マグネシウムはFoxp3+ Treg細胞の数を増やし、腸内細菌叢を介したIL-10依存的な方法で関節炎の重症度と関節損傷を軽減する

論文|92巻104603号、2023年6月号
マグネシウムはFoxp3+ Treg細胞の数を増やし、腸内細菌叢を介したIL-10依存的な方法で関節炎の重症度と関節損傷を軽減する

https://www.thelancet.com/journals/ebiom/article/PIIS2352-3964(23)00168-8/fulltext

テレジーナ・ララギオネ
キャロライン・ハリス
ナシム・アジズゴルシャニ（Nasim Azizgolshani
クリスティン・ビートン
ゲロルド・ボンガースd
ペルシオ・S・グルコ

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オープンアクセス公開日：2023年5月16日DOI:https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2023.104603
PlumX メトリクス
概要
背景
関節リウマチ（RA）は、環境およびマイクロバイオームの危険因子が出現している一般的な自己免疫疾患である。西洋の食事は一般的にマグネシウム（Mg）が不足しており、Mgが抗炎症作用を持つ可能性を示唆するいくつかの証拠がある。しかし、関節炎やT細胞サブセットにおけるMgの補給の実際の役割については、これまで検討されていませんでした。
研究方法
我々は、KRN血清で誘発されたRAおよびコラーゲン誘発関節炎の2つの異なるマウスモデルにおいて、高Mg食の役割を調査した。また、脾臓細胞の表現型、遺伝子発現、および糞便材料移植（FMT）を含む広範な腸内細菌叢の分析も行った。
所見
高Mg食群は、関節炎の重症度と関節損傷が減少し、IL-1β、IL-6、TNFαの発現が減少し、有意に保護された。また、高Mg食群はFoxp3+ Treg細胞およびIL-10産生T細胞数を増加させた。IL-10ノックアウトマウスでは、高Mgの保護効果は消失した。高Mg食マウスのFMTは、関節炎の重症度の低下、Foxp3+ Tregの増加、IL-10産生T細胞の増加など、食餌処理マウスで見られた表現型を再現した。16S rDNA配列解析による腸内細菌叢の解析では、高Mg群では関節炎に関連するPrevotellaが減少し、Bacteroidesや短鎖脂肪酸の産生増加に関連する他の細菌が増加するなど、食事特異的な変化が認められた。メタゲノム解析により、L-トリプトファン生合成やアルギニンデイミナーゼなどの経路が追加された。
解釈
我々は、関節炎の抑制、Foxp3+ T reg細胞の拡大、IL-10の産生におけるMgの新しい役割を説明し、これらの効果が腸内細菌叢によって媒介されることを示す。この発見は、RAやその他の自己免疫疾患や炎症性疾患を治療するために、腸内細菌叢を改変する新しい戦略を示唆している。
資金提供
なし
キーワード
関節リウマチ
高マグネシウム食
マイクロバイオーム
トレグ
IL-10
炎症
自己免疫
略号
RA（Rheumatoid arthritis）、Mg（Magnesium）、IL-10 KO（B6. 129P2-IL10tm1Cgn/J）、IL17-GFP（GFP誘導型C57BL/6-IL17atm1Bcgen/J）、KRNマウス（KBxN TCR transgenic mouse）、CIA（collagen-induced arthritis)、 KSIA（KRN血清誘発性関節炎）、Mg500（Mg500ppm（通常のMg食））、Mg2800（Mg2800ppm（高Mg食））、Treg（Foxp3+制御性T細胞）、Th17（T helper type 17）、 Tr1（IL10産生制御性T細胞）、Tfh（T濾胞ヘルパー細胞）、Tconv（従来のT細胞）、ASV（アンプリコン配列変異）、LDA（線形判別分析）、LefSe（線形判別分析効果量（LefSe）分析）、FDR（誤発見率）、FMT（糞便物質移植）。
研究の背景
はじめに
関節リウマチ（RA）は人口の1％近くが罹患しており、障害のリスク増加や死亡率の上昇と関連しています。
1
RAは、遺伝的要因と環境的要因の両方が疾患に関与している。
2
疾患感受性に関与する遺伝子に関する知識は、著しく拡大している、
3
環境および食事による疾患への影響についてはほとんど知られていません。
4
過去20年間で、より効果的な新しい治療法が開発されたにもかかわらず、RAの疾患寛解は依然として稀である。
5
そのため、リスクとなる環境因子や食事因子を特定し、修正することで、疾患の制御をさらに向上させる可能性があります。
マグネシウム（Mg）は、細胞内で2番目に多い陽イオンであり、多くの細胞内生化学機能において重要な役割を担っています。
6
短期間のin vitro研究では、Mgの濃度を高めると、LPSによるTNFα、IL-6、IL-8などの炎症性サイトカインの産生が減少し、単球や内皮細胞におけるNFκBの活性化が抑制されることが示されました、
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一方、Mgの濃度が低下すると、炎症が促進され、NFκBが活性化することが報告されています。
9
RAではTNFα、IL-6、IL-8の濃度とNFκB活性が上昇し、関節炎症と関連し、滑膜の過形成や関節障害に関与しているとされています。
1
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さらに、Mgは米国の食事では一般的に不足しており、人口の40％近くが必要量以下の摂取しかしていません。
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そこで、我々は、米国で一般的なMg不足の食事は、RA感受性や疾患の重症化に寄与する炎症性経路を促進する可能性があると考えた。我々は、Mgの投与がRAまたはRAのげっ歯類モデルの治療に有益である可能性を仮定した。
腸内細菌叢は、局所および全身の免疫反応を促進する上で重要な役割を担っている。
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腸内の異なる細菌集団のバランスは、Foxp3+ TregやTr1などのT細胞サブセットの数に異なる影響を与え、自己免疫反応や炎症反応を制御する上で中心的な役割を担っている。実際、腸内細菌叢の変化は、RAを含むヒトの自己免疫疾患に対する感受性と関連している、
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16
全身性エリテマトーデス
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糖尿病である、
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多発性硬化症
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などが挙げられます。RA患者の微生物組成は健常対照者と異なり、特にBacteroidesとBifidobacteriumのファミリーに属する細菌が減少し、Prevotellaが著しく増加しています。
14
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21
現在までのところ、RAを治療するために腸内細菌叢をうまく変化させた戦略は知られていない。
本研究では、2つの確立されたRAモデルにおいて、高Mg食が疾患の重症度と関節損傷を軽減することを初めて明らかにした。さらに、高Mg食は、Foxp3+ Treg細胞の数とIL-10産生T細胞の数を増加させる腸内細菌叢に誘導される変化を介して関節炎を調節することを証明した。さらに、これらのMgによる変化は、IL-10によって媒介されることを説明した。この発見は、Mgの経口投与が、RA、そしておそらく他の炎症性疾患や自己免疫疾患に対する、安価で穏やかな新しい治療法になる可能性を示唆している。
方法
マウス
雄のC57BL/6マウスをTaconic社（Rensselaer, NY）から購入した。雌雄のC57BL/6J、B6.129P2-IL10tm1Cgn/J（IL-10 KO）、GFPinducible- C57BL/6-Il17atm1Bcgen/J, 雄DBA/1J マウス、NOD/ShyltJはJackson Laboratories (Farmington, CT) から入手した。Th17誘導性の腸内レベルにおけるC57BL/6の既知の差を考慮し、Segmented filamentous bacteria（SFB）の
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は、TaconicとJacksonの両マウスを試験したところ、KSIAの高Mg2800食によって同様に保護された。したがって、すべてのマイクロバイオームおよびFMTの実験では、Taconicマウスのみを使用しました。KBxN（KRN）TCRトランスジェニックマウス（C. Benoist博士、マサチューセッツ州ボストンからの贈り物）は、Mount Sinaiで繁殖され維持された。マウスは特定の病原体を含まない条件下で飼育され、すべての実験はMount Sinai Institutional Animal Care and Use Committee（プロトコル番号2014-0283）により承認されたプロトコルに基づいて行われた。マウス実験は、ARRIVEガイドライン（www.ARRIVEguidelines.org）に従って計画した。
関節炎の誘発とスコアリング
コラーゲン誘発性関節炎（CIA）
8〜12週齢の雄のDBA/1Jマウスに、0日目にComplete Freund's Adjuvant（Hooke laboratories, Lawrence, MA）中の1mg/mlの鶏II型コラーゲン乳剤50μLを尾部に皮下注射し、21日目にIncomplete Freund's Adjuvant（Hooke laboratories）中の1mg/mlの鶏II型コラーゲン乳剤を含むブースター50μLが与えられた。
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マウスは71日間追跡し、週に3回採点した。
KRN血清誘発関節炎（KSIA)
KRN TCRトランスジェニックマウスをNODと交配し（KRN × NOD F1）、60日齢の関節炎マウスから関節炎誘発性血清を採取した。異なるバッチの血清をプールし、0日目と2日目に100μL IPで雄C57BL/6マウスに投与した。マウスは典型的には3日目に関節炎を発症し、6～15日間追跡し、週に3回採点した。
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関節炎の活動性と重症度のスコアリング
臨床的な関節炎スコアは、既報のように1日1マウスあたり0から16までのスコアリングスケールに従って決定された。1＝単一の関節の腫れと紅斑、2＝複数の関節の腫れと紅斑、3＝肉球全体の腫れ、4＝肉球の腫れと体重負荷不能の意味。
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組織学および組織学的スコアリング
関節炎観察期間終了後、マウスを安楽死させ、前足を10％ホルムアルデヒドで固定し、塩酸と0.1M EDTAを含む溶液（Cal-Ex；Fisher Scientific, Fairlawn, NJ）で脱石灰した。組織はパラフィンに包埋し、スライドを作成し、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。スライドは、滑膜炎症、滑膜過形成、軟骨、骨びらんの各パラメーターを含む複合スコアリングシステムにより、盲検法で評価した（Supplemental Table S1）。
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小腸と大腸を採取し、組織検査のために「スイスロール」した。
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免疫組織化学（IHC）は、Ventana Discovery Ultra（ロシュ、スイス）を用いて行った。マウス抗Foxp3モノクローナル抗体（ab20034、Abcam、Cambridge、UK）を1：6000希釈で使用し、30分インキュベートした。二次抗体としてDiscovery OmniMap anti-mouse-HRP（Roche 760-4310）を使用し、Discovery ChromoMap DAB RUO（Roche 760-2513）を用いてシグナルを取得しました。その後、組織をヘマトキシリンで染色し、核を可視化した。
食餌の組成とレジメン
飼料
飼料はTeklad-Envigo Laboratories (Somerset, NJ)から購入した。マウスは、マグネシウムの量を除いて、同一の飼料を摂取した。具体的には、飼料は照射され、以下の内容（g/kg）であった：タンパク質（17.7）、炭水化物（64.4）、脂肪（6.2）、カゼイン（200）、DL-メチオニン（3.0）、スクロース（415）、コーンスターチ（250）、ダイズ油（60）、セルロース（30）、ビタミン混合（Teklad 40060）, エスオキサイド（抗酸化剤）（0.01）, 二塩基リン酸カルシウム（13. 7）、クエン酸カリウム（一水和物）（7.7）、炭酸カルシウム（4.8）、塩化ナトリウム（2.6）、硫酸カリウム（1.82）、クエン酸第二鉄（0.25）、炭酸マンガン塩（0. 12）、炭酸亜鉛（0.056）、硫酸クロムカリウム（十二水和物）（0.02）、炭酸銅（0.012）、ヨウ素酸カリウム（0.0004）、亜セレン酸ナトリウム（五水和物）（0.0004）です。通常の（ノーマル）マウスMg飼料は、酸化Mg 0.822g/kg of chow（Mg 500ppm）（全米研究会議農業委員会動物栄養委員会実験動物栄養小委員会の定義による。）
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高Mg飼料は、酸化Mgを2.3g/kg（Mg 2800ppm）含有するものであった。
KSIAにおけるMgの食餌療法
雄のC57BL/6マウスを、KSIAを誘発する14日前から通常のMg食Mg500または高Mg食Mg2800のいずれかを与えるようにランダムに割り当て、組織採取のための6-9日目までその食餌を続けた（Supplemental Fig.S1A）。より長い実験Mg2800食を、KSIAの誘導後15日目まで継続した（図1A）。糞便サンプルは、実験開始時（14日目）、KSIAの誘導前（0日目）、実験終了時（それぞれ6日目または15日目）に採取した。
図1Mg2800飼料を摂取したマウスは、KSIAにおける関節炎の重症度が低下した。A) 実験のタイムライン：KSIAの誘導に関連して：14日目の食事開始、0日目と2日目のKRN血清注入、15日目の食事およびKSIAスコアリング期間の終了；B) Mg2800の食事を摂取したマウスでは、Mg500と比較して関節炎の重症度スコアが著しく低下した（各処理群n = 25；＊p = 0.0005および＊p < 0.0001). C) 15日目の両Mg食群の関節の代表画像（ヘマトキシリン／エオシン、H&E染色；左パネルが低倍率、ボックス部分が右パネルで拡大；12日目、H&E、サイズバー＝500μMと250μM）；D) 滑膜の炎症、過形成、軟骨のびらん（＊p≦0.03；各群n＝9-10）および骨（＊＊p＜0.002；各群n＝9-10）についての関節組織学スコアリング。
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CIAにおけるMgの食餌療法
雄のDBA/1Jマウスを、CIA誘導の14日前（day-14）からMg500またはMg2800のいずれかの食餌にランダムに割り当てた。この食餌は、初回免疫後さらに3日間続けられ、合計17日間継続された。3日目（CIA誘導の3日後）にMg2800群のマウスはMg500食に切り替えられ、実験終了（71日目）まで継続された。糞便サンプルは、実験開始時（14日目）、異なる食餌の17日間投与後（3日目）、実験終了時（71日目）に採取した（Fig. 2A）。
図2Mg2800飼料を摂取したマウスは、CIAの重症度が低下した。A) 実験のタイムライン：CIA誘導に対するもの：14日目の食餌開始、0日目のCIA誘導、3日目のMg2800食を中止してマウスを通常のMg500食に切り替え、21日目のCIAブースターと71日目の実験終了；B) Mg2800食を投与したマウスではMg500と比較して関節炎重症度スコアが有意に低かった（各群n = 10; ＊p ≦ 0. 03）；C）Mg500およびMg2800飼料で処理したマウスの代表的な関節組織学（72日目、H＆E染色；左パネルは低倍率、ボックス領域は右パネルで拡大；12日目、H＆E、サイズバー＝500μMおよび250μM）。
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糞便微生物叢の採取と移植
ナイーブな雄のC57BL/6マウス（ドナー）を、上述の2つの食餌のうち1つに16日間置いた。14日目と15日目に糞便サンプルを採取し、水（75gr/L）でホモジナイズし、40μMメッシュを用いて濾過した。レシピエントオスのC57BL/6は、メトロニダゾール（140mg/kg）、ネオマイシン（140mg/kg）、およびバンコマイシン（10mg/kg）の組み合わせからなる経口ガベージによる抗生物質処理を5日間毎日受けた。マイクロバイオームの枯渇を確実にするため、Eubacterium（Eub）およびBacteroides fragilis（Bfrag）のプライマーを用いてqPCR（糞便DNA）を実施した。ドナーの糞便材料ホモジネート（200μL/マウス/日）を、5日間毎日経口投与でレシピエントに移植した。レシピエントマウスは、実験期間中、Mg500飼料で飼育した。KRN関節炎血清は、便のガベージ開始3日後と5日後に投与し、12日間にわたってスコア化した。糞便サンプルは、抗生物質投与前（5日目）、投与後（0日目）、関節炎実験終了時（12日目）に採取しました。脾臓、滑膜、腸は、組織学、遺伝子発現、フローサイトメトリーのために採取された。
図. 3Mg2800食はサイトカインおよび他の炎症メディエーターのレベルに有意な影響を与える（qPCR）。A) IL1β、B) IL6、C) Tnfα、D) Cxcl10のレベルは、Mg2800群で有意に減少した。E)IL10は、KSIAの初期時点（6日目）およびF)後期（15日目）において、Mg2800食で増加した。G) MMP3はMg2800群の滑膜で減少した（データは平均±SEMで示す；（＊p≦0.04；＊＊p≦0.005））。
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図4Mg2800食のT細胞サブセットに対する初期効果および持続効果 KSIAを発症したMg2800食群では、脾臓細胞T細胞サブポピュレーションに以下の変化がみられた： A) GFP+IL17+細胞の割合が減少；B) 6日目にCD4+Foxp3+T細胞の割合が増加；C) CD4+Foxp3+細胞は15日目でも増加したまま；D) 6日目および15日目にCD4+IL10+の割合が増加した；E)； F) CD4+Foxp3+IL10+細胞は6日目に増加し、G)、15日目でも増加したままであった；H) Tfh IL10+細胞は9日目とI)15日目に増加した；J) Tr1 IL10+細胞の9日目の増加（結果は平均±SEMとして示す；＊p ≦ 0. 03；＊＊p＝0.001）；K) 15日目もTr1 IL10+の数は増加したが、その差は統計的有意差には至らなかった。
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図5Mg2800食群からの糞便材料移植（FMT）レシピエントはKSIAで保護された。A）0日目をFMTの初日とするタイムライン（ATB＝抗生物質）；B）Bacteroidis fragilis（Bfrag）およびEubacteria（Eub）の糞便DNA qPCRにより、抗生物質（D0）後の細菌枯渇を確認；C）関節炎の重症度はMg500グループ（n＝9）と比較して、Mg2800ダイエットグループ（n＝7）のFMT受信者で著しく減少；D）。Mg2800食のFMTレシピエントはほぼ正常な構造を保っているのに対し、Mg500食のレシピエントは顕著な滑膜過形成、細胞浸潤、血管新生を伴うびらん性変化を示した代表的な組織像（左パネルが低倍率、ボックス部分が右パネルで拡大したもの； 12日目、H&E、サイズバー＝500μMおよび250μM）；E）組織学的スコアリングにより、レシピエントにおいて滑膜炎症の有意な減少、滑膜過形成の減少、軟骨および骨のびらんが減少した（Mg2800．n = 7, Mg500: n = 9; ∗∗p < 0. 007).
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定量的PCR（qPCR）
関節炎スコアリング期間終了後に脾臓、腸、足関節滑膜の組織を採取し、直ちに液体窒素で凍結した。組織をホモジナイズし、RNeasy Kit（Qiagen, Germantown, MD）を用いて全RNAを分離した。各サンプルから200 ngの総RNAをcDNA合成に使用した（ABI high-capacity reverse transcription kit, Thermo Fisher, Waltham, MA; Supplemental Table S2のプライマーを参照）。マウスアクチンは内因性コントロールとして使用した。
マウスナイーブ CD4+T細胞の単離と分化
ナイーブCD4+ T細胞は、EasyStep Mouse Naïve CD4+ T cell isolation kit（StemCell Technologies, Vancouver, Canada）を用いて、製造者の指示に従って免疫磁気ネガティブ選択によりC57BL/6脾臓から分離した。次に、細胞をRPMIで1×106細胞／mlに再懸濁し、1μg／mlの抗CD3抗体（クローン：145-2C11；Biolegend、San Diego、CA）でプレコートした96穴プレートにプレーティングした。異なるT細胞サブセットの分化を誘導するためにサイトカインを補充した培養液： Treg：TGFβ1 5 ng/ml（R＆D Systems、Minneapolis、MN）＋mIL-2 100 U/ml（R＆D）；Th17：mIL-6 20 ng/ml（R＆D）＋TGFβ1 5 ng/ml； Tr1：mIL-2750ng/ml（バイオレンド）； Tfh：mIL-6 100 ng/ml ＋ mIL-21 50 ng/ml（R＆D）。
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可溶性抗CD28（クローン：37.51、Biolegend）を各ウェルに1μg/mlずつ添加した。これらの条件は、フローサイトメトリー分析の前に、37℃で5日間、3連で実行したインビトロ実験（下記）で使用された。
インビトロでの処理
CD4＋ナイーブ細胞がT細胞サブセットに分化する能力を試験するため、及びTconvの増殖を抑制するTregの能力を試験するために、3つの異なる処理を使用した：a. 異なる濃度のMg（MgCl2）（ThermoFisher）の効果：異なる濃度のMgCl2（低＝0. 4 mM または 0.972 mg/dl; 通常 = 0.8 mM または 1.944 mg/dl; 高 = 1.6 mM または 3.889 mg/dl）を実験中（分化は5日間、Treg抑制は72時間）； b. 選択したMgチャネルのアゴニストおよびアンタゴニストによる影響： Rocaglamide（TRPM6アゴニスト）5μM（Millipore-Sigma、Burlington、MA）、Mesendogen（TRMP6アンタゴニスト）10μM（Aobious、Gloucester、MA）、Naltriben（TRPM7アゴニスト）50μM（Millipore-Sigma）またはNS8593（TRPM7アンタゴニスト）20μM（Millipore-Sigma）は3重で上記に示した時間ウェルに加えられた；c．選択されたMgチャネルのsiRNAノックダウンの効果： 分化または抑制実験を開始する72時間前に、TRPM6、TRPM7、MAGT1、またはsiRNAコントロール（Dharmacon Accell, Cambridge, UK）に対する1μM siRNAを細胞に添加し、qPCRによってノックダウンを確認しました。
フローサイトメトリー解析
脾臓を採取し、個別に解析した。単一細胞懸濁液（3×106）を、細胞表面抗原の蛍光標識モノクローナル抗体で染色し、25℃で10分間インキュベートした。細胞内染色は、Cytofix/Cytoperm™（BD Bioscience, San Jose, CA）で4℃、20分間固定し、1X Perm/Wash™ solution（BD Bioscience）で15分間透過させた。固定した細胞を蛍光色素結合抗体で4 ℃、暗所にて1時間染色した。CD4+CD25+Foxp3+制御性T細胞（Treg）は、抗CD4-Vioblue（クローン：VIT4）、抗CD25-APC（クローン：4E3）、および抗Foxp3-PE（クローン：3G3）（すべてMiltonyi、Bergisch Gladbach、ドイツ製）で染色されました。Th17細胞は、抗CD4-Pacific Blue（クローン：RM4-5）、および抗IL-17-PerCP/Cy5.5（クローン：TC11-18H10.1）を用いて分析した。Tr1細胞は、抗CD4-Pacific Blue（クローン：RM4-5）、抗CD45RA-PE（クローン：14.8）、抗CD49B-PeCy7（クローン：DX-5）、抗LAG3-APC（クローン：C9B7W）、および抗IL-10-PerCP/Cy5.5（クローン：JES5-16E3）により特定した。最後に、Tfh細胞を、抗CD4-Pacific Blue（クローン：RM4-5）、抗CXCR5-biotin-APC（クローン：2G8）、抗PD1-PeCy7（クローン：RMP1-30）、抗BCL6-PE（クローン：IG191E/A8）、および抗IL-10-PerCP/Cy5.5（クローン：JES5-16E3）（バイオレンドまたはバイオサイエンスの抗体）で染め上げた。1サンプルあたり少なくとも50,000個の細胞を取得した。すべてのサンプルは、BD LSRII（BD Biosciences）またはAttune（Thermo Fisher）フローサイトメーターで取得し、De Novo FCS Express（Pasadena, CA）で解析した。
糞便DNA抽出、16S rDNA増幅、マルチプレックスシークエンス、メタゲノミクス解析
0.1 mm Zirconia/Silica Beadsを400 μL含むDNA抽出バッファ（4.3 mM Tris, pH 8; 0.4 mM EDTA, 43 mM NaCl, 3% v/w SDS, 42% v/v phenol/chloroform/IAA and 21% v/v QIAquick PM buffer）を便サンプルに加え、既出の方法によりサンプルを5分間 BioSpec Mini-Beadbeater-96 でビーズビートした。
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遠心分離（5分、4000rpm）後、約400μLの水層を650μLのQIAquick PM bufferと混合し、QIAquick 96 PCR Purification Kit（Qiagen）を用いてDNAを精製した。DNA濃度は、Quant-iT dsDNA Assay Kit, broad range (Life Technologies)を用いて測定し、ベックマンの液体処理ロボットで2 ng/μLに正規化した。アンプリコンの調製とシークエンスは、以前に記載されたとおりに実施した。
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簡単に説明すると、テンプレートなしのコントロールを含む細菌16S rDNA PCRは、二重インデックスのプライマーを使用して、別のPCRワークステーションでセットアップした。PCR反応には、各プライマー1μM、4ng DNA、およびPhusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific）が含まれた。反応は98℃で30秒、98℃で10秒、45℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを50回行い、72℃で2分間の最終伸長を行った。アンプリコンは、ゲル電気泳動で評価した。各アンプリコンの等容量量を組み合わせ、サイズ選択し、AMPure XPビーズ（0.8X、Beckman）を用いて濃縮して、シーケンスライブラリーを調製した。ライブラリー濃度をQubitおよびqPCRで定量し、15% PhiXと混合し、4pMに希釈し、Illumina MiSeqシーケンサーでペアエンドシーケンス（Reagent Kit V2, 2 × 150bp）に供しました。
統計データ
治療群あたり7～15匹のマウスが、関節炎スコアの30%減少を80%～93%の検出力で検出できると計算し、p≦0.05とした。平均値はt検定またはペアt検定で、中央値はGraphPad Prism 6 (San Diego, CA)を用いて示されるたびに順位和検定で比較した。関節炎実験中の各時点における各治療群の関節炎スコアは、t検定または順位和検定を使用して、実験中の同じ時点における他の群のスコアと比較した。QPCR解析では、StepOneソフトウェアv2.3（Thermo Fisher；補足表S2上のプライマーおよびプローブ）で得られたCt（閾値サイクル）を用いた。Ctは各サンプルのActinで調整した（ΔCt）。RelCt（2-ΔCt×10,000）値はt-testで比較し、遺伝子発現の倍数差は2-ΔΔCtで求めた。
37
マイクロバイオーム解析のため、シーケンスのfastqファイル（各サンプルの平均カウント数42,360±10,250）をQIIME2バージョン2019.10を用いて解析した。
38
し、DADA2
39
denoised-pairedプラグインを使用し、切り捨て長をフォワードリード150bp、リバースリード145bpとした。アンプリコン配列変異（ASV）は、Scikit-Learnプラグインを使用して分類されました。
40
silva-132-99-515-806-nb-classifierで学習させたNaive Bayes分類器を用いて分類した。得られたASVテーブルは、最小深度5000、最小ASV頻度10、最小サンプル頻度2を用いてフィルタリングされ、Qiime2コアメトリクスプラグインを使用してコアメトリクスが計算された。統計解析は、LEfSe
41
v1.0.8 post1 または R v3.6.1 に実装されている Kruskal-Wallis および Wilcoxon を用いて行った。プロットはすべて R/ggplot2 を用いて作成した。
42
または R/pheatmap を用いて作成した。メタゲノム機能は PICRUSt2 を用いて予測した。
43
ANOVAで偽発見率（FDR）補正p値<0.05、Tukeyのポストホックテストp<0.05となった比較は、統計的に有意と判断した。
結果
高Mg食（Mg2800）は、KSIAおよびCIAモデルにおいて、関節の炎症および関節炎の重症度スコアを有意に低下させた。
KSIAでは高Mg食は保護的である
KSIA発症後8日目および9日目の時点で、Mg2800（高Mg）食を投与したマウスは、Mg500（通常）食と比較して関節炎の重症度スコアが有意に低かった
33
,
44
(図1AおよびB、ならびに補足図S1A-D）。この保護効果は、15日目の実験終了時まで持続し、関節炎の重症度スコアは20%から40%の範囲で有意に減少した（図1AおよびB）。組織学的には、Mg2800グループは、9日目に滑膜炎症スコアが54％低下し、滑膜過形成が53％低下し（補足図S1D）、15日目には炎症とびらん性変化が減少した（図1CおよびD）。経口Mgは腸で吸収され、吸収されなかったMgは糞便とともに排出される。吸収されたMgと過剰なMgは腎臓から排泄される。Mg500群とMg2800群のマウスは摂食パターンが似ており、腎機能が正常なマウスで予想されるように、体重に有意な変化はなく（補足図S2A）、Mgの血清レベルにも差はなかった（補足図S2B）。
高Mg食はCIAにおいて保護的であり、びらん性関節損傷を減少させる
高Mg食（Mg2800）の保護効果の持続時間、およびびらん性関節変化における効果を調べるために、RAの慢性的でよりびらん性モデルであるCIAを使用した。マウスはCIA誘発の14日前から17日間Mg2800食を与え、その後Mg500（同コントロール食群）に切り替え、実験終了の71日目まで続けました（図2A）。短期間のMg2800群は保護され、コントロールと比較して関節炎重症度スコアが61%減少に達した（42日目にp = 0.03; Fig. 2B）。Mg2800の保護効果は49日目（Mg2800食の中止から46日後）まで持続し、42日目から49日目まで統計的有意性を示した（図2B）。関節保護効果は持続し、軟骨びらん（48％、p＝0.05）および骨びらん（48％、p＝0.05）が対照群と比較して減少し、Mg2800群では正常な関節構造が維持された（図2Cおよび補足の図S3）。
高Mg食は、炎症性遺伝子および走化性遺伝子の発現を低下させ、IL-10のレベルを増加させた
KSIAマウスの発病ピーク（6日目）前に得られた脾臓細胞をqPCRで解析すると、炎症性サイトカインIL-1β、IL-6、TNFα、CXCL10のレベルが著しく低下した（図3A-D）。IL-10のレベルは、コントロールと比較してMg2800食群で増加し、疾患の後期（15日目まで）でさらに高くなった（図3EおよびF）。
KSIAモデルのMg2800マウスの滑膜組織では、MMP3の発現が低下した（図3G）。
食餌性Mg含有量はT細胞サブセット数に影響する
Mg2800食のKSIAマウスは、6日目にコントロールのMg500と比較してIL17GFP+細胞数が減少した（33.49%; p = 0.03; Fig. 4A）。また、6日目には、CD4+Foxp3+Treg細胞の数が、Mg500食と比較して6倍近く増加した（平均22.05 vs 3.29; p = 0.03; Fig. 4B）。15日目のFoxp3+ Treg細胞の数は、Mg500グループよりも2倍高いままであった（図4C；ゲーティング戦略については補足図S4参照）。
Mg2800グループはまた、6日目にCD4+IL10+細胞の数が約2倍増加し（p = 0.03；図4D）、その数は15日目まで上昇したままだった（p < 0.05；Fig. 4E）。Foxp3を発現するCD4+IL10+のサブセットも、6日目と15日目の両方でMg2800食群で拡大した（それぞれ、p = 0.02 と p = 0.001; 図4FとG）。
我々は、KSIAの初期段階9日目と後期段階15日目の両方でMg2800食で拡大したIL10を発現するTfh細胞のサブセットを特定した（図4HおよびI）。これらのIL10+細胞は、最近、制御特性を持つTfh（Tfr）として説明されている。
45
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46
Tfh（CD4+CXCR5+PD1+BCL6+）細胞の数は、Mg2800食によって影響を受けなかった（データは示さず）。
IL10+Tr1細胞は、9日目にMg2800グループの脾臓細胞で増加した（図4J）。KSIAが解決期に入る15日目には、IL10+Tr1の数は両食事群で増加した。IL10+Tr1細胞の平均パーセンテージは依然としてMg2800群で高かったが、その差はもはや統計的に有意ではなかった（図4K）。この観察から、IL10+Tr1細胞はKSIAの治癒に重要な役割を果たし、Mg2800食がその数の増加を早めたという可能性が浮上した。CD4-IL10+細胞は、グループ間で有意な差はなかった（データは示さず）。
また、ナイーブC57BL/6マウスの異なる脾臓細胞集団の割合に対するMg食の影響も調べた。T細胞亜集団（補足図S5A-F）、CD19+ B細胞（補足図S5GおよびH）、IL10産生細胞（補足図S5I）の割合は、2つの食事グループ間で有意差がなく、炎症の文脈でMg2800食の効果がより顕著であることを示唆した。しかし、Mg2800群ではIL10+Tr1細胞の数が増加する傾向が見られた（補足図S5F；有意ではない）。
In vitroでのMg濃度の変化、または選択されたMgチャネルへの干渉は、CD4+ナイーブT細胞のFoxp3+ Tregまたは他のT細胞サブセットへの分化に影響を与えなかった。
次に、CD4+ナイーブT細胞の異なる細胞サブセットへのin vitro分化における、細胞外Mg濃度の変化の役割を調べた。Mg濃度の増加は、ナイーブT細胞のTreg、Th17、Tr1、またはTfh細胞へのin vitro分化に大きな影響を与えなかった（データは示さず）。さらに、ナイーブT細胞のT細胞サブセットへの分化における特定のMgチャネルの役割を、siRNAによる遺伝子サイレンシング（TRPM6、TRPM7、MAGT1）、またはTRPM6とTRPM7のアゴニストやアンタゴニストによる処理で検討した。これらの処置はいずれも、ナイーブT細胞のT細胞サブセットへの分化に有意な変化を誘発しなかった（データは示さず）。
Mg2800食を摂取したドナーマウスからの糞便微生物叢移植（FMT）は、レシピエントマウスにおいて関節炎予防効果を伝達し、Foxp3+ Treg細胞数を増加させる。
高Mg食による関節炎の重症度やT細胞サブセットの変化が腸内細菌叢に依存しているかどうかを調べるために、FMT実験を行った（図5A）。Mg500またはMg2800のいずれかの食餌を14日間摂取した健康なマウスから糞便を採取した。レシピエントマウスは、5日間、毎日経口投与で抗生物質を投与された。抗生物質の投与により、細菌のレベルは著しく低下し、その後、FMT後に細菌が再増殖した（図5B）。
Mg2800飼料を投与したマウスのFMTレシピエントは、KSIAの12日目までに関節炎の重症度がほぼ50％減少し（p = 0.04；図5C）、これは飼料実験（図1B）で認められた効果と同様であった。Mg2800のFMTレシピエントはまた、組織学的に滑膜の炎症が減少し、滑膜の過形成が減少し、軟骨および骨のびらんが減少した（53％以上の減少；p＜0.007）（図5DおよびE）。
Mg2800のFMTのレシピエントは、脾臓Foxp3+ Treg細胞の割合が増加し（図6A、p＝0.002；ゲーティング戦略については補足図S4参照）、Tr1細胞の割合が増加し（p＝0.02；図6B）、Mg2800食を受けたKSIAマウスで見られた変化（それぞれ図4B及びJ）と一致していた。
図6Mg2800食群のFMTレシピエントは、Foxp3+ TregおよびIL10+ Tr1細胞数が増加している。A）Mg2800群からのFMTのレシピエントでは、Mg500と比較してFoxp3+ Treg細胞の数が増加している（＊p = 0.002）； B）Mg2800群のFMTレシピエントではIL10+ Tr1細胞の数が増加している（＊＊p = 0.02 （結果は平均±SEMとして示す））。
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次に腸を調べたところ、Mg2800 FMTのレシピエントの大腸絨毛でFoxp3+細胞の増加が検出されたが（p = 0.01, Mg2800 vs Mg500；図7）、小腸では検出されなかった（データ示さず）。
図7KSIAのMg2800グループからのFMTのレシピエントの大腸におけるFoxp3+細胞の数の増加。A）組織学的解析およびFoxp3免疫ペルオキシダーゼでカウンター染色したH&E染色スライドのmm2あたりのFoxp3+細胞の数のカウント（スライドあたり10フィールドを採点、平均±SEMで示す；＊p = 0.01）；B）Mg500グループおよびC）Mg2800グループのFMTのレシピエントのコロンの代表スライド；矢印はFoxp3+細胞（サイズバー＝50μM）を示す。
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高Mg食はTh17およびTreg細胞の分化に関連する腸内細菌叢を変化させる
関節炎とT細胞サブセットにおいて、Mg食とそれぞれのFMTレシピエントで観察された変化の類似性に基づいて、我々は高Mg食が腸内細菌叢に影響を与えていると仮定した。糞便中の細菌DNAを16S rDNA増幅と塩基配列決定で調査した。α多様性プロファイルは、Mg食開始前（14日目）、食餌中（0日目）、およびKSIA関節炎の実験終了時（15日目）に両群で類似していた（Supplemental Fig. S6A）。
LDA（線形判別分析）効果量（LEfSe）分析を用いて、相対的な存在量を用いて2つの食餌群間の細菌表現の差異を特定した。関節炎誘発日（0日目）には、24クレードが2つの食餌間で有意に異なり、8クレードがMg500グループで多く、16クレードがMg2800グループで多かった（図8A )。15日目には、29のクレードが有意に異なり、15クレードがMg500グループで発現量が増加し、14クレードがMg2800グループでより多く発現した（図8B）。また、0日目と15日目の両方において、各食餌群で異なる表現が残る特定の細菌群があり、Mg500群では4つ、Mg2800群では8つだった（図8AおよびB、それぞれ赤と青の太字で示す）。
図8Mg500またはMg2800の食餌後の腸内細菌叢の変化に関する線形判別分析（LDA）効果量（LEfSe）分析。LEfSeを用いたMg食に対する腸内細菌の特異的なフィロタイプ。ヒストグラムは、クレードレベルの特徴量について計算された有意なLDAスコアを示す。色は、その分類群が他のグループと比較してより豊富であったグループ（赤＝Mg500、青＝Mg2800）を表している。A) 0日目、B) 15日目。太字は、Mg500グループ（赤）、Mg2800グループ（青）において、より多く存在する細菌を持続的に示している。
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図9Mg500またはMg2800の飼料を与えた動物のFMTレシピエントにおける腸内細菌叢の相対的存在量およびα多様性の変化。A）当初は同様のマイクロバイオーム相対量を示していたマウス（5日目）。抗生物質投与後（0日目）、相対量が有意に減少している。B) アルファ多様性（FaithのPD）は抗生物質投与後（0日目）に減少するが、FMT再増殖後（12日目）には回復している。C) Mg500（赤棒）またはMg2800（青棒）由来の便のFMT後の糞便微生物叢の変化に関する線形判別分析（LDA）効果量（LEfSe）分析では、各グループで腸内細菌の特定の系統の表現が増加した。ヒストグラムは、クレードレベルの特徴について計算されたLDAスコアを示している。色は、どのグループに属する菌が他のグループより多いかを表しています（p値は0.0000832～0.0492）。赤太字で示されているのは、Mg500グループのFMT受信者で増加したPrevotellaceae（CとD）、Mg2800グループのFMT受信者で増加したBacterioides（CとE）です。
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食餌に応じた細菌組成と個々の細菌数／レベルの解析を行いました。マウスが14日間飼料を摂取した後、KSIAを誘発する前の0日目に、26の細菌数が2つの飼料間で異なっていた。Mg2800で8個（Supplemental Fig. S7A-H）、Mg500で18個（Supplemental Fig. S7I-Z）増加し、すべてFirmicutes-Clostridiaに属した。
マウスが関節炎を発症した15日目では、14の細菌ファミリーが有意に異なり、Mg2800で6個（Supplemental Fig.S8A-F）すべてFirmicutes-Clostridiaに属し、Mg500で8個（Supplemental Fig. S8G-O）、ほとんどがFirmicutes-Clostridia（補足図S8G-L）、さらにBacteriodetes-Bacteroidia（補足図S8M）、Actinobacteria-Coriobacterilia（補足図S8N）1種が追加されました。
11の細菌ファミリーは、0日目と15日目の両方で有意に異なる発現を維持し、したがって、関節炎の重症度における食餌の長期的効果に潜在的により大きな関連性があると考えられるとされた。これらの細菌は、異なるClostridia（Mg2800についてはSupplemental Fig.S9A-D、Mg500についてはSupplemental Fig.S9F-J）、Actinobacteria（Supplemental Fig.S9E） およびBacteroidia（Supplemental Fig.S9K） を含んだ。
FMTはレシピエントマウスの腸内細菌叢の組成を調節する
次に、FMT後のレシピエントマウスの細菌組成を調べた。相対存在量分析により、抗生物質または食餌の前の微生物叢組成（図9A）およびα多様性（図9B；5日目）は類似しており、抗生物質処理により、両群で糞便微生物叢のほとんどが枯渇した（図9AおよびB；0日）。2つのMg食グループのFMTは、腸内細菌叢の多様性を再構成した（図9AおよびB；12日目）。12日目（FMT後）の2群では15クレードが有意に変化し、Mg500では8クレード、Mg2800では7クレードの存在量が増加した（図9C）。
図10オスとメスのIL-10 KOマウスは、Mg2800の食事では保護されない。A-C) Mg2800食は、野生型（WT）C57BL/6マウスでは保護されたが、IL10 KOマウスでは保護されなかった。Mg2800食を摂取したIL10 KOマウスは、Mg500食を摂取したWTおよびIL10 KOマウスの関節炎と同程度に重症化した（各群雌7、雄8）；D）Mg2800食群は、WTおよびE）ともにIL17＋細胞数の減少に関連していたが、IL10 KOマウスでは関連していなかった；F）CD4＋Foxp3＋細胞はMg2800食でWTマウスで増加していた；G）しかしIL10 KO（＊p ≦ 0. 015, ＊＊p ≦ 0.009; ＊＊＊p ≦ 0.0001 平均±SEMとして示す）。
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Prevotellaceaeファミリー（Alloprevotella属）は、通常のMg500からのFMTのレシピエントにおいて最も有意に過剰発現したファミリーであったが、Mg2800グループからのFMTのレシピエントにおいてそのレベルは減少した（図9A、12日目；図9CおよびD）。Mg2800のFMTのレシピエントは、とりわけBacterioides、Bacteroidaceae（図9CおよびE）のレベルが増加した（図9AおよびC）。Mg2800からFMTを受けたSFB（Candidatus Arthromitus）のレベルには有意な差は検出されなかった（補足図：S6B）。
メタゲノム機能解析により、高Mg群ではL-トリプトファン生合成などのプロセスが増加することが明らかになった。
メタゲノム解析により、Mg2800食とMg500食の微生物群の間で発現や制御が異なる313の経路、酵素、プロセスが同定された（Supplemental Table S3）。このうち、Mg2800 FMTのレシピエントでは、a）L-トリプトファン生合成のスーパーパスウェイ、b）トリプトファナーゼ、c）L-メチオニン生合成、d）転写制御因子、プロピオン酸異化オペロン制御タンパク質、e）マンナン分解、f）マンヌロン酸生合成、g）プロピオン酸異化、h）アルギニンデイミナス、など271種の発現が著しく増加した（表1；Subsequal Table S4）．また、Mg2800 FMTのレシピエントで存在量が減少したのは、a）アルギニンおよびポリアミン生合成のスーパーパスウェイ、b）グリシンからのヘム生合成のスーパーパスウェイ、c）L-リジン、L-スレオニンおよびL-メチオニン生合成のスーパーパスウェイIである（表1、Supplemental Table S3）。
表1FMTレシピエントで同定された豊富なメタゲノム経路の選択リスト（313のリストより）。
a
パスウェイ説明ID番号p値Mg2800の存在量Mg500の存在量fold differenceMg2800FMTからのレシピエントにおける存在量の増加cutM; aerobic carbon-monoxide dehydrogenase medium subunit [EC:1.2.5.3]K035190.00211140.8616. 8967.6rspA, manD; mannonate dehydratase [EC:4.2.1.8]K083230.00222196.7143.3350.7rspB; L-gulonate 5-dehydrogenase [EC:1.1.1.380]K083220.00101663.0042.3339.3phnK; Putative phosphonate transport system ATP-binding proteinK057810. 001021.500.6135.2phnM; α-D-リボース1-メチルホスホン酸5-三リン酸ジホスファターゼ [EC:3.6.1.63]K061620.001021.500.6135.2D-arabinitol dehydrogenase (NADP (+))EC:1.1.2870.001041.861.2234. 24-ヒドロキシフェニルアセテートデカルボキシラーゼEC:4.1.1.830.0010125.573.6734.2ASRB；嫌気性亜硫酸還元酵素サブユニット BK169510.00131273.0739.0332.6Methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase (CoA acylating)EC:1.2.1.270.0008588.5724.3324. 2mmsA、iolA、ALDH6A1；マロン酸セミルアルデヒド脱水素酵素（アセチル化）／メチルマロン酸セミルアルデヒド脱水素酵素［EC：1.2.1.18 1.2.1.27］K001400.0008588.5724.3324.2asrC; 嫌気性亜硫酸還元酵素サブユニット CK003850.0011744.5032. 6922.8ulaG; L-アスコルビン酸6-リン酸ラクトナーゼ [EC:3.1.1.-]K034760.00081771.6481.1021.8dcyD; D-システイン脱硫脱水酵素 [EC:4.4.1.15]K053960.0007710.5738.1118.62-deoxy-D-gluconate 3-dehydrogenaseEC:1.1.11.1250.00081464.79133.9410. 9kduD；2-デヒドロ-3-デオキシ-D-グルコン酸5-デヒドロゲナーゼ [EC:1.1.1.127]K000650.00081464.79133.9410.9TC.CITMHS; citrate-Mg2+:H+ or citrate-Ca2+:H+ symporter, CitMHS familyK033000.0007143.0014.2210.1prpR; transcriptional regulator, propionate catabolism operon regulate proteinK026880. 001085.1423.333.6Superpathway of L-tryptophan biosynthesisPWY-66290.0023588.03181.673.2UDP-2,3-diacetamido-2,3-dideoxy-α-D-mannuronate biosynthesisPWY-70900.0004184.0367.612.7mannan degradationPWY-74560. 000113612.675866.522.3tnaA; tryptophanase [EC:4.1.99.1]K016670.00042503.021191.112.1Acetaldehyde dehydrogenase (acetylating)EC:1.2.1.100.00137466.297069.631.1L-methionine biosynthesis IHOMOSER-METSYN-PWY0.00181377.441304.591. 1Superpathway of S-adenosyl-L-methionine biosthesisMET-SAM-PWY0.00162072.661985.721.0arcA; arginine deiminase [EC:3.5.3.6]K014780.00251221.591182.671.0superpathway of L-methionine biosthesis (transsulfuration)PWY-53470.00152973. 712886.481.0Mg2800 FMTSCD, desC; stearoyl-CoA desaturase (Delta-9 desaturase) [EC:1.14.19.1]K005070.001113.7181.67-6.0FAH, fahA; fumarylacetoacetase [EC:3.7.1.2]K015550.001013.7181.11-5. 9FAB2, SSI2, desA1; アシル-[アシル-キャリア-タンパク質]デサチュラーゼ [EC:1.14.19.2 1.14.19.11 1.14.19.26]K039210.001013.7181.11-5.9K09992; uncharacterized proteinK099920.001013.7181.11-5.9lcyB, crtL1, crtY; リコペンβシクレターゼ [EC:5. 5.1.19］K064430.001013.7181.11-5.9アルデヒド脱水素酵素（NADP（＋））EC：1.2.1.40.001114.2981.11-5.7chlI、bchI；マグネシウムキレータゼ サブユニットI [EC:6.6.1.1]K034050.001114.2981.11-5.7aldH;NADP 依存型 アルデヒド脱水素酵素 [EC:1. 2.1.4］K145190.001114.2981.11-5.7マグネシウムキラターゼEC：6.6.1.10.001114.2981.11-5.7L-チロシン分解 ITYRFUMCAT-PWY0.0008205.67334.25-1.6coaW; Type II pantothenate kinase [EC:2.7.1.33]K096800.00097363.639041. 14-1.24-hydroxy-2-oxoheptanedioate aldolaseEC:4.1.2.520.0021841.861023.44-1.2Superpathway of heme biosynthesis from glycinePWY-59200.00022303.942707.64-1.2coxC, ctaE; cytochrome c oxidase subunit III [EC:1.9.3.1]K022760. 00021290.711508.11-1.2Superpathway of L-lysine, L-threonine and L-methionine biosthesis IP4-PWY0.00184131.514676.90-1.1Superpathway of Arginine and Polyamine biosthesisARG + POLYAMINE-SYN0.00212165.212257.81-1.0
a FMT後12日目、倍率の差で並べたもの、ANOVAに基づくp値、太字は原稿で言及した経路やプロセスを表す。
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IL-10ノックアウトマウスではMg2800食の保護効果が消失した
Mg2800食を摂取したマウスおよびそのマウスからFMTを受けた患者では、CD4+Foxp3+を含むさまざまなタイプのIL-10産生T細胞の頻度が増加していることから、Mg2800食はこのサイトカインの誘導を介して関節炎抑制活性を媒介している可能性があると考えた。IL-10ノックアウトマウスを14日間Mg飼料で飼育し、その後KSIAを誘発した。Mg2800食を摂取したIL-10発現の雌雄野生型マウスは、KSIAモデルで一貫して保護された。しかし、IL-10 KOマウスはMg2800食によって保護されず、これらのマウスはMg500食を受けたマウスと同様に重度の関節炎を発症した（図10A-C）。また、Mg2800食を摂取した野生型IL10+マウスは、IL17+細胞の数が減少し、CD4+Foxp3+細胞の数が増加したが、IL-10 KOマウスでは観察されなかった（図10D-G）。
考察
本研究では、2つの異なるRAマウスモデルにおいて、Mg欠乏がない場合でも、Mg（Mg2800）の食事摂取量の増加が、疾患の重症度、関節炎症、および関節損傷を軽減することを初めて説明した。我々の研究は、連続的な高Mg食と間欠的な高Mg食の両方が、疾患の重症度を低下させることを示している。高Mg食による関節炎の重症度低下は、IL-1β、IL-6、TNFα、CXCL10、MMP3といったRAの病因と関節損傷に関わる主要な炎症メディエーターのレベルの低下と、抗炎症サイトカインIL-10のレベルの上昇と関連していた。
また、高Mg食は、CD4+IL10+細胞、CD4+Foxp3+Treg、CD4+Foxp3+IL10+Treg、IL10+Tfh（Tfr）の数の増加と関連しており、CD4+Foxp3+Treg細胞がCIAにおける疾患の重症度の調節に関与していると考えられている、
47
抗体誘発性関節炎における
48
および他の自己免疫疾患の重症度制御に関与している。
49
,
50
,
51
,
52
さらに、CD4+Foxp3+ Treg細胞の数は、RAの疾患寛解と強い相関がある。
53
また、高Mg食は、CIAに関与する病原性Th17細胞の数を減少させた、
54
,
55
およびKSIAにおける疾患の重症度の制御に関与している。
56
我々はまた、より特異的な機構を発見し、Foxp3+ Treg細胞数および関節炎の重症度に対する高Mg食の効果が、IL-10を介し、IL-10に依存していることを示した。IL-10は、いくつかの炎症性サイトカインを抑制し、以前からCIA
57
,
58
および他の自己免疫疾患を抑制することが示されている。
49
,
50
KSIAモデルは主に自然免疫によって媒介されるが、IL-10は補体も制御することが知られている。
59
と好中球の活性化を制御することが知られている、
60
を制御することが知られています。
61
,
62
異なるMg濃度がナイーブT細胞のin vitro分化に直接的な影響を及ぼさないこと、両投与群におけるMgの血清レベルが同程度であること、およびMgを経口投与したことから、関節炎に対する食事の効果は腸内細菌叢の変化によって媒介されているのではないかと考えさせられた。そして実際に、高Mg食マウスから抗生物質を投与したレシピエントへのFMTは、関節炎の保護、Foxp3+およびFoxp3+IL10+ TregsおよびCD4+IL10+（Tr1）細胞の拡大において食餌そのものと同様の効果を引き起こしました。包括的なマイクロバイオーム解析により、食事およびFMTに関連した有意な変化が明らかになり、高Mg群では、腸内短鎖脂肪酸（SCFA）、トリプトファン代謝物、および免疫細胞の制御に関与する他の細菌生成物のレベルを上昇させることが知られている細菌のレベルが増加していることが示された。
Prevotellaceae、特にPrevotella copriは、異なる集団において一貫してRAと関連してきた。
14
,
20
,
63
RAと同様に、Mg500の通常食によるFMTの非保護レシピエントではプレボテラ属菌のレベルが増加したが、Mg2800の高食によるFMTの保護レシピエントではレベルが有意に減少していることがわかった。RAにおいてプレボテラが制御する正確な経路、および感受性や重症度におけるその役割はまだ不完全に理解されていないが、マウスにプレボテラを投与すると、大腸Th17細胞数とIL-6の血清レベルが増加する、
64
また、齧歯類モデルにおいて、関節炎の重症度を増加させる、
65
これは、我々の観察と同様である。プレボテラはまた、SCFAのレベルの低下とも関連している。
66
SCFAは、Foxp3+ Tregの分化と拡大を誘導することが知られている、
67
,
68
,
69
であり、高Mg2800からのFMTのレシピエントは、AlistipesのようなSCFAレベルの増加に関連する細菌のレベルが増加した、
70
Anaerostipesであった、
71
Bacterioidesであった、
71
およびRuminococcaceaeを含む、
71
であり、疾患保護やFoxp3+ Tregの増加との相関がある。バクテロイデス属はRAで減少
14
,
20
,
63
であり、重症のMg500 FMTレシピエントでは減少し、高Mg2800食FMTレシピエントでは増加した。SCFAに加え、Bacteroides（特にB. fragilis）は多糖類A（PSA）を産生し、これもTreg細胞の拡大を促進する72。
72
とIL-10のTreg分泌を促進する、
73
という2つの現象が観察された。
その他の腸内細菌は、SCFAを増加させ、IL-10を産生するT細胞を制御することができる
74
,
75
,
76
で、ビフィズス菌を含むいくつかの菌がMg2800食群で増加したことが検出された、
74
Clostidieaceae、Eubacterium、Actinobacteriaなどである。
66
食餌療法を受けたマウスとFMTを受けたマウスの糞便細菌組成の違いは、他のグループからも報告されており、食餌療法の期間やマイクロバイオーム再構成の時間との関連性が考えられている。
77
FMTでは、抗生物質投与により腸内細菌を大幅に減少させた後、5日間という短期間で腸内細菌叢を再構成したため、おそらく多様性が低下し、短期間で増殖・再増殖しやすい細菌が選択されたと考えられる。他の研究では、FMTの前に抗生物質を使用するかしないかで、レシピエントの微生物叢とドナーの微生物叢の全体的な類似性が増加しないことも判明している。
77
私たちの研究にも同じ考え方が当てはまります。しかし、異なる食餌性Mg含有量に伴う細菌生着の違いは、大きな関連性があり、治療薬に適用できる可能性があるものである。
しかし、マイクロバイオームの表現に違いがあるにもかかわらず、我々は、食事群およびFMTのそれぞれのレシピエントにおいて、臨床的および免疫的表現型に同様の効果を観察した。Mg2800食とFMTレシピエントの両方が、SCFAを増加させることが知られている細菌の拡大を共有し、Tregの増加と関節炎の重症度の低減を統一的に説明することができました。
メタゲノム解析の結果、高Mg食とFMTの保護効果に関連するいくつかのパスウェイが同定されました。「L-トリプトファン生合成のスーパーパスウェイ」は、トリプトファンとその代謝物がアリール炭化水素受容体を活性化して免疫反応を抑制することから注目されている経路である、
78
また、Treg細胞の分化を促進する可能性がある。
79
,
80
トリプトファン代謝物である3-ヒドロキシアントラニル酸（3-HAA）は、Tregの割合を高め、Th17細胞を抑制し、実験的自己免疫脳脊髄炎（EAE）を改善することが報告されています。
81
トリプトファン欠乏食はEAEにおいて保護的であり、糞便中のPrevotellaceaeの減少およびClostridiumの増加と関連していた、
82
本試験で検出された変化と同様である。アルギニンの増加は、Tエフェクター細胞とTregsの活性のバランスを制御することができるため、Mg2800 FMTレシピエントで存在量が増加した「アルギニンとポリアミン生合成のスーパーパスウェイ」にも関心が持たれています。
83
,
84
「マンナン分解」は、マンナンオリゴ糖に関与し、関節炎発症の2つの中心的要素である補体や好中球を含む免疫系を広く活性化する。
85
細菌由来のアルギニンデイミナーゼは、抗炎症作用を有し、LPS誘発性の反応を抑制する。
86
マウスの大腸炎を抑制する。
87
「プロピオン酸異化作用」は、Mg2800グループに多く存在するもう一つの重要なメタゲノム経路であり、SCFAに関与している。
71
,
88
その他の経路は、Mg食で異なる表現が見られ、マイクロバイオーム、免疫反応、および関節炎の間の新たな発見や関連につながる可能性がある。
我々は、糞便中の代謝物の直接測定が行われなかったことを認め、これは、メタゲノム解析の確認と検証のために、ネズミを用いた将来の研究またはRA患者におけるMgの将来の試験で行われることになる。さらに、我々は、腸内のMgの管腔内濃度の変化がマイクロバイオームで観察された変化を引き起こすかもしれないという仮説を立てたが、確認するためには今後の研究が必要である。
結論として、我々は、Mgの摂取量を増やすことで、Foxp3 Tregの数を増やし、IL-10のレベルを上げ、病原性サイトカインの発現を抑えて炎症を抑制し、関節炎の重症度や関節損傷を軽減するという大きな効果が得られることを初めて記述しました（図11）。また、これらの保護的所見は、IL-10に依存し、高Mg食によって誘発された腸内細菌叢の変化を介するものであり、RAで通常減少するSCFA産生菌の存在を促進する変化を含むことを明らかにした。また、高Mg食は、RAに関連するPrevotellaのレベルも低下させました。これは、関節炎を改善するために腸内細菌叢に有益な変化をもたらすことができる初めての食事戦略であり、さまざまな自己免疫疾患や炎症性疾患の治療に役立つ可能性があります。
図11関節炎における高Mg食の効果の概要。SCFA＝短鎖脂肪酸、矢印上＝増加、矢印下＝減少、関節像＝炎症・過形成のある関節滑膜組織。
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投稿者
概念化： TL、PSG
メソドロジー TL、CH、NA、GB
インベスティゲーション TL、CH、PSG、GB、CB
資金獲得 PSG
プロジェクト管理 プロジェクト管理：PSG
スーパービジョン TL、PSG
執筆-原案 TL、PSG
執筆-校閲・編集 TL、CH、NA、CB、GB、PSG
基礎データの検証 TL、PSG
データおよび資料の入手と共有
すべてのデータは、本文および補足資料で入手可能です。
マイクロバイオームシーケンスデータは、リクエストに応じて入手可能です。
利害関係の宣言
著者は、競合する利害関係がないことを宣言する。
謝辞
資金提供 米国国立衛生研究所（NIAMS）R01 AR 073165 (PSG).
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記事情報
出版履歴
掲載されました： 2023年5月16日発行
受理された： 2023年4月19日
改訂版受理 2023年3月10日
受理された： 2022年10月27日
識別情報
DOI: https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2023.104603
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図1Mg2800食を摂取したマウスは、KSIAにおける関節炎の重症度が低下した。A) 実験のタイムライン：KSIAの誘導に関連して：14日目の食事開始、0日目と2日目のKRN血清注入、15日目の食事とKSIAスコアリング期間の終了；B) Mg2800食を摂取したマウスは、Mg500と比較して関節炎の重症度スコアが有意に減少した（各処理群n = 25；＊p = 0.0005と＊＊p＜0.0001）。C) 15日目の両Mg食群の関節の代表画像（ヘマトキシリン／エオシン、H&E染色；左パネルが低倍率、ボックス部分が右パネルで拡大；12日目、H&E、サイズバー＝500μMと250μM）；D) 滑膜の炎症、過形成、軟骨のびらん（＊p≦0.03；各群n＝9-10）および骨（＊＊p＜0.002；各群n＝9-10）についての関節組織学スコアリング。
図2Mg2800食を摂取したマウスは、CIAの疾患重症度が低下した。A) 実験のタイムライン：CIA誘導に対して：14日目の食事開始、0日目のCIA誘導、3日目のMg2800食を中止し、マウスを通常のMg500食に切り替え、21日目のCIAブースター、71日目の実験終了；B) Mg2800食を与えたマウスではMg500と比較して関節炎重症度スコアが有意に低かった（n = 10/グループ；＊p ≦ 0. 03）；C）Mg500およびMg2800飼料を投与したマウスの代表的な関節組織像（72日目、H＆E染色；左パネルが低倍率、ボックス部分が右パネルで拡大；12日目、H＆E、サイズバー＝500μMおよび250μM）。
図. 3Mg2800食はサイトカインおよび他の炎症メディエーターのレベルに有意な影響を与える（qPCR）。A）IL1β、B）IL6、C）Tnfα、D）Cxcl10のレベルは、Mg2800群で有意に減少した。E)IL10は、KSIAの初期時点（6日目）およびF)後期（15日目）において、Mg2800食で増加した。G) MMP3はMg2800群の滑膜で減少した（データは平均±SEMで示す；（＊p≦0.04；＊＊p≦0.005））。
図4Mg2800食のT細胞サブセットに対する初期効果および持続効果 KSIAを発症したMg2800食群では、脾臓細胞T細胞サブポピュレーションに以下の変化がみられた： A) GFP+IL17+細胞の割合が減少；B) 6日目にCD4+Foxp3+T細胞の割合が増加；C) CD4+Foxp3+細胞は15日目でも増加したまま；D) 6日目および15日目にCD4+IL10+の割合が増加した；E)； F) CD4+Foxp3+IL10+細胞は6日目に増加し、G)、15日目も増加したままであった；H) Tfh IL10+細胞は9日目とI)15日目に増加した；J) Tr1 IL10+細胞の9日目の増加（結果は平均±SEMとして示す；＊p ≦0. 03；＊＊p＝0.001）；K) 15日目もTr1 IL10+の数は増加したが、その差は統計的有意差には至らなかった。
図5Mg2800食群の糞便材料移植（FMT）レシピエントはKSIAで保護された。A）0日目をFMTの初日とするタイムライン（ATB＝抗生物質）；B）Bacteroidis fragilis（Bfrag）およびEubacteria（Eub）の糞便DNA qPCRにより、抗生物質（D0）後の細菌枯渇を確認；C）関節炎の重症度は、Mg500グループ（n＝9）と比較して、Mg2800飼料グループ（n＝7）のFMT受信者で著しく低下；D）。Mg2800食のFMTレシピエントはほぼ正常な構造を保っているのに対し、Mg500食のレシピエントは顕著な滑膜過形成、細胞浸潤、血管新生を伴うびらん性変化を示した代表的な組織像（左パネルが低倍率、ボックス部分が右パネルで拡大したもの； 12日目、H&E、サイズバー＝500μMおよび250μM）；E）組織学的スコアリングにより、レシピエントにおいて滑膜炎症の有意な減少、滑膜過形成の減少、軟骨および骨のびらんが減少した（Mg2800．n = 7, Mg500: n = 9; ∗∗p < 0. 007).
図6Mg2800食群のFMTレシピエントは、Foxp3+ TregおよびIL10+ Tr1細胞数が増加している。A) Mg2800群からのFMTのレシピエントでは、Mg500と比較してFoxp3+ Treg細胞の数が増加（＊p = 0.002）；B) Mg2800群のFMTレシピエントではIL10+ Tr1細胞の数が増加（＊＊p = 0.02 （結果は平均±SEMとして示す））。
図7KSIAにおけるMg2800グループのFMTレシピエントの大腸におけるFoxp3+細胞数の増加。A）組織学的解析とFoxp3免疫ペルオキシダーゼでカウンター染色したH&E染色スライドのmm2あたりのFoxp3+細胞数のカウント（1スライドあたり10フィールドを採点、Mean±SEMで示す；＊p＝0.01）；B）Mg500グループおよびC）Mg2800グループのFMTの受信者の大腸の代表スライド；矢印はFoxp3+細胞（サイズバー＝50μM）。
図8Mg500またはMg2800の食餌後の腸内細菌叢の変化に関する線形判別分析（LDA）効果量（LEfSe）分析。LEfSeを用いたMg食に対する腸内細菌の特異的なフィロタイプ。ヒストグラムは、クレードレベルの特徴量について計算された有意なLDAスコアを示す。色は、その分類群が他のグループと比較してより豊富であったグループ（赤＝Mg500、青＝Mg2800）を表している。A) 0日目、B) 15日目。太字は、Mg500グループ（赤）、Mg2800グループ（青）でより多く存在する細菌を持続的に示している。
図9Mg500またはMg2800の飼料を与えた動物のFMTレシピエントにおける腸内細菌叢の相対的存在量およびα多様性の変化。A）当初は同様のマイクロバイオーム相対量を示していたマウス（5日目）。抗生物質投与後（0日目）、相対量が有意に減少している。B) アルファ多様性（FaithのPD）は抗生物質投与後（0日目）に減少するが、FMT再増殖後（12日目）には回復している。C) Mg500（赤棒）またはMg2800（青棒）由来の便のFMT後の糞便微生物叢の変化に関する線形判別分析（LDA）効果量（LEfSe）分析では、各グループで腸内細菌の特定の系統の表現が増加した。ヒストグラムは、クレードレベルの特徴について計算されたLDAスコアを示している。色は、どのグループに属する菌が他のグループより多いかを表しています（p値は0.0000832～0.0492）。赤太字で示したのは、Mg500グループのFMT受信者で増加したPrevotellaceae（CとD）、Mg2800グループのFMT受信者で増加したBacterioides（CとE）である。
図10IL-10 KOマウスのオスとメスはMg2800食で保護されない。A-C) Mg2800食は、野生型（WT）C57BL/6マウスでは保護されたが、IL10 KOマウスでは保護されなかった。Mg2800食を摂取したIL10 KOマウスは、Mg500食を摂取したWTおよびIL10 KOマウスの関節炎と同程度に重症化した（各群雌7、雄8）；D）Mg2800食群は、WTおよびE）ともにIL17＋細胞数の減少に関連していたが、IL10 KOマウスでは関連していなかった；F）CD4＋Foxp3＋細胞はMg2800食でWTマウスで増加していた；G）しかしIL10 KO（＊p ≦ 0. 015, ＊＊p ≦ 0.009; ＊＊＊p ≦ 0.0001 平均±SEMで示す）。
図11関節炎における高Mg食の効果のまとめ。SCFA＝短鎖脂肪酸、矢印上＝増加、矢印下＝減少、関節像＝炎症・過形成のある関節滑膜組織。
補足図S1
補足図：S3
補足図S4
表
表1FMTレシピエントで同定された豊富なメタゲノム経路の選択リスト（313のリストより）。
a

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