植物とその微生物叢の間の広範な水平遺伝子移動

2023年1月25日 22:56

植物とその微生物叢の間の広範な水平遺伝子移動
シェリー・ハイムリッチ、ユリア・フリドマン、ヒタイシ・カンダル、シガル・サバルディ・ゴールドスタイン、ORCID プロフィールを見るアサフ・レヴィ
doi: https://doi.org/10.1101/2022.08.25.505314
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000030120
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要旨
植物は、宿主と相互作用する多数の常在菌を宿主としている。植物と細菌の相互作用は、宿主の病原菌に対する免疫力を向上させ、植物の生育に必要な栄養素を供給する。このような古くからの相互作用は、研究されているすべての陸上植物に共通しており、植物の適切な健康状態や発達に不可欠である。我々は、植物とその微生物相の空間的な近接性と長期的な関係は、自然界では比較的まれな現象である生物界を越えた遺伝子水平移動（HGT）を促進、あるいは依存する可能性があると仮定した。この仮説を検証するために、我々はシロイヌナズナゲノムとその広範な配列決定されたマイクロバイオームを解析し、植物に関連しない細菌には存在しない全長遺伝子の水平伝播の事象を検出した。その結果、植物とその微生物相の間で水平伝播した180のユニークな遺伝子が検出されました。植物から微生物群へ移行した遺伝子は、糖質を代謝する分泌タンパク質に富み、一方、微生物から植物へ移行した遺伝子は、酸化還元恒常性機能に富んでいることが明らかになった。このアプローチを検証するため、ある細菌遺伝子が植物体においてそのシロイヌナズナのホモログと機能的に類似しているかどうかを検証した。シロイヌナズナのDET2遺伝子は、植物ホルモンであるブラシノステロイドの生合成に必須であり、この遺伝子の機能喪失は矮性化につながる。我々は、アクチノバクテリア門のLeifsonia菌のDET2ホモログをシロイヌナズナdet2バックグラウンドで発現させると、変異体が補完され、正常な植物生育につながることを見いだした。これらのデータは、植物とそのマイクロバイオームとの相互作用を形成する、領域を超えた水平方向の遺伝子転移事象を示唆している。

意義・解説宿主と微生物の相互作用を形成する遺伝子は何か、その起源は何かは、分子生態学および進化学の基本的な問題である。我々は、宿主-微生物相互作用のモデルとして、シロイヌナズナ-微生物相互作用を形成する進化的なメカニズムを探った。その結果、植物とその共生微生物との間で、180の遺伝子を含む広範な水平的遺伝子転移が起こっていることを発見した。これらの遺伝子は、宿主とその微生物相の間の分子模倣に関与していることが示唆された。植物から獲得した遺伝子は、主に糖質を代謝する分泌タンパク質をコードしており、これにより細菌は植物由来の糖質で生育することができるようになった。さらに、植物ホルモン生合成遺伝子を模倣した細菌遺伝子が、植物遺伝子の機能を代替できることを実証した。この結果は、宿主とその微生物相との間の水平的な遺伝子伝達が、植物とその共生微生物相に新たな形質をもたらす重要かつ活発な進化メカニズムであることを示唆している。

はじめに
植物は微生物と密接な関係を築いており、これらを総称して植物微生物叢と呼ぶ。微生物は植物と共生していることがほとんどである。しかし、微生物が宿主の分子ネットワークとどのように相互作用しているのか、その分子機構はほとんど分かっていない。しかし、多様な植物種や組織と共生する数百種類の細菌を分離し、ゲノム配列を決定することで、植物の適応に関わる微生物遺伝子のいくつかを明らかにすることができました（1-6）。また、トランスクリプトームやプロテオーム研究により、どの細菌遺伝子が植物体内で活性化しているかが検出されました（7, 8）。植物と微生物との相互作用の一環として、単純糖質、有機酸、シグナル伝達物質、抗菌物質、植物の生理機能を変化させる細菌エフェクタータンパク質など、さまざまな分子が交換されている(9-16)。交換された分子の一部は、微生物が宿主を模倣する分子模倣に利用され、新たな代謝能力や共有環境に対する迅速な適応など、供与側の生物機能を受容側に提供する。分子模倣は、植物病原菌で広く報告されている。Pseudomonas syringae病原体は、植物毒素であるコロナチンを使って植物ホルモンであるジャスモノイルイソロイシン（JA-Ile）を構造的に模倣し、それによって宿主のジャスモン酸シグナルを操作している（17, 18）。また、P. syringaeは、宿主のキナーゼを分解するエフェクタータンパク質AvrPtoBの一部として真核生物のE3ユビキチンリガーゼドメインを獲得し、宿主の病害感受性につながるようになった(19)。また、Xanthomonas oryzaeは、植物成長を刺激するPSYペプチドを模倣して、感染を促進する（20）。常在菌の枯草菌は、植物のエキスパンシンタンパク質のリモートホモログをコードしている。細菌のエキスパンシンは植物の細胞壁の伸長を促進し、根のコロニー形成に重要である(21)。分子模倣は、生物界を横断する遺伝子水平移動（HGT）現象によって起こる可能性がある（22-24）。HGTは植物宿主とそのマイクロバイオームの間で起こる可能性がある。生物間の近接性、根圏における巨大な微生物競争と植物免疫による選択圧、および外来DNAを統合する微生物固有の能力が、植物からそのマイクロバイオームへのDNA転移を導く可能性がある（25）。バクテリアから植物の生殖細胞への遺伝子導入現象は、そのメカニズムが不明である。しかし、過去にそのような事象が報告されており、その多くは、バクテリアから陸上植物の祖先への古代のHGT事象であるとされていた(26-29)。もちろん、アグロバクテリウムは植物の体細胞に遺伝子を導入するが、これらの遺伝子は植物の種子には渡らない。

我々は、植物とその直接の根や芽のマイクロバイオームのゲノムから、植物とバクテリアの間のクロスキングダムHGTイベントの範囲と性質が明らかになると仮定した。本研究では、モデル植物であるシロイヌナズナと、その広範囲に分離され配列決定されたマイクロバイオームとの間のクロスキングダムHGT事象の可能性を系統的に探索した。植物、植物関連細菌、およびいくつかの対照群から得られた数百のタンパク質の系統解析を用いて、180の水平遺伝子転移事象を検出し、その方向性、分類学的および機能的な偏りを決定することができた。さらに、植物から植物関連細菌に転移した遺伝子は、変異によって植物のホモログから分岐しているにもかかわらず、植物体内でその機能を維持していることを明らかにした。このように、生物界をまたぐ遺伝子組み換えは比較的頻繁に起こっており、植物やその微生物群に適応的な形質を与えることでゲノムを形成していることが示唆された。

研究成果
シロイヌナズナとその微生物群の間でアミノ酸配列の類似性が高い遺伝子の同定
植物とマイクロバイオームの間の分子模倣現象の程度を定量化するために、我々は植物と微生物の相互作用のモデルとして機能している植物シロイヌナズナに注目した（30, 31）。シロイヌナズナの微生物相は、異なるグループによって根や芽から広範囲に分離され、そのゲノムはこれまでに配列決定されている(1, 2, 4)。我々は、シロイヌナズナから分離された582の完全に配列決定された細菌の遺伝子とシロイヌナズナの遺伝子を比較した（補足表1）。今回の解析では、健康な植物から分離されたシロイヌナズナに関連する常在菌を対象としたが、ほとんどの分子模倣現象は、Xanthomonas属やPseudomonas syringae種などの植物病原体の観点から以前に研究されている(32)。我々は、BLASTPプログラムを用いて、シロイヌナズナとその細菌がコードするタンパク質セット間の類似性を検出した（図1A）。分子模倣に関与するタンパク質ドメインと比較して、これらのタンパク質は比較的研究が進んでいないため、全長タンパク質配列間の類似性に着目した。タンパク質ドメインは、病原性細菌のエフェクターとの関連で広く研究されている(33, 34)。シロイヌナズナと細菌のタンパク質の少なくとも80％において、少なくとも35％のアミノ酸配列の同一性があるBLASTPヒットのみを使用した。次に、「トリビアルヒット」と呼ばれる、細菌と植物のオルガネラ、ミトコンドリアや葉緑体に共通するタンパク質配列で、それ自体は細菌に由来し（35）、そのプロテオームは元の細菌のプロテオームと高い類似性を維持している可能性があるものを除外した。この解析の結果、60,850個の細菌タンパク質にマップされ、同様の機能を持つと思われるシロイヌナズナタンパク質が767個リストアップされた（Supplementary Table 2）。タンパク質配列の類似性に基づく検索では、シロイヌナズナや細菌のDNAが、それぞれ誤って細菌ゲノムやシロイヌナズナゲノムに組みこまれて検出されることが懸念されている。しかし、76%以上のアミノ酸同一性を持つ細菌-シロイヌナズナ相同タンパク質ペアは同定されず、高度に類似したタンパク質配列につながる仮想的なDNA汚染の可能性は否定された。

図1.
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図1.
植物とバクテリアの間のクロスキングダムHGTイベントを検出するために使用される解析。
A. 植物とその微生物群との間の分子模倣イベントとクロスキングダムHGTイベントを検出するために行ったバイオインフォマティクス解析の概要。B. 分子模倣事象の進化経路に基づくクラス分け。PA - 植物関連、NPA - 非植物関連。

180の遺伝子が、植物から微生物へ、あるいはその逆へと、領域を越えて水平移動していることが明らかになった。
植物と微生物相の間で高い配列類似性を示すと同定されたタンパク質は、様々な進化シナリオの結果である可能性がある。例えば、真核生物と原核生物の間で保存されている古い遺伝子である可能性もある。私たちは、植物とその微生物相の間で直接遺伝子が受け継がれていることを支持する系統学的証拠を特に探した。この目的のために、我々は1051のゲノムを含むデータセットを作成した（補足表1）。その中には、放線菌、タンパク質、堅果類、細菌目のバクテリア1023個、単子葉および双子葉植物10種、真菌8種、古細菌2種、さらに動物、パラサイト、カビの真核生物8種が含まれていた。重要なことは、我々が以前に手作業でキュレーションしたオリジナルの分離部位に基づいて、細菌を植物関連（「PA」、n=582、ほとんどがシロイヌナズナから分離）と非植物関連（「NPA」、n=441、他の場所から分離）に分類したことである(2)。植物とPA菌の間の遺伝子転移事象は、転移事象が発生した生息地を特定し、転移した遺伝子に植物環境における適応的役割の可能性を付与することを可能にする。

予測された分子模倣に関わる767のシロイヌナズナ遺伝子それぞれについて、ゲノムデータセット内の全ヒットの多重配列アライメントに基づいて遺伝子木を構築した（Supplementary Dataset 1）。植物から微生物へ、あるいは植物から微生物へと、領域を越えて遺伝子が水平伝播した場合、ゲノムツリーと遺伝子ツリーの間に矛盾が生じ、両グループの生物のサブセットが遺伝子ツリーで同じ枝を共有したとき、このイベントを定義した（図1B）。具体的には、植物とPA菌の相同遺伝子で構成される枝に、動物やNPA菌の相同遺伝子が含まれていないことを確認した。植物とその微生物相にのみ共有される遺伝子があることで、その遺伝子が植物環境での機能により長い系統的距離にもかかわらず直接移転し、受容体ゲノムに維持されている可能性が高まると推測されます。しかし、植物以外の環境で遺伝子が大量に失われるシナリオの可能性も否定できない。

そこで、植物とPAバクテリアを含む枝のうち、最も近い姉妹クレードにある生物をもとにドナードーマン（バクテリアなど）を定義した。その結果、植物からその細菌に転移したと思われる遺伝子を84個、PA菌から植物宿主に転移したと思われる遺伝子を96個同定した（補足表3、補足図1〜6）。さらに、PA菌と真核生物領域の間で水平移動した161遺伝子を同定した。これらの場合、植物とPA菌の間で移動したのか、別の真核生物グループとPA菌の間で移動したのか判断できない（補足表3、補足図7-9）。最後に、さらに2つのグループに分類した。第1グループは、継承のパターンが不明瞭で、複数の解釈が可能な65個の遺伝子、第2グループは、HGTパターンが観察されなかった361個の遺伝子である（補表3、補図10-15）。

植物からバクテリアへ、バクテリアから植物へ転移した遺伝子は、それぞれ糖質代謝機能、酸化還元恒常性機能に濃縮されている
水平転送された遺伝子の機能濃縮解析を行った（Materials and Methods）。植物からPA菌に移行した遺伝子は、Gene Onthology (GO) 項目が「シグナル」、「分泌」、「細胞外領域」であるタンパク質を含む分泌タンパク質をコードする遺伝子に富んでいる（図2A）。また、これらの遺伝子はペクチンエステラーゼやグリコシダーゼ活性を持つ糖質異化を行う酵素に富んでおり、植物細胞壁を標的とするか、根からの滲出液から糖質を搾取していると思われる(36)。これらの遺伝子には、例えば、キチナーゼ（CHI、AT2G43570）、エンドβマンナナーゼ（XCD1、AT3G10890）などのグリコシルヒドロラーゼ、ペクチンリアーゼ（PME5、AT5G47500）などをコードする遺伝子がある。また、キチナーゼ（CHI）遺伝子は、全身性獲得抵抗性（37, 38）の際に植物に誘導される防御遺伝子として機能しており、細菌への導入により、植物の防御反応を操作したり、植物環境中の菌類を直接攻撃することができる可能性がある。一方、PA菌から植物に転移した遺伝子は、解析したすべての双子葉植物と単子葉植物にほとんど存在し（69/96遺伝子、72%）、これらは古代のHGT事象であることが示唆された。しかし、PA菌に由来するシロイヌナズナ遺伝子のうち10個は、我々の解析の結果、双子葉植物でのみ見つかっている（補足表3）。これらの遺伝子には、例えば、AAA型ATPaseファミリータンパク質をコードするAT1G24290が含まれている。また、これまでの研究から、陸上植物の祖先はバクテリアから遺伝子を受け継いだことが示唆されている(27, 29)。我々は、このリストの中に、植物と微生物との相互作用の結果として、バクテリアから獲得されたと以前に示唆されたオーキシン生合成YUCCA遺伝子（YUC1、YUC3、YUC5、YUC6、YUC7、YUC8、YUC9、YUC11）の多くを検出した（27, 39）。植物から細菌に転移した遺伝子とは対照的に、反対方向に転移した遺伝子は、細胞質タンパク質をコードする遺伝子に富むことが確認された（図2B）。植物に転移した遺伝子は、オーキシン生合成関連機能に加えて、ウリジン-リボヒドラーゼ1（AT2G36310）などのヌクレオシド代謝過程にも濃縮されていることがわかった。PA菌から転移したシロイヌナズナ遺伝子は、平均的な植物遺伝子よりもイントロンが少ないだろうと仮定して、見つかったイントロンの数を解析した。しかし、水平転送された遺伝子とそれ以外のシロイヌナズナ遺伝子のイントロン数には統計的な差がないことがわかった（補足図16）。この結果は、植物への遺伝子導入が十分に古く、これらの遺伝子が他の植物遺伝子と類似しているという仮説をさらに支持するものである。

図2:
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図2:
HGTのサインを持つ異なるグループのジーンオントロジー（GO）濃縮解析。
DAVIDを用いたGOエンリッチメント解析。最も有意に（P<0.05、偽発見率補正後）濃縮された25のGOターム。A. 植物からPAバクテリアへのHGTパターンを持つシロイヌナズナ遺伝子（n=84）のGO機能解析。B. PA菌から植物へのHGTパターンを持つシロイヌナズナ遺伝子(n=96)のGO機能解析。C. PA菌と真核生物領域の間のHGTパターンを持つシロイヌナズナ遺伝子(n=161)のGOファンクション解析。

第3の遺伝子群には、植物や他の真核生物からPA菌への、より複雑なHGTシナリオが含まれている。このグループは、細胞質タンパク質やグリコシドヒドロラーゼまたはβ-グルコシダーゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子に濃縮されている（図2C）。

分子模倣現象の分類学的パターン
次に、特定の微生物が遺伝子受容体あるいは遺伝子供与体になる傾向があるかどうかを尋ねた。我々は、全細菌ゲノムセットをコントロールとして、HGTを行った細菌の分類学を考慮したエンリッチメント解析を行った（Materials and Methods）。まず、植物からPA菌へのHGT事象を門レベルで解析した（図3A）。アクチノバクテリアとプロテオバクテリアは遺伝子アクセプターとして枯渇していたのに対し、バクテロイデスは遺伝子アクセプターとして濃縮されていた。興味深いことに、植物から遺伝子を受け取った枝には、複数のグループの微生物が存在するため、ほとんどの場合、濃縮された分類群は「未知」であった。現在の分類学的情報では、このHGTパターンが、ある微生物門への遺伝子移転の後に別の微生物門へさらに移転した結果なのか、あるいは複数の門への独立した遺伝子移転イベントなのかを判断することはできない。分類学的解像度を上げ、分類学的順位を見ると、未知の遺伝子アクセプターのパターンが濃縮されていることがわかる（図3A）。例えば、S-アデノシル-L-メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼスーパーファミリーをコードする遺伝子AT1G54310.2（図3B）はその一例である。この遺伝子は単子葉植物、双子葉植物、コケ類に保存されており、コケ類（Physcomitrium patens）からBacteroidetes（Pedobacter）とProteobacteria（Rhodanobacter）の限られたグループに水平移動したと思われる。3つの目については、配列決定されたゲノムの数から予想されるように、HGT事象が著しく少ないことが確認された。また、根粒菌とヒポミクロバクテリア（プロテオバクテリア）、ミクロコッカス（アクチノバクテリア）の3つの目では、ゲノム配列の数から予想されるように、HGT事象が有意に少ないことが確認された。次に、PA菌から植物へのHGT事象における細菌分類の偏りを解析した。その結果、寄贈者が分類学的に未知である（すなわち、複数の系統が寄贈者となりうる）事象が濃縮され、遺伝子寄贈者となるプロテオバクテリアとアクチノバクテリアが枯渇していることが検出された。これらの偏りは、PAバクテリアが遺伝子アクセプターとして機能するシナリオと非常によく似ていた。PAバクテリアから植物への移行は比較的古かったため、門以下の分類レベルではこの解析を行うことができなかった。この解析をまとめると、ほとんどの場合、ドナーあるいはアクセプターとなる細菌の分類は不明であり、放線菌やプロテオバクテリアが植物から遺伝子を提供したり受け入れたりすることは比較的まれであることが判明した。この傾向には、一般的なエンドファイトとして機能する根粒菌目のメンバーも含まれるが、他のグループと比較して、根粒菌は植物から多くの遺伝子を受け入れていないことがわかった。

図3.
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図3.
A. フィッシャー正確検定を用いて、遺伝子を受容／供与する傾向のある細菌分類群を調べた。オッズ比は濃縮または枯渇の大きさを表し、オレンジ色/赤色は濃縮を、青色は枯渇を表す。灰色から赤色で示されるq値の負のlog10は多重仮説検定で補正されたもので、灰色は有意でない値を表す。B. 植物から2つの系統のPA細菌に転移した植物遺伝子（AT1G54310）の例（「Unknown acceptor」）。

細菌ゲノムへの最近の遺伝子水平伝播の兆候を検出することができる。
植物から植物性細菌への遺伝子水平移動は、比較的最近起こったと思われるケースがいくつか確認された。これらの事象は、単一の植物関連細菌属に挿入されることで特徴づけられた。また、獲得した遺伝子のゲノム近傍を観察したところ、その遺伝子は同属間でパッチ状に存在／不在のパターンがあり、その近傍領域と比較して比較的変動しやすいゲノム領域に位置していることが確認された。一例として、植物特異的なCHI遺伝子（AT2G43570）の細菌ホモログがあり、推定上の塩基性キチナーゼをコードしていることがわかった。CHI遺伝子は、チョウの産卵に反応して植物で強く発現が上昇する防御遺伝子である(40)。CHI遺伝子はPA Streptomycesの7つのゲノムに存在するが、他のPA Streptomycesには存在しないことから、最近の遺伝子獲得／喪失イベントが示唆される（図4A）。植物と細菌のCHIホモログの予測されるタンパク質構造を比較したところ、RMSD=0.791と非常によく似ていることがわかった（図4C）。N末端は2つの構造の間で最も大きな違いを示した。

図4.
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図4.
植物または他の真核生物からPA菌への最近のHGTと思われる例。
A. PA菌ゲノムにおけるCHIホモログ遺伝子（赤丸）の有無のパターン。B. 主に植物に存在し、PA Streptomycesの小さなグループにも見出されるCHIタンパク質を提示した系統樹。植物とその細菌が共有するクレードのブートストラップ値は0.939である（矢印で示す）。C. CHI植物タンパク質（緑）と細菌タンパク質（青）の構造比較、Root-Mean-Square Deviation= 0.791。上部がN末端を表す。D. LeifsoniaゲノムにおけるDET2ホモログ遺伝子（赤丸印）の有無のパターン。E. 主に真核生物のドメインとLeifsoniaバクテリアの小さなグループに見出されたDET2タンパク質を提示する系統樹。植物とその細菌、および他の真核生物が共有するクレードのブートストラップ値は0.978である（矢印で示す）。F. DET2植物タンパク質（緑）と細菌タンパク質（青）の構造比較、二乗平均平方根偏差 = 0.727.

もう一つの興味深い例は、ステロイド-5α-還元酵素であるDET2の細菌ホモログで、これはブラシノステロイド生合成経路の重要な遺伝子の一つである(41)。細菌のDET2は、植物に共生する放線菌門のLeifsonia属にほぼ特異的であり（図4E）、我々が細菌から検出した唯一のブラシノステロイド生合成経路の遺伝子であった。Leifsonia DET2分岐は植物から分岐し、植物以外の真核生物の分岐に隣接している（図4E）。したがって、この遺伝子が植物から直接獲得されたのか、他の真核生物から獲得されたのかを判断することは困難である。この遺伝子はtRNA遺伝子の下流にある可変ゲノム領域にあり（図4D）、外来DNAの遺伝子座への組み込みを媒介する可能性がある(42)。植物と細菌のDET2ホモログは50%以下の配列同一性しかないが、予測される構造はRMSD=0.727と驚くほど似ており、同様の生化学的機能を持つことが示唆された（図4F)。

水平転送された細菌遺伝子は、相同な植物遺伝子と機能的に置き換わることができる
植物から水平感染した細菌遺伝子が、その相同植物遺伝子を置き換えることができるかどうかを検証した。概念実証として、私たちはDET2を選びました（図4D-F）。シロイヌナズナのDET2タンパク質は、LeifsoniaのDET2ホモログと46%同一であることがわかった。興味深いことに、このレベルの配列類似性は、シロイヌナズナのDET2とイネおよびオオムギからのそのホモログとの間で共有されている。重要なことは、PhytophthoraやPythiumなどの他の真核植物病原体のタンパク質は、Leifsonia-Arabidopsis DET2の類似性よりも弱い同一性（最大41％）をシロイヌナズナのタンパク質と共有していることである。det2変異体は、BR欠損変異体に典型的な、細胞壁の配向が変化した広い根の分裂組織を含む重度の矮性表現型を持つ（図5A-C）（43, 44）。我々はこの変異体を、35SあるいはシロイヌナズナDET2プロモーターで駆動する蛍光タンパク質を融合したLeifsonia Det2（lfDET2）（lfDET2-NG）で形質転換し、これらのBR表現型の欠損を救済することを観察した（図5A-C）。根の長さは野生型より短いままであり、シロイヌナズナDET2 (atDET2) を用いた同等の形質転換と同様であった (45)。また、lfDET2はatDET2と同様に小胞体に局在していた(図5D-F)。結論として、lfDET2はシロイヌナズナのホモログを機能的に置き換えていることがわかった。

図5.
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図5.
det2細菌ホモログによるシロイヌナズナdet2の相補性から、細菌とシロイヌナズナのホモログ遺伝子間の機能的な類似性が明らかになった。
野生型（WT）、det2、およびpDET2:lfDET2-NGとp35S:lfDET2-NGを保有するトランスジェニックdet2系統（2つのプロモーターからdet2を発現）を比較したもの。A. Det2、WT、p35S:lfDET2-NGの成体発生段階。救出されたdet2のWT様表現型に注目。B. WT, det2, pDET2:lfDET2-NG, p35S:lfDET2-NGの7日目の実生。C. Aと同様の系統の根の分裂組織。det2の分裂組織の広く異常な形態とlfDETによるその救済に注目。mNeonGreen（NG）を緑、細胞境界を示すプロピジウムヨダイド（PI）をマゼンタで表示した。D-F. 表皮根細胞におけるatDET2およびlfDET2の細胞内局在。小胞体での局在が似ていることに注目。スケールバー = 20 um。

考察
本研究では、シロイヌナズナとそのマイクロビオームサンプリングに焦点を当て、植物の進化に及ぼすHGTの影響について詳しく調べた。植物の進化におけるHGTの影響については、近年、いくつかの著作で述べられている。コケのPhyscomitrella patensの解析では、核内遺伝子の44ファミリーがバクテリアから獲得されたのに対し、真菌から獲得された遺伝子ファミリーはわずか10ファミリー、古細菌からは1ファミリーのみ、ウイルスからは1ファミリー獲得されたことが確認された(27)。これらの知見には、オーキシンの生合成に関わる2つの遺伝子ファミリーが含まれている。緑色植物は、生合成や代謝経路、適応、脱適応、ストレス応答などに関連する遺伝子をバクテリアから獲得した(46)。例えば、キシランの分解、植物の血管系の発達、寒冷やカドミウムに対するストレス応答などに関わる遺伝子などである。また、陸上植物の生物的・生物的ストレスに対する耐性、特にアブシジン酸（ABA）による乾燥への耐性を高める遺伝子ファミリーは、土壌細菌からのHGTによって獲得されたと、Zygnematophyceae藻類のゲノム解析は結論付けている(47)。最近の研究では、代表的な12種の植物におけるHGTのパターンが解析された(48)。著者らは、植物の進化における2つの主要なHGTエピソードを同定し、それぞれが100以上の遺伝子ファミリーに寄与していることを明らかにした。一つは連鎖植物の進化の初期に起こったもので、もう一つは陸上植物の起源に起こったものである。貢献した生物の多くはバクテリアであったが、菌類からも若干の貢献があった。これらの結果は、シロイヌナズナへのほぼ全ての移入は古く、単子葉植物と双子葉植物に共通しているという我々の現在の結果も裏付けている。アブラナ科に直接移入し、他の双子葉植物には存在しない細菌遺伝子を検出することはできなかった。

これまでの研究では、どの微生物が（分類学的に低いランクの）遺伝子供与体または受容体であるかを具体的に特定することができなかった。そこで、植物のマイクロバイオームこそが、HGTの自然な相手であると考えた。真菌や古細菌ではなく、細菌に着目したのは、シロイヌナズナ関連細菌の配列が多く、植物への遺伝子供与が最も多いことがこれまでの研究で明らかにされていたからです。また、分離部位によって、植物関連菌（PA）と非植物関連菌（NPA）に分け、後者をコントロールとしたことも、我々のアプローチに加えた点です。この区別により、植物マイクロバイオームを経由して起こるHGTの経路を示唆することができました。さらに、植物性細菌への遺伝子導入の場合、植物環境における細菌の適応度を高めるために、遺伝子導入後も遺伝子が維持されたことを示唆することができた。特にペクチンやキシロースなどの植物性糖質の糖鎖異化に関連した遺伝子がPA細菌に濃縮導入されていることは、新しい細菌遺伝子が適応的役割を担っているという仮説を支持するものであった。ペクチン酸リアーゼ、グリコシルヒドラーゼ、糖イソメラーゼ、アラビナナーゼなどの遺伝子は、植物依存的に細菌の増殖を促進し、植物細胞壁を分解して植物組織にコロニー形成する能力を持つと思われる。ペクチン酸リアーゼ酵素は、真菌によるシロイヌナズナの根の内生化に重要であることも示され、植物のパフォーマンスを低下させた(49)。

興味深いことに、我々は以前の研究で、PA菌のゲノムは同じ分類群のNPA菌のゲノムよりも糖質代謝遺伝子の数が多いことを示した(2)。この傾向は、4つの異なる系統の細菌群を調べた際にも再現された。本研究では、これらの遺伝子の一部は、実は植物から直接マイクロバイオームに伝達されたというモデルを提唱している。例えば、Cluster of Orthologous Genes (COG) 4677は、細胞壁の完全性を変えるペクチンメチルエステラーゼと関連するアシル-CoAチオエステラーゼ遺伝子の大きなグループを表している。我々は、COG4677がBacteroidetes門、Burkholderiales目、Bacillales目、Xanthomonadaceae科のPA菌にNPA菌より多く存在することを明らかにした(2)。今回の研究では、これらの遺伝子が植物からPA菌に移行したことを確認し、その中には、配列同一性が35%〜40%の相同な細菌タンパク質を持つペクチンエステラーゼPME5, PME31, PME44, QRT1等が含まれていた。

いくつかの植物ホルモン経路は、植物と関連する微生物との間で伝達されることが以前から報告されている。アグロバクテリウムは、そのオーキシンの生合成遺伝子を宿主植物に自然に転移させる(50)。オーキシンの生合成に関わるYUC遺伝子は、バクテリアから陸上植物の最も新しい共通祖先に移されたことが示唆されている(27)。また、アグロバクテリウムはサイトカイニンの生産に必要な遺伝子をコード化し、植物に導入している（51）。一方、根粒菌は植物との相互作用の一環として、ジベレリン生産のための独立した経路を進化させた(52)。本研究では、ブラシノステロイド生合成経路のDET2が植物関連細菌、主にLeifsonia属に移行した可能性を示した。この遺伝子は、植物ホモログに代わってブラシノステロイドを生産できることを示したが、バクテリアにおけるこの遺伝子の役割はまだ不明である。我々は、det2が天然に陽性または陰性であるLeifsonia株を用いてシロイヌナズナの根のコロニー形成実験を行ったが、遺伝子の存在と相関する表現型の効果は検出できなかった。したがって、このHGTの意義は依然として不明である。本研究の結果は、植物と微生物相のゲノムがHGTによって形成され、特定の遺伝子機能が細菌によって獲得されたことを示唆しており、植物が光合成と根からの土壌への滲出によって作り出す炭水化物に富んだユニークな環境を利用した可能性が高い。

材料と方法
データソースとゲノムのスクリーニング
シロイヌナズナの全ゲノム配列はTAIRウェブサイト(https://www.arabidopsis.org/)からダウンロードした。さらに、582 個の微生物相のコレクションを準備した。これらの細菌は、シロイヌナズナの根および芽から、異なるグループによって広範囲に単離され、そのゲノムは以前に配列決定されていた。BLASTP (53) version 2.8.1+ (standard settings) を用いて、582の細菌とシロイヌナズナのタンパク質を比較した。植物と細菌のタンパク質長の80%以上にわたって、少なくとも35%のアミノ酸配列の同一性があるものをヒットとしてフィルタリングした。バクテリアと植物オルガネラに共通するタンパク質配列で、それ自体がバクテリアに由来するものはフィルターで除外された。植物オルガネラ由来の情報は、TAIRサイトのATH_GO_GOSLIM.txtファイル（https://www.arabidopsis.org/download/GO and PO Annotations/Gene Ontology Annotations /ATH_GO_GOSLIM.txt.gz ）から取得した。この解析の結果、60,850個の細菌タンパク質にマッピングされた767個のシロイヌナズナタンパク質を同定した（Supplementary Table 2）。

HGTを発見するための系統的比較手法
完全に配列が決定された多様な生物を含むデータセットを作成した。このデータセットには、1023のバクテリア（582のPAバクテリア、441のNPAバクテリア）、10の単子葉植物と双子葉植物、8の真菌、2の古細菌、および8の追加の真核生物（補足表1）を含む1051ゲノムが含まれていました。自動的な多重配列アライメントはClustal Omega (54) version 1.2.4 を用いて標準設定で行い、767本の系統樹はFastTree (55) version 2.1.11 SSE3 を用いて標準設定で構築した（Supplementary Dataset 1）。系統樹の表示、アノテーション、管理はInteractive Tree Of Life (56) (ITOL version 6.5)を用いて行った。系統樹の表示・アノテーション・管理は、Interactive Tree Of Life (56) (ITOL version 6.5) を用い、系統樹を手作業で検討し、系統樹で観察される継承パターンに応じて、すべての系統樹を次の5つのカテゴリーに分類した：(1) PA菌から植物へのHGT (2) 植物からPA菌へのHGT (3) 真核生物とPA菌間のHGT (4) 不明な系統パターン (5) HGT検出不可 (Supplement Table 3)。

ジーンオントロジー・エンリッチメント解析
遺伝子に関する機能情報は、PA菌から植物へのHGT、植物からPA菌へのHGT、真核生物とPA菌の間のHGTの3つのグループに分け、シロイヌナズナ遺伝子に対してDAVID（57）バージョン6.8を用いた機能アノテーションテスト（GO分析）を行った。

エンリッチメント解析
どの細菌が遺伝子を受け入れるか、またはドナーになる傾向があるかを調べるために、各系統樹を手作業で調べ、植物と共有する枝のPA菌分類群を探しました。すべての分類群を調べ、同じ植物枝のすべてのPAバクテリアに共通する最も低い分類群を探した。異なる2つのPhylaが同じ枝にある場合、アクセプターまたはドナーは「不明」と判定した。フィッシャー正確検定は、pythonパッケージscipy.statsを使用し、FDR補正を行ってq値を算出した。

ゲノム近傍、構造予測、構造比較
IMGウェブサイト（58）を用いて、"Show neighborhood regions with the same top COG hit (via top homolog)" というオプションで、遺伝子の存在／不在のパターンを作成した。シロイヌナズナ蛋白質の構造予測はUniProtサイト（https://www.uniprot.org/）からダウンロードし、バクテリア蛋白質の予測構造はAlphaFold2（59、60）を用いて作成した。構造比較はPyMOL（52）バージョン2.4.1を用いて作成した。

グラフと図
グラフの作成には、ggplot2、reshape2、dplyr、tidyverse、RColorBrewerといった様々なRパッケージが使用されています。

図 1、3、4 の作成には BioRender（https://biorender.com/）を使用した。

増殖条件、分子クローニング、形質転換
lfDET2の過剰発現のため、細菌遺伝子配列はArabidopsis thaliana用にコドン最適化が行われた。コンストラクトはGolden Gate MoClo Plant Tool Kit (61)を用いて作製した。DET2プロモーター（pDET2）には、最初のDET2 ATGから上流の550bp断片を用いた。pDET2とレベル0（pICH41295中）のp35Sを、追加のレベル0部分：lfDET2（pAGM1287中）、mNeonGreen（NG、pAGM1301中）およびRBCS末端（pICH41276中）とともにレベル1（pICH47742）へサブクローニングした。シロイヌナズナDET2（atDET2）の過剰発現のために、DET2ターミネーターを使用した以外は、同様のクローニング手順を使用した。構築したレベル1を、レベル1カナマイシン耐性遺伝子（pICH47732）と共に、レベル2構築物（pAGM4723）にサブクローニングした。野生型 Col-0 および det2 バックグラウンドへの植物形質転換は、Agrobacterium tumefaciens (GV3101) を媒介とするフローラルディップ形質転換法を用いて行われた。トランスジェニック系統は、50 mg/l カナマイシン (Duchefa Biochemie) を供給した選択的な 0.5 MS プレート上でスクリーニングされた。選択マーカーのメンデル分離に従って、ホモ接合体系統を選択した。使用した各コンストラクトについて、2-3個の独立したトランスジェニック系統を作製した。ここに提示するのは、ライン6（det2；pDET2：lfDET2）、ライン3（det2；p35S：lfDET2）およびライン4（pDET2：atDET2）である。植物成長条件は、Fridmanら(62)の記載に従った。簡単に言えば、種子を表面殺菌し、0.8%の植物寒天、0.46 g/l MES pH 5.8, 0.2% (w/v) ショ糖で補充した1/2強のMurashige and Skoog (MS)培地に発芽させた。滅菌した種子を植えたプレートは、4℃、暗所で2日間成熟させた後、22℃、16時間明/8時間暗サイクルのグロースチャンバーに移した。照射条件は∼70μmol m-2 s-1。

共焦点顕微鏡観察
共焦点顕微鏡は、LD LCI Plan-Apochromat 25×水浸対物レンズ (NA-0.8) を用いた Zeiss LSM 510 (Zeiss, Jena, Germany) 共焦点レーザースキャン顕微鏡、または Plan-Apochromat 20×対物レンズ (NA-0.8) を用いた LSM 710 (Zeiss, Jena, Germany) で実施された。根は水中、またはヨウ化プロピジウム（PI、10 μg/mL）を添加した水中で撮影した。緑色蛍光タンパク質NeonGreen（NG）とPIは、それぞれアルゴンレーザー（488 nm）とDPSSレーザー（561 nm）で励起された。LSM 710でのPI検出には、固体レーザー（543 nm）を使用した。LSM 510では，NGとPIの蛍光発光信号は，それぞれバンドパスフィルタ（500-530 nm）とロングパスフィルタ（575 nm）を備えたPMT検出器で収集された．LSM 710では、NGの蛍光発光信号はBIG検出器（GaAsP）、バンドパスフィルタ（500-550 nm）、バンドパスフィルタ（570-620 nm）によりそれぞれ収集された。

コドン最適化後のlfDET2配列
Atgcccgacggtccatcgctggttcgtatgccgagatcgccctcgcggtgg

tcaccttcgtcgctgtgcttcggtagcgccgtacggcacggccgctc

CGATGGGCCGACCTGCCGCGCGGGTGCTCGTGATGAGTC

CAGCATCCATCGTCTCCTGCTGTTACCTGCTCGGACCATGTTCGAGCTG

TGCCTGCTGTTCGCGCTGGCAGCCACTACGTGCAGCGTGCCTTCG

TCTACCCGTTCCTGATGCGCCACGTCCAGATGCCGTGTCCGTGGAT

GGCGATCCTGTTCAACCTGCTCAACGCGTGTGAATGCGGTGATCTCGCAG

TACGCCAGTACCGAACAGCTGCTCGCCGACCGTTCTGATCGGCGTG

tcgtgttcatcgccgggttcgctcaacctcggttccgaccgcatcctgcgcag

ACTGCGGTGCGATCCGCGGGTACAGCGCGCGGGTGGGATACG

ctgggtccagccgaactacctgggcgatggtggtggggaccggggc

GATCGCGACCTGTCGCTCGCCGCTGCGTTCGCGCTGACGATCGCGAA

CCTCGCCGCGGATGCGAACCGCTGTACGAGACGTTCGACGA

ctatccgccggagcgaaaagcgatcatcccctatctgctga

補足情報
補足図1.
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補足図1.
植物からPA菌へのHGTの例。
SLP3（AT2G19170）遺伝子のホモログを提示した系統樹。植物とその細菌が共有するクレードのブートストラップ値は1である（矢印で示す）。

補足図2.
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補足図2.
植物からPA菌へのHGTの例。
CKX1遺伝子（AT2G41510）のホモログを提示した系統樹。植物とその細菌が共有するクレードのブートストラップ値は0.797である（矢印で示した部分）。

補足図3.
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補足図3.
植物からPA菌へのHGTの例。
AXS2（AT1G08200）遺伝子のホモログを提示した系統樹。植物とその細菌が共有するクレードのブートストラップ値は0.935である（矢印で示した部分）。

補足図4.
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補足図4.
PA菌から植物へのHGTの例。
AT5G04520遺伝子のホモログを提示した系統樹。植物とその細菌が共有するクレードのブートストラップ値は0.894（矢印で示した）。

補足図5.
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補足図5.
PA菌から植物へのHGTの例。
AT3G52905遺伝子のホモログを提示した系統樹。植物とその細菌が共有するクレードのブートストラップ値は1である（矢印で示す）。

補足図6.
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補足図6.
PA菌から植物へのHGTの例。
YUC8 (AT4G28720) 遺伝子のホモログを提示した系統樹。植物とその細菌が共有するクレードのブートストラップ値は0.997である（矢印で示した部分）。

補足図7.
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補足図7.
真核生物とPA菌の間のHGTの例。
TGG4（AT1G47600）遺伝子のホモログを提示した系統樹。植物とその細菌、および他の真核生物が共有するクレードのブートストラップ値は0.702である（矢印で示した部分）。

補足図8.
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補足図8.
真核生物とPA菌の間のHGTの例。
AT4G13720遺伝子のホモログを提示した系統樹。植物とその細菌、および他の真核生物が共有するクレードのブートストラップ値は0.998（矢印で示す）。

補足図9.
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補足図9.
真核生物とPA菌の間のHGTの例。
AT5G23600遺伝子のホモログを提示した系統樹。植物とその細菌、および他の真核生物が共有するクレードのブートストラップ値は0.943（矢印で示す）。

補足図10.
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補足図10.
不明瞭な系統樹の例。
AT1G48430遺伝子のホモログを提示した系統樹。

補足図11.
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補足図11.
系統樹のパターンが不明瞭な例。
HDA9（AT3G44680）遺伝子のホモログを提示した系統樹

補足図12.
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補足図12.
不明瞭な系統樹の例。
ATKRS-1（AT5G08170）遺伝子のホモログを提示した系統樹。

補足図13.
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補足図13.
HGTが検出されない例。
THA2（AT3G04520）遺伝子のホモログを提示した系統樹。

補足図14.
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補足図14.
HGTが検出されない例。
IBI1 (AT4G31180) 遺伝子のホモログを提示した系統樹。

補足図15.
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補足図15.
HGTが検出されない例。
RCI2A（AT3G05880）遺伝子のホモログを提示した系統樹。

補足図16.
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補足図16.
A. PA菌から植物へのHGT」グループに属する遺伝子のイントロンの数。B. シロイヌナズナ全体のイントロンの数。

補足図17.
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補足図17.
det2バックグラウンドでlfDET2-NGを発現させた根（左）とWTバックグラウンドでatDET2-NGを発現させた根（右）の共焦点画像。NGは緑、細胞境界を示すヨウ化プロピジウム（PI）はマゼンタで示す。

謝辞
本研究は、イスラエル農務省からALとS.S.-Gに支給された助成金番号12-12-0002およびイスラエル科学財団（番号1725/18）からS.S.-Gに資金提供されたものである。SHはエルサレム・ヘブライ大学農業・食品・環境学部からの優秀な奨学金によって支援されています。ALは、イスラエル高等教育評議会のAlon Fellowshipとイスラエル科学財団（助成金1535/20、3300/20）、ヘブライ大学-イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校の種子助成、イスラエルのICAからも支援を受けている。生命科学工学基盤センター (N. Dahan, Y. Lupu-Haber), Technion の Russell Barrie ナノテクノロジー研究所、および det2 実験の最終段階を手伝ってくれた O. Erlichman に感謝する。Omri Finkel博士、Uri Gophna教授、Itay Mayrose教授には、研究に関して有益なご指摘をいただきました。

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このような場合、「痒い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」、「痛い」。Plant Cell 16, 2117-2127 (2004).Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
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また、このような研究成果を踏まえて、「シロイヌナズナの根に生息する微生物群の構造と集合の手がかりを明らかにする。このような場合、「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」。
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41.⅛ 藤岡慎一郎、他、シロイヌナズナdeetiolated2変異体は、ブラシノステロイド生合成の初期段階でブロックされる。また、このような場合にも、「播種後1年以上経過していない」ことが重要である。
原核生物のtRNAおよびtmRNA遺伝子における遺伝的要素の統合部位：インテグラーゼ・サブファミリーのサブロケーション・プレファレンス。また、このような場合にも、「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」。
また、このような場合にも、「播種後1年以内」であれば、播種後1年以内に播種することが可能である。また、このような場合にも、「播種後1年以上経過している」ことが条件となる。
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このような場合、「逐次刊行物」に掲載されている「逐次刊行物」の内容は、「逐次刊行物」に掲載されている「逐次刊行物」に掲載されている「逐次刊行物」に掲載されている「逐次刊行物」に掲載されている「逐次刊行物」に掲載されている「逐次刊行物」の内容とは異なります。このような場合、「曖昧さ」を解消することが重要です。
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2022年8月26日に掲載されました。
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COVID-19 SARS-CoV-2のプレプリント（medRxivおよびbioRxivより
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bioRxiv の臨床研究パイロットプロジェクトが終了し、健康科学専用サーバー medRxiv（submit.medrxiv.org）が開設されたため、臨床試験と疫学分野の新規投稿は締め切られました。臨床試験の結果を報告する新規の論文は、medRxiv への投稿が必須となります。疫学分野の新規論文の多くも medRxiv に投稿されるべきですが、健康関連の情報を含まない論文であれば、著者は bioRxiv の他の科目（例：遺伝学、微生物学）に投稿することもできます。

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