。<スケールバーは10μmを表す>。成人対高齢者のStudent's unpaired t test分析、*p< 0.05。n」の値は、異なる成人または高齢者ヒトドナーからの個々のALFサンプルを用いた生物学的レプリカの数を表す。A＝成人ALF曝露M.tb；ALF＝肺胞ライニング液；ATs＝肺胞上皮型細胞；E＝高齢者ALF曝露M.tb；GFP＝緑色蛍光タンパク質；hpi＝感染後数時間；MOI＝感染多重度；M.tb＝結核菌；ns＝有意差なし；SEM＝平均値の標準誤差；SSB＝一本鎖DNA結合タンパク質。
図のサムネイルgr3
図3E-ALFに暴露されたM.tbは、AT内の後期エンドソームへの輸送が減少した。ATをA-ALFまたはE-ALFに曝露したGFP-M.tbに100:1のMOIで2時間感染させた後、細胞外M.tbを死滅させるためにゲンタマイシンを1時間投与した。単層膜は、指定された時点（6時間後、12時間後、24時間後、72時間後）で異なる細胞内マーカーで染色した。(A) M.tbとRab5+Rab7+（初期エンドソームから後期エンドソームへのM.tbの移動を示す）またはRab7+（すでに後期エンドソームにあるM.tbを示す）とのコンパートメント融合を示す共局在事象。(B)E-ALFに曝露したM.tbの、A-ALFに曝露したM.tbに対する共局在化の減少率。(C）細胞内マーカーRab5およびRab7で染色した、A-ALF暴露およびE-ALF暴露M.tbに感染したATの代表的な共焦点画像。イベントは少なくとも200の独立したイベント（200-300菌）をカウントすることで列挙した。灰色の破線で示した領域は右側に拡大して示し、共局在化イベントは白矢印で示した。開いた矢頭は二重共局在イベント（Rab5+Rab7+）を示す。<スケールバーは10μmを表す。成人対高齢者のStudent's unpaired t test analysis, *p < 0.05, **p < 0.01。n」の値は、異なる成人または高齢者ヒトドナーからのALFサンプルのプーリングを用いた生物学的レプリカの数を表す。A＝成人ALF曝露M.tb；ALF＝肺胞ライニング液；ATs＝肺胞上皮型細胞；DAPI＝4'，6-ジアミノ-2-フェニルインドール（ATs核DNA）；DIC＝微分干渉コントラスト；E＝高齢ALF曝露M. tb；GFP＝緑色蛍光タンパク質；hpi＝感染後数時間；MOI＝感染多重度；M.tb＝結核菌；ns＝有意差なし；Rab＝Ras関連結合タンパク質；SEM＝平均値の標準誤差。
図のサムネイルgr4
図4E-ALFに曝露したM.tbは、AT内でのエンドリソソーム輸送が減少した。ATをA-ALFまたはE-ALFに曝露したGFP-M.tbに100:1のMOIで2時間感染させた後、細胞外M.tbを死滅させるためにゲンタマイシンを1時間投与した。単層膜は、指定された時点（6時間後、12時間後、24時間後、72時間後）で異なる細胞内マーカーで染色した。(A) M.tbとLAMP-1+（リソソーム内のM.tbを示す）またはLC3+（オートファゴソーム内のM.tbを示す）のコンパートメント融合を示す共局在事象。(B) A-ALFに曝露したM.tbに対するE-ALFに曝露したM.tbの共局在の減少率。(C）A-ALFとE-ALF-M.tbに感染したATを、細胞内マーカーLAMP-1とLC3で染色した代表的な共焦点画像。イベントは少なくとも200の独立したイベント（200-300菌）をカウントすることにより列挙した。灰色の破線で示した領域は右側に拡大して示し、共局在化イベントは白矢印で示した。開いた矢印は二重共局在イベント（LAMP-1+LC3+）を示す。<スケールバーは10μmを表す。成人対高齢者のStudent's unpaired t test analysis, *p < 0.05, **p < 0.01。n」の値は、異なる成人または高齢者ヒトドナーからのALFサンプルのプーリングを用いた生物学的レプリカの数を表す。A＝成人ALF曝露M.tb；ALF＝肺胞ライニング液；ATs＝肺胞上皮型細胞；DAPI＝4'，6-ジアミノ-2-フェニルインドール（ATs核DNA）；DIC＝微分干渉コントラスト；DNA＝デオキシリボ核酸；E＝高齢ALF曝露M. tb；GFP＝緑色蛍光タンパク質；hpi＝感染後数時間；LC3＝微小可溶性関連タンパク質軽鎖3；LAMP＝リソソーム関連膜タンパク質；MOI＝感染多重度；M.tb＝結核菌；ns＝有意差なし；SEM＝平均値の標準誤差。
図のサムネイルgr5
図5ALFに暴露されたM.tbは、AT内の細胞内局在に違いをもたらす。ATをA-ALFまたはE-ALF曝露M.tbに100:1のMOIで2時間感染させ、その後ゲンタマイシンで細胞外M.tbを1時間死滅させた。膜結合小胞内に存在する細胞内細菌と細胞質内に遊離して存在する細胞内細菌の割合をTEMで観察した。(A)72時間後のA-ALF曝露M.tbとE-ALF曝露M.tbの液胞(エンドソーム/リソソーム)または細胞質コンパートメントに位置するM.tbを定量化するために、ブラインド分析によりコード化したサンプルをスコア化した、n=2(平均±SEM)。 (B)ALF曝露M.tbのTEM顕微鏡写真。A-ALF暴露およびE-ALF暴露M.tbは、膜に囲まれていない場合は「細胞質、C」、液胞膜に囲まれている場合は「液胞、V」とスコア付けした。液胞膜は青い矢印で示す。細菌はアスタリスクで示す。値は少なくとも100の独立したイベント（バクテリア）をカウントして決定した。A-V対E-V、A-C対E-CのStudent's unpaired t test解析；*p< 0.05。A-V：液胞コンパートメント内のALF曝露M.tb（サイズバー：それぞれ400 nmおよび800 nm）、A-C：細胞質コンパートメント内のALF曝露M.tb（サイズバー：それぞれ400 nm）、E-V：液胞コンパートメント内のALF曝露M.tb（サイズバー：それぞれ600 nmおよび200 nm）、E-C：細胞質コンパートメント内のALF曝露M.tb（サイズバー：それぞれ400 nmおよび600 nm）。n "値は、異なる成人または高齢者ヒトドナーからの個々のALFサンプルを用いた生物学的複製数を表す。A＝成人ALF曝露M.tb、ALF＝肺胞ライニング液、ATs＝肺胞上皮型細胞、E＝高齢者ALF曝露M.tb、hpi＝感染後数時間、MOI＝感染多重度、M.tb＝結核菌、SEM＝平均値の標準誤差、TEM＝透過型電子顕微鏡。
図のサムネイルgr6
図6E-ALF暴露はAT内のM.tbエンドソーム膜損傷を増加させる。ATをA-ALFまたはE-ALFに曝露したTd-トマトM.tbに100:1のMOIで2時間感染させた後、細胞外M.tbを死滅させるためにゲンタマイシンを1時間投与した。単層膜を72時間後に異なる細胞内マーカーで染色した。(A-B）Mtb-Galectin-3+、Mtb-Galectin-8+、およびM.tb-FK2+（ユビキチン化タンパク質の蓄積）のコンパートメント融合を示す共局在化イベント。(C-D）細胞内マーカーGal-3とFK2（C）またはGal-8とGal-3（D）で染色したA-ALF感染およびE-ALF感染M.tb感染ATの感染後72時間における代表的な共焦点画像。イベントは、100-300の独立したイベント（バクテリア）をカウントすることにより列挙した。灰色の破線で示した領域は右側に拡大して示し、共局在化イベントは白矢印で示した。開いた矢印は二重共局在イベント（Gal-3+FK2+またはGal-8+Gal-3+）を示す。<スケールバーは10μmを表す>。成人対高齢者のStudent's unpaired t test analysis, *p< 0.05。n」の値は、異なる成人または高齢者ヒトドナーからのALFサンプルのプーリングを用いた生物学的レプリカの数を表す。A＝成人ALF曝露M.tb；ALF＝肺胞ライニング液；ATs＝肺胞上皮型細胞；DAPI＝4'，6-ジアミノ-2-フェニルインドール（ATs核DNA）；DIC＝微分干渉コントラスト；E＝高齢者ALF曝露M. tb；FK2＝ユビキチン化タンパク質（クローンFK2）；Gal＝ガレクチン；hpi＝感染後数時間；MOI＝感染多重度；M.tb＝結核菌；ns＝有意差なし；SEM＝平均値の標準誤差。
図のサムネイルgr7
図7E-ALFに暴露されたM.tbはATの免疫メディエーター産生を減少させる。ATをA-ALFまたはE-ALF曝露M.tbに100:1のMOIで2時間感染させた後、細胞外M.tbを死滅させるためにゲンタマイシンを1時間投与した。A-ALFまたはE-ALFに曝露したM.tbに感染したATの上清を、成長因子、サイトカイン、ケモカインの産生を評価し、72時間後と120時間後にマルチプレックスバイオマーカーアッセイにより、製造元の指示に従って測定した。グラフは、A-ALFに対するE-ALF曝露M.tb感染ATの上清のlog2倍変化を示し、以下のグループに分類した：成長因子、ケモカイン、インフラマソーム、インターフェロン、Th1およびTh2/Th17メディエーター。値は、3つの別々の実験から得られた4つの異なるA-ALFまたはE-ALFドナーのプーリングを用いたn = 4のlog2（総[pg/ml]の中央値E-ALF / 総[pg/ml]の中央値A-ALF）に対応する。A＝成人ALF曝露M.tb；ALF＝肺胞ライニング液；ATs＝肺胞上皮型細胞；E＝高齢ALF曝露M.tb；hpi＝感染後数時間；MOI＝感染多重度；M.tb＝結核菌；Th＝Tヘルパー細胞メディエーター。
図のサムネイルgr8
図8本研究で得られた主な知見の概略。M.tbが高齢者のE-ALFに暴露されると、ATにおける初期複製とその結果としての細胞内増殖が促進される。さらに、E-ALFに曝露したM.tbをATに感染させると、細菌のエンドソーム輸送が変化し、ガレクチンのリクルートメントが増加する。これは、エンドソーム膜の損傷が増加し、細菌の細胞質への移行が促進されることを示唆している。E-ALFに暴露されたM.tbは、宿主細胞の生存率に影響を与えることなく、いくつかの炎症性メディエーター（サイトカインとケモカイン）の産生にも変化を示した。全体として、A-ALFに暴露されたM.tbは主にエンドソーム／リソソーム（液胞）に存在するのに対し、E-ALFに暴露されたM.tbは液胞と細胞質の両方のコンパートメントに存在する。つまり、E-ALFへの暴露はAT内でのM.tbの増殖を促進し、ATの免疫応答を低下させ、宿主細胞の活性化と死を防ぐ。E-ALFに暴露されたM.tbは、AT細胞質を細菌の生存のためのニッチとして利用している。この図はBioRender (https://biorender.com/)で作成した。A = ALFに曝露した成人M.tb; ALF = 肺胞ライニング液; ATs = 肺胞上皮型細胞; E = ALFに曝露した高齢者M.tb; M.tb = 結核菌。
図サムネイルgr9
図9マウスモデルにおける感染初期のM.tb感染AT。(A)拡大正断面図、(B)感染後15日目にTd-Tomato（オレンジ）を構成的に発現するM.tb Erdmanに感染したC57BL/6マウスの肺のAT細胞内に細胞内存在するM.tb桿菌の立体像。ポドプラニン、PDPN（I型AT陽性、緑）、CD45（白血球マーカー、ピンク）、DAPI（DNA/核マーカー、パネルAのみ青）。<スケールバー（A）15 µm、（B）5 µm＞。3D＝3次元；ATs＝肺胞上皮型細胞；DAPI＝4'，6-ジアミノ-2-フェニルインドール；DNA＝デオキシリボ核酸；M.tb＝結核菌；PDPN＝ポドプラニン。
図サムネイルgr10
図10ヒト肺における肺胞および肺胞上皮内のM.tbの可視化。(A)微生物学的に結核と確定された患者の肺実質の複数の切片のZiehl-Neelsen(ZN)/CD68染色と(B)ZN/Heme Oxygenase-1(HO-1)染色の組み合わせ：低倍率画像と高倍率画像では、肺胞上皮細胞内のAFB(黒矢印)を含め、細胞外および細胞内のacid-fast bacilli(AFB)(黄色矢印)を示す。赤の点線は、複数のAFBを持つM.tb感染細胞を示す。ZN法はM.tbのAFBを赤色に染色し、その断面は赤い点状の構造として見える。CD68はマクロファージの免疫マーカーである。希釈HO-1免疫組織化学染色により、細胞の輪郭がより鮮明に可視化された。B）の（i）、（ii）、（iii）は拡大図。AFB = 酸菌; HO-1 = ヘムオキシゲナーゼ1; M.tb = 結核菌; TB = 結核; ZN = Ziehl-Neelsen.
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