ライノウイルスとA型インフルエンザウイルスの干渉：臨床データ解析と実験的感染研究

哉百名


ライノウイルスとA型インフルエンザウイルスの干渉：臨床データ解析と実験的感染研究

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7580833/

Anchi Wu, Valia T Mihaylova, [...], and Ellen F Foxman

論文追加情報

関連データ
補足資料
概要
背景
2009年の新興A型インフルエンザウイルス（IAV；H1N1pdm09）のパンデミックの際、欧州のいくつかの国のデータから、毎年秋に流行するライノウイルスによってウイルス伝播が阻害された可能性が示唆された。我々は、ライノウイルスとIAVのウイルス干渉について、臨床データおよび実験モデルを用いて検討することを目的とした。

研究方法
Yale-New Haven病院（米国CT州）のマルチプレックスPCRパネルで検査した成人（21歳以上）の呼吸器検体におけるライノウイルスとIAVの共発生を、3年連続の冬季シーズン（2016-17、2017-18、2018-19、11月1日から3月1日）に臨床データ解析と実験感染調査を行った。Epic Systems社の電子カルテシステムから抽出したデータを用いて、観察された共検出と予想された共検出を比較しました。ライノウイルス感染がその後のIAV感染にどのように影響するかを評価するために、分化したヒト気道初代培養物にライノウイルス（HRV-01A；感染多重度［MOI］0-1）を接種するか、模擬感染を行った。感染後3日目に、同じ培養物にIAV（H1N1緑色蛍光タンパク質［GFP］レポーターウイルスまたはH1N1pdm09；MOI 0-1）を接種した。ライノウイルスまたはモック感染後3日目にインターフェロン刺激遺伝子（ISG）の宿主細胞mRNAを、ライノウイルスまたはモック感染後4、5、6日目にIAV RNAを逆転写定量PCR法または顕微鏡法で定量した。また、インターフェロン反応を抑制するため、BX795（6μM）存在下で連続感染試験を行った。ISGの発現とIAV RNAの発現、IAVレポーターウイルスによるGFPの発現を比較した。

得られた知見
2016年7月1日から2019年6月30日の間に、任意の検査方法でライノウイルス（n=3821）またはIAV（n=4463）のいずれかに陽性の呼吸器検体8284件を調べ、ウイルス共流のピーク時期として11月1日から3月1日を設定した。この期間内に対象基準を満たす検体（n=13 707）をフィルタリングした結果、ライノウイルス989（7-2％）、IAV922（6-7％）が検出され、共検出オッズは予想より有意に低かった（オッズ比0-16、95％CI 0-09-0-28）。ライノウイルスの細胞培養への感染はISGの発現を誘導し、3日後のIAV感染を防御し、ライノウイルス接種後5日目にIAV H1N1pdm09ウイルスRNAが約50 000倍減少する結果となった。インターフェロン反応の阻害はライノウイルス感染後のIAV複製を回復させた。

解釈
これらの結果は、ある呼吸器ウイルスが気道粘膜の抗ウイルス防御を刺激することによって別の呼吸器ウイルスへの感染を阻止できることを示しており、ライノウイルスからの干渉が2009年のヨーロッパでのIAVパンデミックを混乱させたという考えを支持するものである。これらの結果は、ウイルスの干渉が流行の経過に影響を与える可能性があることを示しており、季節性インフルエンザの流行や現在進行中のCOVID-19パンデミックに対する介入策を考える際に、この可能性を考慮する必要があると思われる。

資金提供
National Institutes of Health, National Institute of General Medical Sciences, and the Yale Department of Laboratory Medicine.

はじめに
COVID-19の大流行により、呼吸器系ウイルスの流行に影響を与える基本的なメカニズムの検討が急務となっている。このメカニズムは、あるウイルスに感染すると、他の関連・非関連ウイルスへの感染から一過性に保護される現象である、ウイルスの干渉が提案されている1。

過去10年間、ゲノムに基づくウイルス検出法の進歩により、呼吸器ウイルス感染症の診断能力は著しく向上している。このような方法が普及するにつれて、ウイルスの干渉が呼吸器系ウイルスの流行を形成している可能性を示す試験結果が蓄積されてきました。2009年の新型インフルエンザ（IAV）のパンデミックの際、欧州のいくつかの国から、毎年秋に流行するライノウイルスが新型インフルエンザウイルスの感染を中断させ、遅らせていることが示され、この考えに注目が集まった。2-4 2009年以降、ライノウイルスとIAV、ライノウイルスと呼吸同期ウイルス（RSV）など、一般的な呼吸器ウイルスの共検出が偶然に予想されるよりも著しく低く、ウイルス干渉仮説も支持していることがわかっている3, 5。 -11 マウスモデルでは、ライノウイルスに過去に暴露されたことにより、IAV感染が減弱されましたが、ライノウイルスはマウスでは複製されないという注意点があります12。過去10年間における呼吸器系ウイルスのマルチプレックス検査の普及と、電子カルテやバイオインフォマティクスの進歩により、従来よりもはるかに大規模にウイルスの共検出率を比較し、ウイルスによる干渉の証拠をさらに評価する機会が提供されるようになっています。

臨床的な観察結果のみに基づいてウイルスの干渉を評価する場合の課題は、因果関係を示す情報がないことです。例えば，環境要因に基づくウイルスの季節性の違いや，ウイルス宿主域の違い（例えば，ウイルスが異なる年齢層に優先的に感染する）など，ウイルス干渉以外の要因が低いウイルス共検出率に寄与している可能性がある．本研究では、患者集団における両ウイルスの検出率がほぼ等しい年齢層と時間帯に限定して解析を行うことで、考えられる交絡因子に対処した。また、気液界面で培養した分化した初代ヒト気道上皮細胞に順次感染させることで、因果関係を検討した。ここでは、患者データを用いたライノウイルスとIAVの共検出解析と、ライノウイルスとIAVの干渉を検証するための感染実験結果について報告する。

研究方法
研究デザイン
Yale-New Haven病院（米国CT州）でのライノウイルスとIAVの共発生を調べるための臨床データ解析と、両ウイルス間の干渉を調べるための実験的感染症研究を行った。臨床データ解析では、2016年から2019年にかけて、当医療機関の患者さんにライノウイルスとIAVが共存している期間と年齢層を設定するため、Yale-New Haven病院の臨床ウイルス学研究所が作成した検査結果サマリーを用いて、すべての検査方法とすべての年齢層のデータを検討しました。検査方法は付録（P2-4）に記載しています。これらのデータを基に、2016-17年、2017-18年、2018-19年の11月1日から3月1日までの成人（≧21歳）の検査結果が大半であり（88％）、この年齢層ではライノウイルスとIAVの検出率がほぼ同等であることから解析対象として選定された。

共検出解析は、ライノウイルス、IAV、インフルエンザBウイルス（IBV）、RSV AおよびB、パラインフルエンザウイルス1、2および3、ヒトメタニューモウイルス、およびアデノウイルスという10種類のウイルスについて、前述13と同様に、実験室で開発された完全なYale-New Haven Hospital respiratory virus PCRパネルで検査したサンプルにのみ実施し、2018年3月に更新したライノウイルスプライマー14（付録p 4）を使用した（付録p 4）。検査結果は，Yale-New Haven Hospital Epic Systems の電子医療記録システムから，Yale Joint Data Analytics Team が作成したカスタムレポートを用いて取得し，暗号化されたコンピュータで Microsoft Excel スプレッドシートにエクスポートした。取得されたデータは、患者の年齢と性別、検査日、各ウイルスの検査結果、および検査プラットフォームです。患者の医療記録番号も取得されましたが、分析前に削除され、匿名化されたサンプル番号に置き換えられました。データは成人（21歳以上）のみを含み、同一患者の同一週における反復検査を除外するようフィルタリングされた（付録p7）。

研究プロトコルはYale Human Investigation Committeeにより検討・承認され、特定の患者の同意や施設審査委員会の審査は不要と判断された。

実施手順
気液界面で分化させ、生体内の粘膜表面を再現したオルガノイド培養を行った初代ヒト気道上皮細胞を用いて、共感染モデルを構築した。健康な成人ドナーから得た細胞は市販品（Lonza, Walkersville, MD, USA）を用い、製造元の指示に従って、還元型ヒドロコルチゾンを用いて培養した（Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada）。細胞は4週間分化させ、その時点では繊毛の拍動と粘液の産生を確認した。予備実験により、0-1の感染倍率（MOI）で感染させた場合、これらの培養物はライノウイルスとIAVの両方の強固な複製を支持し、各感染に耐えることが確認され、連続感染実験を可能にし、このMOIを共感染実験に選ぶことが正当化された。

感染のために、各プライマリーヒト気道上皮細胞培養物の頂部表面を200μLの温リン酸緩衝生理食塩水（PBS；Sigma-Aldrich、Burlington、MA、USA）で洗浄し、培養物にライノウイルス1A（HRV-01A；VR-481; American Type Culture Collection [ATCC], Manassas, VA, USA）を0-1％ウシ血清アルブミン（AmericanBio, Natick, MA, USA）入り200μL PBS中でウェル当たりMOI 0-1を35℃にて1時間接種し、その後接種物を取り除き、頂部表面をPBSですすぎ、底部培地を新しい培地に取り替えた。細胞は35℃で3、24、48、72時間培養し、感染動態を確立した。逐次感染モデルでは、3日目に基底側培地に150μLの新鮮な培地を補充し、ライノウイルス1Aと同じ手順でモック接種またはIAV（MOI 0-1）接種を行った。細胞には、García-Sastre 研究所（Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA）から寛大に提供された、複製中に緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターを発現する、以前記述したH1N1 IAVを接種した（PR8-GFP）。 15 ライノウイルス感染後3日目にISG15、RSAD2（Viperin）、MX1、IFITM3の宿主細胞mRNAの逆転写定量PCR（RT-qPCR）を、ライノウイルス感染後4日目と5日目（それぞれIAV感染後24時間と48時間）にIAV RNAのRT-qPCRを用いて宿主反応とIAV複製に対する以前の曝露の影響を評価した。また、ライノウイルス感染後4日目（IAV感染後24時間）に共焦点蛍光顕微鏡を用いてGFP発現細胞の定量を行った。

その後のIAV H1N1pdm09 (strain A/California/07/2009; ATCC VR-1894) 感染に対するライノウイルスの影響を評価するため、分化した気道上皮細胞にそれぞれのウイルスを個別かつ順次感染させ、IAV PR8-GFPと同様の感染手順でウイルス増幅とインターフェロン刺激遺伝子（ISG）誘導のタイムコースを検討（RT-qPCRによる）した。IAV H1N1pdm09の感染動態を確立するために、細胞を35℃で3、24、48、または72時間インキュベートした。連続感染実験では、ライノウイルス感染後4日目（モックまたはIAV感染後24時間）に細胞を回収し、ISG誘導に対する連続感染の影響を評価し、ライノウイルス感染後4、5、6日目（IAV感染後24〜72時間）に回収し、IAV RNAの発現量を評価した。

IAV H1N1pdm09の複製に対するインターフェロン応答の効果を調べるため、IAVを接種する18時間前に1000 U/mLの組み換えインターフェロンβ（PBL Assay Science, Piscataway, NJ, USA）を基底側培地に添加した（MOI 0-1）。IAVの感染24時間後にRT-qPCRでウイルス複製とISGの誘導に対する効果を評価した。

ライノウイルスへの曝露が、宿主細胞のインターフェロン応答の活性化を通じてIAVの複製を阻害するかどうかを正式に調べるために、インターフェロン応答に必要な自然免疫シグナルを遮断する薬剤であるBX795（Sigma Aldrich, Burlington, MA, USA）の存在下で連続感染試験を行った16。BX795をライノウイルス接種の18時間前に6μM濃度で基部培地に加え、実験中は同じ濃度に維持した。ライノウイルス感染後3日目にISGの誘導を測定するためのRNA単離とRT-qPCRのために培養液を回収し、またはライノウイルス感染後5日目（IAV感染後48時間）にライノウイルスおよびIAVウイルスRNAの定量のためのRT-qPCRのために培養液を回収した。RT-qPCRおよび共焦点蛍光顕微鏡の詳細は、付録（pp2-3）に記載されている。示された結果は、少なくとも3つの独立した実験の代表である。

統計解析
ライノウイルスとIAVの相互作用の可能性を評価するために、対象基準を満たした患者の検査結果を用いて、これら2つのウイルスの共感染の観察値と期待値を比較した。まず，ライノウイルス，IAV，IBV，RSV，パラインフルエンザウイルス，ヒトメタニューモウイルス，アデノウイルスの組合せについて，単独感染と共感染の観察例を数えた．次に，すべてのウイルスペアについて，干渉がない場合の共感染の期待数を推定した．共検出期待数は，ウイルス1の発生率とウイルス2の発生率の積に総標本数を乗じたものと定義した．次に、Python、バージョン3.7.3を用いて、干渉がない場合の共検出数の観測値と期待共検出数の間に有意差があるかどうかをχ2またはフィッシャーの正確検定（有意水準はp＜0-05）で評価した。また、各ウイルスペアの共検出に関するオッズ比（OR）および対応する95％CIを算出した。これらの統計的検定の詳細については、付録（p3）に記載されている。他の研究者による同様の解析を容易にするため、2×2分割表からこれらの統計量を生成するウェブツールを作成し、データを共有するオプションも用意した。

実験データについては、GraphPad Prism, version 8.4.2 を用いて、条件間の一対比較のための両側t検定と、時系列比較のための二元配置ANOVAを実施した。

資金提供者の役割
本研究の資金提供者は、研究デザイン、データ収集、データ解析、データ解釈、報告書の執筆においていかなる役割も果たさなかった。責任著者は、本研究の全データにアクセスでき、論文投稿の決定に関して最終的な責任を有していた。

研究成果
2016年7月1日から2019年6月30日の間に、Yale-New Haven病院の臨床ウイルス学研究所で検査した8284の呼吸器検体は、インフルエンザ迅速検出法、蛍光直接抗原検出法、呼吸器ウイルスパネルのPCRを含むすべての検査法でライノウイルス（n=3821）またはIAV（n=4463）陽性だった（付録P 4）。ライノウイルス陽性検体のピークは秋から春にかけて広く、IAV陽性検体のピークはライノウイルスのピークと冬の間に狭く、他の研究17,18と一致する季節性が認められた（図1A）。また，ライノウイルスとインフルエンザの共流行のピークは，毎年11月1日から3月1日にかけてであった（図1A）．次に、2016-17、2017-18、2018-19のデータを含む、11月1日から3月1日の期間にYale-New Haven病院の完全な呼吸器ウイルスPCRパネルで検査したサンプルにのみ焦点を当てました。フィルタリング前の呼吸器ウイルスPCRパネルでは、15 940件の検査結果があり、ほとんどの検査が21歳以上の成人に対して行われた（13 973件［87-7％］）。成人のライノウイルスとIAVの検出数はほぼ同数であり、全体の検査数、ライノウイルスとIAVの陽性検査数ともに若干女性に偏っていた（付録P6）。成人（21歳以上）のみを対象とし，同一週内の同一患者に対する再検査を除外するフィルタリングを行った結果，13707件が共検出解析に利用可能であった（付録p.7）．ライノウイルスおよびIAVの結果は、大規模なサンプルデータセットにおける季節的な傾向を反映しており、毎年11月1日から3月1日の間にライノウイルス発生率は減少し、IAVは上昇した（図1B）。フィルタリング後のライノウイルスとIAVの陽性検体数はほぼ等しく、ライノウイルスは989（7-2％）、IAVは922（6-7％）検出された（付録p5）。

図1:
図1:
週ごとのウイルス検出数（2016年7月～2019年6月
ライノウイルスとIAVは、共病のピークとなる月において、予想を大きく下回る共病率を示しました。対象基準を満たした検査結果を対象とした共検出解析では、ライノウイルス検出とIAV検出の間に有意な負の関連が認められ、ORは0-16（95％CI 0-09-0-28、表）であった。相互作用がない場合のライノウイルスとIAVの共検出数の予測値は67であったが、共検出は12にとどまった（χ2 p値=1-08×10-12）。ライノウイルスとIAVの一次解析に加え，他のウイルスペアについても，2種類の統計学的検定により，組み入れ基準に合致した検査結果を用いて，共検出数と予想数を比較する二次解析を行ったところ，表に示すように，ライノウイルスとRSV，ヒトメタニューモウイルスおよびIBVの間，IAVとRSV，ヒトメタニューモウイルスおよびパラインフルエンザウイルスとの間，RSVとヒトメタニューモウイルスおよびパラインフルエンザウイルスとの間，に負の有意差を持って検出されることが明らかになった．

表
表
ウイルスペアの共検出期待値 vs 実測値、呼吸器ウイルスPCRパネル、2016年11月1日～3月1日、19日
分化したヒト気道上皮培養物にHRV-01A（MOI 0-1）を感染させると、最初の24～48時間の間に強固なウイルス複製が生じ、感染後3日目頃にプラトーになった（付録P 8）。この時点で、ライノウイルス感染培養物は、IAV感染を阻止するエフェクターをコードすることが示されている4つのISGを含む抗ウイルスインターフェロン反応に特徴的なmRNAの有意な誘導を示した（図2A、付録p8）。 19 ライノウイルスを接種し、ライノウイルス感染後3日目に既報のH1N1 IAV GFPレポーターウイルス（IAV PR8-GFP）15を感染させた培養物では、IAV感染後24時間および48時間の両方でRT-qPCRによるIAVウイルス量の15倍以上の減少によって示されるように、IAV複製の著しい阻害が認められました（図2C）。PR8-GFP感染培養物を共焦点蛍光顕微鏡で観察したところ、ライノウイルス感染前の培養物ではGFP陽性細胞の数が著しく減少していた（図2D、 ,2E;2E; 動画1, 2）。以上のことから、ライノウイルス感染によってヒト気道上皮に抗ウイルス反応が誘導され、それが感染後3日目まで持続すること、そしてライノウイルス感染がその後のIAV感染を阻害することが示された。

図2:
図2:
ライノウイルス感染が上皮の遺伝子発現とIAV感染に与える影響
気道上皮の分化培養は、2009年に流行したIAV、H1N1pdm09の強固な複製を支持し、0-1のMOIで接種後、ウイルス力価は1000倍以上増加した（付録p8）。IAV H1N1pdm09はライノウイルスと同様にISGの発現を誘導したが、誘導の大きさはライノウイルス感染時に比べてはるかに小さく、24時間後にわずかに誘導され、感染後48-72時間までにISG転写量が増加した（付録p8）。これらのデータから、インフルエンザ単独感染では、インフルエンザ感染とライノウイルス感染歴がある場合に比べ、早い時間帯にISGの誘導が大幅に低下している可能性が示唆された。この仮説を検証するために、ライノウイルスの後にH1N1pdm09を用いた連続感染実験を行った（図3A）。各単発感染時のISG誘導の時間経過と同様に、IAV感染24時間後に、ライノウイルスに前感染した培養物では、IAVのみに曝露した培養物に比べ、ISG転写物の発現が有意に高かった(図3B)。また、ライノウイルスとIAV PR8-GFPの順次感染（図2）で見られたように、ライノウイルスによる前感染は、感染後4日目と6日目（IAV感染後24時間と72時間；図3C）におけるIAV H1N1pdm09ウイルス量の著しい減少につながった。

図3:
図3:
分化した気道上皮培養における上皮遺伝子発現と2009パンデミックインフルエンザAウイルス感染に対するライノウイルス既往感染の影響
ライノウイルスに以前さらされた場合と同様に、インターフェロンβの前処理は、気道上皮培養におけるISGの発現を有意に誘導し、H1N1pdm09の複製を減少させた（付録p9）。これまでの研究と一致して、この結果は、抗ウイルスインターフェロン応答の前活性化がIAV感染を抑制することができることをさらに示した。

図4Aに示すように、上皮培養物を、インターフェロン応答に必要な自然免疫シグナルを遮断する薬剤であるBX795とともに、またはBX795なしでプレインキュベーションした16後、ライノウイルスに模擬感染または感染させて3日間培養し、その後IAV H1N1pdm09に感染させた。ISG mRNAのRT-qPCRにより、BX795は、IAV複製を制限することが以前に示された4つのISGの誘導を完全にブロックした（図4B）19。次に、培養物をIAV H1N1pdm09に感染させ、感染後5日目にウイルスRNAの分離とRT-qPCRによる定量のために収集した。ライノウイルス-IAV共感染時のライノウイルスRNA量は、BX795存在下でライノウイルス量が多くなる傾向が見られたが、有意差はなかった（図4C）。一方、BX795前処理は、IAV RNAの量に顕著な影響を及ぼした。IAV感染後24時間および72時間の観察（図3）と同様に、ライノウイルスに前感染したウェルではIAVの著しい減少が見られ、H1N1pdm09単独で感染したウェルと比較して、ライノウイルスに前感染した培養物ではH1N1pdm09量がおよそ5万倍に減少していた（図4D）。しかし、BX795で前処理したライノウイルス感染ウェルでは、H1N1pdm09の複製はほぼ回復し、ライノウイルス前感染なしの細胞での量と有意差はなかった（図4D）。

図4:
図4:
ライノウイルス-IAV干渉に対する抗ウイルスシグナルの阻害の効果
考察
本研究では、ライノウイルスがウイルス干渉（あるウイルスに感染すると、関連・非関連ウイルスに対する宿主の感受性が変化する現象）を媒介する役割を検討した1。その結果、両ウイルスの標的組織（ヒト気道上皮）における抗ウイルス防御を活性化することにより、ライノウイルスへの前感染がA型インフルエンザウイルスへの感染を阻害することが示された。過去10年間のPCR法による検出の増加により、ライノウイルスは、ウイルス培養や免疫染色などの従来の技術では容易に検出されないため、これまで認識されていなかった、ヒト気道における予想外の高い有病率が明らかになりました17,20。 -ライノウイルス感染の検出が可能になったことで、ヨーロッパで流行した2009 H1N1インフルエンザウイルスの伝播が、再入学後の秋のライノウイルス流行によって中断されたように見えたことから、これら2つのウイルス間の干渉が疑われ、この研究のきっかけとなりました2-4。

我々の臨床データ解析の結果は、ライノウイルスとIAVの干渉に関する証拠の蓄積に貢献するものであり、それは主に患者におけるライノウイルスとIAVの共検出率の観測値と予想値の比較に基づいている。我々は、Yale-New Haven病院のヘルスケアシステムがカバーするCTおよびNY地域（米国）の成人患者集団について、冬季の3シーズンにわたって調査した。本研究は21歳以上の成人に限定されているが、この集団で観察されたライノウイルスとIAVの低い共検出率は、フランスで2009年に流行したH1N1 IAVから採取した2121の小児検体の研究、オーストラリアで2003年から症状のあった小児から得た1247検体、オーストラリアで12年間に採取したあらゆる年齢の患者の33 652検体、スコットランドで9年間に採取したあらゆる年齢の患者44 230検体など異なる患者集団からの結果と著しく類似する3、8。 -10異なる地域、集団、研究デザインにおける結果の類似性は、低いウイルス同時検出率は、特定の患者群における交絡因子を表すのではなく、生物学的根拠を持つという考えを支持するものである。ここでは、より多くの地域や集団からのこの種の解析をサポートするために、共検出解析とデータ共有のためのウェブツールを紹介する。

ウイルスの干渉を媒介するメカニズムとして、あるウイルスの侵入受容体を別のウイルスが直接ブロックする、宿主細胞の資源をめぐるウイルスの競争、関連するまたは異なるウイルスから身を守る自然免疫または適応免疫応答のウイルスによる誘導など、いくつかのメカニズムが提案されています1、23、25 ライノウイルスやその他のRNAウイルスが、無症状の場合でもヒト気道でISG発現を誘導することが示された研究により、考えられるメカニズムとして抗ウイルスインターフェロン反応に注目することになりました13、26。 -インターフェロンは、1957年にIsaacsとLindemannによって、ウイルスに曝された卵膜が産生する物質が未熟卵のインフルエンザウイルス感染を防ぐことを示した一連の実験で初めて特徴づけられ、現在では多くのウイルスに対する有効な防御機構であることが知られている23。

我々は、ライノウイルスとIAVの干渉について、ヒト気道上皮の分化したインビトロモデルを用いて調べた。このモデルでは、動物モデルとは異なり、両方のウイルスが複製され、細胞株とは異なり、両方の感染に耐えることができる。その結果、インターフェロンの前処理またはライノウイルスの前感染がIAVの複製を抑制すること、ライノウイルスの前感染がIAV感染初期にISGの発現を大きく増強すること、ISG誘導を阻止するとライノウイルス感染後のIAV複製を救済することが分かりました（図2-4）。これらの結果は、ライノウイルス感染によって引き起こされるインターフェロン応答が、IAV感染から気道上皮を保護することを示す強い実験的証拠である。また、このモデルは、干渉を支配するパラメータをさらに解明する可能性を与えている。例えば、各感染によって誘導される抗ウイルス反応の動態（付録p8）から、ライノウイルスによるISG誘導のピーク前（例えば、ライノウイルス感染後2時間）のIAV感染は、ライノウイルス感染3日後の感染で観察されたものよりもIAVに対する抑制効果が小さいと予測される。

我々の実験モデルは、生体内で起こりうるすべての干渉機構を捉えているわけではないことに留意することが重要である。動物モデルの研究では、あるウイルスに感染すると別のウイルスに対する適応免疫防御が増強される異種免疫の証拠が示されている24。また、連続した感染は、さらなるメカニズムによって交差防御的自然免疫を誘導する可能性がある。マウスを用いた研究では、IAV感染を生き延びた細胞に関連する粘膜自然免疫応答の変化が、異なるインフルエンザ株間の干渉を最大3週間にわたって媒介することが示された30。我々のモデルは、インターフェロン関連シグナル伝達経路に遺伝的または後天的な欠陥がある人は、気道の局所ISG発現の低下と相まって、ウイルスの共感染率が高くなることを予測している。ヒトにおけるウイルスの検出と気道の宿主反応に関する縦断的な研究は、生体内の連続したウイルス感染に対する感受性におけるインターフェロン反応の役割について洞察を与えるであろう。

COVID-19のパンデミックは、効果的な介入策を設計するために、呼吸器系ウイルスの拡散を理解し予測することの緊急性を浮き彫りにしている。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の感染は、毎年秋に流行するライノウイルスと2020-21年の冬季インフルエンザシーズンと交差すると予想される。ここで紹介する研究は、ライノウイルスや他の呼吸器系ウイルスがSARS-CoV-2に干渉するかどうかという問題を提起している。研究によると、IAVや他の多くのウイルスと同様に、SARS-CoV-2もインターフェロンによって阻害されることが分かっている。ライノウイルスによる干渉が2009年にヨーロッパで流行したIAVを崩壊させたのであれば、ウイルスによる干渉、あるいは気道インターフェロン反応の治療的誘導は、現在のパンデミックを崩壊させる可能性を持っているかもしれません。しかし、SARS-CoV-2のウイルス侵入受容体であるACE2がそれ自体ISGであるという証拠を考慮すると、ライノウイルスおよび気道インターフェロン反応のSARS-CoV-2への影響を確立するためには、さらなる研究が必要である。

最後に、今回報告された結果は、ライノウイルス感染症に関する現在の概念の再評価を示唆するものである。ライノウイルスは風邪の原因として古くから知られているが、過去10年の研究により、ライノウイルスは無症状の人にも予想外に高い確率で存在し、無症状の感染でも気道粘膜でのISG発現を誘発することが明らかになった20-22,26-28。この結果は、ライノウイルスが病原体となり得る一方で、ライノウイルス感染が上皮性自然免疫のセットポイントを変化させてより病原度の高いウイルスによる感染を阻止し、宿主保護として機能しているかもしれないという示唆を与える。実際、北半球では毎年秋の再入学に伴うライノウイルスの流行が、毎年罹患率と死亡率の重要な原因である冬のインフルエンザの流行時期や重症度を決める大きな要因になっている可能性があります。今回発表された知見は、これまでの研究と合わせて、毎年の季節性インフルエンザ流行や現在進行中のCOVID-19パンデミックを含む呼吸器系ウイルス流行の予測や介入策の設計の取り組みにおいて、ウイルス干渉を考慮すべきことを示唆している。

研究の背景
本研究以前のエビデンス
ライノウイルスとA型インフルエンザウイルス（IAV）の干渉に関連するあらゆる言語の論文を、データベース開設から2020年5月10日までに、検索語「ライノウイルス」「ウイルス干渉」「ライノウイルス」「干渉」でPubMedおよびWeb of Scienceで検索した。ライノウイルスを介した干渉を示す可能性のある論文をすべて捉えるため、インフルエンザという用語は含めなかった。秋のライノウイルスの流行が、ヨーロッパにおける2009年H1N1パンデミックIAVの拡散を妨害し、遅延させたことを示唆するデータが3報で示された。1000人以上の呼吸器検体を対象とした5つの研究では、患者におけるライノウイルスとIAVの共検出率が予想より低いことが報告された。また、高用量のライノウイルスを接種することで、その後のIAV感染が減衰することを示した研究が1件ありました。

本研究の付加価値
ライノウイルスとIAVの干渉について、臨床データと実験モデルを用いて評価しました。成人患者を対象とした初めての研究で、3年間の両ウイルスの共流行のピーク時に、ライノウイルスとIAVの間に有意な負の相関があることを観察した。我々は、他の患者集団における共検出解析とデータ共有のためのウェブツールを紹介する。また、生体外で分化させたヒト気道上皮への連続感染を用いた新しい干渉の実験モデルも紹介する。ライノウイルスの複製をサポートしない動物モデルとは対照的に、このモデルでは両方のウイルスが複製されます。緑色蛍光タンパク質レポーターIAVと2009年パンデミックのIAV分離株を用いて、ライノウイルスの前感染がその後のIAV感染を抑制することを明らかにした。さらに、ライノウイルス感染歴があると気道上皮で抗ウイルス反応が誘導されること、宿主細胞で自然免疫シグナルを遮断するとライノウイルス感染後にIAVの複製が回復することも明らかにした。この研究は、ライノウイルスがIAV感染に干渉することの明確な臨床的および実験的証拠を提供し、今後の研究のために生理学的に適切なモデルを確立するものである。

利用可能なすべてのエビデンスの意味するところ
本研究は、ライノウイルスがその後のIAV感染から身を守ることを示す有力な証拠であり、ライノウイルスによる干渉が欧州における2009年IAVパンデミックの拡大を遅らせたという考えを支持するものである。これらの知見は、ウイルスの干渉が流行を形成し、それを中断させる可能性があることを示しており、季節性インフルエンザの流行や現在進行中のCOVID-19パンデミックの予測や介入策の設計に際して考慮されるべきものである。

補足資料
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謝辞
資金提供は、National Institutes of Health (K08 AI119139 to EFF), National Institute of General Medical Sciences (T32GM007205 to AW), and some by the Yale Department of Laboratory Medicine (to EFF)から一部提供されたものである。著者らは，Calin Sapatoru（Yale- New Haven Hospital, New Haven, CT, USA）とYale-New Haven Hospital Joint Data Analytics Team，およびYale New Haven Hospital臨床ウイルス学研究室のスタッフの協力に感謝したい．また、Veronika Shabanova (Yale University, New Haven, CT, USA)には、有益な議論をしていただいた。Sam Foxman（WH Hall High School, West Hartford, CT, USA）にはco-detection calculatorのウェブツールをデザインしていただき、謝意を表したい。

EFFは、研究実施中にNational Institutes of Healthから助成金を受けたことを報告し、提出した研究以外ではThe Hartwell Foundationから助成金を受けたことを報告する。さらに、EFFは出願中の特許出願WO2019/217296 A1の発明者であり、EFFおよびMLLは出願中の特許出願WO2018/071498 Alの発明者である。

脚注
利害関係の宣言

他のすべての著者は、競合する利益を宣言していない。

データの共有

図1および表の生データは、発表時にデータリポジトリで公開される予定です。

論文情報
Lancet Microbeに掲載されました。著者原稿; PMC 2021 Oct 1で入手可能。
最終編集版として出版
Lancet Microbe. 2020 Oct; 1(6): e254-e262.
オンライン公開 2020 Sep 5. doi: 10.1016/s2666-5247(20)30114-2
pmcid: pmc7580833
NIHMSID: NIHMS1628631
PMID: 33103132
呉杏樹、*ヴァリア・T・ミハイロヴァ、*マリー・L・ランドリー、およびエレン F・フォックスマン
実験室医学部門（A Wu BSE, V T Mihaylova PhD, Prof M L Landry MD, Prof E F Foxman MD）、内科部門（Prof M L Landry）、免疫生物学部門（A Wu, Prof E F Foxman）, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA
*等しく貢献
貢献者

EFFは本研究を構想した。EFFはこの研究の構想を練った。臨床データの収集と解析はAW、実験計画の立案と実行はVTMとEFFが行った。MLL は、臨床データと情報を提供し、データの解釈に貢献した。EFFは、すべてのデータ分析を検討し、原稿の第一稿を執筆した。すべての著者は、データ分析、解釈、原稿の重要なレビューに貢献した。最終原稿は全著者が承認した。
連絡先 Prof Ellen F Foxman, Department of Laboratory Medicine, Yale, University School of Medicine, New Haven, CT 06520, USA, ude.elay@namxof.nelle。
著作権表示
本論文は、CC BY 4.0ライセンスに基づくオープンアクセス論文である。
この論文の出版社による最終編集版は、Lancet Microbeで無料で入手できます。
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