多機能マイクロエレクトロニックファイバーが、腸と脳の神経回路のワイヤレス変調を可能にする

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発行：2023年6月22日
多機能マイクロエレクトロニックファイバーが、腸と脳の神経回路のワイヤレス変調を可能にする
アタルヴァ・サハスラブデ
ローラ・E・ルプレヒト
...
ポリーナ・アニキーワ
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Nature Biotechnology (2023)この記事を引用する
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指標詳細
概要
行動中の脳と末梢臓器の神経生理の両方をプローブするのに適した埋め込み型デバイスが少ないことが、脳と臓器の相互知覚シグナリングの理解の進展を妨げている。ここでは、熱延伸ポリマーをベースとしたファイバーのスケーラビリティと機械的汎用性と、脳や腸のような多様な臓器に対応するマイクロエレクトロニックチップの洗練性を組み合わせた多機能神経インターフェースについて述べる。我々のアプローチでは、光源、電極、熱センサー、マイクロ流体チャンネルを小型のフットプリントで統合できる数メートルの連続繊維を使用する。特注の制御モジュールと組み合わせることで、ファイバーはオプトジェネティクスのためにワイヤレスで光を照射し、生理学的記録のためにデータを転送する。我々は、マウスの脳における中脳辺縁系報酬経路を調節することにより、この技術を検証した。次に、解剖学的に困難な腸管内腔にファイバーを適用し、摂食行動を誘導する感覚上皮細胞のワイヤレス制御を実証した。最後に、腸管内腔からの迷走神経求心性を光遺伝学的に刺激することで、繋がれていないマウスに報酬表現型を呼び起こすのに十分であることを示す。
主な内容
脳と内臓器官を結ぶ双方向の広範なコミュニケーションラインは、生存に不可欠な内部で生じる相互知覚的手がかりの統合を促進する。腸と脳のコミュニケーションはそのような重要な経路の一例であり、腹部内臓から発生する体液性シグナルと神経シグナルが、エネルギーバランスを維持するための代謝情報を脳に伝える。よく知られた恒常性維持機能だけでなく、最近の証拠によると、意識的には感知できない腸から脳へのシグナルが、やる気、感情、学習、記憶といったより高度な認知プロセスも調節できることが示唆されている1,2,3,4,5。これらの知見は、このような脳-臓器神経回路を利用することで、治療抵抗性うつ病、肥満、糖尿病などの難治性代謝・神経疾患に対する低侵襲自律神経調節療法を開発する機会を生み出す6,7。しかし、神経認知状態に影響を及ぼす脳と内臓のコミュニケーションの根底にあるメカニズムの同定は依然として困難であり、その理由の少なくとも一部は、行動動物の解剖学的・生理学的に異なる臓器に安全かつ長期的に配置できる、移植可能な生体一体型多機能デバイスが少ないことにある。従来、生体集積デバイスの製造は、特殊なクリーンルーム環境を必要とする半導体産業から転用された、資源集約的なリソグラフィ技術の使用に依存してきた8,9,10,11,12,13,14,15。リソグラフィーの薄膜加工の性質上、デバイススタックの各モダリティを個別に作製し、その後慎重に手作業で組み立てる必要があるため、このアプローチは迅速なカスタマイズには不向きである16,17,18,19,20,21,22。その結果、バイオエレクトロニック・インターフェースの設計の柔軟性、マルチモーダリティ、機能の洗練性、長期的な生体適合性を損なわない、モノリシックでスケーラブルな製造アプローチが必要とされている。ここでは、この技術的ギャップを埋める戦略を紹介し、脳と腸の神経回路にまたがる実験でその可能性を実証する。
われわれは、熱延伸23を用いて、固体マイクロエレクトロニクス部品を埋め込んだポリマーファイバーをベースとする多機能バイオエレクトロニック・インターフェースを開発した（図1a）。私たちは、熱延伸のトップダウン的性質を利用して、（1）オプトジェネティクスのための表面局在型マイクロスケール発光ダイオード（μLED）、（2）精密温度測定のためのマイクロスケール温度センサー、（3）電気生理学のためのマイクロ電極、（4）薬物・遺伝子デリバリーのためのマイクロ流体チャンネルをホストすることができる数十メートルのマイクロスケール・ファイバー（～1,000ロッドスケールのプローブ）をワンステップで作製する（図1b）。このようなファイバーの機械的特性は、深部脳や蛇行し移動する消化管への埋め込みに適合した構造を作り出すために設計できることを実証している。さらに、マイクロエレクトロニックファイバーとのインターフェースとして、モジュール式ワイヤレス制御回路NeuroStackを開発し（図1c）24、複数の独立したチャンネルにわたるリアルタイムのプログラム可能な光照射と、無拘束の行動マウスにおける局所組織温度の記録用のワイヤレスデータ転送を可能にした。
図1：脳と腸の神経回路のワイヤレス変調を可能にするマイクロエレクトロニクス一体型多機能ファイバーの模式図。
a:熱延伸を用いた多機能ポリマーファイバーの高スループットなモノリシック製造により、調整可能なメカニクスと固体マイクロエレクトロニクスコンポーネントを備えた数十メートルの連続ファイバー（～1,000ロッドスケールのプローブ）が得られる。b:このようなファイバーは、オプトジェネティクス用の独立したアドレス指定可能な複数のµLED、細胞外電気生理学用の微小電極、遺伝子/化学物質ペイロード送達用のマイクロ流体、組織温度測定用の温度センサーを、すべて小型のフットプリントでホストできる。c, カスタム設計のモジュール式ワイヤレス制御回路NeuroStackは、リアルタイムのプログラム可能な光刺激と組織温度の記録用データ転送を可能にする。 d, NeuroStackと組み合わせた多機能マイクロエレクトロニックファイバーは、覚醒行動マウスの深部脳と小腸の神経回路をワイヤレスで変調することを可能にする。
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我々は、マイクロエレクトロニックファイバーをマウスの脳と腸に慢性的に移植できることを実証した（図1d）。脳用に設計された硬いが柔軟なファイバーは、腹側被蓋野（VTA）などの脳深部の核を正確にターゲットにすることができ、そこでチャネルロドプシン-2（ChR2）を搭載したウイルスベクターを、統合されたマイクロ流体チャンネルを通してドーパミン作動性（DA）ニューロンに送達する。同じファイバー上に電極とμLEDを共局在させることで、遺伝子導入後の自発的および光学的に誘発される神経活動を縦断的に記録することができる。一方、腸管内腔に光と栄養素を送り込むことができる柔らかく柔軟性のある腸管ファイバーは、近位および遠位小腸の上皮感覚細胞や迷走神経求心性神経を支配する腸管上部を含む消化管神経回路を直接調節することができる。さらに、マルチサイトデバイスにより、腸と脳に多機能性線維を同時に植え込むことができるため、栄養センシングの中枢神経表現を探ることができる。VTAに植え込まれた線維をNeuroStackに結合させることで、DAニューロンへの無線プログラム可能な光遺伝学的刺激が報酬行動を誘発することを示した。同様に、軟腸ファイバーは、摂食行動を調節する十二指腸と回腸にまばらに分布する腸内分泌/神経脚細胞を標的とした、ワイヤレス腸管内光遺伝学を可能にする。最後に、腸管腔からの迷走神経求心性の光遺伝学的刺激により、摂食行動するマウスの中枢神経系機能を腸から直接調節できることを明らかにした。これらの応用例は、脳-内臓間および多臓器間の神経伝達経路を研究するための、ワイヤレス多機能マイクロエレクトロニックファイバーの広範な利用を予見させるものと期待される。
研究成果
脳用多機能マイクロエレクトロニックファイバー
脳の神経回路を調べるための多機能マイクロエレクトロニック・ファイバーを作製するために、多層ポリカーボネート（PC）プリフォーム（ガラス転移温度Tg = 150 °C、ヤング率E = 1.8-3.2 GPa）を設計し（図2a）、それを熱延伸して機能性ファイバーを作製した（図2b、補足図1）。2b、補足図1a-d、補足ビデオ1）。同時に、インターコネクト（銀-銅、Ag-Cu、直径40µm）と記録電極マイクロワイヤー（タングステン、直径25µm）のスプールを供給した（補足注1）。プリフォーム（図2c）の全体的な断面形状は、ドローイング（図2d）中も維持され、370.7±2.8µm×190.4±3.4µm（平均±s.d.、n=5切片、補足図1e）の寸法を持つ機能性ファイバー（図2e）が～50m得られた。青色（ピーク発光波長λ＝470 nm）および緑色（λ＝527 nm）のµLED（InxGa1-xN、270×210×50 µm3）をファイバー表面に沿って取り付け、その後、生体流体バリアコーティングとしてパリレン-Cの薄層を蒸着することにより、ファイバーを移植可能なプローブ（補足図2a-fおよび図2f）に組み立てた。図2g-iに、最終的なファイバー・デバイスにおける独立したアドレス可能なμLEDとマイクロ流体注入の光学顕微鏡写真を示す。上記のアプローチは、ファイバー内へのマイクロエレクトロニクス・コンポーネントの集積をファイバー延伸後に示しているが、われわれは、ファイバー延伸中に多機能ファイバー内に半導体デバイスを埋め込むことも実証しており、このプラットフォームのさらなる拡張性を示している（補足注2および補足図3a-k）25。
図2：多機能脳繊維の作製と特性評価。
a,中央のPC層に相互接続チャネル、底部のPC層にマイクロ流体チャネルと記録電極の前駆体からなる多機能脳神経繊維のプリフォームレイアウトと組み立て。 b,相互接続マイクロワイヤー（40µm Ag-Cu）と記録電極（25µm タングステン）の同時供給を伴う熱延伸プロセスの概略図。c,相互接続、電極、マイクロ流体用のチャネルを強調したプリフォームの写真。d,保存された特徴を示す繊維断面の光学顕微鏡写真。f。微小電極とμLED用のI/Oピン、マイクロ流体チャンネル用のアクセスチューブ、およびアース線を備えた、完全に組み立てられた多機能ファイバーデバイス。g,h,デバイスの遠位端にある、独立してアドレス指定可能な青色（g）と緑色（h）のμLED。 j,1×PBS中のタングステン微小電極の電気化学インピーダンス・スペクトル（n = 3独立サンプル）。k,入力電力を変化させながらファイバー内に集積したμLED（λ = 470 nm）の光強度出力（青色トレース）と効率（赤色トレース）（n = 6個の独立したサンプル）。l, 32-42 °Cにおけるファイバー内温度センサーの定常状態較正曲線（n = 4つの独立したサンプル）。 m, 異なる刺激周波数（35. 2 mW mm-2、10-ms パルス）。 n, 入力注入速度を変化させたときの出力速度（赤のトレース）と戻り速度（青のトレース）を示すファイバー微小流体チャネルの特性（n = 4 独立したサンプル）。すべての斜線部とエラーバーはs.d.を表し、データは平均値±s.d.で示されている。
出典データ
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脳線維の特性評価
タングステン・マイクロワイヤーをファイバーに組み込むことで、デバイスの柔軟性を損なうことなく、電気生理学用の低インピーダンス・マイクロ電極（1 kHzで｜Z｜＝46.3±6 kΩ）を得ることができた（図2jおよび挿入図）。電極インピーダンスは、7週間にわたってリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に浸漬しても無視できるほどの増加を示し、ポリマークラッドからのリーク電流は観察されなかった（補足図4a,b）。集積された青色μLEDからの光強度は、0.6 mW mm-2～70 mW mm-2の範囲で調整可能であった（図2k）。これは、ChR2などの微生物ロドプシンを介した行動の光遺伝学的制御に十分な値である（参考文献26,27）。μLEDの強固な接合は、90°までの大きな曲げ角度でも安定した光出力によって裏付けられた。また、PBSへの長期浸漬試験では、少なくとも7週間は機能性が実証された（補足図4c,d）。有限要素モデリング（FEM）を適用して、異なる入力強度において、μLEDからの距離によって照明強度と体積がどのように変化するかを調べた（補足図5a-d）。その結果、30 mW mm-2という中程度の強度でも、ファイバー表面近傍の組織体積は～0.75 mm3であり、マウスのほとんどの脳核を光遺伝学的に調節するのに十分であることがわかった。
ダイオード（InxGa1-xN µLED、λ = 470 nm）の温度依存電流-電圧（I-V）特性を利用して、隣接するµLED28の動作中の組織内の熱放散を記録した。ダイオード電流の温度に対する線形依存性が、センサーの検量線を定義した（図2l）。熱FEM（補足図6a-d）と一致し、センサーは、40Hzで動作する同位置のμLED（λ＝470nm、～30mW mm-2）から0.085℃の無視できる温度上昇を検出した。これは、臨床の電気的深部脳刺激（図2mおよび補足図7）29中に発生する～2℃の加熱をはるかに下回る。マイクロ流体の機能性を評価するため、ファイバーを通して注入された液体の戻り率を測定したところ（図2n）、頭蓋内注入の生理学的に適切な注入速度20～100nl s-1で、80～100％の範囲にあることがわかった。神経プローブに複数の機能を実装することは、柔軟な装置力学を達成することと相反する可能性があるため、頭蓋骨への固定を模倣するために、単一カンチレバーモードでファイバーの曲げ剛性を測定しました。繊維の剛性は25～33 N m-1の範囲であり、同程度の寸法のシリカ（132 N m-1、直径0.4 mm、長さ1 cm）およびステンレス鋼（792 N m-1、直径0.4 mm、長さ1 cm）プローブの剛性よりも大幅に低かった（補足図8a）。このことは、力学的FEMによってさらに確証され、ファイバー先端と脳組織の間の相対微小運動は、同程度の寸法のシリカやスチールのインプラントよりも2～4桁低いことが推定された（図2oおよび補足図8b～f）30。
腸用マイクロ電子ファイバー
脳とは異なり、消化管はデリケートな組織に包まれ、摂取された食物や体液が通過しなければならない曲がりくねった管腔の解剖学的構造により、硬いデバイスを埋め込むことができない31。そこでわれわれは、上述の脳インターフェースよりも10～15倍もコンプライアントな多機能マイクロエレクトロニック・ファイバーを作製した。これらのファイバーは、行動マウスの腸管内腔において、光と栄養素を部位特異的に送達することを可能にした。このファイバーのクラッド（図3a）には、熱可塑性トリブロックエラストマーであるポリ（スチレン-b-エチレン-co-ブチレン-b-スチレン）（SEBS）（Tg＝140℃、E＝3～5MPa）32を利用した。エラストマークラッド内の金属相互接続を統合するために、柔軟な導電性ポリエチレン複合材が採用され、延伸条件での構造的完全性を維持するためにPCの薄層が適用された。このプリフォームを延伸して（図3b）、断面形状をほぼ維持した連続マイクロスケール・ファイバー（535×315µm2）～50mにすると同時に（図3c～e）、収束延伸によって相互接続マイクロワイヤーを組み込んだ。完全に組み立てられたガットファイバーデバイス（図3f）の長さは約8.5cmで、遠位端に6個のµLEDを備え、青色と緑色のµLED（各3個、図3f挿入図）の独立したアドレス可能な2組として操作でき、マイクロ流体出口は最初のµLED組の約0.8～1mm後方に位置していた。
図3：軟質多機能腸ファイバーの作製と特性評価。
a,多層腸ファイバー・プリフォームのレイアウト。収束用SEBS層とマイクロ流体チャンネルが逆アルミニウム型から成形され、その後プリフォームが組み立てられる。c、組み立てられたプリフォームの断面を示すデジタル画像。 d、保存された特徴を強調する腸ファイバーの断面顕微鏡写真。 e、スプーラーに巻き付けられた数メートルの引き出されたままのファイバー。挿入図は、ファイバー上の3個の緑色μLED（左）と青色μLED（中央）、およびPBSボーラスの注入と青色μLEDの動作を伴う二重光流体様式（右）。h. 曲率半径 90°（n=独立した 3 つのサンプル）および 180°（n=独立した 3 つのサンプル）の変形を受けたファイバー μLED からの光出力。 i. 400µm シリカ導波路（破線）と比較した、同一断面の SEBS クラッド（n=独立した 3 つのサンプル）および PC クラッド（n=独立した 3 つのサンプル）付きファイバーの曲げ剛性。硬質シリカファイバー（上）、硬質PCファイバー（中）、軟質SEBSファイバー（下）の応力分布プロファイルを示す機械的FEM。硬質シリカファイバーの管腔内埋め込みは腸組織の破裂を招くが（左）、軟質腸ファイバーは組織を損傷することなく管腔の湾曲を通過できる腸の埋め込みを可能にする。m、曲率半径5.6cm（上）および0.7cm（下）で曲げた腸ファイバーにおける対応する空間歪み分布。 n、直線および曲げた形状における管腔内栄養注入に関連する注入速度1～5μl s-1での腸ファイバーを通る微小流体戻り速度（n = 3独立サンプル）。すべての斜線部およびエラーバーはs.d.を表し、データは平均±s.d.で示されている。
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腸内繊維の特性評価
腸線維では、表面実装されたµLEDにより、横方向に指向性のある照明プロファイルが可能になり、管腔内から上皮細胞と迷走神経求心性神経を空間的にターゲティングすることができる。この照明プロファイルは、典型的なシリカファイバーの解剖学的に不一致な背側-腹側指向性の光円錐とは対照的である（補足図9a）。軸方向に分布した3個のμLEDからの累積光出力は、少なくとも4週間にわたってPBS中で安定したままであり（補足図9b,c）、腸壁外面の光出力は腸組織の存在によってわずかに減衰しただけであった（補足図9d）。FEMを用いると、腸壁における光透過深さは0.15～1 mmの範囲にあることがわかり、入力強度が20～100 mW mm-2の場合、照明体積は0.9～8.8 mm3と見積もられた（補足図10a～f）。これは、迷走神経支配を密に受けている粘膜の下50～100μmの上皮下粘膜層を広く照らすのに十分である33。入力光強度が20～100mW mm-2の場合、腸壁の対応する温度変化は無視できるほど小さく、µLEDの間隔（～1cm）は、熱の共働蓄積を防ぐのに十分であることがわかった（補足図11a-e）。
腸管は絶えず蠕動運動による変形を受けるため、1mmと5mmの変形で最大104サイクルの繰り返し座屈試験を行い、ファイバーの機械的完全性を評価したが、デバイスの性能に影響はなかった（図3g）。ファイバーの堅牢性は、半径2～10cmの90°および180°曲げ変形時の光出力の変化がごくわずかであったことからも裏付けられた（図3h）。われわれは、腸ファイバーの機械的コンプライアンスが、行動動物における慢性的な生体統合に重要な、腸管内腔にかかる力を最小化するという仮説を立てた。一端が腹壁に固定された外科的に移植された腸ファイバーを模倣するため、その剛性を片持ち梁曲げモードで評価した。腸ファイバーは、心拍、呼吸、運動、および蠕動の周波数範囲にわたって2～5 N m-1の剛性を示し（図3i）、これはPC（70～75 N m-1）のようなより硬いプラスチックのみで構成された同一のファイバーの剛性および同様の大きさの市販のシリカファイバー（直径400μm、132 N m-1）の剛性よりかなり低い。応力分布プロファイルのFEMも、実験的に観察されたこれらの剛性傾向を定性的に捉えています（図3j）。当然のことながら、マウスの小腸に管腔内に移植した際、硬いシリカファイバーは粘膜に穴を開けたため、生体内での使用には適さなかったが、柔らかい腸ファイバーは上皮組織を損傷することなく管腔の湾曲に容易に対応した（図3k）。外科手術では腸ファイバーを鋭角に曲げる必要があるため、ファイバー構成要素の中で最も降伏ひずみが小さい銅の相互接続部のひずみ分布をシミュレートしたところ、半径0.5cm以上ではひずみは弾性限界の0.3％以下であることが確認された（図3l,m）。最後に、腸ファイバーのマイクロ流体チャンネルを通して、腸の栄養供給に関連する注入速度（1～5 µl s-1）34で流体を注入したところ、まっすぐな状態でも曲がっている状態でも、60～90％の範囲の高い戻り率が得られた（図3n）。
マイクロエレクトロニクス繊維のワイヤレス操作
ポリマーファイバーにマイクロエレクトロニクスを組み込むことで、ワイヤレス双方向操作が可能になり、無拘束被験者での行動アッセイを容易にすることができる。これを実現するために、私たちは小型（15.5mm）、軽量（1.1g）のモジュール式プラットフォーム24、NeuroStackを設計し、2つの独立したチャンネルにわたるプログラム可能なワイヤレス光刺激と、リアルタイムの温度記録のためのデータ転送を可能にした（図4a）。この回路は、2.4GHzワイヤレスリンクを介したBluetooth Low Energy（BLE）通信プロトコルと、安定動作のためのオンボード小型充電池を備えている。これにより、ユーザーの介入を最小限に抑えて動物行動研究に簡単に導入できるだけでなく、基地局として機能するnRF52840開発キットに接続したコンピューターから、特別な機器を使用せずに、独立したチャンネルで最大4つのデバイスをリアルタイムでプログラミングすることができる。モジュラー設計の回路は、実験のカスタマイズを容易にし、小型のげっ歯類では制限される同じ面積のフットプリント内で、追加機能の統合を可能にする（図4b）。同様に、モジュールの取り外し可能な構造により、動物が位置ずれや誤作動を起こしやすい皮下電子機器を持ち運ぶ必要がなくなる（補足説明3参照）。
図4：NeuroStackは、マイクロエレクトロニックファイバー用にカスタム設計されたモジュール式ワイヤレス回路であり、プログラム可能な光照射と生理学的記録を可能にする。
a,b,一次モジュール（a）および強度モジュール（b）の重要な回路構成要素を強調した概略図（左）およびデジタル画像（右）。c-f,脳繊維内の青色（c）および緑色（d）µLED、ならびに腸繊維内の青色（e）および緑色（f）µLEDの独立したワイヤレス制御を示す画像。g: 電力管理ブロック、温度検出ブロック、および強度制御ブロックを強調した NeuroStack の回路レイアウト。 h: 10～40 Hz の光刺激周波数のリアルタイム制御。k, 2.4,2.6,2.8Vバイアスで対応する写真とともにµLEDの明るさをリアルタイムで制御できる強度モジュール。 m, マイクロエレクトロニックファイバー内の温度センサーによる温度過渡現象のワイヤレス記録と、有線モードでの市販熱電対との比較。dは直径、wは重量、CPUは中央演算処理装置、DACはデジタル・アナログ・コンバーター、GNDはグラウンド、GPIOは汎用入出力、LDOは低ドロップアウト・レギュレーター、RFは無線周波数、SPIはシリアル・ペリフェラル・インターフェース、SWCLKはシリアル・ワイヤー・クロック、SWDはシリアル・ワイヤー・デバッグ、SWDIOはシリアル・ワイヤー・デバッグ・データ入出力、VDDはドレイン間電圧、ADCはアナログ・デジタル・コンバーター。
ソース・データ
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NeuroStackの一次モジュールは、MDBT42Vワイヤレスマイクロコントローラー（Nordic nRF52832チップ搭載）と、向きに依存しない電源供給用の充電式バッテリーを搭載している（図4a、補足図12a-d、補足ビデオ2-4）。動作中、一次モジュールはマイクロコントローラーの汎用入出力（GPIO）ピンに依存してファイバーμLED（図4c-f）に電流を流し、上部のヘッダーピンは強度モジュール（図4b）の取り付けをサポートします。強度モジュールは、シリアルインターフェースからプログラムされるデジタル-アナログ変換器を通して光刺激の強度を制御することができ、光刺激パルスの過渡整形を可能にします。この機能は、光刺激中の電気生理学的記録における電磁結合アーチファクトを最小限に抑えるために重要です。温度検出回路は、ファイバー内μLEDの1つを温度センサーとして使用し、もう1つのチャンネルは2番目のμLEDを介して光刺激用に割り当てられる。電流変化を測定するために、低ドロップアウトレギュレータを使用して、ターンオン電圧以下の一定電圧がセンサーダイオードに印加される。検出された電流は、1段反転差動増幅器で増幅される。その後、マイクロコントローラーの内部アナログ・デジタル・コンバーターが増幅されたアナログ信号をデジタル化し、コンピューターにワイヤレスで送信する。温度記録のデフォルト・サンプリング・レートは200Hzに設定されており、不要時にはシステム・ソフトウェアで温度検知機能をオフにして電力を節約することもできる。主要コンポーネントに加え、モジュールには32kHzの水晶発振器と電源管理用のインダクターも搭載されている。デバイスは6ピンJリンク・インターフェースでプログラム／デバッグされ、直感的なソフトウェア・プラットフォームでリモート制御される（ソフトウェアの詳細については「方法」のセクションを参照）。NeuroStackのパワーブレークダウン（補足図12e,f）は、µLEDのデューティサイクルと、温度検知や強度制御を含むその他の機能によって変化します。図4c-fは、NeuroStackに接続された脳および腸線維内の独立したアドレス指定可能なµLEDのワイヤレス動作を示している。プライマリー・モジュールの完全な電気レイアウトは、温度感知回路と強度制御回路とともに図4gに示されている。われわれは、NeuroStackがユーザーインターフェースからリアルタイムで光刺激の周波数、デューティサイクル、パルス形状、強度を制御できることを特徴とした。刺激パルスの生成は、ソフトウェアタイマーによって制御される2つのフェーズからなる。タイマーの1つはパルス発生期間と休止期間の間の状態変化を管理し、それによって光刺激の周波数を制御し（図4h）、もう1つのタイマーはパルス発生期間中のデューティサイクルを設定する（図4i）。同じ原理が強度制御にも使われ、パルスの最大強度と立ち上がり/立ち下がり時間を設定する（図4j,k）。ワイヤレス温度記録機能は、ホットプレート上での定常測定によって評価され、測定電流の周囲温度に対する線形依存性を示した（図4l）。
中脳DAニューロンのマルチモーダルインタロゲーション
脳繊維の光学的、電気的、流体的、温度測定機能を組み合わせることで、移植後少なくとも2ヶ月間は、マウスを使った複数の実験が可能になった（図5a）。検証研究として、われわれはまず、報酬と動機づけ経路35の重要な結節点であるVTAのDAニューロンをターゲットにした。ドーパミン輸送体（DAT）プロモーター下でCre-リコンビナーゼを発現するDAT::CreトランスジェニックマウスのVTAに、ファイバーを定位的に移植した。ファイバーに内蔵されたマイクロ流体チャンネルにより、Cre依存性コンストラクト（Ef1α::DIO-ChR2-mCherry）またはコントロールコンストラクト（Ef1α::DIO-mCherry）のChR2遺伝子を持つアデノ随伴ウイルス（アデノ随伴ウイルス血清型5（AAV5））を一段階の手術でVTAに送達することができた（Fig. 5b(i-iii)）36、ChR2の強固な発現がVTA矢状断面で観察された（図5c）。ファイバーμLEDを介した光刺激に応答して、集積型微小電極を通して記録された電気生理学的電位から、DAニューロンにおけるCre依存性オプシン発現の時間経過が明らかになった（図5dおよび補足図13）。記録電極が光刺激アーチファクト（例えばベクレル効果）37を示すことが知られているため、光誘発信号の生理学的起源を確認し、過渡パルス整形によるアーチファクト軽減戦略を考案した（補足図14a-i、15a-h、補足注4）。光学的に誘発された多ユニット神経活動は、覚醒した動くマウスで少なくとも2ヶ月間、確実に記録された（補足図16a-o）。柔軟なファイバーは、脳組織との相対的な微小運動が少ないため、自発的な単一ニューロンの活動を長期間にわたって安定的に記録できるのではないかと考えた。埋め込み電極の機能的安定性を6ヶ月まで確認した後（補足図17a,b）、慢性的に埋め込んだマウスの推定VTAニューロンからの自発的単一ユニット活動を4週間記録した（図5eと補足図18）。2週目（n=3マウス）と4週目（n=3マウス）の単一ニューロンの電気生理学的変化の追加例は、それぞれ補足図19a-iと20a-iに掲載されている。
図5：行動中の脳深部神経回路とワイヤレスプログラマブルオプトジェネティクスのマルチモーダルインタロゲーション。
b, マイクロ流体チャンネルを介した遺伝子導入とファイバー移植を同じ外科手術で行う(i); ワンステップ手術の写真で、流体注入セットアップと移植されたファイバープローブを強調している(ii); 完全に回復した動物が術後1ヶ月でワイヤレスモジュールを携帯している(iii)。c,DAT::CreマウスのVTAへのマイクロ流体AAV5投与4週間後のCre依存性ChR2-mCherry構築物の発現；（上）青、DAPI；（中）赤、mCherry；（下）マージ。e,移植後4週目にVTAから記録された自発神経活動（上）；単離された2つのニューロンの対応する平均活動電位波形（下）。f,ワイヤレス光刺激（斜線領域）を同時に行いながら、オープンフィールドチャンバーを探索するマウス（n = 6）のワイヤレス頭蓋内温度記録。 g,ケタミン-キシラジン混合物を30-mg kg-1 (n = 3 mice)および60-mg kg-1 (n = 3 mice)の用量で腹腔内注射することにより誘発されたVTAの脳低体温をファイバー温度センサーで検出。i,k,m、3つの異なるワイヤレス光刺激条件（上）において、VTAにChR2-mCherryまたはmCherryを導入したマウスのベースライン時および試験日における、報酬光刺激に結合したチャンバーへの選好率。ChR2-mCherry： P = 4.16 × 10-5, t = -9.03, d.f. = 7; mCherry： p = 0.183、t = -1.50、d.f. = 6。 k, フェイシック対トニック。ChR2-mCherry： P = 2.02 × 10-4, t = -9.65, d.f. = 5; mCherry： p = 0.403, t = -0.88, d.f. = 7. m, 青色光対緑色光刺激。ChR2-mCherry： P = 3.58 × 10-5, t = -9.24, d.f. = 7; mCherry： P = 0.55; t = -0.64, d.f. = 5 (**P < 0.01; ***P < 0.001; NS, P > 0.05; 両側ペアサンプルt検定)。 j,l,n, それぞれパネルi,k,mに要約されたアッセイに対応する動物の位置をトレースした代表的なヒートマップ。Aは前方、Dは背側、NSは有意ではない、OFTはオープンフィールドテスト、Pは後方、Stim.は刺激、Vは腹側。
出典データ
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装置の安全性を確認するため、オープンフィールドチャンバー内で自由に動く動物の頭蓋内温度を埋め込み型温度センサーでワイヤレス記録したところ、ワイヤレス光刺激を同時に与えても組織温度に有意な変化は見られなかった（図5f）。グリアの瘢痕化に特徴的なマーカー（活性化マクロファージマーカーであるイオン化カルシウム結合アダプター分子1（Iba1）、アストロサイトマーカーであるグリア線維性酸性タンパク質（GFAP））の免疫組織化学分析（補足図21a-l）によって、ファイバーの長期的な生体適合性を評価した。FEMと実験的に測定された曲げ剛性の低さから予想されるように、マイクロエレクトロニックファイバーに対する免疫反応は、2週目において、両方の炎症マーカーにわたって、同程度の大きさ（300μm）のシリカファイバーよりも低かった（参考文献30）。
次に、体温調節反応を用量依存的に阻害することで低体温症を誘発することが知られている麻酔薬混合物（ケタミン・キシラジン）によって誘発される頭蓋内温度の生理学的に誘発される変化を検出する熱センサーの能力を評価した38。ケタミン-キシラジン（9:1比）を2つの濃度（ケタミン30mg kg-1と60mg kg-1）で腹腔内注射したマウスでは、線維は頭蓋内温度の低下を確実に記録した（図5gおよび補足図22a,b）。麻酔前のレベルまで体温が回復するのは、動物が意識を取り戻し、ホームケージ内を歩行するのと一致した。同じファイバー内に温度センサーと記録電極を併設することで、脳温の変化が麻酔下の神経ダイナミクスをどのように変化させるかの理解が容易になる可能性がある39。
行動研究において、ワイヤレスでプログラム可能な光刺激機能を説明するために、VTAのDAニューロンでChR2を発現させたマウスを、リアルタイム場所選好（RTPP）課題に供した（図5h）35。BLE通信プロトコルを使用することで、視線や角度のハンディキャップなしに光学パラメーターをプログラミングすることができた。これを説明するために、リアルタイムで更新される3つの異なる刺激条件でRTPP課題を行った：(1)刺激ON（λ＝470nm、25Hz、10msパルス、1秒ON、2秒OFF）対OFF、(2)フェイシックバースト（λ＝470nm、40Hz、5msパルス、0. 5秒ON、4秒OFF）対強直刺激（λ＝470nm、5Hz、5msパルス）；（3）青色光（λ＝470nm、25Hz、10msパルス、1秒ON、2秒OFF）対緑色光刺激（λ＝527nm、25Hz、10msパルス、1秒ON、2秒OFF）。VTAのDAニューロンでChR2を発現したマウスは、ベースライン値（試験前日）と比較して、刺激条件と対になったチャンバーに対して有意な選好性を示した（図5i,k,mおよび補足図23a-f）が、これはmCherryのみを発現した対照マウスでは観察されなかった。図5j,l,nは、各実験条件におけるRTPPアリーナの動物位置の代表的なヒートマップである。さらに、VTA ChR2発現DAニューロンの光刺激に対する運動活性の有意な変化も観察されなかった（補足図24a-eおよび補足ビデオ5）。ファイバーに埋め込まれたμLEDも、移植後少なくとも9ヵ月間は機能し続けた（補足図24f）。
腸-脳コミュニケーションのマルチモーダルインタロゲーション
オプトジェネティクスと薬理学は、脳回路の研究に革命をもたらした。しかし、これらの方法論を腸の神経回路に拡張することは、依然として困難であった。われわれは、消化管に沿って光や薬液を送達できる、柔らかい多機能マイクロエレクトロニクス腸ファイバーが、この難題に対処できるという仮説を立てた。
腸上皮の感覚細胞は腸内分泌細胞であり、ニューロポッド細胞としても知られている40,41。腸内分泌細胞は歴史的に、栄養刺激に反応するホルモン分泌の文脈で研究されてきたが、最近、迷走神経とシナプスし、ミリ秒以内に脳に信号を伝達することが明らかになった34,40,42。その神経伝達機能を認めるために、私たちはこれらの細胞をニューロポッド細胞と呼んでいる。これらの細胞は、腸から直接行動を駆動するための重要な入力を提供する重要な細胞であるにもかかわらず、摂食行動におけるその役割を解明するために、標的を絞った光遺伝学的・薬理学的操作を行った研究はわずかである34,43。われわれはまず、これらの上皮性感覚細胞を実験台として用い、頸迷走神経の電気生理学的情報をリードアウトとして用いて、繊維の二重光流体様式を評価した（図6aおよび補足図25a）。野生型マウスでは、スクロース溶液（300 mM、0.2 ml、3.3 µl s-1）を腸に注入すると、迷走神経発火率がベースラインと比較して有意に増加することがわかった（図6b,c）。この化学刺激の効果は、コレシストキニン（Cck）細胞でChR2を発現させたトランスジェニックマウス（Cck::ChR2）でも再現され、青色μLED（40Hz、パルス幅10ms）を介した光遺伝学的興奮により、腸線維内の迷走神経発火率が上昇した。Cck::ChR2マウスでは、Cck細胞内にChR2を持たないコントロールの同腹子と同様に、同じ装置内に統合された緑色のμLEDを照射しても、迷走神経反応は変化しなかった（図6d,eおよび補足図25b）。腸管は、温度感受性イオンチャネル（例えば、transient receptor potential vanilloid family member 1）44を保有する侵害受容性迷走神経求心性神経にも支配されているため、腸管腔内でµLEDを作動させる際に組織が加熱されると、侵害受容性末端が標的外に活性化され、腸管腔内オプトジェネティクスで得られる細胞型特異性が損なわれるのではないかという懸念が生じる。この懸念に対処するため、覚醒した慢性移植マウスを用い、光刺激エポック中にワイヤレスin vivo温度計測を行ったところ、FEM研究で予測されたような局所温度の実質的な変化は見られなかった（補足図25c）。
図6：行動中の腸管神経回路のマルチモーダルインタロゲーションとワイヤレスプログラマブルオプトジェネティクス。
b, 十二指腸スクロース（300 mM）は迷走神経発火率を増加させる。 c, ピーク応答の定量化（n = 4; *ウィルコクソン法を用いたノンパラメトリック比較によるクラスカル・ワリス検定でP = 0.0304）。d, Cck+細胞の光遺伝学的刺激は迷走神経発火率を増加させる。 e, ピーク反応の定量化。P < 0.0367 by Kruskal-Wallis test with nonparametric comparisons using Wilcoxon method, baseline (n = 5) versus blue µLED (n = 5)： P = 0.0367；ベースライン対緑色μLED（n = 4）： P = 0.1113；青色μLED対緑色μLED： f,g, 摂食行動(g)を評価しながら(f)Cck+細胞をワイヤレスで光遺伝学的に十二指腸内制御する模式図。 h,i, (h)Cck::ChR2マウス(n = 4)のチョウ摂取量(時間(P = 0.0003)、刺激(P < 0.0001)および時間×刺激の交互作用(P = 0.0086)の有意な影響)： 1時間, P = 0.0161; 2時間, P = 0.0376; 3時間, P = 0.0044)、および(i)ChR2欠損コントロールマウス(n = 4, 時間の有意な影響(P = 0.0020)、刺激(P = 0.4975)および時間×刺激の交互作用(P = 0.8906)はなし)。 j,k, Pyy+細胞の回腸光遺伝学的制御(j)と食物摂取量の評価(k)の図。l, ワイヤレス光刺激中のPyy::ChR2マウスの摂取量（n = 4, 時間(P < 0.0001)、刺激(P < 0.0001)および時間×刺激の交互作用(P < 0.0001)の有意な影響）。 n, 対照マウスの摂取量（n = 4, 時間(P < 0.0001)および刺激(P = 0.0160)の有意な影響）。 o,nの累積摂取量（両側対t検定、P = 0.4639）。 p,十二指腸マイクロ流体注入中の脳VTA電気生理の模式図。 q,推定DAニューロンの発火率はキヌピロールに感受性がある。r,スクロースを十二指腸内に投与すると、生理食塩水と比較して推定DAニューロンの発火率が増加する（生理食塩水：n=20、スクロース：n=18ニューロン、両側ウィルコクソン符号順位検定、それぞれP=0.8595、P=6.71387×10-4）。s,Phox2b::ChR2マウスにおける十二指腸光刺激の模式図。 t,u,Phox2b::ChR2(t)とChR2欠損コントロールマウス(u)のベースライン時とテスト日における嗜好性の割合（両側対t検定、Phox2b::ChR2： P = 0.014、t = 4.19、d.f. = 4；コントロールマウス： v,w, t (v)とu (w)に対応する動物の位置の代表的なヒートマップ。） すべてのデータは平均±s.e.m.で表されるが、rは平均±s.d.を示す。
ソースデータ
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神経節細胞は消化管全体に存在し、ホルモンや神経伝達物質を放出して摂食量を調節している41,45。摂食行動に対する神経節細胞の影響を評価するため、我々は十二指腸と回腸という2つの異なる消化管領域に軟腸線維を移植した。腸管内腔の適切な機能は生存に不可欠であるため、まず、多機能繊維を慢性的に腸に移植したことが、動物の摂食量や摂水量、運動量に影響を与えるかどうかを評価した。その結果、繊維移植前後でこれらの測定値に有意な変化は見られなかった（補足図26a-c）。このことから、移植した繊維は摂取した食物や水分の通過を妨げず、生理的活動を妨げないことが確認された（補足動画6および7）。慢性的に移植した腸ファイバーの生体適合性は、腸組織の組織学的分析によっても評価されたが、上皮層の解剖学的特徴に大きな変化は見られなかった（補足図27a-d）。このことは、慢性的に移植された腸管ファイバーは、その柔らかい力学的性質に相応して、脆弱な上皮バリアの完全性を損なわないことを示している。
満腹ホルモンであるコレシストキニン（CCK）を外因的に投与すると、げっ歯類やヒトで強い食欲不振が生じることはよく知られている46,47。CCKはまた、腸に入る栄養素に反応して小腸の神経叢細胞から放出される48。したがって、十二指腸のCckを発現する神経叢細胞を光遺伝学的に刺激すると、摂食量の変化で測定できる持続的な食欲不振効果が得られるという仮説を立てた。この仮説を検証するために、Cck::ChR2マウスの十二指腸に軟腸線維を移植した（図6f,g）。腸線維には独立に制御された複数の刺激チャンネルがあるため、これらの研究では被験者内の実験デザインが可能であった（Methods）。一晩絶食した後、十二指腸Cck細胞（補足図28a,b）を青色μLED（20Hz、パルス幅10ms、0.5秒点灯、1秒消灯）で刺激すると、対照の緑色光刺激と比較して、3時間にわたってチャウ摂取が有意に抑制された（図6h）。ChR2発現欠損マウスでは、青色光刺激は摂食量に影響を与えず、緑色光対照と比較した（図6i）。
回腸では、脂肪と炭水化物が存在すると回腸ブレーキが誘導される。回腸ブレーキは、摂食量を減少させることによって胃腸の排出速度を調節する、神経ホルモンを介したフィードバックループである49。回腸への栄養注入または神経ペプチドの外因性投与を用いた以前の研究では、ペプチドYYY（PYY）とグルカゴン様ペプチド1（GLP-1）が回腸ブレーキの効果を媒介することが示された50,51。しかし、これらの知見は相関的なものであり、回腸の特定の細胞タイプと生理的フィードバックループとの因果関係を立証するアプローチは限られていた52,53。我々は、PYYとGLP-1を放出する回腸のPyy+細胞を、慢性的に植え込んだ腸管ファイバーを通して光遺伝学的に直接活性化することで、これらの細胞が回腸ブレーキのメディエーターとしてさらに関与する可能性があると考えた。時間にわたる回腸摂食アッセイ中、腸ファイバーからの安定した光出力を確保するため、ワイヤレス回路は、高電圧をサポートする低ドロップアウト電圧レギュレーターと、高容量、軽量の充電式バッテリーを含むように改良された（補足図29a-d）。術後1週間回復させ、実験前に18時間絶食させたPyy::ChR2マウスの回腸に、軟腸ファイバーを移植した（図6j,k、被験者内実験デザイン）。回腸Pyy神経脚細胞（補足図30a,b）を青色μLED（20Hz、パルス幅10ms、0.5秒点灯、1秒消灯）で無線刺激すると、対照の緑色光と比較して、高脂肪・高炭水化物溶液の摂取が有意に抑制された（図6l,m）が、回腸Pyy細胞でChR2を欠損したマウスでは、青色光刺激は被験者内対照と比較して摂取量に影響を与えなかった（図6n,o）。ChR2欠損マウスではベースライン摂取量が少ないことに注意されたい（Methods）。しかし、被験者内デザインでは、総摂取量に対する青色光の影響は見られなかった。近位小腸および遠位小腸における迷走神経活動の制御と管腔内光流体刺激による摂食行動とを合わせると、まばらに分布する腸細胞（上皮細胞の約1％）を調節する多機能性腸線維の有効性が浮き彫りになる45,54。
食物摂取は、双方向かつ協調的な腸-脳シグナル伝達によって調節されている55。腸由来のシグナルが満腹感に及ぼす影響は広く研究されているが、食物摂取を駆動する神経集団に及ぼす影響は完全には解明されていない56。われわれは、微小流体で腸管繊維を介して栄養素を投与している間に、脳繊維を介して単一ユニットの神経活動を記録することで、腸における栄養素の検出が脳でどのように符号化されるかを探る将来の可能性が開けるのではないかと考えた。例えば、腹側線条体における摂食誘導性DA放出は、体性感覚的手がかりとは無関係に、栄養特異的な方法で掲示性フィードバックによって駆動されることが以前に示された57,58。腹側線条体はVTAのDAニューロンから濃密な神経支配を受けていることから、我々はスクロースを腸管内に投与することで、VTAのDAニューロンの発火率をポジティブに調節できるという仮説を立てた。この仮説を検証するため、野生型マウスに脳線維をVTAに移植し、手術の1週間後に電気生理学的記録を行った（図6p）。DA D2自己受容体アゴニストであるキ ンピロール（200μg kg-1、腹腔内）に対する感受性から、仮説的DAニューロンの同定が裏付けられた（図6qおよび補足図31a）。一晩絶食させた後（18時間）、動物を小腸近位部に腸管ファイバーを埋め込み、VTAのスパイキング活動を同時に記録しながら、スクロース溶液（600 mM、10分間で0.5 ml）または生理食塩水（10分間で0.5 ml）のいずれかを腸管内マイクロ流体で投与した。スクロースの腸内投与では、DAニューロンの発火率が注入前と比較して有意に増加したが、生理食塩水の注入後には発火率の変化は観察されなかった（図6rおよび補足図31b-e）。ワイヤレス・デバイスの多臓器への埋め込みは、インターオセプティブ神経回路の機能的研究にとって特に魅力的であるため、摂食と運動のアッセイ（補足注5および補足図33a-h）を通して、マルチサイト・多機能マイクロエレクトロニクス・ファイバー（補足図32a-h）による生存手術の有効性をさらに立証した。これらの実験は、覚醒行動マウスにおいて、腸や脳のような複数の器官にまたがる回路のダイナミクスをプローブするためのワイヤレスファイバーニューロテクノロジーの有用性を強調している。
満腹感や食物摂取だけでなく、脳に到達する腸のシグナルもまた、意欲や報酬を調節する。脳幹レベルで腸管上部に投射する迷走神経求心性神経を光遺伝学的に刺激すると、DA依存的な報酬行動を引き起こすことが示された5。これらの知見に触発され、われわれは行動するマウスの腸から中枢神経系の機能を直接制御できるかどうかを調べるために、腸線維を応用した（図6s）。Phox2b::ChR2マウスは、蛍光タンパク質tdTomatoに融合したChR2が、粘性感覚結節神経細胞に広く見られるPhox2bプロモーター下で発現している（補足図34a）59。その後、十二指腸に慢性的に腸線維を移植したPhox2b::ChR2マウス（補足図34b,c）にRTPP行動課題を行ったところ、青色μLED（20Hz、パルス幅10ms、0.5秒点灯、1秒消灯）による腔内迷走神経刺激が、試験前の値と比較して、光と対になったチャンバーへの有意な選好を引き起こした（図6t,u）。同じ光刺激を受けたChR2発現欠損の対照マウスでは、いずれのチャンバーに対する選好性にも有意差は認められなかった（図6v,w）。同様に、Phox2b::ChR2マウスにコントロールの緑色μLED（20Hz、パルス幅10ms、0.5秒点灯、1秒消灯）で管腔内刺激を与えても、試験前の探索と比較して、光ペアチャンバーに対する有意な選好は誘発されなかった（補足図34d,e）。これらの結果は、ワイヤレス多機能マイクロエレクトロニックファイバーが、複雑な動機づけ行動の根底にある腸-脳シグナリングの寄与を解明することを目的とした研究に役立つ可能性を示している。
考察
多機能でワイヤレス可能なマイクロエレクトロニックファイバーは、拘束されていない行動マウスにおいて、脳と消化管との安定したバイオエレクトロニックインターフェースを可能にした。我々は、繊維延伸のスケーラビリティを活用して、表面に沿って固体デバイスを集積できる数十メートルのマイクロスケールポリマーフィラメントを作製した。このアプローチは、ファイバー力学の決定論的な調整可能性と相まって、これまでにない設計の柔軟性を提供するものであり、脳とのインターフェイスを実現する硬質でありながら柔軟な多機能ファイバーや、腸とのインターフェイスを実現する軟質コンプライアントファイバーの製造によって実証されている。そうすることで、我々はまた、繊維延伸に関連する未解決の課題を克服した。熱的に延伸されたファイバーベースの神経インターフェースは、先端に限局された機能性に限られ、受動的な特徴を使用し、繋がれていない操作とは相容れなかった36,60。ファイバーベースの神経プローブ内に埋め込まれたマイクロエレクトロニクスは、その軸方向の冗長性を断ち切り、ソリッドステート・デバイスによって強化された新しい刺激およびセンシングモードのロックを解除する。これらのファイバーをNeuroStackモジュールと結合させることで、ワイヤレスでプログラムされた制御をリアルタイムで実証している。多くのエレガントな完全埋め込み型ワイヤレス・プラットフォームとは異なり、NeuroStackは外部に取り付けられているが、特別なアンテナを使用することなく、Bluetoothプロトコルを使用して簡単に展開することができる。さらに、軽量でカスタマイズされたバックエンド回路を積み重ねることで、センシングや変調機能のミキシングやマッチングが可能である。このように、この完全なプラットフォームは、リソグラフィを必要としないスケーラブルな製造、シングルステッププロセスでの多機能性、視線のハンディキャップや角度依存性のない安定したワイヤレス制御、複雑な行動パラダイムに見合った直感的な操作性を実現することで、現在のワイヤレスバイオエレクトロニクス技術のいくつかの限界を克服している（補足注6および補足表1）。多機能マイクロエレクトロニックファイバーとNeuroStackモジュールの将来的な拡張は、クローズドループ、完全に移植可能な操作とその場での充電を可能にするために、低消費電力の特定用途向け集積回路、小型バッテリー、ワイヤレス通信プロトコルの継続的な進歩を活用する。
私たちは、このプラットフォームを応用して、自由に行動する動物の脳と腸の神経活動を感知し、調節する。脳繊維は、遺伝子導入、特定のニューロンにおけるオプシン発現の動的かつ慢性的な光電気生理学的モニタリング、単一ニューロン記録、麻酔による脳低体温の感知、報酬行動の無線プログラム可能な光制御を可能にする。軟性腸ファイバーは、マウスの腸の数センチメートルに及ぶ標的部位に光と栄養を供給することを可能にし、感覚性腸内分泌細胞や迷走神経求心性の調節を可能にする。これは、胃底や大腸外壁の小さな領域で光調節を実証した以前のエレガントなツールでは到達できなかった能力である18,34,61。マイクロエレクトロニックファイバーは、脳と腸に複数の刺激を伝えたり感知したりすることができ、また両方の器官と同時にインターフェースをとることができるため、腸から脳へのシグナル伝達の研究に応用することが可能である。組織レベルの力学を模倣した材料やファイバー構造における将来の技術革新は、マイクロエレクトロニック・ファイバーの応用範囲を、腸以外の末梢臓器にまで広げるかもしれない。
私たちは、トランスジェニック動物のレパートリーが増え続けるにつれて、多機能ワイヤレスファイバーベースのツールが、末梢器官と脳との間の双方向コミュニケーションにおける特定の細胞の役割について、重要な洞察を与えてくれるものと期待している。これらのツールは、健康や病気における謎めいた相互受容ネットワークの研究に力を与えるだろう。
研究方法
多機能脳線維の作製
多機能脳繊維は、PCスラブ（McMaster, 8574K43）のコンピュータ数値制御機械加工によって製造された巨視的プリフォームから熱延伸によって製造された。14.8mm×3mm×30cmのスラブに、1.6×1.6mm2の正方形の溝を4mmピッチで3本加工し、収束チャンネル層を得た。14.8×0.8mm2のトップカバーが収束チャンネルを完全に定義した。続く層には、マイクロ流体機能を規定する中央チャンネル（3.2mm×2mm×30cm）があり、記録電極用の2つの追加チャンネル（1mm×1mm×30cm）が両側に並んでいた。この3層プリフォームを185℃で1時間熱圧着し、40～50のサイズ縮小比で機能性ファイバーに延伸すると同時に、それぞれ相互接続と記録電極として機能するAg-Cuとタングステンのマイクロワイヤーをスプールに供給した。
多機能ガットファイバーの引き込み
柔らかい多機能性腸ファイバーのプリフォームの組み立ては、SEBSペレット（Kraton, G1657）をコンピュータ数値制御で機械加工された逆アルミ金型で真空下、200℃で12時間、所望の幾何学的パターンに成形することから始まった。最上層は、4mmピッチのコンバージェンス・チャンネル（3.6mm×3.6mm×30cm）を形成し、相互接続用マイクロワイヤーを収容した。マイクロ流路の前駆体（2.8 mm × 2 mm × 30 cm）と軟導電性電極（2 mm × 2 mm × 30 cm）は下層に組み込まれた。SEBS収束チャンネルは、壁厚1mm、チャンネルサイズ1.6×1.6mm2のU字型PC層で裏打ちされた。最後に、カーボン入りポリエチレンのスラブ2枚（2mm×2mm×30cm）をボトム層に挿入した。多層プリフォームを130℃で45分間圧密し、その後、特注のドロータワー（LabView, v.18.0）を用いて、40～45のサイズ縮小比でマイクロスケールファイバーに延伸し、同時に、相互接続として機能する40μmのAg-Cuマイクロワイヤーを3本のスプールに供給した。
ファイバーデバイスの作製と特性評価
埋め込み型脳繊維デバイスの作製は、まず、引き出されたままの繊維の遠位～1cm長さのPC層をジクロロメタン中で2～3分間溶解除去し、相互接続と電極マイクロワイヤーを露出させることから始まった。その後、マイクロワイヤーをオスヘッダーピンにはんだ付けし、3次元印刷された特注ケーシング（5×7×0.5 mm3）内に組み立て、紫外線硬化型エポキシ（NOA 61、Norland Products）で固定した。光学顕微鏡下でファイバー遠位端をカミソリの刃で低速機械加工することにより、Ag-Cu相互接続の約0.5cmを露出させ、続いてリフローはんだ付け（Chip Quik, TS391LT10）または熱硬化性銀ペースト（Epo-Tek, H20E）を用いて青色および緑色のμLEDチップ（Cree, TR2227またはSR2130）を実装した。ヘッダーピンに接続された絶縁ステンレス鋼アース線は、アースネジにはんだ付けされた。マイクロ流体チャンネルへの接続は、ポリテトラフルオロエチレン製アクセスチューブを使用したT字型接合部を介して確立した。この目的のため、まずファイバー上のマイクロ流体チャンネルを剃刀で露出させ、その後ファイバーを金属針を通してアクセスチューブに通した。チューブとポリマーの接合部に紫外線エポキシ樹脂を流し、T字型接合部を水密にした。マイクロ流路の開通性は、脱イオン水を流すことで確認した。最後に、12-14μmのパリレン-C蒸着層（SCS Labcoter2、パリレン蒸着システム）が生体流体バリア層を規定した。このようにして組み立てられた最終的なデバイスは、VTAをターゲットとするため、全長が～6～6.5mmであった。ソフトガットファイバーの作製には、相互接続の露出、入出力（I/O）ピンへのはんだ付け、ファイバーへのμLEDの取り付け、Tジャンクションを介したマイクロ流体チャンネルの接続という同一のステップが含まれた。最終的なガットファイバーの全長は約8.5cmで、ファイバーの遠位2cmの長さに緑と青のμLEDをそれぞれ1cmの間隔で3個ずつ搭載した。このデバイスは、～4～6μmのパリレン-Cの薄い層でカプセル化され、その後、ポリテトラフルオロエチレンの犠牲型にファイバーを挿入することにより、～100μmの医療グレードのシリコーン（MED-6215、Avantor）の層でカプセル化された。シリコーン混合物を充填し、ファイバーとともに金型内で90～100℃の温度で3時間熱硬化させた後、チューブを切り開いて移植用の最終的なコーティング・デバイスを得た。ファイバーデバイスのキャラクタリゼーションとFEM研究の詳細は、Supplementary methodsに記載されている。
NeuroStackハードウェア
NeuroStackモジュールは、基地局コンピュータに接続された中央システム（nRF52840 DK開発キット）とBLE通信するためのMDBT42Vワイヤレスマイクロコントローラ（Nordic nRF52832チップとオンチップPCBアンテナ搭載）を搭載したカスタムプリント基板（PCB）で構成されている。円形ボードの端近くにあるオス型ヘッダーピンで、植込み型プローブとの接続と切断が可能です。ボードの底面にある2つの垂直ヘッダー・ピンは、オプション・モジュールの着脱を可能にする。この研究では、オプションモジュールが光強度を正確に制御する。個々のデバイスとオプション・モジュールを準備するために、リフローはんだ付けを使用してコンポーネントをカスタムPCBに実装し、Arduinoライブラリーを備えたJ-linkプログラマーを使用してソフトウェアをロードした。ファイバーと一体化されたµLEDは、3.3Vの定電圧源またはプログラマブル・デジタル・アナログ・コンバーター（MAX5510）のいずれかによって駆動され、適切な電流制限用直列抵抗を配置して輝度を所望のレベル内に維持した。デバイス波形の検証は、測定された周波数と形状をインターフェースで指定されたものと比較するために、オシロスコープを使用して行われた。消費電流パターンは、Keithley 100Bソース・メーターを使用して特性評価した。電池寿命のさらなるテストは、出力電圧が光遺伝学的刺激閾値を下回るまで、目的の刺激パラメータでシステムを稼動させたままにしておくことで行った。11mAh容量の充電式リチウム電池（MS920SE-FL27E、セイコーインスツルメンツ、直径9.5mmのコイン型電池、厚さ3mm、0.47g）を使用すると、脳デバイスは1回の充電で最大1時間動作させることができ、一方、腸デバイスの最初のバージョンは、ほとんどの神経科学行動研究に十分な最大30分間動作させることができる。補足図28で開発した、腸管オプトジェネティクスを用いた長期摂食研究を行うための改良型ワイヤレス回路は、1回の充電で最大2時間の連続動作が可能である（45mAh容量充電池、4×12×15 mm3、1.1 g、GM041215、PowerStream社製）。軽量で大容量のバッテリー（例えば、容量62mAh、3×10×30mm3、～1.2g、GM 01030、PowerStream）を採用すれば、脳・腸両デバイスの連続稼働時間を数時間に延長することも容易である。温度記録機能をテストするため、プローブを市販の熱電対を取り付けたホットプレート上に置き、各温度測定値の間に30秒間放置した。アンプ出力電圧と市販センサーからの温度の記録は、検量線の生成に使用された。ワイヤレス温度記録では、NRF52チップの12ビットアナログ・デジタルコンバーターを使用して送信データを収集し、BLEで中央収集ポイントに送信した。帯域幅を改善し、パケット・オーバーヘッドを削減するため、記録における遅延を犠牲にしてデータをバッチ化した。受信したデータは、シリアルインターフェースを介してMATLAB（R2019b）プログラムに転送されるか、後の解析のために保存された。
NeuroStackユーザーインターフェース
制御ソフトウェアは、ハードウェアが提供するモジュール性をサポートし、システムのプリファレンスに関してユーザーに柔軟性を提供するとともに、記録されたデータをプロットしてコンピューターに保存する。希望に応じて機能を有効/無効にすることができ、リアルタイムで刺激の更新を神経調節プラットフォームに送信する。このシステムは、神経調節プラットフォームの通信と制御のために2つのソフトウェアに依存している。1つ目は神経調節ボードにロードされるファームウェアで、刺激の更新を送信し、希望する機能を有効にし、有効になっていればコンピュータにデータを送り返す。コードの周辺部分はArduino IDEで開発された。その後、Adalink Tool Kitを使用してシステムコードを神経調節装置にロードした。コードの中心部分は、Nordic Software Development KitとSegger Embedded Studio Softwareを使って開発した。コードのこの部分は、周辺ボードとの通信と制御を担当する。システム操作に不可欠な2番目のコード部分は、MATLAB（R2019b）で開発されたグラフィカル・ユーザー・インターフェースであり、ユーザーがリアルタイムで機能を選択し、神経調節デバイスに更新を送信できるようになっている。
動物を対象とした実験
すべての動物実験は、MIT動物飼育委員会およびデューク大学動物飼育使用委員会の承認を受け、米国国立衛生研究所「実験動物の飼育と使用に関する手引き」に従って実施された。雌雄同数のマウスを使用した。マウスは、特に断りのない限り、22℃、12時間明暗サイクル、湿度50％に保たれたケージ内で、手術前は群飼いし、手術後は単独飼いとし、餌と水は自由摂取とした。
脳へのマイクロエレクトロニクスファイバーの埋め込み
6～8週齢の野生型マウス（C57BL/6）（Jackson Laboratory、系統番号000664）および8～10週齢のトランスジェニックDAT::Creマウス（Jackson Laboratoryより入手した繁殖ペア、系統番号006660）を試験に用い、すべての手術は無菌条件下で行った。マウスはイソフルランガス（O2中0.5～2.5％、VET EQUIP社製）で麻酔し、脳定位固定装置（David Kopf Instruments社製）に装着した。眼に眼軟膏を塗布した後、皮膚を切開して頭蓋骨を露出させた。ラムダ点とブレグマ点を用いて、マウス脳アトラス（Franklin and Paxinos）に対する頭蓋骨の位置合わせを行った。移植と注入の座標はすべて脳アトラスに従って設定した。VTAにシングルステップの注入／移植を行った（ブレグマに対する座標；-3.2mm前後；0.5mm縦；-4.4mm背腹）。Ef1α::DIO-hChR2-mCherryおよびEf1α::DIO-mCherryプラスミドを有するAAV5ウイルスは、それぞれ2×1012粒子/mlおよび3×1012粒子/mlの力価でノースカロライナ大学ベクターコアから購入した。マイクロインジェクション装置（NanoFilシリンジとUMP-3シリンジポンプ、Word Precision Instruments社製）を用いて、1.2μlのAAVウイルスをファイバーマイクロフルイディックチャンネルに前装填した。ファイバーを脳内に下ろし、背腹側-4.6 mmと-4.2 mmの部位に600 nlのウイルスペイロードを注入速度～150～300 nl min-1で注入した。各注入後、ファイバーはさらに10分間放置された。対側半球の小脳の頭蓋骨にステンレス製のグランドスクリューを固定した。最後に、ファイバーバックエンドコネクターを接着剤（C&B Metabond、Parkell）と歯科用セメント（Jet-Set 4、Lang Dental）の層で頭蓋骨に固定した。手術後、マウスは個々に22℃、12時間の明暗サイクルで飼育され、餌と水は自由摂取とした。さまざまな実験に対する組み入れ基準は以下の通りであった： (1)自発電気生理学-低バックグラウンドノイズ（<400μVpp）、(2)光電気生理学、温度計測-in vivoおよびex vivoのI-V曲線から評価したintact μLED、(3)行動-in vivoおよびex vivoのI-V曲線から評価したintact μLED、光誘発神経活動および/または組織学から評価したウイルス構築物の発現。
ファイバープローブの腸への外科的埋め込み
成体の野生型（ジャクソン研究所、系統番号000664）、Phox2b::ChR2（ジャクソン研究所から入手した繁殖ペア、系統番号016233、012567）、Pyy::ChR2（Pyy::Creマウスはジャクソン研究所のAndrew Leiterの好意による、系統番号012567）、またはCck::ChR2（Pyy::Creマウスはジャクソン研究所のAndrew Leiterの好意による、系統番号012567）。012567）またはCck::ChR2マウス（繁殖ペアはJackson Laboratoryより入手、系統番号012706、012567）（C57BL/6Jバックグラウンド）または同腹子をイソフルラン（酸素中1-3%）で麻酔した。剣状突起から左鎖骨正中線まで斜めに1cmの切開を加えた。腹腔にアクセスし、野生型マウス、Phox2b::ChR2マウス、Cck::ChR2マウスに移植するために胃を体外離脱させた。これらのマウスでは、腸ファイバーの遠位端を幽門から十二指腸に導入した。幽門にアクセスするため、胃肛門に縫合糸を入れ、その間に胃壁に小さな切開を入れた。器具の遠位端を近位十二指腸に通した。その後、腸内でデバイスを固定するために財布のひもで縫合した。Pyy::ChR2マウスでは、剣状突起の3cm下を1cm切開して盲腸にアクセスした。盲腸を体外離脱させ、十二指腸の手術と同様に、腸ファイバーの遠位端を回腸遠位端に縫合糸を通して導入した。回腸内で器具を固定するために、財布のひもを結んだ。すべての手術において、デバイスの残りの長さは、皮下ポケットを形成することによって頭蓋骨の底部までトンネル状に挿入された。腹膜とその上の皮膚は腹部部位で縫合閉鎖した。ファイバーは頭蓋底の皮下トンネルを出た。頭蓋骨をメスの刃でエッチングし、メタボンドセメント（クリアLパウダーS399＋触媒、メタボンド）を薄く塗布した。その後、メタボンド層を同様にメスでエッチングし、ファイバーのバックエンドコネクターを歯科用セメント（Stoelting社製、No.51458）を用いて頭蓋骨に固定した。マウスは少なくとも5日間回復し、その間ウェットマッシュを与え、適切な術後ケアを受けた。各試験の終了時の組み入れ基準は、ファイバーが小腸近位部で適切に固定されていること、およびμLEDが動作可能であることであった。
In vivo電気生理学的検査と光電気生理学的検査
植え込まれたファイバーは、PZ2-32 ヘッドステージ（Tucker Davis Technologies）を介して RZ5D 電気生理システムに接続された。データ取得後、電気生理学的信号は50kHzのサンプリング周波数でデジタル化され、周波数範囲0.3～5kHzでフィルタリングされた。その後の信号処理と解析はMATLAB（R2019b）で行った。スパイク活動は、信号の平均値から5 s.d.を閾値とする閾値検出を用いて検出した。二重検出を排除するため、ダウンタイムは2msとした。主成分分析とガウス混合モデルクラスタリングを用いて、スパイクの分類とクラスタリングを行った（完全共分散行列と独立共分散行列）。クラスタ化されたデータの質を評価するために、分類されたクラスタのL-比と分離距離が用いられた。光電気生理学実験では、容量結合アーチファクトを最小化するために、光遺伝学的刺激パルスをファイバー上の集積μLEDを介して、1～15msの立ち上がり/立ち下がり時間で照射した。刺激は、カスタム設計のコネクタを用いたRZ5D収集システムから、周波数10Hzで、4秒間の休息エポックで区切られた1秒間の刺激エポックで供給された。
生体内インピーダンス分光法
記録電極のin vivoでの安定性を評価するため、野生型マウスを移植したVTAにおいて、ポータブルBioLogic VMP3ポテンショスタットを用いて、最大6ヶ月間（n = 3マウス）、これらの電極対グランドスクリューのインピーダンス分光測定を行った。
In vivo脳温測定
ワイヤレス頭蓋内温度測定は、オープンフィールド競技場で行った。較正済みマイクロエレクトロニックファイバーをVTAに移植した野生型マウス（n = 6）をNeuroStackモジュールに連結し、青色μLEDによるワイヤレス光刺激（20Hz、パルス幅10ms）を200秒間受けながら、オープンフィールドアリーナ（30×30cm2）を探索させた。ケタミン・キシラジンの混合麻酔薬（9：1希釈）を30mg kg-1および60mg kg-1の用量でVTAに移植した野生型マウスに腹腔内注射し、麻酔による脳低体温を定量した（各用量についてn＝3）。ファイバー温度センサーからの電流応答は、動物が意識を取り戻し、ホームケージ内を自由に歩き始めるまで、ポテンショスタット（ソーラトロン、1280C）を用いて2電極構成で測定した。
In vivo腸温測定
ワイヤレス腸温測定は、餌と水を除去した清潔なホームケージ内で行った。野生型マウスには、上述のように十二指腸に腸ファイバーを慢性的に埋め込んだ。ホームケージ内で10分間、移植した青色μLEDによるワイヤレス光刺激（20Hz、パルス幅10ms）を受けながら、体温を継続的に記録した。
迷走神経カフ電気生理学的同時測定によるin vivo腸光流体モジュレーション
全神経記録は、Cck::ChR2マウスを用い、前述の方法で行った40。PBS灌流用と刺激薬投与用の2本のチューブが接続された腸ファイバーを、外科的に胃壁から十二指腸に挿入した。灌流出口は小腸のTreitz靭帯で切開した。容積圧をコントロールし、被験者内のベースラインとして機能させるため、PBSを単離された腸領域を通して400μl min-1で常時灌流した。刺激条件は、2分間のベースライン活動を記録した後に適用した。栄養刺激条件下では、PBS灌流を継続し、シリンジポンプ（Fusion 200、Chemyx）を用いて200μlの刺激物質を1分間かけて灌流した。各化合物の1分間の注入は、少なくとも6分間、またはベースライン発火率への復帰のいずれか早いほうで区切った。迷走神経発火率を刺激することが知られているため、スクロース（300 mM）を栄養剤として用いた。青色光（λ = 470 nm、20 Hz、30.3 mW mm-2、パルス幅10 ms）または緑色光（λ = 527 nm、20 Hz、45.6 mW mm-2、パルス幅10 ms）を、スクロース注入と同時にファイバーμLEDを介してマイクロ流体チャンネルに照射した。細胞外電圧は既述の方法で記録した40。生データは、カスタムMATLAB（R2019b）ソフトウェアスクリプトであるSpikeTailorを用いて解析した40。スパイクは、二乗平均平方根ノイズによって決定されるノイズフロアより2s.d.高い閾値を使用して検出された。発火率は、200ミリ秒ビンのガウスカーネルスムージングアルゴリズムを用いて計算した40。
In vivoでの腸内栄養投与と脳電気生理学の同時測定
C57BL/6Jマウスに脳繊維をVTAに慢性的に埋め込み、1週間回復させた。その後、電気生理学的記録を行い、「in vivo電気生理学」の項で詳述したように解析した。仮説的DAニューロンの同一性は、ドーパミンD2受容体作動薬キ ンピロール（200-300μg kg-1、腹腔内）に対する特徴的な抑制反応によって評価した。発火率は、ウィンドウサイズ1秒（標準偏差200msの移動平均ガウス）の刺激時間ヒストグラムに基づいて、記録された各ユニットについて計算された。DAニューロンからの記録がうまくいかなかった動物（バックグラウンドノイズが400μVpp以上、またはキインピロール投与に鈍感）は実験から除外した。その後、動物は一晩18時間絶食させられ、腸ファイバーの十二指腸内植え込みのための2回目の手術を受けた。スクロース（0.6M、10分間で0.5ml）または生理食塩水の注入（10分間で0.5ml）を、プログラム可能な注入ポンプ（New Era Pump Systems社製）を用いて行い、同時にVTA活動を記録した。平均発火率は、40ミリ秒のビンサイズでの平均刺激間間隔に基づき、注入前後120秒の記録ウィンドウにわたって各DAユニットと推定されるものについて計算された。
RTPPアッセイ
行動テストは、実験群と対照群の同一性を知っている研究者によって行われた。
脳
多機能マイクロエレクトロニクスファイバーを移植し、VTAにウイルスベクターを注射したDAT::Creマウスは、行動試験の2日前に、それぞれ10分間、治験責任医師が取り扱い、馴化させた（各群n = 8-10）。3日目に、動物をNeuroStackモジュールの接続に慣れさせ、ホームケージを15分間探索させた。翌日（プレテスト日）、NeuroStackモジュールを装着したマウスを、ビデオ録画しながら、偏りのない2コンパートメント・チャンバー（60×30×30cm3）を30分間自由に探索させた。各チャンバーに動物が滞在した時間は、行動ソフトウェア（Ethovision XT、Noldus）を用いて算出した。予備試験で70%以上の嗜好性を示したマウスはその後の解析から除外した。試験当日、各動物の嗜好性の低いチャンバーを、5mほど離れたベースコンピュータからNeuroStackを制御することで、ワイヤレス光刺激条件と連動させた。記録カメラからのライブ映像により動物の位置が入力され、研究者がリアルタイムで刺激条件の状態を制御した。上記の手順で3つの異なる光刺激条件をテストした：（1）刺激ON（470nm、25Hz、10msパルス、1秒ON、2秒OFF）対OFF（刺激なし）；（2）フェイシックバースト（470nm、40Hz、5msパルス、0. 5秒ON、4秒OFF）対強直刺激（5Hz、5msパルス、ON）；（3）青色刺激（470nm、25Hz、10msパルス、1秒ON、2秒OFF）対緑色刺激（527nm、25Hz、10msパルス、1秒ON、2秒OFF）。
腸
Phox2b::ChR2マウスとその陰性遺伝子型同腹子を十二指腸に移植した。マウスは、脳実験と同様に、治験責任医師の取り扱いおよびNeuroStackモジュールへの接続に慣らした。試験前日、NeuroStackモジュールを移植したファイバーのI/Oピンに取り付け、マウスに20分間、偏りのないチャンバー（マウス用Techniplast Greenline IVCケージ）を自由に探索させた。動物の活動は、xおよびy平面で交差するビームによって決定され、TSE PhenoMaster（software v.7.3.3）を用いて100Hzのスキャンレートで収集された。試験当日、各動物のあまり好まないチャンバーを、ベースコンピュータからワイヤレスモジュールを制御することによりワイヤレス光刺激に連結した。ライブ活動フィードによりマウスの位置が入力され、治験責任医師がワイヤレスでリアルタイムに刺激状態を制御した。(1)実験群はPhox2b::ChR2マウスに青色光刺激（470nm、20Hz、10msパルス、ON）を与えた群と刺激を与えなかった群（OFF）、(2)μLED対照群はPhox2b::ChR2マウスに緑色光刺激を与えた群である： ChR2マウスに緑色光刺激（527nm、20Hz、10-msパルス、ON）を与えた群と無刺激（OFF）を与えた群、（3）遺伝的対照群は、陰性遺伝子型同腹子に青色光刺激（20Hz、10-msパルス、ON）を与えた群と無刺激（OFF）を与えた群である。
摂食行動の調節
十二指腸の研究では、Cck::ChR2マウスまたは陰性対照マウスを十二指腸近位部に軟腸ファイバーを移植した。マウスは、治験責任医師の操作とNeuroStackモジュールへの接続に慣らした。マウスは、NeuroStackモジュールに接続し、ワイヤレス光刺激（20Hz、10msパルス）を30分間受ける前に、一晩（18時間）餌を絶った。30分間の刺激後、マウスをNeuroStackから切り離し、標準的なチャウペレット（Purina 5001）を与えた。餌の摂取量は1時間ごとに3時間測定された。マウスは餌の制限と検査の間、自由に水を飲むことができた。各マウスは青色光刺激と緑色光刺激を条件ごとに無作為に受けた。各試験日は48時間以上あけた。回腸試験では、Pyy::ChR2マウスまたは陰性対照マウスを回腸に軟腸ファイバーを移植した。マウスは実験者の操作とNeuroStackモジュールへの接続に慣らした。手術後の回復後6時間、最初の実験セッションの少なくとも48時間前に、マウスをエンシュア（30％）溶液に馴化させた。NeuroStackモジュールに接続する前に、マウスは一晩（18時間）餌を与えないようにした。マウスはワイヤレス光刺激（20Hz、10msパルス）を1時間受け、これはEnsure溶液にアクセスする10分前に開始した。Ensure（30%）は、シッパーとして作られた5mlの血清ピペットに充填された。マウスは1時間溶液を摂取し、5分ごとに摂取量を測定した。試験中、マウスは餌や水を摂取することはできなかった。各マウスは青色光と緑色光のシミュレーショ ンを条件ごとに無作為に受けた。各試験日の間隔は少なくとも48時間空けた。摂食実験では、腸管繊維上の独立にアドレス可能な複数の刺激チャンネルを利用した。そのため、これらの実験は被験者内コントロールでデザインされた。ChR2欠損マウスの対照コホートではベースラインの摂餌量が少なかったが、これは体重の個体差62と試験時期の違い63によるもので、これらの研究の被験者内デザイン64では考慮されていなかった。
脳および腸移植マウスの運動アッセイ
脳、腸、または腸-脳二重移植とニューロスタックの組み合わせが運動量に影響を及ぼすかどうかを調べるため、20分間の運動行動を評価した。ナイーブマウス(未手術)とNeuroStackを装着したマウスを用い、脳移植ではオープンチャンバー(60×30×30cm3)で、腸移植および腸脳二重移植ではホームケージ内で、20分間にわたってオープンフィールド試験を行った。運動活性はRTPPアッセイで説明したように記録した。マウスの位置、移動距離、速度を算出した。
腸および腸-脳移植マウスの摂餌量および摂水量
動物は特注のPhenoMaster行動表現型システム（TSE Systems）に個別に収容した。PhenoMasterは光サイクル（3時点灯、15時消灯）、温度（22℃）、湿度（50％）を自動的に維持するようにプログラムされていた（ソフトウェアv.7.3.3）。動物には標準的なマウス用餌（Purina, 5001）と逆浸透水を自由摂取させた。フードホッパーと水筒には重量センサー（TSE）を取り付け、5秒ごとに0.01g単位で自動サンプリングした。食物と水の重量測定には、15gの閾値で15秒の平滑化間隔を使用した。摂取量は5秒ごとに測定した。データは、食物摂取量と水分摂取量の両方について単調増加関数のみを許容することで、わずかな変動を補正した：負の食物摂取量を表す値は、最新の値で置き換えた。摂取量測定の安定性のため、各個体のマウスについて連続する2日間の平均摂餌量と摂水量を算出した。
異物反応の免疫組織化学的評価
マイクロエレクトロニックブレインファイバーまたは市販のシリカ導波管（300μm、FT300UMT Thorlabs）をVTAに両側植え込んだ野生型マウス（各群n＝5）をイソフルランで麻酔し、Fatal-Plus（100mg kg-1）を腹腔内注射し、50mlの氷冷PBS、続いて50mlの氷冷PBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）で経心灌流した。装置を慎重に摘出し、脳を取り出し、さらにPBS中4％PFAで4℃、24時間固定し、その後PBS中で保存した。ビブラトーム（Leica, VT1000S）と剃刀（Electron Microscopy Sciences, 72002）を用いて、氷冷PBS中で冠状スライス（厚さ50μm）を作製した。スライスをPBS中、4℃、暗所で染色まで保存した。スライスを0.3% v/v Triton X-100で透過処理し、PBS中2.5%ロバ血清で30分間ブロックした。スライスをPBS中の2.5%ロバ血清と一次抗体（Iba1: Goat anti-Iba1, ab107159 Abcam, 1:500希釈; GFAP： GFAP: Goat anti-GFAP, ab53554 Abcam, 1:1,000希釈）。インキュベーション後、スライスをPBSで3回洗浄した。その後、スライスを二次抗体（Donkey anti-Goat Alexa Fluor 488, A11055, 1:1,000、Thermofisher）と室温で2時間、振とう器でインキュベートし、さらにPBSで3回洗浄した。その後、スライスをDAPI（4′6-diamidino-2-phenylindole）（1:50,000）でさらに20分間インキュベートし、PBSで3回洗浄した。Fluoromount-G（SouthernBiotech社製）を用いてスライスをスライドガラスにマウントした。レーザー走査型共焦点顕微鏡（Fluoview FV1000、Olympus）を用い、20倍の対物レンズで、スライス厚を横切るz-スタック画像を撮影した。関心領域はインプラントの位置に基づいて選択し、インプラントの痕跡周辺の免疫反応を画像化した。FIJI（ImageJ 1.53g）を用いて、免疫反応を画像取得領域で正規化した積算蛍光強度として定量化した。
ヘマトキシリン・エオジン染色による異物反応の評価
十二指腸インプラントを移植していない野生型マウス（n = 4）および移植したマウス（n = 4）の十二指腸組織をスライスし、Duke病理組織学研究室によりヘマトキシリン・エオジン染色で評価した。絨毛の高さと陰窩の深さは、ImageJ 2 (1.5.3)を用いて測定した。各マウスについて、絨毛の高さと陰窩の深さは10個の絨毛または陰窩の平均値として計算した。
統計と再現性
OriginPro2021b、JMP Pro 15、JMP Pro 16のいずれかを用いて、本研究の全ての比較試験の統計的有意性を評価した。免疫組織化学と行動検査のサンプルサイズを決定するための検出力分析は行わず、代わりに同じ脳回路または腸領域で行われた過去の研究に基づいてグループサイズを選択した。これにより、われわれの結果を先行研究と直接比較することが可能となった。繊維の特徴に関する統計解析では、一元配置変動分析（ANOVA）とTukeyのポストホック比較検定を用い、閾値はP < 0.05、**P < 0.01、**P < 0.001とした。免疫組織化学分析、行動アッセイ、低体温効果の定量化における2群間の比較にはt検定を用い、有意閾値はP < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001とした。すべてのパラメトリック検定において、正規性はShapiro-Wilk法を用いて決定した。分散の均質性は、適切な場合にはLeveneの検定を用いて決定した。脳組織の共焦点顕微鏡写真は、結果の再現性を確認するため、1脳につき少なくとも3スライス収集した。研究に含まれる各オプシン発現マウスにおいて、適切な蛍光色素を評価した。結果の再現性を確認するため、1匹につき少なくとも3つの組織サンプルについて腸組織の顕微鏡写真を収集した。繊維断面の顕微鏡写真は、再現性を確認するために、ドローの無作為に選んだ5つの領域から収集した。その他、代表例としてプリフォーム、繊維束、最終デバイス、移植動物のデジタル写真を1回ずつ収集した。
報告概要
研究デザインに関する詳細は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの入手可能性
ソースデータは本論文とともに提供される。
コードの入手可能性
本研究で使用したカスタムソフトウェアスクリプト、マイクロコントローラのファームウェアコード、NRF52840開発キットのファームウェアコードは、https://github.com/HarrisonAllen/Wireless-Controllers-for-Microelectronic-Fibers。
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謝辞
プラスミドを提供してくれたK. Deisserothに感謝する。本研究の一部は、McGovern Institute for Brain ResearchのHock E. Tan and K. Lisa Yang Center for Autism ResearchおよびK. Lisa Yang Brain-Body Center、National Institute of Neurological Disorders and Stroke（助成金番号R01-NS115025-01A1、P.A.）、National Institutes of Health and National Center for Complementary and Integrative Health（助成金番号DP1-AT011991、P.A.）、National Science Foundation（NS）（助成金番号DP1-AT011991、P.A.）の助成を受けた。 助成金番号DP1-AT011991、P.A.）、全米科学財団（NSF）材料科学・工学センター（助成金番号DMR-1419807、P.A.およびY.F.）、NSF神経技術センター（助成金番号EEC-1028725、P.A.）、全米補完統合医療センター（助成金番号R21-AT010818、P.A.）。R21-AT010818、D.V.B.）、国立精神衛生研究所（助成金番号DP2-MH122402、D.V.B.）、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所（助成金番号R01-DK131112、D.V.B.）。A.S.はLore Harp McGovern Fellowshipの受賞者である。L.E.R.はHartwell Biomedical Research Fellowshipおよび助成金No. F32-DK127727。S.O.はMathWorks Engineering FellowshipおよびSchmidt Science Fellows Programを受けた。M.-J.A.はFriends of McGovern Graduate Fellowshipの奨学生である。A.T.はPaul and Daisy Soros Fellowshipに感謝する。A.T.とI.C.G.はNSF Graduate Research Fellowshipの受給者。J.P.はKwanjeong Educational Foundationからの奨学金受給者。T.T.は日本電気株式会社からの支援を受けている。G.L.、T.K.、Y.F.はさらに、契約番号W911NF-13-D-000のInstitute for Soldier Nanotechnologiesを通じた米国陸軍研究所および米国陸軍研究局、契約番号NA18OAR4170105のMITシーグラント、契約番号SA21-03の国防総省を通じた国防脅威削減庁の支援を受けた。
著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Atharva Sahasrabudhe、Laura E. Rupprecht、Sirma Orguc、Tural Khudiyev。
著者および所属
マサチューセッツ工科大学化学部（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ
アタルヴァ・サハスラブデ
マサチューセッツ工科大学エレクトロニクス研究所（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ
Atharva Sahasrabudhe、Tural Khudiyev、Tomo Tanaka、Weikun Zhu、Anthony Tabet、Marie Manthey、Marc-Joseph Antonini、Dekel Rosenfeld、Jimin Park、Indie C. Garwood、Wei Yan、Farnaz Niroui、Yoel Fink & Polina Anikeeva
マクガバン脳研究所、マサチューセッツ工科大学、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ
Atharva Sahasrabudhe、Anthony Tabet、Marie Manthey、Marc-Joseph Antonini、Dekel Rosenfeld、Jimin Park、Indie C. Garwood、Polina Anikeeva。
米国ノースカロライナ州ダーラム、デューク大学、腸脳神経生物学研究室
ローラ・E・ルプレヒト＆ディエゴ・V・ボホルケス
米国ノースカロライナ州ダーラム、デューク大学医学部
ローラ・E・ルプレヒト＆ディエゴ・V・ボホルケス
マサチューセッツ工科大学電気工学・コンピューターサイエンス学科（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ
Sirma Orguc、Joanna Sands、Harrison Allen、Farnaz Niroui & Anantha Chandrakasan
マサチューセッツ工科大学医用工学・科学研究所（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ
シルマ・オルグック
日本電気株式会社 セキュアシステムプラットフォーム研究所（日本、川崎
田中 友
マサチューセッツ工科大学化学工学科（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ
朱偉勲、アンソニー・タベット、ヨエル・フィンク
マサチューセッツ工科大学材料科学・工学部（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ
ガブリエル・ロケ、ジミン・パク、ポリーナ・アニキーワ
ハーバード／MIT健康科学技術大学院プログラム（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ
マーク＝ジョセフ・アントニーニ、インディー・C・ガーウッド
マサチューセッツ工科大学ソルジャー・ナノテクノロジー研究所（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ
ヨエル・フィンク
米国ノースカロライナ州ダーラム、デューク大学神経生物学部
ディエゴ・V・ボホルケス
デューク大学脳科学研究所（米国ノースカロライナ州ダーラム
ディエゴ・V・ボホルケス
マサチューセッツ工科大学脳認知科学部（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ
ポリーナ・アニキーワ
貢献
A.S.、L.E.R.、P.A.がすべての実験をデザインし、結果を分析した。L.E.R.は、D.V.B.S.O.の助言を得ながら、腸の手術、迷走神経カフの記録、組織学用の組織採取、動物行動実験を最適化し、実施した、 A.S.とT.K.は、Y.F.とP.A.の助言を得ながら、熱延伸プロセスを用いて多機能脳・腸ファイバーを作製した。A.S.とM.M.は、L.E.R.とP.A.の助言を得ながら、口腔後スクロースセンシングの神経エンコーディングに関する実験を行った。 T.T.は、ファイバーの特性評価とデバイス製造ステップの最適化を支援した。A.S.とA.T.は経心筋灌流を行った。M.-J.A.は電気生理学データ解析コードの作成と最適化を行った。A.S.、D.R.、J.P.およびM.-J.A.は、ファイバーを移植した脳組織の免疫組織化学分析を行った。I.C.G.は脳低体温実験のデザインに協力した。W.Y.は曲げ剛性測定を手伝った。A.S.は図の作成を主導し、L.E.R.、S.O.、T.K.、G.L.、S.Z.の貢献と全著者の洞察があった。全著者が論文執筆に貢献した。
筆者
Polina Anikeevaまで。
倫理申告
競合利益
P.A.、A.S.、T.K.、L.E.R.およびD.V.B.は、脳および腸線維の設計に関する米国特許出願（63/279,860）の共著者である。T.T.は日本電気株式会社の支援を受けている。A.C.はアナログ・デバイセズ社の取締役。M.-J.A.およびP.A.は、研究および臨床応用のための多機能ファイバーの開発に焦点を当てたバイオテクノロジー企業であるニューロバイオニクス社（NeuroBionics Inc.）と金銭的利害関係がある。残りの著者は、競合する利害関係はないと宣言している。
査読
査読情報
Nature Biotechnology誌は、Bozhi Tian氏、および本論文の査読に貢献した他の匿名の査読者に感謝する。
追加情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っている。
補足情報
補足情報
補足方法、注1-6、図1-34、表1、動画1-7のキャプション、参考文献。
報告概要
補足ビデオ1
熱延伸を用いたスケーラブルファイバー製造プロセスの代表的なビデオで、金属相互接続がプリフォームに収束する様子を示す。
補足ビデオ2
独立したアドレス指定可能な青色および緑色µLEDと、ブレインファイバーにおける刺激周波数のプログラム可能な制御。
補足ビデオ3
独立したアドレス指定が可能な青色および緑色μLEDと、腸ファイバーにおける刺激周波数のプログラム可能な制御。
補足ビデオ4
脳および腸ファイバーにおける独立したアドレス指定可能なマルチカラーµLED。異なる解剖学的領域に植え込まれた複数のデバイスを同時に制御する能力を強調している。
補足ビデオ5
腹側被蓋野にマイクロエレクトロニックブレインファイバーを埋め込み、オープンフィールドチャンバー内でNeuroStackモジュールを搭載したマウスの代表的なビデオ。
補足ビデオ6
NeuroStackモジュールを搭載した腸管ファイバーを移植したPhox2b::ChR2マウスのペアがホームケージ内を歩行する代表的なビデオ。
補足ビデオ7
回腸にマイクロエレクトロニクス腸管ファイバーを慢性的に植え込み、NeuroStackに接続したPyy::ChR2マウスが、ホームケージ内で高脂肪溶液を飲んでいる代表的なビデオ。
補足データ1
統計元データ。
補足データ3
統計的出典データ。
補足データ4
統計資料
補足データ5
統計資料
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統計資料
補足データ7
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補足データ8
統計資料
補足データ9
統計資料
補足データ10
統計資料
補足データ11
統計資料
補足データ14
統計資料
補足データ15
統計資料
補足データ16
統計資料
補足データ17
統計資料
補足データ21
統計資料
補足データ22
統計資料。
補足データ23
統計資料
補足データ24
統計資料
補足データ25
統計資料
補足データ26
統計資料
補足データ30
統計資料
補足データ32
統計資料
補足データ33
統計資料
補足データ34
統計資料。
出典データ
ソースデータ Fig.
統計的ソースデータ。
ソースデータ Fig.
統計的ソースデータ。
ソースデータ Fig.
統計的ソースデータ。
ソースデータ Fig.
統計的ソースデータ。
ソースデータ Fig.
統計資料
権利と許可
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転載と許可
この記事について
この記事の引用
Sahasrabudhe, A., Rupprecht, L.E., Orguc, S. et al. 多機能マイクロエレクトロニックファイバーは、腸と脳の神経回路のワイヤレス変調を可能にする。Nat Biotechnol (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-023-01833-5
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2021年12月22日受領
受理2023年5月23日
2023年6月22日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41587-023-01833-5
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