ヒトの微生物叢は都市環境における病院関連抗菌薬耐性の普及を促進し、患者の症例数を反映する
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公開日：2022年12月02日
ヒトの微生物叢は都市環境における病院関連抗菌薬耐性の普及を促進し、患者の症例数を反映する
Cecilia Salazar, Matias Giménez, ...Gregorio Iraola 著者名を表示する
Microbiome 10巻、記事番号：208（2022）この記事を引用する
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指標詳細
概要
背景
都市環境における微生物群集の構成は、主に人間の活動によって決定される。メタゲノム解析によって、都市における微生物群集の形成過程を探ることは、公衆衛生対策、建築設計、都市の回復力に関する意思決定を改善するための新しい知見を提供する。特に、都市の下水道は、細菌、医薬品、抗菌剤耐性（AMR）遺伝子の複雑な貯蔵庫として機能し、疫学的な情報の重要な源となり得る。病院からの排水は、患者由来の細菌が多く含まれるため、抗生物質耐性菌の温床となり、やがて環境中に取り込まれる。しかし、院内感染が都市環境にどのような影響を及ぼすかについては、まだ十分に理解されていない。
研究成果
本研究では、小川、海岸、下水放水路、集水管などの都市水域には、人由来の細菌による汚染や混合の度合いが異なるという特徴を持つ、個別の微生物群集が存在することを広範囲にわたって示した。ヒト由来細菌の多さは、環境中のAMR遺伝子の多さと相関しており、β-ラクタマーゼは、影響の少ない都市環境と影響の大きい都市環境を区別するために最も貢献度の高いクラスである。実際、都市環境におけるβ-ラクタマーゼ耐性およびカルバペネム耐性決定因子の存在量は、1年間で有意に増加した。これは、同時期に報告された、主にアウトブレイクを引き起こすカルバペネマーゼ産生Klebsiella pneumoniae（KPC）ST-11株による院内カルバペネム耐性感染症の顕著な増加と一致するものであった。この集団発生の前後の都市水域のゲノム分解メタゲノム解析と高解像度全ゲノム配列解析により、ST-11株と新規KPCメガプラスミドが病院から都市環境へ伝播していることが確認された。また，都市環境におけるKPCメガプラスミドの伝播は，下水道インフラに逆相関していることが都市全体の分析から明らかになった．
結論
都市メタゲノム解析とアウトブレイクゲノムサーベイランスを組み合わせることで、感染制御、抗生物質管理、病原体疫学に関連する情報を生成することができることを示した。この結果は、都市環境におけるヒト由来の細菌および抗菌剤耐性菌の拡散について、その特性をよりよく理解し、排水処理インフラおよび公衆衛生政策の開発にこの情報を取り入れる必要性を強調するものであった。
ビデオの要約
はじめに
抗菌薬耐性（AMR）は、通常阻害濃度の抗菌薬の存在下で、細菌が適応して生存できるようになる過程と定義される。このプロセスは、様々なヒトの病原体がAMRの表現型に向かって進化していることを考えると、公衆衛生上の懸念事項である。驚くべきことに、世界保健機関（WHO）は、AMR をヒトと食品の安全性に対する最も危険な脅威の 1 つとみなしています[1]。この問題は、COVID-19のパンデミックによって悪化し、集中治療室での入院と抗生物質による治療が世界的に急増しました[2]。実際、免疫不全の患者が存在し、抗生物質の選択圧が高いことから、病院環境はAMRの出現と拡散の温床と考えられています[3]。このような背景から、Klebsiella pneumoniae は、主にカルバペネム系などの最終ラインの抗生物質を含む多剤耐性に関連して、世界中で院内感染を引き起こす、人間の健康に対する大きな脅威として認識されています[4]。この種の臨床的重要性に加え、K. pneumoniaeは通常ヒトの腸内細菌叢の一部として保有され[5]、宿主関連および自然の幅広いニッチで生存するため、病院環境から他の環境へAMRメカニズムを拡散させる理想的な媒介物となり得ます[6]。
公衆衛生、特に低・中所得国における大きな問題は、病院排水が患者由来の微生物叢で汚染され、この排水が処理されることなく下水道を通じて都市環境に直接取り込まれることです。このような複雑な下水混合物を考慮し、全ゲノムおよびメタゲノム次世代シーケンス（NGS）アプローチを使用して下水水を解析し、AMRサーベイランスを行う方法がますます適用されるようになってきています。NGS ベースの手法は、都市部の人口全体の健康状態を把握するための、非侵襲的で簡単な戦略です [7, 8]。実際、メタゲノム解析による都市環境のグローバルな分析により、都市環境にはダイナミックながらも確立されたマイクロバイオームが存在すること [9]、そして都市の下水道は AMR の広大な貯蔵庫であること [10]が明らかになっています。これは、都市環境におけるヒト由来細菌と環境細菌の相互作用が、AMR遺伝子の拡散と出現に適したシナリオを提供するためであり、一般的にAMRはプラスミドなどの移動性遺伝要素に関連しているためです[11]。
ここでは、メタゲノム解析と病院関連アウトブレイク株のロングリード全ゲノムシークエンシングを組み合わせた都市水域の2年間の研究を紹介し、都市規模のAMRの循環を特徴付ける。また、病院から都市水域に伝播したカルバペネム耐性クローンのゲノム解析も行い、多剤耐性プラスミドの広範な伝播における建築環境の影響を明らかにした。本研究は、都市環境におけるAMR病原体の動態を調べるために、高解像度都市メタゲノム解析とアウトブレイクゲノム疫学をいかに共同で適用できるかを示すものである。
研究成果
研究概要
モンテビデオはウルグアイの首都であり、リオデラプラタ河口（-34° 54′ 11.81″ S; -56° 11′ 17.38″ W）沿いに位置している。モンテビデオとその都市圏には150万人以上の住民が住んでおり、これは国の人口の50%に相当する。この地域の90%以上の家屋が市の下水道に接続されており、下水道は廃水を収集し、5km先の河口へ送られる前にほとんどのマクロ粒子をろ過する。しかし、市の西部地域はまだ完全に接続されておらず、彼らの廃水は海岸や都市の小川に直接流されている。以前、我々はメタゲノミクスを用いて、2016年8月にサンプリングした12の海岸と8の下水管における抗菌剤耐性の拡散の特徴を明らかにしました[11]。今回、このメタゲノム研究を拡張し、2017年11月に収集した、市内全域の前回および新規のサンプリング地点と環境を代表する22のサンプルを含めました（追加ファイル1：表S1）。並行して、市内の人口の約半数にサービスを提供する市内の主要な公立病院の1つで、2017年3月から11月（9カ月）の間に続いた多剤耐性アウトブレイクの疫学調査と全ゲノム特性解析を実施しました。
都市環境はヒト由来の微生物叢によって異なる影響を受ける
まず、全メタゲノム試料（n = 44）間の共有k-mer数に基づく分類不要のクラスタリング解析を行いました。その結果、3つの異なるクラスターが存在することが明らかになりました。クラスター I は、2016 年と 2017 年に収集された下水サンプルによって大部分が占められています。クラスターIIは、2017年に収集された下水管、放水路、小川からのサンプルで構成されています。クラスターIIIは、2016年に収集されたビーチのサンプルを含んでいます（図1A）。興味深いことに、3つのクラスターは、その環境構成と人間の行為への露出が著しく異なっていた：予想されるより影響の少ないビーチから、中程度の影響を受ける都市の小川や放水路、下水道水が直接注がれるより影響の大きい環境まで（図1B）。
図1
図1
都市水環境の異なるニッチにおけるヒト細菌の拡散。A 都市水メタゲノム（n = 44）から得られたk-mers頻度に基づくクラスタリング解析。サンプルは、各主要クラスター（クラスター1、2、3）への所属、サンプリング年、採取場所（ビーチ、下水、小川、放水路）に応じた環境タイプに応じて色分けされている。B 環境の種類によって層別された各メタゲノミッククラスターに属するサンプルの割合を示す棒グラフ。C 各クラスターに属するサンプルにおけるヒト腸内細菌関連バクテリオファージB40-8およびcrAssphageのメタゲノム定量（キロベースミリオンあたりの読み取り数、RPKMとして測定）。D 各クラスタに属するサンプルにおけるヒト腸内細菌叢に関連する、または関連しない細菌種のメタゲノム定量（相対存在量として測定）。
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次に、これらのサイトにおける人為的影響の程度を、環境における人為的汚染の適切な指標であることが以前に示されているBacteroidesバクテリオファージB40-8およびcrAssphageの存在量を測定することで評価した[12, 13]。特に、これらのファージの相対的な存在量は、環境負荷の高いクラスターから低いクラスターへと徐々に減少していった（図1C）。さらに、この傾向を、ヒトのマイクロバイオームに含まれる、または含まれないことが知られている細菌種の相対量を測定することで検証しました（図1D）。実際、影響が大きい環境から小さい環境にかけて、ヒトに関連する細菌が同じように徐々に減少することが明らかになったが、ヒト以外の細菌については逆の傾向が見られた。これらの結果を総合すると、さまざまな影響を受けた都市環境では、ヒト関連細菌の拡散によって微生物群集の構造が規定されることが明らかになった。
ヒト由来細菌が抗菌薬耐性の環境拡散を促進する
次に、都市環境における人為的な影響として、人為的細菌の拡散が抗菌薬耐性遺伝子（ARG）の高い負荷につながるかどうかを調べることを目的としました。その結果、各サンプルにおけるヒト関連細菌の相対的な存在量とARGの全体的な存在量の間に、統計的に有意な正の相関（p < 0.001; 相関係数 = 0.67）が認められました（図2A）。クラスタIとIIのサンプルでは、クラスタIIIよりも高いAMR遺伝子の存在量が観察された（図2B）。非ヒト関連菌との比較では、有意な相関は認められなかった（p = 0.2; 相関係数 = - 0.2）（追加ファイル 2: 図 S1）。さらに、これを評価するために、非計量的多次元尺度法（NMDS）解析を行ったところ、各サンプルにおけるARGの存在／非存在パターンは、微生物群集全体に基づいて以前に定義されたクラスターを再現していることがわかった（図2C）。この結果に基づき、観測されたクラスタ間の差異を支えているのはどのARGクラスであるのか、その答えを探りました。そこで、NMDS解析の1次元目で各抗生物質クラスの加重平均スコアを求めたところ（図2D）、β-ラクタム薬に対する耐性が、観測された差の主な要因であることがわかった。これは、βラクタム耐性遺伝子の多様性を測定したときにクラスタ間で見られた統計的に有意な差（p < 0.01）によっても観察可能であった（図2E）。これらの結果は、都市環境における抗菌薬耐性の拡散には、ヒトに関連する細菌が主要なドライバーである可能性を示すものであり、影響の大きい場所と小さい場所を区別する最も適切な抗生物質クラスとしてβ-ラクタム耐性を示しています。
図2.
図2
抗菌薬耐性（AMR）遺伝子の拡散は、ヒト細菌の存在と相関がある。A ヒトに関連する細菌種の相対的な存在量とAMR遺伝子の存在量の間に正の有意な相関（R = 0.67, p値 = 1.3e-6）があることを示す線形回帰。B 3つのメタゲノムクラスターにおけるARGの相対的な存在量を示す箱ひげ図。C 全サンプルにおけるAMR遺伝子の存在量に基づくNMDS（Non-metric multidimensional scaling）解析。サンプルはクラスタごとに色分けされている。横軸（NMDS1）の変動は、AMR遺伝子のレパートリーと存在量に基づくクラスタに応じたサンプルの分離を説明する。D パネルBのNMDS1で観察されたサンプル間の分離に最も寄与している抗生物質耐性遺伝子クラスのランキングを示すバープロット。E βラクタム耐性遺伝子のα多様性（Shannon indexとして測定）をクラスタ別に示したボックスプロット。統計的に有意なレベルはアスタリスクで示されている（p < 0.01）
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都市と病院環境におけるβ-ラクタム系抗生物質とカルバペネム系抗生物質の耐性の同時増加
β-ラクタム系抗生物質（特にカルバペネム系抗生物質）に対する耐性は、多剤耐性腸内細菌による院内感染で最も一般的かつ問題となる特性の一つである。次に、今回の結果を文脈化するために、都市環境におけるβ-ラクタムおよびカルバペネム耐性遺伝子の存在量を評価し、16例からなるカルバペネマーゼ産生Klebsiella pneumoniaeアウトブレイクを含む1年間（2016-2017）の院内カルバペネム耐性感染症の疫学データと比較しました(図3A)。β-ラクタム耐性遺伝子とカルバペネム耐性遺伝子の両方について、都市環境では年度間で相対量が有意に増加（p < 0.01）していた（図3B）。これは、2016年から2017年にかけて報告されたカルバペネム耐性腸内細菌による院内感染の激増と一致し、K. pneumoniaeが上位を占めた（2017年のK. pneumoniae報告症例の25%を占めるアウトブレイク症例）（図3C）。また、都市環境におけるK. pneumoniaeの存在を見ると、2016年のK. pneumoniae陽性サンプルの20%から2017年の陽性サンプルの80%と、これらの年の間に著しい差が観察された（図3D）。2016年と2017年の本種の相対的な存在量をみても、同じ傾向が検出された（図3E）。さらに、両年とも同じサンプリング地点から採取したペアサンプルを比較したところ、以前に観察されたK. pneumoniaeの増加が確認された（図3F）。以上の結果から、同一都市の都市環境と病院環境において、1年を通じてカルバペネム耐性菌が同時に増加しており、都市環境への抗菌薬耐性の伝播に入院患者の微生物叢が重要な役割を果たすことが示唆されました。
図3
図3
都市環境と病院環境におけるβ-ラクタム耐性とカルバペネム耐性の関係。A 関連する収集日を示す年表。上の帯は、都市環境から水サンプルを収集した日付（2016年8月と2017年11月）を示しています。真ん中のストリップは、カルバペネマーゼ産生Klebsiella pneumoniae株（KPC）により、市内の主要病院の1つで登録されたアウトブレイクのスパン期間を示しています。下の帯は，集団発生の原因となったK. pneumoniae（n=15）の各分離株が報告された時刻を示している。B 2016年または2017年に採取された都市水サンプルにおけるβ-ラクタム薬に対する耐性を付与する遺伝子（赤色）の相対的な存在量を示す箱ひげ図。カルバペネム耐性遺伝子（青色）についても同様に示す。統計的有意水準はアスタリスクで示す（p < 0.01）。C KPCアウトブレイクが報告された同じ病院における、2016年と2017年の異なるカルバペネム耐性腸内細菌科細菌による院内感染件数を示すバープロットである。D 2016年または2017年に採取したメタゲノム試料のうち、K. pneumoniaeに陽性となった割合を示す棒グラフ。E 2016年または2017年に採取されたすべてのメタゲノム試料におけるK. pneumoniaeの相対存在量（対数スケール）。F 2016年または2017年に同じ部位から採取した対のメタゲノム試料におけるK.pneumoniaeの相対存在量（対数スケール）。
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ゲノム分解メタゲノム解析により、院内K. pneumoniae ST-11クローンの環境拡散が明らかになった
K. pneumoniaeの顕著な増加は、病院と都市の間で本当に同じクローンが共有されているのかどうかを調べる動機となりました。そこで、まず病院内で発生した16株のカルバペネム産生性K. pneumoniaeの全ゲノム配列を決定した（Additional file 1: Table S2）。これらのゲノムを比較解析したところ、いずれもepidemic and multidrug-resistance associated sequence type 11（ST-11）に属し、siderophore yersiniabactin genotype 183（type ybt 9; ICEKp3のゲノムアイランド内）、capsular type KL64、O-locus type O2v1を持っており、疫学的知見をもとにクローン性を明らかにしていた。また、この染色体には、コリスチン耐性のmgrB遺伝子変異やフルオロキノロン耐性のgyrA遺伝子変異がコードされていた。他の移動性遺伝要素とともに、すべてのゲノムは、カルバペネム耐性遺伝子BlaKPC-2を持つタイプIインテグロンなど、複数の抗生物質に対する耐性をコードする約146kbのメガプラスミド（以下pKPC-146と呼ぶ）を保有していた（付加ファイル2：図S2）。
発生株とのゲノムレベルでの比較を行うために、我々の都市メタゲノムから高・中品質のメタゲノム集合ゲノム（MAG）383個を作成した。そして、系統樹的アプローチにより、K. pneumoniae ST-11アウトブレイクゲノム16個をこの中に配置した（Fig. 4A）。予想通り、アウトブレイクゲノムは、Escherichia coli、Leclercia adecarboxylata、Providencia rettgeri、Raoultella ornithinolyticaなどの腸内細菌種に分類される環境MAGとともに単系統群にクラスター形成していた。興味深いことに、2017年に採取したサイトCPBから回収した1つのMAGは、K. pneumoniaeに分類され、アウトブレイクゲノムとクラスタリングされました。このMAGのMLST解析により、ST-11遺伝子型に属し（図4B）、アウトブレイク株と同じゲノムマーカーを有することが明らかになった（追加ファイル1：表S3）。さらに、このMAGとアウトブレイク原因K. pneumoniae株の関連性を確認するために、このMAGとアウトブレイクゲノム、あるいは世界的なST-11ゲノムコレクションとを区別するSNPsの数を測定した。この解析により、ST-11 MAG は世界的に報告されている他の ST-11 株よりも、平均して約 70 SNPs もアウトブレイクゲノムに近いことが明らかになりました（図 4C）。これらの結果は、病院関連 K. pneumoniae ST-11 クローンが、病院でアウトブレイクが報告される前ではなく、後に都市環境中に存在したことを裏付けており、都市環境におけるヒト病原体と抗菌剤耐性の拡散に病院由来の糞便廃棄物が影響を与えていることを浮き彫りにするものである。
図4
図4
ゲノムレベルの解析により、病院と都市環境の間の伝播が明らかになった。都市環境から回収した高・中品質のMAG383個と病院関連感染症（ST-11アウトブレイク）から配列決定した高解像度K. pneumoniaeゲノム15個を含む120個の保存原核生物マーカー遺伝子の連結に基づく系統樹。樹木の枝は分類学（門レベル）に応じて色分けされている。B腸内細菌科に相当する単系統のクレードを拡大したもの。先端は種により色分けされ、枝はサンプルの由来（ST-11アウトブレイクまたは環境）によりグループ化されている。サンプルCPB-17（bin.7）から回収したK. pneumoniae MAGは、アウトブレイクから回収したK. pneumoniae院内分離菌との系統的関連を示すためにハイライト表示されている。C CBP-17_bin.7とアウトブレイク関連K. pneumoniae ST-11ゲノムまたはアウトブレイク以外のK. pneumoniae ST-11ゲノムのグローバルコレクションを分離するSNPs数を示すボックスプロット。
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カルバペネム耐性菌の地理的伝播は下水道のインフラと逆相関している
ヒトの糞便汚染が抗菌薬耐性の伝播に与える影響をより明確にするため、我々はさらに、アウトブレイクに関連するカルバペネム耐性メガプラスミドpKPC-146の都市環境における地理的分布と存在比を調査した（図5A）。我々のデータは、2016年と2017年の間でpKPC-146の相対的な存在量が有意に増加したことを示しました（p < 0.01）。さらに、このプラスミドの相対存在量は、環境中のK. pneumoniae ST-11染色体の存在量と高い相関（p < 0.01、相関係数 = 0.99）を示しました（図5B）。そこで、この多剤耐性プラスミドによる汚染の程度が下水道のインフラに依存しているかどうかを調べることを目的とした。下水道が整備されている都市部は、整備されていない都市部に比べて、環境中の微生物リスクを効率的に除去できると考えたからです。そこで、2017年の各サンプルにおけるpKPC-146プラスミドの存在量を測定し、下水道インフラを各サンプリング地点から半径1.5kmの下水道集水管の密度と定義しました。実際、pKPC-146の存在量と下水道インフラの間には、有意かつ負の相関（p < 0.01、相関係数 = - 0.58）が見出された（図5C）。これは、下水道集水管の地理的分布とpKPC-146の現存量を評価した地点のプロットで、モンテビデオの西部で特に顕著であった（図5D）。これらの結果は、都市の建築環境（この場合は下水道管のインフラ）が、高耐性病原体のような微生物学的リスクへの曝露に大きく影響しうるという証拠を示している。
図5
図5
カルバペネム耐性プラスミドの地理的伝播は、都市の下水道インフラに依存する。A 2016年から2017年の間に、都市メタゲノムにおけるアウトブレイク関連カルバペネム耐性プラスミドの存在量が統計的に有意（p < 0.01）に増加したことを示すボックスプロット。B 都市メタゲノムにおけるアウトブレイク関連カルバペネム耐性プラスミドの存在量とK. pneumoniae ST-11染色体の間に正の統計的に有意な相関があることを示す線形回帰。C 都市部の各サンプリングポイントにおけるアウトブレイク関連カルバペネム耐性プラスミドの存在量と、下水収集管の密度（パイプ/km2）として測定される周辺の下水道インフラとの間に統計的に有意で負の相関があることを示す線形回帰。D モンテビデオ市内の下水収集器（青色点）とサンプリングポイント（赤色円）の地理的分布。赤丸の大きさは、アウトブレイクに関連するカルバペネム耐性プラスミドの存在量に比例している。
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考察
我々の分析から、都市の下水システムおよび都市河川内の異なる生態的ニッチには個別の微生物群集が存在し、これらの違いの主な要因はヒトマイクロバイオームに関連した細菌の拡散であることが示された。ヒトのマイクロバイオームの構造と構成は、食事、民族、地理的な場所と関連していることを考えると [14, 15]、都市の水域の微生物を特徴付けるローカルスケール研究の開発は、地域の微生物ランドスケープとAMR伝播パターンを理解する上で特に重要な意味をもちます。このような知識があれば、科学者、臨床医、政策立案者は、都市の人口とインフラの活動が、ローカルスケールの環境マイクロバイオームの変化を通じて、健康や福祉にどのような影響を与えるかを理解することができます。
病院は、AMR菌の重要な貯蔵庫として注目されています[3]。この問題は、都市環境に排出する前に病院の廃水を処理する一次処理が行われていない発展途上国において悪化しています [16]。他の著者は、病院廃水が特定のAMRシグネチャーを持っていたとしても、都市廃水と混合すると、希釈率のためにこれが消去されることを示しています[17]。私たちの研究では、ゲノム解析メタゲノム解析により、アウトブレイクを引き起こす多剤耐性クローンが病院から都市環境へ伝播したことを株レベルの分解能で明らかにしたため、ゲノム情報を追加してこの先行研究を発展させることができました。ヒトの病原体となる腸内細菌種の多くは、環境中の非病原性系統や高リスクの流行性系統によって規定される複雑な集団構造を持っているため、このことは特に重要である。したがって、都市メタゲノミクスを高解像度疫学調査ツールとして活用するためには、同じ種に属する一般細菌と高リスクのAMR株を検出・区別する能力が不可欠になる。
このことは、多様な生態的ニッチや自由生活環境でも生存可能なヒトの病原体として認識されているK. pneumoniaeにとって重要である。K. pneumoniaeは複雑で大きな集団構造を持っているにもかかわらず、ほとんどの感染症は世界的に問題となっているクローンのサブセットによって引き起こされている[4]。ST-11 クローンは、他の K. pneumoniae と比較して、病院の建物環境における生存期間が長いことが知られています[18]。都市環境から回収できた K. pneumoniae ゲノムが ST-11 であったことは，ST-11 が病院から都市環境へ伝播する能力が高いこと，あるいはこの菌株の環境伝播にアウトブレイク期間が大きく影響することを示しているかもしれない．このことは，K. pneumoniae を含む院内感染腸内細菌の腸内コロニー形成が12ヶ月を超えることがあることを考えると，特に重要である[19]．また、ST-11 は、世界でも有数の広域β-ラクタマーゼおよびカルバペネマーゼ産生菌である。したがって、都市環境におけるST-11の普及は、下水道水中のβ-ラクタムおよびカルバペネム耐性遺伝子の経時的な増加や、2014年にウルグアイで一部のβ-ラクタムが処方の70%以上を占めたというレトロスペクティブデータと一致します[20]。
重要なのは、私たちがST-11 MAGを回収した都市の下水サンプリング地点は、アウトブレイクが検出された病院から約20km離れており、アウトブレイク株が下水システムを通じてかなり長距離を移動する可能性を示唆していることです。このことは、都市環境におけるAMRおよび流行性細菌クローンの時間的・空間的な拡散を追跡するために、より詳細な分析を行うことの重要性を示している。いずれにせよ、我々の結果は、感染症の罹患率と死亡率の上昇に関連する広域β-ラクタマーゼおよびカルバペネマーゼ産生微生物の増加における都市環境の重要な役割を明らかにした[21, 22]。
重要なことは、β-ラクタム系抗生物質とカルバペネム系抗生物質に対する耐性は、主に多様なプラスミドにコードされているため、ヒトや病院関連株が環境中に排出されると、これらの最終ラインの抗生物質に耐性を与えるプラスミドの伝達と拡散に好条件が生じることです[23]。このことから、抗菌薬耐性の問題に取り組むためには、移動性要素の監視を統合したワンヘルス的なアプローチが必要であることがわかります。実際、このアプローチにより、ある都市部における不均一な下水道インフラが、新規の病院関連カルバペネム耐性プラスミドの広範な拡散に影響を与えていることが明らかになりました。このことは、劣化した配管や下水道のオーバーフローから下水道水が流出し、住民が有害な細菌にさらされ、腸内感染症のリスクが高まることを考えると、公衆衛生上の大きな問題であるといえます[24]。今後は、下水道水から直接測定した病原性細菌やAMRの循環を、都市計画やインフラ計画、住民から収集した疫学データと統合的に解析することが重要であると考えています。例えば，抗生物質の使用と処方に関する系統的かつ遡及的なデータがあれば，環境と人口におけるAMRの動態を十分に理解し，予測することができる．
結論
我々の結果は、AMRの拡散という問題に取り組むために、一人一人の健康という観点から緊急のグローバルなアクションが必要であることを証明している。AMRの出現と拡散のための貯蔵庫として、また排水システムを介した輸送手段として、都市の人口集団の役割を強調する必要がある。特に、病院排水と環境中の病原体の循環および生存との関係は、公衆衛生上の脅威であり、病院排水処理プロトコルの改善と実施が必要である。実際、K. pneumoniaeのような流行性で多剤耐性の病原体による長期の院内感染の発生は、都市のマイクロバイオームを変化させ、その程度は建築環境インフラに影響される可能性があるという証拠を示しています。最後に、メタゲノム解析による長期的な下水道監視プログラムの展開は、病原体の動態やその他の微生物関連疾患に対する理解を深めるだけでなく、感染制御、公衆衛生政策、都市設計に有用な情報を提供することができる有望なツールであることを表している。
研究方法
環境サンプル収集とメタゲノムデータ作成
2017年11月、24の環境水サンプルを既述のように収集した[11]。これらの場所は、モンテビデオ市大都市圏内のビーチ、小川、放水路、下水集水管を表すように選択された。場所、サンプリング日、関連するメタデータの簡単な説明は、Additional file 1: Table S1 にまとめてある。すべてのサンプルは無菌の200 mLボトルで採取され、氷上に保管された。その後、サンプルは以前に記述されたように処理された[11]。簡単に言うと、10,000×gで15分間遠心分離し、上清を捨て、ペレットをFastDNA™ Spin Kit (MP Biomedicals) を使って製造者のプロトコールに従って処理した。イルミナHiSeq4000プラットフォームでペアエンド（2 x 150 bp）リードを用いたショットガンメタゲノムアプローチでDNAの塩基配列を決定した。さらに、2016年8月に収集され、私たちのグループから以前に発表された20のサンプルから生成されたショットガンメタゲノムシーケンスデータを、さらなる解析のために取得した（PRJNA515946）。組み合わせたデータセットは、平均42.3Mペアエンドリード（最小：23M、最大：64.8M）の44のメタゲノムサンプルで構成されています。
細菌の分離、特性解析、全ゲノムシークエンス
血液サンプルから細菌コロニーを取得し、VITEK 2 y VITEK MSシステム（bioMérieux）を使用して種レベルで同定し、Klebsiella pneumoniaeの存在を確認した。抗菌薬感受性はCLSI 2019のカットオフに従ってVITEK 2，ディスク拡散，E-testにより測定した。カルバペネマーゼ産生の検出はGeneXpert装置を用いて行った。コリスチンに対する感受性は、コリスチンブロスディスク溶出試験で検討した。ゲノムDNAはPurelink Genomic DNA kit（Invitrogen）を用いて精製した。DNAはIllumina HiSeq4000プラットフォームでpaired end (2 × 150 bp) readsを用いて塩基配列を決定した。また、製造元の指示に従い、G-tube（Covaris）を用いてDNAを約8Kbの断片分布になるように断片化した。その後、Native barcoding genomic DNA by Ligation (SQK-LSK109) protocol (Oxford Nanopore Technology, ONT) を用いてロングリードシーケンスライブラリを作成し、R9.4.1 FLO-MIN106D フローセルにロードした。ベースコールは、MinITデバイスにインストールされたGuppy 3.2.9を使用して実施しました。Porechop v0.2.3 (https://github.com/rrwick/Porechop)を用いてDemultiplexingとアダプター配列の除去を行った。NanoFilt v2.3.0 (q score > 8, length > 500)を用いてリードのフィルタリングを行った。
メタゲノム解析、ビニング、分類学的分類
各サンプルから得られたメタゲノムリードは、metaSPAdes [25]を用いてデフォルトのパラメータでアセンブルした。その後、metaWRAP binning, refinement, and reassembly module [26]を用いてメタゲノム集合ゲノム（MAG）を再構築した。MAGsの完成度と汚染度の評価にはCheckM[27]を用いた。中品質（contamination < 5%; completion >= 50%） および高品質（contamination < 5%; completion >= 90%）の MAGs のみを下流の解析に使用した。GTDB-tk [28]の分類ワークフローを使用して、MAGsの分類を取得した。
K. pneumoniaeゲノムのアセンブリと特性解析
イルミナショートリードデータとONTロングリードデータを組み合わせたハイブリッドアセンブリは、デフォルトパラメータでUnicycler [29]を使用して生成し、Bandage [30]を使用して可視化した。配列のタイプは、まずMLSTar [31]を用いて決定した。病原性遺伝子やAMR遺伝子の検出を含む詳細なゲノム特性解析は、Kleborate [32]を用いて実施された。プラスミドはPlasmidFinder[33]を用いて分類された。
比較メタゲノム解析
SimkaMin [34]を用いて、リードk-mer距離を用いた全体的な遺伝的関連性によるメタゲノム試料のクラスタリングを行った。MetaPhlAn2 [35]を用いて、細菌種の相対的な存在量を決定した。ヒトマイクロバイオームと関連する、または関連しない細菌種の定義は、微生物の特性に関する手動でキュレーションされたデータベースであるMicrobe Directoryから取得しました[36]。バクテリオファージの存在量の推定は、crAssphageおよびB40-8参照ゲノムに対してbowtie2 [37]を用いてメタゲノムリードをマッピングすることにより行った。RPKM（Reads per million kilobase）値はRで算出した[38]。メタゲノムサンプル中のARGの相対的存在量は、ShortBRED [39]とCARDデータベース[40]を用いて推定しました。ARGの相対的存在量に基づくサンプルのクラスタリングは、veganパッケージで実装された非計量的多次元尺度法（NMDS）アプローチを用いて決定した[41]。1次元の加重平均スコアを各抗生物質クラスについて抽出し、観察されたクラスタリングに最も寄与する抗生物質クラスを決定するためにランク付けした。β-ラクタムARGについては、veganパッケージ[41]を用いてα多様性（Shannon index）を算出した。
系統解析
GTDB-tk [28]は、120の保存された細菌マーカー遺伝子を検索、連結、整列する手法である。プロットは ggtree package [42]で作成した。コアゲノムSNPは、Snippy (https://github.com/tseemann/snippy) を用いて、CPB-17 MAGを16のK. pneumoniae outbreak genomeまたはPATRICデータベースから得られた873のグローバルK. pneumoniae ST-11 genomesと比較することにより算出された[43]。
地理的解析
bowtie2 [37]を用いて、プラスミドゲノム全体に対するメタゲノムリードのマッピングを行い、異なるサンプリング位置におけるpKPC-146プラスミドの有病率を算出し、R [38] で百万キロベースあたりのリード数（RPKM）値を計算した。モンテビデオ市の下水道管の地理空間分布は、ウルグアイの空間データ基盤（https://www.gub.uy/infraestructura-datos-espaciales/）システムから取得しました。下水道構築済みインフラの密度は，各サンプリング地点の周囲半径2kmの下水道管の数として計算した．可視化は、ggplot2 [44]とggmap [45]パッケージで作成した。
データおよび資料の利用可能性
本研究で生成および／または解析したデータセットは、FigShareリポジトリ（https://doi.org/10.6084/m9.figshare.20304078.v2）で入手可能である。本研究で作成したシーケンシングリードは、NCBIリポジトリ（プロジェクト識別子：PRJNA857878）に寄託されている。
略語
KPC:
Klebsiella pneumoniae carbapenemase（クレブシエラ・ニューモニエ・カルバペネマーゼ
AMR:
抗菌薬耐性
WHO：世界保健機関
世界保健機関（WHO
ARG
抗菌剤耐性遺伝子
NMDS:
非計量的多次元尺度法（Non-metric multidimensional scaling
ST-11:
配列タイプ11
MAGs:
メタゲノム解析されたゲノム
MLST
多座標型配列タイピング
ONT:
オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズ
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謝辞
環境水のサンプリングでフィールドワークに協力したIntendencia de Montevideo（ウルグアイ）の担当者に感謝します。
資金提供
この研究は、ウルグアイのBanco de Seguros del Estado（BSE）が資金提供するInstitut Pasteur de MontevideoのG4プログラム、Pfizer-ISID Global Medical Grants（助成番号56270969）およびIntendencia de Montevideoの支援を受けて実施された。M.G.は、Agencia Nacional de Investigación e Innovación de Uruguay（ANII）、助成金番号POS_FSA_2019_1_1008860の支援を受けています。
著者情報
著者および所属
微生物ゲノミクス研究所、Institut Pasteur de Montevideo、11400、Montevideo、Uruguay
セシリア・サラザール、マティアス・ヒメネス、ナディア・リエラ、アンドレス・パラダ、ジョセフィナ・プイグ、ベロニカ・アンテロ＆グレゴリオ・イラオラ
ウルグアイ、モンテビデオ、クレメンテ・エスタブル生物学研究所（IIBCE）、分子微生物学研究室
マティアス・ヒメネス
ウルグアイ、モンテビデオ、マキエル病院
アントニオ・ガリアナ、ファビオ・グリル、マリエラ・ビエテス
Weill Cornell Medicine（米国ニューヨーク州ニューヨーク）生理学・生物物理学教室
クリストファー・E・メイソン
プリンス・アルワリード・ビン・タラル・ビン・アブドゥルアジーズ・アルスード計算生物医学研究所（米国ニューヨーク州ニューヨーク、Weill Cornell Medicine)
クリストファー・E・メイソン
WorldQuant Initiative for Quantitative Prediction, Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA
クリストファー・E・メイソン
モンテビデオの環境評価と環境管理サービス（ウルグアイ、モンテビデオ、インテンデンシア
ブルーノ・ダレッサンドロ & ヒメナ・リッソ
ウルグアイ、モンテビデオ、共和国大学医学部、衛生研究所
ブルーノ・ダレッサンドロ
ウェルカム・サンガー研究所（英国・ヒンクストン
グレゴリオ・イラオラ
マヨール大学統合生物学センター （チリ、サンティアゴデチリ
グレゴリオ・イラオラ
貢献
GIは、本研究の構想および設計を行った。CS、MG、NR、AP、JP、AG、FG、MV、VA、BD、GIがデータを作成し、解析を行い、データを読み解いた。GI、CS、MG、NRは原稿を起草し、改訂した。すべての著者は提出された原稿を承認した。
著者名
Gregorio Iraolaに連絡する。
倫理的宣言
倫理的承認と参加への同意
該当なし
論文発表の同意
該当なし
利害関係
著者らは、競合する利害関係を有しないことを宣言する。
追加情報
出版社からのコメント
Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して、中立的な立場をとっています。
補足情報
追加ファイル1：補足表S1.
解析したサンプルのメタデータ。補足表S2. K. pneumoniae ST-11アウトブレイク株の抗菌薬耐性表現型。補足表S3. K. pneumoniae ST-11分離株とMAGのゲノム特性。
追加ファイル2：補足図S1.
ARGと非ヒト種との解析。ARGの相対的存在量と非ヒト種との間に有意な線形相関がないこと。ドットは3つのメタゲノミッククラスターによって色分けされている。補足図S2. pKPC-146プラスミドの模式図。注釈付き遺伝子を含むpKPC-146プラスミドの円形図。遺伝子はその機能に応じて色分けされている：プラスミド結合（空色）、仮説（灰色）、抗生物質耐性（緑色）、水銀耐性（黄色）、その他の機能（紫色）、トランスポゾン（ピンク色）。KPCカルバペネマーゼ遺伝子は赤でハイライトされている。
権利と許可
オープンアクセス この記事は、クリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下に提供されており、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えた場合に限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可しています。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。もし素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合には、著作権者から直接許諾を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの献呈放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジットラインに特に記載がない限り、この記事で利用可能となったデータに適用されます。
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Salazar, C., Giménez, M., Riera, N. et al. Human microbiota drives hospital-associated antimicrobial resistance dissemination in the urban environment and mirrors patient case rates.ヒト微生物相は都市環境における病院関連抗菌薬耐性の普及を促進し、患者症例率を反映する。Microbiome 10, 208 (2022)。https://doi.org/10.1186/s40168-022-01407-8。
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2022年7月13日
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2022年10月21日
公開日
2022年12月02日