スウェーデンの飲料水における細菌組成から、3つの主要な相互作用するユビキタスメタコミュニティが発見される

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スウェーデンの飲料水における細菌組成から、3つの主要な相互作用するユビキタスメタコミュニティが発見される

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mbo3.1320

Björn Brindefalk, Harald Brolin, Melle Säve-Söderbergh, Edvin Karlsson, David Sundell, Per Wikström, Karin Jacobsson, Jonas Toljander, Per Stenberg, Andreas Sjödin, Rikard Dryselius, Mats Forsman, Jon Ahlinder
https://doi.org/10.1002/mbo3.1320
について
セクション

グラフの概要
飲料水の原水として使用されているスウェーデンの淡水域6カ所において、数年にわたり微生物群集の組成を調査した。これらのメタコミュニティは、環境要因への応答や代謝能力が異なり、生物学的相互作用が北方温帯地域の水域における微生物発生の重要なドライバーである可能性を示すユニークな知見を提供した。この結果は、これらのバイオームにおける微生物の生態に関する知識を深め、その延長線上で飲料水源のモニタリング手法の改善をもたらす可能性がある。
概要
背景
飲料水製造のための水源として使用される地表原水は、汚染に対して敏感な重要な資源である。我々は、スウェーデンの原水源を対象に、相互に共存するメタコミュニティと、そのようなパターンを生み出す環境因子を特定することを目的とした研究を実施した。
研究方法
水源は、栄養成分、水質、気候の特徴が異なり、人為的な影響の程度もさまざまである。6つの浄水場で3年間にわたり、合計230サンプルの水入口サンプルを収集した。16SメタバーコーディングによりDNA配列が決定されたサンプル（n = 175）の細菌群集を、分類群の存在量に関する共同モデルを用いて解析した。
結果
微生物のメタコミュニティは、2つの主要なグループに加え、分類学的に多様な第3のグループも同定された。これらの3つのメタコミュニティは、測定された環境データに対して様々な関連性を示した。明確なメタコミュニティーの予測では、好まれる代謝経路や生活戦略が異なることがわかった。ある群集では、メタン生成代謝を行う分類群が多く、別の群集では、炭水化物や脂質に特化した代謝を行う分類群が優勢であった。
結論
淡水域に生息するユビキタスで持続的な共起性のある細菌メタコミュニティを同定することで、淡水域の汚染問題の微生物源追跡解析を促進できる可能性があります。
1 はじめに
清潔な水にアクセスすることは、公衆衛生にとって世界的に重要であり、機能的な社会を維持するための重要な要素である。都市化の進展と気候変動によって生じる将来の課題は、淡水の水質を低下させ、粒子や栄養負荷の増加、糞便汚染の発生をもたらすと予想されています（Arnell et al.、2015；Howard et al.、2016；Vörösmarty et al.、2000）。より優れた、より低コストで容易に利用できるシーケンス機能により、最近のいくつかの研究では、流域の細菌組成に対する人為的な影響を評価できるようになりました（Hägglund et al., 2018; Llirós et al., 2014; Newton & McLellan, 2015; Shen et al., 2019）。これらの研究は、人為的な行為が富栄養-貧栄養勾配に沿った細菌多様性に明確な影響を与えることを示しています。富栄養化は、微生物群集組成を乱し、炭素および栄養循環を変化させ、その結果、水生生態系全体を変化させます（Kiersztyn et al., 2019; Newton & McLellan, 2015; Nyirabuhoro et al., 2020; Zeng et al., 2019）。微生物の多様性と機能に対する人為的活動の影響については、長期的な縦断的研究はほとんど行われておらず、コミュニティレベルでの生物多様性の季節的・経年的変化に関する知識を増やす必要性が強調されている。原核生物の多くは、大型の生物と比較して回転率が高いため、微生物群集の長期的なトレンドは特に興味深い。
温帯地域の飲料水源として特に重要な北方湖における細菌群集組成の研究の多くは、細菌群集構造を形成する要因や群集内の相関関係の可能性を推測することに焦点を当てている。これらの研究は、北欧諸国の水域（Eiler & Bertilsson, 2007; Eiler et al., 2012, 2013; Peura et al., 2012）や、米国北部の淡水沼湖（Linz et al., 2017）、カナダ・ケベックの北方湖（Chaib et al., 2018; Niño-García et al., 2017）、ヨーロッパ各地の湖や池（Bock et al., 2020）などの類似環境において記述されています。Eilerら（2012）は、スウェーデン東部に位置するErken湖の細菌プランクトン群集の時間的動態を調査し、群集構造を形成するための生物学的相互作用（直接競合/相互作用だけでなく、より直接的ではない相互作用など）の重要性を示す、年周期の時間軌道と群集内の複雑な相互依存性を発見した。
しかし、Langenheder and Lindström (2019)が指摘するように、前述の研究の限界は、単一の湖の長い時系列、または多くの湖の単一/少数の時点を対象にしていることである。したがって、多様性の複雑な関連性、コミュニティ内およびコミュニティ間の相互作用、環境および人為的要因の影響を理解し、微生物組成および生態の一般的な支配原理を理解するためには、複数の湖で収集された縦断データのさらなる研究が保証されている。水の安全管理の観点からは、外的要因による真の摂動は、そのような研究結果を採用することで、より容易に識別でき、自然の変動と区別することができるため、群集の変動をより明確にするための大規模な長期研究が必要である。また、組成の外部人為的変化から自然変動を識別することは、微生物源追跡性能を大幅に改善することになる（Hägglund et al.、2018；Read et al.、2015）。
本研究では、スウェーデンの6つの原水源を3年間サンプリングしました。水源は、人為的な影響を受けた水域と、より乱されていない水域の両方を含む多様な環境を表しています。本研究では、数年のタイムスケールにわたって微生物群集の組成と推定される代謝能力を記述し、人為的擾乱に関連する要因が現在の微生物の多様性、相互作用、能力を形成するかどうか、また影響を受けた水と自然のままの水の間でこれらのパターンに違いが見られるかどうかを評価することを目的としています。本研究の縦断的デザインは、人為的擾乱や気象・場所的要因によって誘発される他の変動源を同時に考慮しながら、微細な生物間相互作用を推察するユニークな機会を与えてくれた。
2 実験手順
サンプリング地点の選定-化学的・物理的特性
サンプリング地点は、2000年から2011年にかけてモニタリングされた200の地表生飲料水源から選択された。モニタリング期間中、COD-Mn（Method Fd. SS 02 81 18）、色度、濁度、22℃における培養可能微生物数（ISO6222）を測定しました。モデリングに含めるために選択されたパラメータのうち、風、温度、雨量は気象学的要因を表し、濁度や色彩値は水の物理的特性を表しています。また、直接的な生物学的要因として「培養可能コロニー形成単位（CFU）」が含まれています。さらに、各サンプリング前の1週間の平均気温と降水量を算出した。200カ所のサンプリング地点から、より詳細な調査のために6カ所の水源が選ばれました。これは、スウェーデンの南部と中部にある湖と流水の両方で、小さな湖からスウェーデンの平均流量の最大の川まで、幅広い規模のものが選ばれました。選ばれた淡水源は、ストックホルム、エステルサンド、モタラ、ボロース、ヘルノサンド（湖）、トロールヘッタン（川）の地域に位置しています。6つのサンプリング地点の流入源となる流域は、ほぼ原始的な森林地帯の北方湖と、大規模な農業、都市部、工業開発の影響を受けた人為的影響の大きい流域を含む、多様な土地利用を補完しています（図1a、bおよび表1）。サイトを特徴付けるために、大腸菌群、大腸菌、腸球菌、クロストリジウム・パーフリンゲンス、体細胞コリファージを含む、より広範な水質指標の追加セットをより長期にわたって測定しました（Hägglund et al., 2018）。
表1. 各流域の面積（平方キロメートル）および国土面積の分類割合
LocationSize (km2)WaterUrbanForestWetlandOpenMountainBorås4555.422.3056.470.0035.810.00Härnösand2833.740.2084.620.0011.440.00Motala656134.161. 1639.681.1323.880.00Östersund11,40112.810.2656.675.853.7720.64Stockholm22,55010.401.9853.870.4533.310.00Trollhättan40,05521.030.4955.012.1320.970.38
図1
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サンプル採取、DNA抽出、ライブラリー構築、塩基配列決定
原水サンプルは、6つの飲料水処理施設（DWTP）のインレットから収集した。2013年9月から2015年8月の間に、合計230の原水サンプルが収集され、そのうち175がDNA配列決定のために選択された。DNA は、16S rRNA 遺伝子の超可変 V4 領域に特異的な細菌/古細菌プライマー 515 F/806 R を用いて増幅した (Caporaso et al., 2012). 得られたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アンプリコンは、300bpと500bpのペアエンドキットを組み合わせて、Illumina MiSeqプラットフォームで配列決定した。サンプリング手順、DNA抽出、およびシーケンシングは、Hägglundら（2018）に記載され、実行された。
配列決定データのバイオインフォマティクス解析
配列は、deMLソフトウェア（Renaud et al.、2015）を用いてデマルチプレックスされた。リードは、DADA2（Callahan et al., 2016, 2017）を用いて品質フィルタリングおよびノイズ除去した。filterAndTrim」、「learnErrors」、「dada」関数を8つのアンプリコンシーケンスデータセットのそれぞれで実行し、シーケンスランの不均一性を説明できるように、各セットに特化してエラーモデルをトレーニングしました。リード長切り捨てパラメータは、各シーケンスランのPhred quality score plotに基づいて決定し、フォワードリードでは140から180の間、リバースリードでは120から135の間で変化させた。maxEEパラメータはデフォルト（すなわち、2.0に等しい）に設定されました。リードは、品質スコアが11以下の最初のインスタンスで切り捨てられた（すなわち、truncQ）。キメラはremoveBimeraDenovo関数でコンセンサス法に基づいて除去された。品質フィルタリングの結果、68.7%のリードが保持された。サンプルのシーケンスには2種類のIllumina MiSeq試薬キットが使用されたため、リードはリード長が最も短いキットに合わせて切り捨てる必要がありましたが、最終的な配列長はペアエンドリードをうまく重ねるのに十分な長さでした（15～60 bpの重なりの間）。2×SD（242、263bp）より短い、または長いリードは削除され、王国レベルで分類されていないアンプリコン配列バリアント（ASV）も削除されました。この刈り込みにより、ASVの数は40,175から40,012に減少しました。その後、真核生物（ミトコンドリアと葉緑体）の配列を削除した結果、ASVの数は39,081に減少した（リードの総数も20,269,784に減少）。リード数の最大値は433,918、最小値は27,958で、平均リード数は124,865であった（表A3）。
統計解析と可視化
人為的に撹乱された環境と原始的な環境に対応する2つのパーティションへの水サンプルとサイトのクラスタリングは、9つの水質指標を用いて230サンプルの拡張セットに対して行われました： CODMn（化学的酸素要求量）、色価、濁度、大腸菌群、大腸菌、腸球菌、22℃の培養菌、C. perfringens、体性コリファージです。サンプルは、k-means教師なしクラスタリングとRの主成分分析（PCA）の両方を用いて、尺度変数（すなわち、すべての指標データを平均が0、変動が1となるように変換したもの）、両方の分析でデフォルトのパラメータ値を使って、いずれかの環境に割り当てられた。サイトレベルでは、（サンプルの割合の）50％カットオフで、それぞれの環境におけるメンバーシップを決定した。細菌コミュニティの分類学的組成は、phyloseq Rパッケージ（McMurdie & Holmes, 2013）を使用して分析および可視化した。環境データとアルファ多様性の可視化と統計計算は、Rパッケージ（microbiomeseq v. 0.1 https://github.com/umerijaz/microbiomeSeq/）とPhylosmith Rパッケージ（phylosmith v. 1.0.6 https://schuyler-smith.github.io/phylosmith/）を用いて実行した。環境データとサイトごとのアルファ多様性の両方の分布間の平均値の違いを推測するために、分散分析を行い、0.05より低いp値を示す比較を行った。また、MicroViz R-package (Barnett et al., 2021)を用いて、中央対数変換した値を用いてPCAを行い、群集間の差異を可視化した。上位200（すなわち、最も数が多い200）のASVの系統樹を推論するために、標準設定とヌクレオチド置換率不均一性のGTRCAT近似を用いたRaxML version 8.2.X (Stamatakis, 2014) を使用した。系統樹はRのggtreeパッケージ（Yu et al., 2017）を用いて可視化し、ヒートマップはRパッケージheatmaply（Galili et al., 2018）のggheatmap関数を用いて可視化した。メタコミュニティ分布の系統的シグナルの検出は、Borgesら（2019）が発表したデルタ統計法を用い、Rのデルタ関数のデフォルト設定と、形質と系統の間にシグナルがないという帰無仮説の下でのデルタの分布を作成する1000回の並べ替えで行った。
分類群間の相互作用の多変量一般化線形モデリング
コミュニティとその中の生物学的相互作用に対する環境予測因子の効果を調べるために、gllvm Rパッケージ（Niku et al., 2019）を通して多変量一般化線形潜在変数モデル（GLLVM）をコミュニティデータに適合させた。予測因子に対する存在量の応答を分類群間の相関と共同でモデル化することで、潜在変数を介して相関構造を明示的にモデル化することで、2つを分離する可能性を持つ。そうすることで、環境予測因子の効果と残留相関の両方を共同で推定することができる（Caradima et al., 2019; Ovaskainen et al., 2017; Warton et al., 2015）。ASV豊度行列を応答変数とし、再スケーリングしてセンタリングした平均気温、濁度、COD-Mn、Color値を連続予測因子とし、水場の場所とサンプリングの季節をグループレベル予測因子として、以下のように使用した：
◂f()▸=◂+▸,(1)
g()は予測因子の線形関数の平均を定義する対数リンク関数、mijはサンプルi（i = 1...163）のj番目のASV存在量、β0iはASV j（j=1...）に対するサンプルiの合計サンプル配列存在量の効果。 200、存在量の上位ASVのみが含まれるため）、β1iはサンプルiの平均気温（サンプリング1週間前）のASV jに対する影響、β2iはサンプルiの濁度のASV jに対する影響、β3iはサンプルiのCOD-MnのASV jに対する影響、β4iはサンプルiの色値のASV jに対する影響、β5jkはサンプリングサイトk（k＝1...? 6）がASV jに与える影響、β6jlがj番目のASVに与える季節l（l＝1...4）の影響である。潜在（未観測）変数zjkは、残差共分散構造を説明するために含まれている。GLLVM分析に関するさらなる情報は、付録A（「材料と方法」セクションを参照）に記載されている。共線性をチェックするために、予測変数間の相関をRのbase cor関数を使って推定した：結果は付録Aおよび図A13に記載されている。
コミュニティ代謝パスウェイの再構築
GLLVM解析で得られた3つの定義されたメタコミュニティのASVデータから代謝能力を再構築するために、PICRUSt2 v.2.3.0-b (Douglas et al., 2020) を、最も豊富な上位200分類群および各ASVに対応する代表配列の未希釈ASV-テーブルデータで標準設定を使用して実行しました。このとき、DESeq．2 (Love et al., 2014) Rパッケージを使用して、差次的に豊富なKEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) オルソログとBioCycパスウェイを検出しました。データセット中のゼロを処理するために、各データポイントに+1の擬似カウントを追加し、結果はスキューを減らすために分散安定化変換にかけられた（Anders & Huber, 2010; Huber et al., 2003; Tibshirani, 1988）。
集水域における土地利用状況の分析
各サンプルポイントの集水域は、Swedish Meteorological and Hydrological Instituteから入手したデータに基づいている。各集水域の土地被覆または土地利用は、Copernicus (https://land.copernicus.eu/pan-european/corine-land-cover) のCORINE Land Coverデータを用いて推定した。土地被覆の種類は、水面、開けた地面、沼地、山、森林、市街地の6つのカテゴリーに分類された。
3 結果
集水域と土地利用の多様性を表す選択されたサイト（表1および図1a,b）における水特性の違いを詳細に調査するため、2013年から2015年にかけて合計230個のサンプルを収集した。すべてのサンプルは、水質（すなわち、CODMn、色価、濁度、22℃での培養可能微生物、大腸菌、C. perfringens、腸球菌、大腸菌群、体細胞コリファージ）を分析し、175サンプルのサブセットは、生物、気象、物理特性を含む幅広い表現で16Sアンプリコン配列決定（Hägglund et al, 2018）にかけられた（図1C）。様々な因子は、サンプルサイト間とサンプルサイト内の両方で、異なる程度の変動を示し、色彩値はサイト間の変動が最も大きく、温度はサイト内の差が最も大きいことを示しました。ストックホルムとトロールヘッタンでは平均濁度が他の地点より有意に高く、ボロースとヘルノサンドでは平均色彩値が有意に高かった。また、Trollhättanのサンプルは、22℃での培養可能なバクテリアのレベルが他のサイトよりも高いことが示されました。
全230サンプルの水質データを2つのパーティション（人為的な影響を受けた環境と影響を受けていない/原始的な環境）に割り当てたところ、Motala、Östersund、Härnösandの全サンプルはそれぞれ94%、80%、60%が影響を受けていないグループに割り当てられ、Trollhättan、Borås、Stockholmのサンプルは100%、85%、62%が人為的影響を受けたグループに割り当てられました（図 A1a）。パーティションで最も重要な指標は大腸菌で、パーティション間の平均差は1.56、CODMnと色価は平均差0.90と0.86で最も識別力が低い。他の指標はすべて1.23-1.29の差で中間的な識別性を持っていた（図A1b）。この結果はPCAでも支持された（図A1c）。指標データで説明される変動の割合が最も高い最初のPC（41%）は、サイトの同様のパーティショニングを示したが、他の成分の説明量はかなり少なかった（PC2、PC3、PC4でそれぞれ17%、10%、10%）からだ。いくつかの標準的な多様性指標によって測定された、各サイトの原水の全体的な細菌多様性（図A1）を比較すると、MotalaとHärnösandは最も低い多様性を示したが、その差はMotalaでのみ有意であった。Härnösandの多様性が低いのは、この水が他の採取地点と比べて生物学的に乖離した環境であり、北方湖に典型的な腐植質が多いためと思われます。一方、Motalaはスウェーデンで2番目に大きな湖であるVättern湖から水を得ており、水質指標は概して良好（すなわち、貧栄養、低温、栄養不良、酸素過剰）であり、利用可能な微生物ニッチが少ない環境を反映しています。他の大きな水源（ストックホルムとエステルサンド、それぞれMälaren湖とStorsjön湖）からの水は、表面積と体積がはるかに大きいため、より安定した環境を示す反応時間が遅くなり、変動性が低くなりました。予想通り、多様性は夏にピークを迎え、冬に最も低くなった（図A2）。
すべてのサンプルサイトにおいて、微生物群集は3つのフィラに支配されていた（図2およびA3）。これは、淡水湖から採取された水によく見られ、スウェーデンの水に関する過去の調査（Eiler et al.） アクチノバクテリア、バクテロイデーテス、プロテオバクテリア（淡水LD12クレードに属するPelagibacteralesのα-プロテオバクテリアが大部分）は全分類群の約80％～90％を占めていたが、サイトによってあまり多くない分類群が存在するため、ばらつきが見られた。HärnösandとÖstersundの北側のサンプリングサイトでは、アクチノバクテリアがわずかに多く、ÖstersundではChloroflexiが他の水域に比べて多く見られた。注目すべきは、Motalaで唯一、いくつかのサンプルでシアノバクテリアの数が多く、おそらく毎年のブルームイベントに対応していることである（図A3）。
図2
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微生物組成の上位200分類群（図2b）の季節変動についても、一般的な傾向が観察され、放線菌分画は秋にピークを示し、プロテオバクテリア分画は冬から春の季節にピークを示しました。さらに、PlanctomycetesとChloroflexiの大きなフラクションは秋冬の季節に存在し、ActinobacteriaとVerrucomicrobiaは主に夏・秋の季節に関連しているようだ。
未分類の配列は、地理的・時間的に程度の差はあれ、すべての水域に存在し、スウェーデンの淡水にはまだ未解明の多様性があることが指摘された。
相対存在量の多い上位200分類群についてPCA（中心対数変換データ）分析を行ったところ（図3c）、どの分類群が最も相対存在量が多いかという点で、Härnösand（さらにMotala）が最も乖離しており、ストックホルムは最も中央のサンプリング地点であることがわかった。
全体として、すべてのサンプルの少なくとも90%に存在する分類群の相対的存在量は、すべてのサンプルでかなり均等な分布を示す多くの既知の一般的な淡水生物群から構成され、最も多い分類群は様々な放線菌とその他の放線菌であるが、個々のサンプルで全分数の約0.5%を超える分類群はなかった（図A4). さらに、よく知られているいくつかの淡水細菌は低いフラクションで検出されたが、広く分布するα-proteobacterial LD12クレード、Sediminibacterium、Polynucleobacter、その他のBurkholderiales、Bacteroidetes門とVerrucomicrobia門のサブセクション3の未確認メンバー、β-proteobacterial Family Comamonadaceaeのいくつかのメンバーなどサンプル間でほとんど変化がなかった。また、Fluviicola属、Terrimicrobium属、Blastopirellula属、Anaerolineaceae属、Rhodoferax属、Acidovorax属、Rhodocydaceae属、Alcaligenaceae属、Flavobacterium属、Shingorhabdus属など、一部のサンプルで比較的高い存在度を示したものの、散在的に分布した分類もある。
原水集団の一般的な多様性分析をまとめると、サイト間、季節間、水質パラメーター間、配列分類学間の複雑な変動パターンが確認されました。このような複雑な変動が観察されたことから、異なる変動源を分離するために、さらなるモデル化が必要であることが示唆された。
モデル解析により、3つの異なる豊富なメタコミュニティが明らかになった
細菌群集が生息環境の特徴に反応し、ASV間の相互作用の兆候を示すかどうかを調べるため、ASV出現データにGLLVMを当てはめ、濁度、色価、気温、COD-Mnを共変数、場所と季節を因子レベルの予測変数としてモデルに組み込みました。総存在量の上位200のASVのみが含まれ、場所間でASVが高度に共有されている（すなわち、少なくとも90%のサンプルに存在し、読み取り値の少なくとも0.1%の存在量）（図A5）。最も一般的な分類群の選択と、比較的に稀な分類群の除外は、これらが生物学的に重要な種を表していると考えられ、データ中のノイズ（検出限界に近い、PCRによるバイアス、データベースの不完全性など）と、シーケンスの深さに技術的限界があるすべてのシーケンス解析に固有の構成性の問題（Alteioら、2021）の両方の影響を受けにくいことから行われました。95％信頼区間を伴うすべての推論された関連は、10.5281/zenodo.7066483で利用可能な表S1に提供されている。モデルにすべての予測因子を含めると、全変動の41％が解析で説明され、予測因子で調整した後に推測されるASV相関から結論を導き出すことがより可能になります（図A6）。モデルの推定因子負荷量を調べると、ASVの存在量の変動を最も説明するASVは、ProteobacteriaとBacteroidetesという植物門に割り当てられました（図A7）。変数の重要度分析が行われ、地理的位置の効果が（含まれる予測因子の中で）組成に最も影響することが判明した（表A1）。
GLLVM解析の結果に基づく潜在的な生物学的相互作用は、ASV間の推定相関を評価することで分析した。階層的クラスタリングにより、3つの異なるメタコミュニティが同定された（図3a）。第1メタコミュニティは、コミュニティ内（r1 = 0.056 [0.196]）とコミュニティ間の平均相関に明確なパターンを示さなかった（結果は示さず）が、第2と第3メタコミュニティは、コミュニティ内で強い正の相関（相互主義；r2 = 0.330 [0.201], r3 = 0.499 [0.205] ）、コミュニティ間で負の相関（r2,3 = -0.249 [0.174] ）示した。3つのメタコミュニティは、門レベルで異なる分類学的所属を持つメンバーで構成されていた（図2b、A8）。メタコミュニティ1と2は多様性が高く、データセットに存在するほとんどの門が表現されていたが、いずれの場合も放線菌とタンパク質が優勢で、バクテロイデーテスはメタコミュニティ1ではかなりの割合を占めていたが、メタコミュニティ2ではほとんど存在量が少なかった。メタコミュニティ3は、他の2つのコミュニティとは対照的に、ほぼBacteroidetesとProteobacteriaのみで構成され、門レベルでは低い多様性を示した。コミュニティ1がデータセットの一般的な多様性をほぼ反映していたのとは対照的に、コミュニティ2と3は特定の条件に関連する分類群からなり、相互に排他的でユニークな生物から構成されている。注目すべきは、同じメタコミュニティに属するメンバーは、系統樹においてクラスタリングされる傾向があることである。この系統におけるメタコミュニティーのクラスタリング分布をδ統計量を用いて検定したところ、ヌル分布のδ0 = 2.12 (0.63) に対して、δm = 3.28 が得られた (p = 0.000) ことから、系統的シグナル (i.e.,.) が存在することが示唆される、 分類群間の生態学的類似性は系統的関連性と関連している）、分類群によって採用される特定の生命戦略は、同じ分類学的レベルで比較しても分類群間で異なることがあるものの、共有された進化史にある程度支配されていることを示す。3つのメタコミュニティの時空間的な傾向は、各集団への相対的な寄与度を調べることで明らかになった（図A9）。平均すると、メタコミュニティ1が最も多く含まれていた。また、メタ群集組成の時間依存性と副作用が観察され、メタ群集2はÖstersundとBoråsで最も多く（平均頻度：それぞれ21.2%と15.0%）、メタ群集3はMotalaとTrollhättanで最も多く（それぞれ24.5%と16.0%）見られた。
図3
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GLLVM解析では、分類群と環境、季節、地理、水質の変数との関連を推論した。すべての有意な関連を図4、A10、A11に、それぞれの予測因子について最も高い正と負の関連を表A2に示すように強調した。濁度は、メタコミュニティ2のメンバーが多く含まれ、最も正の有意な関連を示した。また、気温は多くの正の相関を示した。ほとんどの分類群では、メタコミュニティ1に属する2つの代表的な分類群（AlkaligenaceaeとPolynucleobacter）を除き、色の値が高いほど負の反応を示した。季節予測因子については、春と他の季節の間で有意な関連を示したほとんどのASVは、春の集合体において過剰発現していた（すなわち、図5aの負の効果量値）。夏と春の要因レベルを対比すると、メタコミュニティ1と2に属する分類群の多くが夏に中程度の減少を示し、メタコミュニティ3のメンバーは夏に過剰な出現を示した。また、秋期は夏期とほぼ同じ傾向であったが、冬期はほとんどの分類群に過少発現が見られた。サイトの影響を調査した結果、メタコミュニティ1と2に割り当てられたASVはメタコミュニティ3に割り当てられたASVよりも高い関連性を示し、メタコミュニティ3のメンバーがジェネラリストのバクテリアで構成されていることをさらに補強している（図A8d）。一部の例外はあるものの、一般的に、同じメタコミュニティーのメンバーは共同選好を示しました。
図4
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GLLVM解析の結果をまとめると、上位200個のASV共起データから、3つの異なるメタコミュニティが同定されました。これらのメタコミュニティは、異なるコミュニティ構造を持ち、測定された環境データとの関連性が示された。メタコミュニティ1のメンバーは、気温に対して正の推定応答を示し、メタコミュニティ2では、ASVの共起率と濁度の間に多くの正の関連が推定された。また、場所と季節の両方の要因で、多くの異なるASVが存在することから、スウェーデンの原水集団には時空間効果が存在することが示唆された。
メタコミュニティの代謝ポテンシャルの予測機能から、特異的な適応が明らかになった。
メタコミュニティについてさらに詳しく調べるため、予測される代謝機能の解析を行い、コミュニティが果たす生態的役割に関わる機能の違いを調査しました。
機能推論ソフトウェアPICRUSt2を用いて、上位200種の理論的な代謝機能を再構築し、得られたKEGGオルソログとMETACycパスウェイについて、各サンプルサイトと分類群について存在量の差分を解析した。その結果、モデル解析から推定された3つのメタコミュニティは、図5に示すように、代謝機能の相対的な存在量をPCAプロットすることで、好ましいオルソログ/パスウェイの存在量が異なることが示されました。
図5
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3つのメタコミュニティの代謝能力を階層的にクラスタリングしたところ、図5aおよびA12a-dに示すように、代謝能力のみで明確に区別できることがわかった。メタコミュニティ1では、より多く観測されたオルソログ/パスウェイを考慮すると、特定の焦点を絞らず多様な代謝を好むようで、多くの異なる細菌門の分類群からなるこのメタコミュニティの多様な構成を反映しているという興味深い内容が明らかになった。代謝に関連するオルソログが最も多く観測されたのは糖質代謝で、これは他の2つのメタコミュニティと共通している。一方、メタコミュニティ2では、メタン代謝やその他の嫌気性プロセスに関与するオルソログの数が増加し、アミノ酸や脂質の代謝はそれほど多くないことがわかった。最後に、メタコミュニティ3は、糖質代謝オルソログの増加量が最も多く、脂質代謝オルソログの増加も見られた。
4 考察
スウェーデンの原水中の細菌群集について、環境・気象データ、土地利用の度合い、調査期間中に採取した水の物理的・生物的特性を選択した今回の多施設縦断研究において、いくつかの（重要な）知見を得た。(1) 全体として、細菌の多様性は明確な季節パターンを示し、夏場に最も高い多様性が観察された。調査した原水は多様であり、地理的な場所によって異なる微生物群集が観察された。(2)それでも、数的には優位ではないものの、安定したコア分類群（アンプリコン判定されたマイクロバイオーム全体の約0.5％を構成）が確認された。(3) 一般的に測定される水の物理・化学的パラメータは、必ずしも微生物群集の組成と相関を示さないことから、測定されなかった未知のパラメータが微生物群集の組成の相違に関与しているか、あるいは分類群間の相互作用が組成の変動の大部分を説明している可能性がある。(4) 調査した水生微生物群集は、その地理的起源にかかわらず、明確に定義されたサブコミュニティが存在し、上位200のASV共起データで特定された3つの異なるメタコミュニティを構成していました。(5) これらのメタコミュニティは、明確なコミュニティ構造を示し、測定された環境データとの関連性が示された。(6) 最後に、メタコミュニティーの代謝経路特性を、再構築された存在量を可視化することで再構築し、観察された違いは、観察されたパターンを決定する要因が何であるかを示す。
安定したコアタクサのセット
ここで紹介したさまざまなサンプリング地点は、さまざまな栄養状態を表しており、したがって、人為的な作用の影響を受けた（すなわち、農地や都市部の土地利用の範囲が広い）地域から、それほど露出していない地域まで、多様な環境の混合である。サンプリング地点は勾配上にあるが、解釈を容易にするために2つのグループに分け、ここではNumbergerら（2020）が提案したようにA（人為的影響を受けた）とP（原生的）と呼ぶことにした。しかし、検出されたコアセットは群集全体の比較的小さな部分を表しており、どこにでも存在する分類群は全体の0.5%未満を構成している。季節や水質特性が大きく異なる流域でサンプリングされた集合体の数が膨大であることを考えれば、コア微生物群を構成する全体の割合がこのように小さいことは驚くべきことではありません。コアマイクロバイオームは、Rhodobacteraceae、Puniceicoccaceae、Sphingomonadaceae、Opitutaceae、Rickettsiaceae、Microbacteriaceaeのファミリーの代表者によって支配されており、他のいくつかの代表分類群は非常に低い存在量でしかなかった。これは、コアマイクロバイオームは、頻度が一定の範囲内で発生する一般細菌からなり、このパターンはより条件の変化や日和見的なライフスタイルを指向する生活戦略を反映していることを示唆する。異なるサンプリング地点の間に明確に定義されたコア分類群が存在するという我々の発見は、他の研究者の結果（Llirós et al., 2014; Newton & McLellan, 2015; Numberger et al. したがって、人為的な影響を受けた地域の淡水の群集組成を、属内のライフスタイルの特殊化が積極的に形成しているという、もっともらしい結論が導かれる。
物理的・化学的な水質パラメータと微生物群集組成の非相関性
興味深いことに、GLLVM解析に含まれる水質・気象変数（ここではCODMn、濁度、気温、色度）は、群集組成の総変動の比較的小さな部分を説明するものであった。したがって、今回の調査地では、サンプリング地点の地理的な違いや水質の違いが、群集組成に大きな影響を与えたと考えられる。組成に対する空間的影響は、富栄養状態や水質の違い（Shen et al., 2019）と同様に、地球規模および地域規模の両方で文書化されている（Eriksson et al., 2022; Ge et al., 2021）。ここで説明されていない変動の部分は、いくつかの要因の結果である可能性がある。第一に、水の栄養素や金属の豊富さなど、我々の研究デザインでは評価されない要因があるかもしれない（Carrero-Colón et al., 2006; Ge et al., 2021; Sun et al., 2012）。第二に、ここに含まれる測定データは、集合体に影響を与えるパラメータの実際の勾配を形成する真の根本的な要因を反映するものではなく、プロキシに過ぎない。また、季節の定義（気象学的定義に基づく）には疑問がある。第三に、微生物間の生物学的相互作用が重要な力である可能性があり、我々は（説明できない環境予測因子と合わせて）非構造化残差項を近似する潜在変数としてGLLVM解析に含めた（Niku et al., 2019; Ovaskainen et al., 2017; Warton et al., 2016）。
人為的な影響による影響
糞便指標菌のレベルが高い人為的影響の高い地域（グループA、ボロース、トロールヘッタン、ストックホルム）の水場では、都市化が進んでいない地域（グループP、エステルサンド、ハルネッサンド、モタラ、Hägglundら、2018も参照）のものより約高いレベルのアルファ多様性として現れる、分類群の増強の証拠を見つけた。さらに、一般的な細菌群（すなわち、上位200のASV）間の相対的な存在量において、グループAとPの間で違いが見られ、Methyloparacoccusは表現が減少し、イルマトバクター・クレード内に置かれたPedobacterと未知の細菌属は、より人為的影響の大きいサイトで表現が増加しました。Yangら（2020）は、富栄養化した淡水湖底堆積物を用いてマイクロコズムを構築し、異なるアンモニウム投与量がMethyloparacoccusを含むメタン栄養細菌群集に与える影響を調査し、栄養豊富さや富栄養化に相関する属の同様の関連を報告している。
他の研究では、ProteobacteriaとBacteroidetesのフィラ内の属が、マイクロコズムと湖水系の両方で、人為的な活動の増加に伴う栄養レベルの上昇と相関することを報告している（例えば、Anderssonら、2018；Buelowら、2016；Fisherら、2015）。NewtonとMcLellan（2015）は、都市化サイト（ミルウォーキーの都市河口）でLimnohabitans、Polynucleobacter、およびRhodobacter属の存在量の上昇を発見し、Numberger et al. (2020)は、ドイツ・ブランデンブルクの都市型湖沼において、糞便汚染水と関連する可能性のある細菌群（Bacteroidaceae、Prevotellaceae、Rikenellaceae、Tannerellaceae、Winksellaceae）が濃縮されていることを見出し、これらを都市の細菌指紋と定義しています。
これらの結果を総合すると、人為的な作用が細菌群集の構造と組成に影響を及ぼすが、人為的あるいは都市的な特徴を構成する微生物分類群は異なるということがわかる。
ユビキタスなメタコミュニティ
水生生態系の機能において、異なる微生物間の相互作用は重要な役割を担っており、生物間相互作用は群集構造に影響を与える可能性があります。本研究で対象とした水生生態系の選択において、コミュニティ内とコミュニティ間の両方で、2つのメタコミュニティのメンバー間の強い一致を見いだした。2つのメタコミュニティが同じような代謝経路を持つ場合、次の2つのシナリオのいずれかが正しいことを示すと思われる：(1)2つのコミュニティは同じ生態系ニッチをめぐって直接競合しており、純粋な偶然と時間の変動によって特定の淡水サンプルにどちらが存在するかが決まる、(2)予測変数のセットでは説明できない環境要因（利用した方法では容易に検出できないそれぞれのコミュニティが進化的に有利な適応によってコミュニティ構成の変動を説明するかもしれません）が特定のメタコミュニティの優位性に寄与していると。逆に、2つのメタコミュニティが明らかに異なる能力を持つ場合、これらの自然環境に存在する微生物の大きな集合体は、存在する資源を利用する異なる方法に適応しており、観察された違いは、メタコミュニティがたどった別の進化経路と異なるライフスタイルへの適応に基礎を置くことを示すであろう。
ASVの上位200種から分割された3つの異なるメタコミュニティは、2つのデータソース、すなわち、存在量のみに基づく共起データおよび代謝の再構築に基づく細菌コミュニティの予測代謝経路を用いた独立した解析によって支持された。つまり、淡水細菌メタコミュニティの予測される機能性は、設計や水質パラメータを調整した後、推測されるASV間の相関パターンに似ていることがわかった。
メタコミュニティのメンバーが水質と関連しているかどうかを評価するために、濁度をプロキシとして使用した。濁度と他の水質指標との関連はよく研究されており、病原体であるジアルジア属やクリプトスポリジウム属（Fergusonら、1996）、合成有機化合物（SoC）や窒素アンモニア（NH3-N）物質（Nnaneら、2011）、糞便指標（Fergusonら、1996; Herrigら、2019）との著しい相関が観察されている。本研究では、メタコミュニティ2には濁度と正の相関を示すメンバーが多く含まれ、メタコミュニティ1には混合反応が見られ、3番目にはこの因子との関連を示す分類子がほとんど含まれていなかった。濁度を指標として、スウェーデンの重要な飲料水源で採取された淡水において、Illumatobacter属やNitrosospiraなどのメタコミュニティ2のメンバーが増加すると、水質が低下し、消費者のリスクが増加する可能性を模倣できることが示された。これらの知見を重要な水資源の水管理や監視活動で実用化するためのアプローチとして、水質低下を迅速に検出するために、これらのコミュニティメンバーを標的としたqPCRベースのマーカーを開発することが考えられる（McLellan & Eren, 2014）。
注目すべきは、濁度と正の相関が示されたメタコミュニティ2が、メタン代謝に関わる経路に存在するいくつかのオルソログを示し、存在量が増加する可能性が高いことである。メタン生成およびメタン栄養過程は主に嫌気性代謝と関連していることから、濁度の高い水域によく見られる粒子関連ニッチに存在する無酸素性微小環境、または基質の直接移動によってメタン生成分類群が光独立栄養種と直接結合する可能性を示唆していると考えられる（Grossart et al., 2011）。
メタコミュニティ3では、脂質代謝に関連するオルソログが多く（ただし顕著ではない）、また糖質代謝に関連するオルソログが3つのメタコミュニティの中で最も多く、このメタコミュニティは栄養豊富な水域と関連している可能性があり、COD-Mn（化学的酸素要求量）のレベルが高いメタコミュニティとの関連から裏付けられた。
結論として、今回発表された知見は、スウェーデンの6つの原水源における細菌群集が、環境および土地利用条件から選択的な圧力を受けていることを示すものである。人為的な擾乱は、細菌群集の構造と組成に影響を与えるが、人為的なシグネチャーを構成する微生物分類群は異なる。この勾配を越えて、群集は、頻度は異なるものの、調査期間中すべての場所に存在し、Burkholderiaceae、Flavobacteriaceae、Commamonadeceae、Pseudomonadaceaeなどの典型的な淡水科からなる3つのメタコミュニティで構成されていた。メタコミュニティ内の細菌系統は強い相関を示し、その結果、同じ生態系ニッチを占有することを好むことがわかった。メタコミュニティ間では、系統は負の相関を示した。また、メタ群集の代謝機能を予測したところ、同じメタ群集構造が再現され、この知見を支持する結果となった。今後の重要な研究目標は、水系が人為的なストレスの影響を受けたときに、競合する細菌系統と共存する細菌系統を研究し、その役割をよりよく理解することである。
著者貢献
ビョルン・ブリンデファルク 概念化（同等）、データキュレーション（同等）、形式的分析（同等）、調査（同等）、方法論（同等）、プロジェクト管理（同等）、執筆-原案（同等）、執筆-レビュー・編集（同等）。Harald Brolin: 概念化（サポート）、形式分析（サポート）。Melle Säve-Söderbergh: 概念化（同等）、執筆-原案（同等）、執筆-校閲・編集（同等）。Edvin Karlsson: 概念化（同等）; 執筆-原案（同等）; 執筆-レビュー＆編集（同等）。David Sundell: 概念化(等); 執筆-原案(等); 執筆-レビューと編集(等). Per Wikström： 概念化（同等）、形式分析（同等）、執筆-原案（同等）、執筆-校閲・編集（同等）。Karin Jacobsson: 概念化(均等); 執筆-原案(均等); 執筆-校閲・編集(均等). ヨナス・トルヤンダー 概念化(均等)、執筆-原案(均等)、執筆-校閲・編集(均等)。Per Stenberg： 概念化（同等）、方法論（同等）、執筆（原案）（同等）、執筆（校閲・編集）（同等）。Andreas Sjödin： 概念化(均等)、執筆-原案(均等)、執筆-校閲・編集(均等)。Rikard Dryselius： 概念化（同等）、調査（同等）、執筆（原案）（同等）、執筆（レビュー＆編集）（同等）。マッツ・フォルスマン 概念化(均等)、執筆-原案(均等)、執筆-校閲・編集(均等) Jon Ahlinder： 概念化（均等）、データキュレーション（均等）、形式分析（均等）、調査（均等）、方法論（均等）、プロジェクト管理（均等）、資源（均等）、ソフトウェア（均等）、監督（均等）、検証（均等）、執筆-初稿（均等）、執筆-レビュー＆編集（均等）。
謝辞
Moa HägglundとEmmy Borgmästarsの技術サポートに感謝したい。このプロジェクトは、Swedish Civil Contingencies Agency（プロジェクトB40624）から資金提供を受けた。
利益相反
宣言したものはない。
倫理声明
特に必要なし。
APPENDIX A
図A1～A13、表A1～A3参照。
表A1. 各モデルが単一の予測因子を含む場合のモデル選択スコア（それ以外はフルモデルと同じ）。
PredictordfAICBICNULL800340547.3343022.3Location1998329758.6335939.9Season1598336090.7341034.5Temperature1198337340.6341046.9Turbidity1198337194.3340900.7CODMn1198337543.9341250.2Color value1198337206.6340912.9
注：スコアが高いほど、モデル性能が低いことを示す。NULLモデルは、予測因子を含んでいない。
略語 AIC, Aikake 情報量規準スコア; BIC, Bayesian 情報量規準スコア; df, モデルの自由度.
表A2. GLLVM解析結果で含まれる200の分類群と予測因子のうち、上位の有意な関連性
PhylumFamilyGenusMetacommunityPredictorEstimate（95％CI）OchrophytaBacillariophyta-3Temperature2.8（1.1、4.5）Color value-7.2（-13.2, -1. 3)モタラサイト-26.6 (-26.6, -26.6)細菌綱フラボバクテリウム属フラボバクテリウム3温度-18 (-3.4, -0.1)CyanobacteriaGpI-1Turbidity1.9 (0.7, 3.1)BacteroidetesFlavobacteriaceaeFlavobacterium 3Temperature 04）VerrucomicrobiaPuniceicoccaceaeCerasicoccus1濁度-4.0（-7.5、-0.5）Boråsサイト31.2（25.5、37.0）酸菌HolophagaceaeGeothrix2CODMn 4.1（2.0, 6.2）Östersund site-27. 2 (-27.2, -27.2)VerrucomicrobiaPuniceicoccaceaeCerasicoccus1CODMn-4.8 (-8.6, -1.0)Turbidity-4.0 (-7.5, -0.5)Härnösand site34.7 (29.7, 39.6)Motala site12.8 (3. 6, 22.1）Trollhättanサイト29.2（26.4, 32.0）腸内細菌科Escherichia1色値5.3 (0.0, 10.6)MoraxellaceaeAcinetobacter3Summer season25.0 (21.7, 28.3)Fall season30. 4 (28.7, 32.0)冬期27.4 (24.2, 30.7)Cryptomonadaceae-2Summer season-7.7 (-11.9, -3.5)BacteroidetesFlavobacteriaceaeFlavobacterium3Fall season-9. 4 (-12.5, -6.3)BacteroidetesFlavobacteriaceaeFlavobacterium3Winter season-16.2 (-16.2, -16.2)Actinobacteria--1 Borås site-22,1 (-22.1, -22. 1）Trollhättanサイト-25.3（-25.3, -25.3）---2Härnösand site-30.5 (-30.5, -30.5)ProteobacteriaMethylococcaceaeMethyloparacoccus1Östersund site20.9 (12.5, 29.3)
注：部位予測因子はストックホルムを基準レベルとし、季節予測因子は春を基準レベルとした。
略語 CI, 信頼区間; GLLVM, 一般化線形潜在変数モデル.
表A3. 完全データセットと上位200分類群のみからなるトリミングデータセットのサンプルあたりのリード数
場所すべてのASVsTop 200 ASVsLocationすべてのASVsTop 200 ASVsLocationすべてのASVsTop 200 ASVsBoras1127,44697,451Harnosand1218,817166,095Motala1116,44286,026Boras1089,89773,656Harnosand1098,57481,449Motala1065,16645,031Boras1125、 32998,216Harnosand11174,886139,978Motala1184,67870,849Boras12156,737129,462Harnosand1362,88146,331Motala12231, 317166,215Boras1495,60574,653Harnosand1483,58961,017Motala14166,850107,000Boras1594,28060,044Harnosand15241,060166, 356Motala15115,58492,286Boras16165,774100,507Harnosand16233,951120,098Motala1679,33965,955Boras17175,558133, 438Harnosand1745,49823,559Motala17137,338107,327Boras18252,354184,009Harnosand18105,93773,349Motala1898,72276, 968Boras1983,47557,759Harnosand19154,111105,538Motala1973,69661,883Boras2134,97196,911Harnosand298,66073,942Motala254, 92041,916Boras2080,01356,431Harnosand20132,64987,363Motala2044,87839,926Boras21129,00792,565Harnosand2188, 98164,978Motala2151,94745,113Boras22164,352124,591Harnosand22106,95777,131Motala2282,50666,499Boras23906,8867,019Harnosand23129,04899,960Motala2368,68551,519Boras2458,39244,532Harnosand2443,55034,810Motala356,91144, 946Boras2555,85545,062Harnosand2543,07133,700Motala4433,918374,908Boras2640,20033,575Harnosand2657,64447, 560Motala5245,189211,234Boras2743,75533,492Harnosand2761,02451,587Motala6101,36292,499Boras2843,58537,561Harnosand2866, 87055,571Motala7170,193154,590Boras2939,17133,924Harnosand2961,80750,407Motala8158,653142,576Boras378,54263, 590Harnosand371,74249,895Boras3059,63852,547Harnosand463,95750,788Boras3165,54449,172Harnosand566,79752,384Boras3260, 92151,257Harnosand653,56641,464Boras451,35042,031Harnosand7286,349213,519Boras555,91545,818Harnosand8206, 095154,958Boras6339,947270,287Harnosand9119,19190,302Boras7136,771119,715Boras893,11381,127Boras9291,021246,311
ロケーションすべてのASVトップ200ASVロケーションすべてのASVトップ200ASVロケーションすべてのASVトップ200ASVオスターズンド1131,678106,984ストックホルム1132,20295、 315Trollhattan194,22377,452Ostersund1177,74655,171Stockholm10162,284141,407Trollhattan10177,217145,359Ostersund1278,56358,590Stockholm11165, 049149,971Trollhattan1279,88955,327Ostersund13232,183189,834Stockholm13137,431108,604Trollhattan1397,12870,217Ostersund14187,953158, 201Stockholm14124,61097,998Trollhattan14224,233144,340Ostersund1582,74767,673Stockholm15237,002181,964Trollhattan15239,811152,548Ostersund1667, 50450,405Stockholm16204,238158,371Trollhattan16262,527183,110Ostersund1783,74965,255Stockholm17247,431199,037Trollhattan1762,12127, 959Ostersund1886,47860,375Stockholm18235,972186,626Trollhattan1887,06359,462Ostersund19131,42589,887Stockholm19222,076187,260Trollhattan19108, 74872,156Ostersund2106,51790,931Stockholm277,06156,178Trollhattan2208,235136,007Ostersund2073,75750,744Stockholm2088,29366,581Trollhattan20154, 989115,470Ostersund2179,31861,661Stockholm2194,75071,435Trollhattan21184,100143,613Ostersund2243,46635,306Stockholm2291,22965, 280Trollhattan22115,40154,135Ostersund2337,42431,614Stockholm23131,093102,347Trollhattan2388,80244,702Ostersund2559,30752,481Stockholm24172, 210135,016Trollhattan2493,15349,833Ostersund2662,21155,363Stockholm25347,433275,912Trollhattan25138,124105,817Ostersund2776,28557, 576Stockholm2695,90679,613Trollhattan2688,09071,410Ostersund344,08337,927Stockholm2746,61240,852Trollhattan2776,69763,918Ostersund453,04945, 565Stockholm2847,77441,442Trollhattan2862,87354,541Ostersund5376,939323,937Stockholm3252,377185,107Trollhattan2959,62350,757Ostersund6166, 074126,610Stockholm3072,04564,806Trollhattan356,43447,801Ostersund7124,504109,742Stockholm3172,39261,501Trollhattan3056,45747, 424Ostersund8142,539120,941Stockholm3276,23465,839Trollhattan3158,83346,168Ostersund9187,572164,837Stockholm477,22061,270Trollhattan3259,71947, 499Stockholm566,32454,921Trollhattan478,55967,981Stockholm646,87440,286Trollhattan527,95824,359Stockholm7348,748295,004Trollhattan6395, 119324,354Stockholm8309,971256,771Trollhattan7337,355290,630Stockholm9177,053156,809Trollhattan8177,052156,176Trollhattan9129,354111,398
略称： ASV、amplicon sequence variant。
図A1
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図A2
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図A3
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図A4
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図A5
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図A6
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図A7
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図A8
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材料と方法
GLLVM解析
このモデル（本文の式（1））は、予測変数を同時に考慮しながら、ASV間の相関を推定することを可能にしました。分析には3つの潜在変数が使用され、これは組成の関連する変動のほとんどを捕えると考えられている：Wartonら（2015）およびNikuら（2019）の例を参照。収束を改善するために、潜在変数のジッタリングは0.5に設定した（jitter.var = 0.5）。カウントデータのモデル化には負の二項分布が選択された。モデリングの詳細については、Niku et al. (2017, 2019)を参照してください。推論された回帰パラメータを可視化するために、ggplot2 Rパッケージを利用した。
共起データの次元を下げるために、ノイズレベルに近い低豊富な特徴とのスプリアスな相関を避けるために、上位200個のASVを選択して分析に含めた。解析では、まず、予測因子を含む（すなわち、メインペーパーの式1のようなフルモデル）ことで、予測因子を含まないモデル（すなわち、ヌルモデル）と比較して、ASVの存在量の総変動の大きな割合を占めるという点で結果が改善するかどうかを確認しました。モデルにすべての予測因子を含めることで、総変動の41％が分析で説明され、予測因子で調整した後に推測されるASV相関から結論を導き出すことがより可能になりました（図A3）。例えば、ヌルモデルや標準的な順序付けの結果（図A6bおよび図）で明らかだったこととは逆に、対応する部位予測因子をモデルに含めた後も、副作用はほとんど残っていません（すなわち、図A6aに示したコミュニティでは目に見えるパターンがありません）。
共線性を確認するために、予測因子間の一対のピアソン相関を計算した（図A11）。6つの推定された一対の相関のうち1つは大きく（r = 0.87）、CODMnとColor valueの共線性の問題の可能性を示唆した。その他の推定値はすべて-0.1～0.3であった。従って、これらは独立に従属変数の値を予測することはできず、従属変数の分散を一部同じように説明している。このため、CODMnとカラーバリューの個々の関連性をASVと解釈する際には注意が必要である。
結果
GLLVM分析
GLLVM分析では、細菌群集と環境、設計、および水質の変数との間の関連も決定されました：すべての非ゼロの関連は、図5およびA7-A9で強調されています。濁度と気温が最も有意な関連性を示しました。CODMn予測因子に正の反応を示した分類群のうち、大多数はコミュニティ1に属していた。興味深いことに、フラボバクテリウム属のメンバーで構成されるコミュニティ2の代表的な数種類も、正の反応を示しました。ほとんどのASVは、コミュニティ1の2つの代表者（AlkaligenaceaeとPolynucleobacterと割り当てられた）を除いて、高い色値に対して負の反応を示した。メタコミュニティ1と2では、気温が明らかにプラスに作用し、ほとんどの分類群が上昇を示しました。また、メタコミュニティ2に属する多くの分類群（n = 26 ASV）が濁度に対して正の反応を示し、その中にはNitrosospiraやVerrucomicrobiaクレードに属する分類群、メタコミュニティ1に属するものを含む分類学的に未確定な分類群も含まれています。さらに、シアノバクテリアファミリー1からの明確なシグナルは、明確なシアノバクテリアのブルームが起こっている少数のサンプルに対応しています。この結果は、メタコミュニティ2が浮遊粒子の多い水域に適応した微生物を構成していることを示しており、最も基本的なレベルでは、トロフィーや一次生産性の代理とみなすことができる。さらに、メタコミュニティ1に属する多くの分類群（Pseudomonas、Comamonadaceae、Polynucleobacter、Methylococcaceae、Cerasicoccus、Plancomycetaeae）は、高い濁度に負の反応を示した。これは、これらがより一般的な種であり、より特殊な生物が有利な条件である、粒子の多い水中の特定の状況にうまく適応できていない、という仮説と一致した。
季節予測因子については、春と他の季節との間に有意な関連を持つASVのほとんどが、春の集合体において過剰発現していた（すなわち、図4aの負の効果サイズの値である）。夏と春の要因レベルを対比すると、メタコミュニティ1と2に属する分類群の多くが夏に中程度の減少を示し、メタコミュニティ3の分類群は夏に過剰な発現を示した。秋季は、いくつかの顕著な例外を除き、全体的に夏季と同様の反応を示した。秋に過剰発現した分類群はメタコミュニティ3のメンバーで占められているが、フラボバクテリウム属は、過剰発現した分類群（n = 13）と過小発現が顕著な分類群（n = 12）とが混在した。メタコミュニティ1と3では、存在量が弱い過小発現の分類群が多く見られた。春と冬の因子レベルを対比すると、ほとんどの分類群は冬に採集された集合体では存在量が不足することがわかった（図5）。より多く存在しない分類群のうち、すべてがメタコミュニティ3（Flavobacterium）のメンバーであった。興味深いことに、2つのASV（いずれもメタコミュニティ1に分類されるメタン栄養細菌）が、すべての季節で存在量の過大化を示している。また、Cerasicoccus属（Verrucomicrobia門）に属する1つのASVは、夏と秋の両方の季節で過剰発現していた。さらに、メタコミュニティ3に属するAcinetobacter属のASV1種は、春と比較して季節を問わず存在量が多くなっていました。
ASVのサイト効果を調べたところ、一般に、メタコミュニティ1と2に割り当てられたASVは、メタコミュニティ3に割り当てられたASVよりも高い関連数を示し、メタコミュニティ3のメンバーは一般細菌からなることをさらに補強している（図5b）。あるASVは複数のサイトで同様の関連を示し、Verrucomicrobia、Cerasicoccus属はBorås、Trollhättan、Härnösandのサイトで存在量の点で過剰発現していた。メタン栄養細菌（Methyloparacoccus）に分類されるASV1種は、ÖstersundサイトとHärnösandサイトで過剰に存在した。Pedobacter属（Bacteroidetes）に分類された1種のASVは、HärnösandとMotalaの両方に比べてStockholmに過剰に存在し、Illumatobacterクレードに分類された、門レベルで何も割り当てられないASVはÖstersundとMotalaに比べStockholmに過剰存在しました。ストックホルムと比較すると、Härnösandでは、200のASVのうち39と51のASVがそれぞれ有意に過剰発現、過小発現しており、分類群の反応の乖離が最も大きいことが示された。Trollhättanの水は河川から供給されているため、上流の水源で条件が変化し、200のASVのうち大部分（n = 102）が場所の違いに関連しており、ほとんどがストックホルムの集合体で過剰に表現されていることが明らかになった。
変数の重要度分析
1つの目的は、GLLVM分析に含まれる予測変数の重要性を決定することで、原水の集合体データに対するモデルの適合度、およびモデルの複雑さ（すなわち、より複雑な予測変数にはモデルの自由度が必要）の両面から検討した。そのため、単一の予測因子を持つ別々のモデルをデータに当てはめ、GLLVM RパッケージによってAICとBICスコアを算出した：低いスコアは、より適したモデルを示していた。すべてのモデルは、フルモデル解析と同じパラメータセットを使用して解析されました。最も重要な予測因子は原水源の位置であったが、この予測因子は最も高い自由度を必要とし、水源間の勾配が組成の最も高い変動を誘発し（表S1）、全体の変動の約20％を占めていることが示唆された。他の予測変数のセットは、全変動の0%～5%を説明し、非常によく似たモデル性能となり、したがって、場所予測変数よりもはるかに少ない変動を説明した。AICに続いて、季節効果は2番目に重要な予測因子であり、BICは濁度を優先した（BICはAICよりも自由度のペナルティが大きい）。しかし、すべての予測因子は、予測因子を含まないヌルモデルよりもわずかに良いモデルをもたらした。色彩値と濁度は、非常によく似たモデル性能を示す結果となった。
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