Klebsiella pneumoniaeとAcinetobacter baumanniiの間の交差防御と交差摂食が両者の共存を促進する
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公開日：2023年02月09日
Klebsiella pneumoniaeとAcinetobacter baumanniiの間の交差防御と交差摂食が両者の共存を促進する
https://www.nature.com/articles/s41467-023-36252-2
Lucie Semenec, Amy K. Cain, ...Ian T. Paulsen 著者を表示する
Nature Communications 14巻 記事番号：702 (2023) この記事を引用する
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指標詳細
概要
Acinetobacter baumanniiとKlebsiella pneumoniaeは、多剤耐性菌感染症からしばしば分離される日和見病原体である。これらの病原体が共存する感染症は、どちらかの菌種が単独で引き起こす感染症よりも重症で治療抵抗性である可能性があるが、その相乗的な相互作用に関する知見は不足している。本研究では、1つのヒト肺感染症から分離されたA. baumanniiとK. pneumoniaeのゲノムの特徴を明らかにした。また、共感染時の抗菌薬耐性や病原性に対する影響を理解するための基礎となるトランスクリプトーム、フェノミック、表現型アッセイを通じて、両者の相互作用の様々な側面を検討した。共培養と分泌代謝物の分析により、K. pneumoniaeがA. baumanniiの糖発酵副産物を交差摂食する能力を発見している。また，A. baumanniiはK. pneumoniaeをセファロスポリン系抗生物質であるcefotaximeに対して交差防御することが，単独培養および共培養による最小阻害濃度試験で明らかとなった。本研究は，A. baumanniiとK. pneumoniaeの間に明確な共栄養的相互作用が存在することを示し，多剤耐性菌感染症における両者の共存の基礎を明らかにする一助となるものである。
はじめに
2種類以上の病原性微生物によって引き起こされる多剤耐性菌感染症は、比較的よく見られるものの、ほとんど研究されていない。細菌感染症の臨床診断1では、優勢な感染微生物のみが考慮されることが多く、低濃度で存在する病原体が見落とされることがある。病原体に関する我々の知識の大部分は、単一種の感染症を理解する上で極めて重要な純粋培養実験室研究によるものであるが、同時感染動態に関する情報はほとんど得られていない。細菌群集の少数集団は、優勢なメンバーの生理や行動に大きな影響を与える可能性があることから2,3、重複感染する病原体間の相互作用の可能性や、それらが多菌感染症における病原性や抗生物質耐性に与える影響について理解することは重要である。
様々な研究により、多剤耐性菌感染症は病原性や抗菌薬耐性を高めることが分かっている4,5。カルバペネム耐性腸内細菌科細菌（CRE）患者におけるAcinetobacter baumanniiまたはPseudomonas aeruginosaによる二重感染は、単一感染と比較して抗生物質耐性レベルおよび死亡率が増加することが示されている6。例えば、Klebsiella pneumoniae、P. aeruginosa、A. baumanniiに重複感染している重症患者において、死亡率の上昇が観察されています6。さらに、多剤耐性（MDR）アシネトバクター属とESBL産生菌（K. pneumoniaeおよびEscherichia coli）の共感染が、MDRアシネトバクター属に感染した入院患者の約38％に確認されている6,7,8。
本研究では、単一の肺感染症から共分離したA. baumannii strain AB6870155とK. pneumoniae strain KP6870155の2菌種間の相互作用について検討した。A. baumanniiとK. pneumoniaeは、日和見主義のヒト病原体で、特に免疫力が低下した患者の呼吸器、尿路、血液感染など、さまざまな類似の感染症に関与している。両者とも、米国感染症学会および世界保健機関により、最優先の危険な6種類の多剤耐性微生物（Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter species）、ESKAPE病原体に分類されました9,10。
A. baumanniiとK. pneumoniaeの病原性メカニズムについては、長年にわたり、それぞれの菌種に応じた広範な研究が行われてきました。どちらの病原菌も、患者の肺の中でしばしばバイオフィルムを形成し11,12、栄養制限、捕食、浸透圧ストレス、抗生物質治療から身を守り、結果として著しい回復力を発揮する13,14。また、両菌株は、鉄分の少ない宿主環境において効率的な鉄の取り込みを可能にするシデロフォア15,16や、フェントン反応によって生じる活性酸素を中和する鉄依存性のスーパーオキサイドディスムターゼ酵素（SodB）17を産生している。また、これら2つの病原体の病原性戦略にはいくつかの相違点がある。A. baumannii は、呼吸器系病原菌の病原性とバイオフィルム形成に関与するポリアミン合成能を有している18。1,3-ジアミノプロパン（DAP）はA. baumanniiが生産する主要なポリアミンであり、偶然にもAcinetobacterのシデロフォアと結合することが知られている19。K. pneumoniaeのポリアミン合成はもう少し多様で、プトレシンやカダベリン20を生産し、これらの陽イオン性炭化水素を細胞外に排出するトランスポーターを持っている11。宿主細胞との相互作用については、K. pneumoniaeは、リポ多糖O抗原と多糖カプセル（K）というよく知られた2つの細胞表面多糖類と、あまり解明されていない腸内細菌共通抗原を生成し、宿主免疫の攻撃を回避することができる21,22。A. baumanniiはリポオリゴ糖とカプセルを形成するが、O抗原リガーゼを持たないためリポポリサッカライドを持たない23。A. baumanniiの莢膜多糖（K遺伝子座にコードされる）は、バイオフィルムの形成を促進し、乾燥に耐えることを可能にする24。A. baumanniiは、OmpAおよびOmp33タンパク質の発現により、宿主のオートファゴソーム内での生存を可能にし、オートファジーを完全に阻止する25、あるいはOmpAを外膜小胞に集中させる26など、肺炎球菌とは異なる方法で宿主の免疫反応に対抗している。このように、これら2つの病原体は、宿主内で重複しつつも異なる様々な病原性機構を有している。
A. baumanniiとK. pneumoniaeは、生命を脅かす様々な感染症において共存し、多様な病原性メカニズムを持つにもかかわらず、これまで両者の相互作用のダイナミクスに着目した研究はなかった。本研究では、1つの肺感染症から分離されたこの2つの菌種について、宿主環境における相互作用の動態を調べ、病原性や抗生物質耐性を増強させる可能性を理解することを目指した。この2菌種のゲノムを短鎖および長鎖シーケンサーで解析し、進化、プラスミドプロファイル、血清型、レジストーム、トランスポーターのレパートリーの特徴を明らかにするためにゲノム解析を実施した。AB6870155とKP6870155の2つの共分離株を2種共培養バイオフィルムで増殖させ、合成肺模倣培地（SLMM）で単培養したバイオフィルムでの遺伝子発現と比較するトランスクリプトーム解析を実施した。SLMMを用いたin vitroの実験で、両者の相互作用が生理、代謝、バイオフィルム形成、抗菌反応にどのような影響を及ぼすかを表現型アッセイで検討した。さらに、この2つの重要なESKAPE病原体や多剤耐性菌感染症に対する治療戦略を開発するための基礎となる、共感染の状況におけるin vivoでの病原性を検討した。
研究成果
AB6870155とKP6870155のゲノムおよび系統学的特徴づけ
A. baumannii AB6870155とK. pneumoniae KP6870155のゲノムは、Oxford NanoporeロングリードとIlluminaショートリードを組み合わせたシーケンサーで配列決定されました。AB6870155のゲノムは、4.0 Mbの染色体と3つのプラスミドpAB0155_1-3 (Fig. S1) からなり、サイズは1.8-8.7 kbです (Table 1)。KP6870155ゲノムは5.36Mbの染色体とpKP0155_1-5と呼ばれる5つのプラスミドからなり（図S2）、サイズは2.1-67.3Kb（表1）であった。KP6870155プラスミドは、PlasmidFinder27によって決定されたIncFIB(K) (pKP0155_1), IncU (pKP0155_2), IncR (pKP0155_3), IncN (pKP0155_4) and Col440I (pKP0155_5) 不適合タイプで、様々な耐性遺伝子とプラスミド維持・動員遺伝子を含んでいた (Figs.S2-S3, Supplement Data 1-2). AB6870155プラスミドのうち、既知の非互換型のいずれにも属さないものが存在した。
表1 A. baumannii AB6870155およびK. pneumoniae KP6870155のゲノムデータとアセンブリ統計量
フルサイズの表
AB6870155 は、系統解析の結果、International Clone I (IC1) clonal complex strains に属し、同じくヒト喀痰分離株であるA85株28と最も近縁であった（図1a）。AB6870155株は、A85株と同様に、ampC遺伝子を持つTn6168 ISAba1拘束性トランスポゾンを保有している28,29。AB6870155は、A85と同様にフルオロキノロン耐性を付与するgyrAとparC変異を保有しているが、2つのカルバペネム耐性遺伝子のうち、oxa23ではなくoxa-51のみを保有している（補足資料3）。KP6870155ゲノムは、中国で急性乳房炎を起こした乳牛から分離されたK. pneumoniaeの強毒株Bckp186と最も近縁であった（図1b）。また，KP6870155は，KL3カプセル遺伝子座とO抗原遺伝子座O1v2を持つ，MDRではあまり知られていない配列タイプ8（ST8）株であるとKleborate30により同定された．
図1 A. baumannii AB6870155とK. pneumoniae KP6870155の系統樹とシンテニー。
図1
AB6870155株と他のA. baumannii株、KP6870155株と他のK. pneumoniae株のゲノム間のペアワイズFastANI距離からユークリッド距離行列を表現したデンドログラム。パネル挿入図は、各株とその近縁株とのオルソログ領域のマッピングをfastANIで計算し、genoPlotR125でプロットしたものである。K. pneumoniaeの配列タイプは、株名の横の括弧内に記載されている。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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これらの株の進化を理解するために、PPanGGOLiNソフトウェア31を用いて、A. baumannii AB6870155のパンゲノムを計算し、RefSeqで利用できる172のA. baumanniiゲノム完全配列（2020年9月30日にダウンロードされた）（補足データ4）を計算した。AB6870155の全遺伝子数のうち、12.4%がクラウド（付属／必須）遺伝子であったのに対し、A. baumanniiゲノムのクラウド遺伝子数は平均8.1%に過ぎなかった（図S3）。また、2020年9月30日にダウンロードしたKP6870155とRefSeqで利用可能なK. pneumoniaeゲノム完全配列530個を用いてK. pneumoniaeパンゲノムを構築した（補足データS5）。また、K. pneumoniaeゲノムの平均が4.2%であるのに対し、KP6870155株では6.5%と多くのクラウド遺伝子が存在した（Fig. S3）。
両株とも比較的大きなアクセサリー遺伝子のレパートリーを有していることから、PPanGGOLiNを用いて、ゲノム可塑性領域（RGP）内にどの遺伝子が位置しているかを調べた。RGPは、シェル（コア）ゲノムまたはクラウドゲノムに含まれる連続した遺伝子群として定義されている。A. baumannii AB6870155には33個のRGPが存在し、そのうち1個はpAB0155_1に位置していた。K. pneumoniae KP6870155には、染色体上に35個、各プラスミド（pKP0155_1〜4にはないがpKP0155_5）上に1個、計39個のRGPが存在していた（補足データ1および6）。AB6870155のRGPに位置する遺伝子のうち、59%が仮説遺伝子であり、62%がKP6870155の仮説遺伝子であった。これらの遺伝子の共感染適応における役割はまだ特定されていない可能性があり、これはこの研究の限界であり、さらなる研究を必要とする。
KP6870155とAB6870155の共培養は、合成肺模倣培地（SLMM）におけるA. baumanniiの増殖に有利である。
共培養の相互作用の背後にある分子メカニズムを明らかにするために、我々は、単種および混合種のバイオフィルム培養を、それらが分離された気道の栄養環境を模倣するSLMMで培養し、RNA-seqを実施しました。混合種共培養では、19,846,556個のRNA-seqリードがAB6870155またはKP6870155にマップされ、このうち約82%がAB6870155にマップされた。このうち約82%がAB6870155に、残りがKP6870155にマップされ、これはRNAが採取された24時間の時点で、共培養バイオフィルム内のA. baumanniiの割合がより高いことを示している。RNAのリードカウントを正規化した結果、純粋培養に対して共培養で増殖したAB6870155は、368遺伝子が有意に（adj. p ≦ 0.05 かつ |log2FC | ≧ 1）高い発現レベルを示し、353遺伝子が有意に低い発現レベルを示した（補足データ2）。解糖、TCAサイクル、ペントースリン酸経路、呼吸、ATP生合成などのエネルギー代謝に関わる遺伝子は、共培養したAB6870155では、単培養のAB6870155に比べて全体的に発現量が増加した（補足データ7、図2a）。さらに、細胞プロセス（細胞周期と分裂、遺伝子伝達、バイオフィルム、接着、運動、ウイルスへの反応）、刺激応答（飢餓、温度、DNA損傷、浸透圧ストレス、酸化剤解毒）、セントラルドグマ（転写、翻訳、DNA/RNA/タンパク質代謝、タンパク質折り畳み/分泌）などに関わる経路（Supplementary Data 7）は、AB6870155とK.pneumoniaeを共培養すると全体的に表現レベルが増加した（補足Data 6）。pneumoniaeとの共培養では、単培養に比べて全体的に発現量が増加しており、共培養時の増殖速度が向上している可能性が示唆された（Fig.2a）。逆に、共培養では、細胞外装や生合成に関わる遺伝子など431のKP6870155遺伝子の転写物が有意に多く、刺激応答や制御に関わる遺伝子など529の遺伝子の転写物が有意に少なくなった（補足データ8）。
図2：AB6870155とKP6870155の呼吸、成長、遺伝子発現。
図2
a 主要経路における遺伝子発現の分布。SLMM で培養し、24 時間のタイムポイントで RNA を採取した純粋培養株に対する各株の共培養株の遺伝子発現の log 2 倍変化 (Log2FC) で測定。 b AB6870155 + KP6870155 (A + K) 共培養とモノ培養の成長と呼吸の A. d SLMM での増殖中の AB6870155 と KP6870155 の共培養比率（n = 3 つの独立した細菌培養）、および e MH 培養（n = 3）の qPCR による測定。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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K. pneumoniae KP6870155と共培養したA. baumannii AB6870155の明らかな適性の優位性をさらに調査するために、ミューラーヒントン（MH）培地およびSLMMにおけるプランクトンの単独および共培養内のそれぞれの成長速度、存在量および代謝活性を監視した。A. baumannii AB6870155の単培養体は、K. pneumoniae KP6870155の単培養体（AUC 4877）および共培養体（AUC 6710）に対して、MH培地で培養した場合、有意な適性優位性（曲線下面積（AUC）-7612）を示した（図2c）。共培養体内の各菌株の割合を決定するために、増殖中の様々なタイムポイントで種特異的なqPCRを行った。MH培地で培養した共培養菌は、ラグ期から指数期にかけてK. pneumoniaeの増殖を強く促した。これは、A. baumanniiよりも豊富な炭素源を利用する能力が高いためと考えられる（Fig. 2e）。定常期（20時間以上）にはA. baumanniiが増加する方向にシフトしたが、これはおそらくK. pneumoniaeの代謝副産物を消費するためであろう。興味深いことに、A. baumanniiはSLMMで培養した共培養の方が良好で、指数期でAB6870155の割合が増加し始めたが（図2d）、MHで培養した場合は定常期（24時間）でのみこの変化が起こった。A. baumannii AB6870155 の単培養体は、SLMM で培養した場合、K. pneumoniae KP6870155 の単培養体（AUC 4856）よりも顕著な増殖優位性（AUC 6819）はなかった（Fig. 2b）。2b）、共培養の呼吸活性（AUC 17439）はSLMMにおけるAB6870155単培養の呼吸活性（AUC 17033）よりも高く（Fig. 2b）、これはK. pneumoniaeと共培養したA. baumanniiにおける呼吸経路の発現が増加したことと対応している。SLMM共培養で増殖したバイオフィルムでは好気性呼吸経路の発現が高いことから、共培養での呼吸活性のほとんどはA. baumanniiに起因すると考えられる（Fig. S4）。
このことは、共培養の成長を通じて利用可能な栄養素が変化し、栄養的に厳しい条件下と豊富な条件下で、共培養集団が時間とともにAB6870155に有利に変動する可能性があることを示唆している。
AB6870155とKP6870155の炭素源プロファイリングにより、K. pneumoniaeの代謝の柔軟性が高いことが実証された。
共培養において、なぜ特定の培地が各菌の増殖や代謝活性に有利なのかを明らかにするために、Biolog PMプレート（PM01-02）を用いて表現型マイクロアレイ（PM）を実施した。これにより、2つの菌株による190種類の炭素源の利用について、ハイスループットなプローブが可能になった。K. pneumoniae KP6870155 は、A. baumannii AB6870155 と比較して代謝の柔軟性が著しく高く（図3a）、試験した異なる炭素源のうち101種類を利用できたのに対し、AB6870155は50種類しか利用できなかった（図3b、補足データ9）。KP6870155の代謝的多様性は、AB6870155（402）と比較して、より多くの推定輸送タンパク質（886）のレパートリーを収容する大きなゲノムと、グリセロール分解に必要なdha遺伝子やガラクトシドの加水分解に関わるベータガラクトシダーゼをコードする遺伝子といったAB6870155には見られない代謝経路をコードする遺伝子と一致している。A. baumanniiが利用可能な炭素源のうち63%は有機酸であったが、K. pneumoniae KP6870155は主に糖を利用していた（補足データ9；Fig. S5）。両菌株は31種類の炭素源を利用する能力を持ち、その多くがアミノ酸と有機酸であった（図3b）。両者ともアミノ酸を炭素/エネルギー源として呼吸することができるが、A. baumanniiはこれらの化合物を利用した場合に高い呼吸活性を示し（図3a）、K. pneumoniaeは糖などの容易に入手できる炭素源で増殖した場合に最も高い呼吸活性を示した。これら2つの菌株の異なる代謝フィンガープリントを考慮すると、生理的に互いに補完し合っている可能性がある。あるいは、代謝の違いから、感染時にヒト呼吸器官内の異なる微小環境に生息している可能性も考えられる。
図3 A. baumannii AB6870155 と K. pneumoniae KP6870155 の炭素源利用およびクロスフィード。
図3
a PM01-02 Biolog Phenotype Microarraysに基づくAB6870155（内輪）とKP6870155（外輪）のAUCにより算出した炭素源利用活性 b AB6870155とKP6870155の重複を示す表現型データからの炭素源利用のベン図 c Millicell培養インサート（メルク）を用いたクロスフィーディング実験の模式図 d KP6870155の存在下（AB＋KPと表記）および非存在下（ABと表記）で、唯一の炭素源として最小限の培地および選択化合物（グリセロール、マンノース、ガラクトース、セリン、マルトース、スクロース）を提供したMillicellプレートにおけるAB6870155の増殖（n = 3つの独立した細菌培養物）。データは、平均値 + /- SDとして提示されています。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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RNA-seqデータの検査により、AB6870155との共培養バイオフィルムで増殖したKP6870155は、アルデヒド脱水素酵素、ald1を約40倍有意に過剰発現していることが示された。一方、L-乳酸脱水素酵素 lldD_1 は約 3 倍、L-乳酸透過酵素 lldP は 2 倍に減少した（補足資料 8）。K. pneumoniae GEM167 変異株では、アルデヒド脱水素酵素の発現量が増加すると、乳酸脱水素酵素の発現量が減少し、グリセロール発酵によるエタノールの生産が促進されることが示されている32,33。このことから、共培養バイオフィルムでは、競合する発酵最終産物である乳酸（SLMMでは炭素源としても供給される）ではなく、エタノールが生産される可能性があることが示唆された。その結果、A. baumannii AB6870155 共培養菌は、アルコール脱水素酵素 (NH10_00199) の転写レベルが純粋培養に比べて 3.2 倍増加し、乳酸トランスポーターおよび脱水素酵素の転写レベルには有意差がなかった (補足データ 10) 。エタノールの酸化は、アルコールデヒドロゲナーゼを介してアルデヒドを生成するが、高濃度ではその毒性により効果的な除去が必要である。これを克服するために、エタノールを同化に利用するA. baumanniiは、アルデヒドをアルデヒドデヒドロゲナーゼ34を介して酢酸に変換するが、この転写レベルは共培養バイオフィルムにおいて約3倍（NH10_01161）と著しく高いことが分かった（補足データ10）。A. baumanniiがエタノールを炭素源として利用することで、TCAサイクル遺伝子を含む糖質代謝経路も増加することがこれまでの研究で示されており34,35、今回の結果と一致する（図S4c、Supplement Data 7）。
K. pneumoniae は A. baumannii をクロスフィードすることができる。
AB6870155 と KP6870155 が本当に代謝レベルで相乗的に相互作用しているかどうかを検証するために、クロスフィーディング実験を行った。細胞に対して透過性のない0.2 μmのフィルター（図3c）で物理的に分離し、グリセロール、マンノース、ガラクトース、セリン、マルトース、スクロースというKP6870155のみが利用する単一の炭素源でプランクトンを培養した（補足データ9）。すべての炭素源について、AB6870155 の成長は KP6870155 の存在下でのみ起こり（図 3d）、KP6870155 が生成した代謝物の要求、つまりクロスフィーディングを示唆するものであった。これらの結果は、選択した炭素源を添加した最小限の培地寒天プレート上でクロスフィーディングアッセイを用いて確認された（図S7）。両生物に存在する代謝経路を調べたところ、KP6870155は代謝の発酵最終産物としてエタノールを生成しており、これがAB6870155の炭素源として機能する可能性が示唆された。
次に、K. pneumoniae KP6870155が利用し、AB6870155が利用しない4つの炭素源（グリセロール、ラクトース、マンニトール、スクロース）をバイオフィルム条件下で代謝する際に、エタノールと乳酸を生産する能力について試験した。KP6870155はこれらの基質で増殖できることを確認したが（図4a, c, e, g）、AB6870155はこれらの基質で増殖しなかった（図S8）。KP6870155は、ほとんどの基質でエタノールと乳酸をそれぞれ生産したが、その濃度と比率は基質によって異なり、スクロースが分泌されるエタノールと乳酸の量が最も多かった（Fig. 4g）。次に、様々な炭素源で培養したKP6870155の使用済み培地をろ過滅菌し、KP6870155代謝物を含むろ過済み培地を除き、炭素源を一切与えずにAB6870155を接種した。したがって、観察されたエタノールまたは乳酸の減少（図4b、d、f、h）は、これらのKP6870155代謝副産物をAB6870155が消費した結果である。AB6870155 によるこれらの消費は、A. baumannii が L-lactic 酸で増殖できること（補足データ 9）、および A. baumannii によるエタノール利用が以前に報告されていることから、可能性が高いと考えられる35。AB6870155 の増殖中に、KP6870155 によるグリセロールおよびマンニトール代謝の上清でエタノールの減少が観察された（図 4b, f）。KP6870155によるグリセロール代謝では乳酸が生成されなかったことから（図4a）、AB6870155はKP6870155によるグリセロール代謝で生成されたエタノールを代わりに利用している可能性が示唆された。K. pneumoniaeによるマンニトール代謝は、乳酸産生量に対して有意に高いエタノールをもたらした（図4e）。したがって、AB6871055はマンニトールを与えたKP6870155上清に存在するこの豊富なエタノールを消費すると予想される。スクロースを与えたKP6870155は最高レベルの乳酸を生成し、スクロースを与えたKP6870155の代謝物に接種したAB6870155も最も活発に乳酸を消費していた。これらの結果は、K. pneumoniae KP6870155 の代謝によって生成された乳酸またはエタノールのいずれかが A. baumannii AB6870155 によって利用され、特に近接した場合には生成した代謝産物の交換が実際に可能であることを示唆している。これは、バイオフィルム内で微生物の相互摂食がしばしば起こることから、驚くべきことではない36。これらのデータを総合すると、エタノールはKP6870155発酵の副産物である可能性が高く、その後、これらの実験条件下でAB6870155によって同化されることが示された。さらに、このクロスフィードの表現型は、試験した他のA. baumannii (AB5075, BAL062) およびK. pneumoniae (ATCC 43816, NTUHK2044, SGH10) 分離株にも広く見られ、特に共感染からの分離株だけに見られるわけではないらしい (Fig. S8)。
図4：様々な炭素源を与えたKP6870155によるエタノールと乳酸の生産、およびAB6870155によるKP6870155使用済み培地の活用。
図4
HPLCで測定した、様々な炭素源を与えて培養したK. pneumoniae KP6870155（KPと略す）のエタノールおよび乳酸産生と、KP6870155使用済み培地で培養したA. baumannii AB6870155（ABと略す）による消費（n = 3 独立した細菌培養）。a、b グリセロール、c、d 乳糖、e、f マンニトール、g、h スクロース。データは平均値 + /- SDで示される。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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共培養によりA. baumanniiとK. pneumoniaeのバイオフィルム形成、ストレス応答、細胞伸長に変化が生じることが明らかになった
エタノールは、ストレス応答遺伝子の発現上昇とバイオフィルム形成の促進を通じて、A. baumanniiの病原性34,35の上昇と関連していることから、次に、バイオフィルム形成とストレス応答に関わる遺伝子のトランスクリプトームデータを調べたところ、単一培養バイオフィルムに比べ、バイオフィルムの共培養では両種ともこれらの経路の発現レベルが著しく上昇したことが確認されました。A. baumannii AB6870155とK. pneumoniae KP6870155の共培養では、エタノール存在下で過剰発現が報告されているシャペロニンGroEL35やスーパーオキシドディスムターゼSodBなどのストレス応答遺伝子の発現量の増加が観察された。両種とも他株の存在下でストレス応答遺伝子の発現に有意な差が見られたが、どのストレス応答経路がトリガーされるかは異なっていた（補足資料7）。共培養した場合、両者とも酸化ストレス関連遺伝子であるsodB, sodC, oxyR, dnaJの発現が有意に増加し、後者はエタノールストレス応答と関連することが知られている37,38. しかし、共培養したA. baumanniiでは、ユニバーサルストレスタンパク質に有意な発現差が生じなかったのに対し、K. pneumoniaeでは、uspB、uspE、uspGの発現が有意に増加していた（Fig. 5a）。Universal Stress Proteinの役割は、様々な生物において、ストリンジェント応答、DNA損傷への応答、バイオフィルム形成など多面的であり、ややとらえどころがない39。本研究では、多種の生物間の相互作用に対するKlebsiellaの反応におけるユニバーサルストレスタンパク質の役割は、これまで報告されておらず、さらなる調査が必要である。逆に、A. baumanniiは、シャペロンストレス応答遺伝子dnaK, grpE, clpB, groL, groSを有意に過剰発現させ、K. pneumoniaeはこれらの遺伝子の発現が減少した（補足資料7）。DnaK/J、GrpE、ClpBは熱ストレス時にミスフォールドしたタンパク質を救済し(36)、GroES/EL、GrpE、DnaKシャペロンは酸化的、浸透圧的、塩水的ストレスなど他の様々なストレスからの保護に重要である(37). GroES/GroEL および DnaK/DnaJ/GrpE シャペロン系は、大腸菌をアミノグリコシドから保護し40 、これらの抗生物質に対する耐性を向上させることも報告されている。さらに、A. baumanniiの病原性における役割が最近発見されたストレスのマスターレギュレータであるDksAも、AB6870155とKP6870155の共育成バイオフィルムにおいて両種ともに著しく過剰発現していた。
図5：A. baumannii AB6870155とK. pneumoniae KP6870155共培養のバイオフィルム特性。
図5
a AB6870155およびKP6870155共培養バイオフィルムの、それぞれの単培養バイオフィルムに対するRNA-seq発現変化（log2FC）。 b 様々な比率のAB6870155の成長（バー）およびバイオフィルム形成（ポイント）（バイオフィルムをクリスタルバイオレットで染色した後のOD550として測定される）。c フローセルチャンバーで3日間培養し、BacLight Live/Dead stain (ThermoFisher)で染色した単一培養および二種バイオフィルムのCLSM画像；緑色は生細胞、赤色は死細胞である。e カバースリップ上で 21 時間培養した単一種または二種バイオフィルムの外観 f カバースリップ上で培養し、SEM で撮影した純粋対共培養バイオフィルムの平均細胞長（AB + KP = AB6870155 + KP6870155 共培養）；SEM 画像の細胞長の算出には MicrobeJ ソフトウェアを用いた．P値は、両側Mann-Whitney検定を用いて算出し、有意値はそれを表す。**p≦0.02、有意でないp値＝ns（p＞0.05）。箱は中央値を横線とした第1四分位と第3四分位で囲み、ひげは四分位間の1.5倍を表す。ドットは個々の細胞を表す（n = 172 AB + KP, n = 225 AB6870155, n = 21 KP6870155）。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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我々のデータは、A. baumannii AB6870155 (csuAB) とK. pneumoniae KP6871055 (fumB, ecpE, oxyR) のバイオフィルム形成に関わる遺伝子が共培養で増殖すると著しく過剰発現することを示した (Fig. 5a) 。共培養によりバイオフィルム形成が促進されるかどうかを調べるために、クリスタルバイオレットバイオフィルムアッセイを行い、単培養と様々な比率の共培養のバイオフィルムバイオマス量を比較した。A. baumanniiの単培養株は、K. pneumoniaeに比べて高いバイオフィルム形成を示した（Fig.5b）。一方、K. pneumoniaeの比率が高い共培養株は、A. baumanniiの比率が高い株よりも厚いバイオフィルムを形成した（Fig. 5b）。これは、単独培養と共培養のバイオフィルムの間に、バイオフィルム構造の明確な違いがある可能性を示している。
栄養制限、酸素供給量、抗生物質などのバイオフィルムにおける様々なストレスは、細菌細胞の糸状化を引き起こす可能性がある42。そこで、共培養と単培養のバイオフィルムにおける細胞形状決定遺伝子、特に細胞の伸長と分裂に関わる遺伝子の発現プロファイルの差を調べた（補足資料7）。共培養したAB6870155とKP6870155は、ともに細胞分裂遺伝子、特にZリング形成に関わる遺伝子の発現が低下しており、これはフィラメント化につながる細胞分裂が典型的に減少していることを示唆していると考えられる43。この発現レベルの低下はKP6870155でより顕著に見られた（図5a）。興味深いことに、A. baumanniiとの共培養ではrodAの転写レベルが有意に増加し、棒状の形態を決定する他の伸長関連遺伝子の遺伝子発現には有意な変化が見られなかった。ほとんどのエロンガソーム遺伝子は、共培養で増殖したK. pneumoniaeでは転写レベルが有意に低く、その結果、細胞の長さが短くなったと考えられる。
バイオフィルム形成におけるクオラムセンシングの役割44を考慮し、我々は、共培養と単培養でこれらのシステムに何らかの変化があるかどうかを調べた。まず、AB6870155では、abaR LuxRファミリー転写調節因子遺伝子の発現が有意に増加した（log2FC 1.3）（図5a）。しかし、abaI アシルホモセリンラクトン（AHL）合成酵素遺伝子の発現には大きな変化が検出されなかった。AbaR制御因子の発現量が増加することで、バイオフィルム遺伝子やAbaRによって制御される他の遺伝子をより活性化することが可能になる可能性がある。K. pneumoniaeは、最近、アシルホモセリンラクトン（AHL）45を生産することが示されているが、AHLの生産を担うLuxI合成酵素ホモログは、これまでK. pneumoniaeでは特徴づけられていない。KP6870155株はLuxR遺伝子とsdiA遺伝子を持ち、いずれもLuxR型の転写制御因子をコードしていることから、AHLシグナルに応答することで種間コミュニケーションを可能にする可能性がある46。KP6870155株は、AB6870155株との共培養に対して、これらの遺伝子の発現に有意な変化を示さなかった。また、AI-2合成酵素S-リボシルホモシステインリアーゼをコードするAI-2システム遺伝子luxSの発現にも有意な変化は見られなかった（Supplementary Data 8）。したがって、24時間の時点では、A. baumanniiとの共培養に反応してK. pneumoniae quorum sensingに大きな変化は見られなかった。これらの結果は、AB6870155とKP6870155の両方が共培養内のバイオフィルム形成に寄与していると思われるが、少なくとも共培養成長の初期定常期には、2種のクオラムセンシングシステム間のクロストークを示す証拠を見出せなかったことを示している。
A. baumanniiとK. pneumoniaeの混合種バイオフィルムの構造を明らかにするために、我々はフローセル連続システムにおいて共焦点レーザースキャン顕微鏡（CLSM）で生／死染色した2種および単一培養バイオフィルムの可視化を行った。興味深いことに、生後3日目のK. pneumoniae単培養バイオフィルムは、ほとんどが死細胞または細胞膜透過性の細胞で構成されていたが、A. baumanniiバイオフィルムの細胞はほとんどが生きていた（図5c）。一方、A. baumanniiのバイオフィルムは、生細胞と死細胞がバイオフィルムの様々なニッチに混在しており、それぞれの単培養バイオフィルムのバイオフィルム構造に類似していた（Fig.5c）。このことは、二重種バイオフィルムに両方の細胞集団が存在し、代謝物の効率的な移動と共有が可能であることを示唆しているのかもしれない。しかし、共培養が細胞の生存率に影響を及ぼしている可能性もある。
カバースリップ上で増殖したバイオフィルムを目視観察したところ、A. baumannii AB6870155はK. pneumoniae KP6870155単独培養バイオフィルムよりもバイオフィルムのバイオマス量が顕著であった（Fig. 5e）。さらに詳しく見るために、SLMMで培養した二重培養バイオフィルムと単一培養バイオフィルムを走査型電子顕微鏡（SEM）で画像化しました。この結果は、MicrobeJ ソフトウェア47 を用いて平均細胞長を算出し、統計的に有意であると判定された（Fig. 5f）。A. baumanniiとK. pneumoniaeのフィラメント形成は、様々な種類の抗生物質に暴露した細胞でこれまで観察されてきたが48,49,50,51、細菌については混合種共培養に反応したこの現象はまだ報告されていない42。抗生物質ストレスに対するこれらの種のフィラメント形成は、共培養で成長したバイオフィルムにおいて両種に観察されたストレス応答遺伝子の発現の増加と対応している（Fig. 5a）。
A. baumanniiによるK. pneumoniaeのセフォタキシムによる交差防御作用
バイオフィルムは種内・種間の複雑な相互作用を促進し、シグナル伝達経路の相互作用、交差摂食による遺伝物質や栄養分の交換を可能にし、微生物群集の抗生物質耐性52、さらには抗菌薬に対する交差耐性53,54,55を変える可能性がある。そこで、バイオフィルム条件下で、共感染分離株が抗生物質に対して交差耐性を示すかどうかを検証した。まず，AB6870155とKP6870155の単培養と共培養（1：1比）の両方で，ゲンタマイシン（アミノグリコシド），テトラサイクリン（グリシルサイクリン），アンピシリン（ペニシリン），メロペネム（カルバペネム），セフォタキシム（第3世代セファロスポリン）などのβラクタムを含むさまざまなクラスの抗生物質のMICを設定した．AB6870155単培養株はcefotaxime，ampicillin，gentamicinに高度耐性を示し，KP6870155はampicillinに高度耐性，cefotaximeに中等度の耐性を示した（表2）。また，EUCASTブレイクポイントによると，両者ともメロペネムに感受性を示した（表2）。セフォタキシムとゲンタマイシンは，一方の株のMICが他方より有意に高いことから，交差防御が起こる可能性が最も高い抗生物質であると考えられた。抗生物質耐性遺伝子の発現プロファイルを見ると、プラスミドにコードされたBla_2 SHV-12型セファロスポリナーゼはKP6870155で有意に低い発現（log2FC -2.4）を示したが、Tn6168結合ampC転写はAB6870155で有意に低くなかった（Fig. S11）。β-ラクタム系抗生物質56,57,58では交差防御がよく知られているが、アミノグリコシド系抗生物質59では知られていないことから、セフォタキシムに暴露した共培養細胞で交差防御現象が起こるかどうかを調べたところ、セフォタキシムでは交差防御現象は起こらなかった。
表2 A. baumannii AB6870155とK. pneumoniae KP6870155の単培養および共培養（1：1）における最小発育阻止濃度（μg/mL）
原寸表
A. baumanniiのバイオフィルム形成はセフォタキシム耐性を著しく高めるため60、K. pneumoniaeに対する交差防御を提供できるかどうかを検証した。AB6870155からKP6870155について、セフォタキシム（512μg/mL）存在下および非存在下で、クリスタルバイオレット染色を用いて増殖およびバイオフィルム形成をアッセイした。相対的な存在量の違いは種間相互作用に影響を与える可能性があるため61、AB6870155とKP6870155のさまざまな共培養比率をテストした。これらの菌株のMICから予想されるように（表2）、セフォタキシムは512μg/mLでKP6870155を殺したが、AB6870155は殺さなかった。しかし、KP6870155の比率が高い共培養では増殖が有意に低下しなかった（図S9a）。モノ培養と様々な共培養の間の成長の変動を考慮して、培養の成長（OD600nmで測定）に対するバイオフィルムのバイオマス（OD550nmでのクリスタルバイオレット染色により測定）を正規化して、成長に対するバイオフィルム産生を計算した（図S9b）。AB6870155の割合がより高い共培養では、セフォタキシムの存在下で培養したもの、特にAB6870155：KP6870155の比率が70：30のものにおいて、培養物の成長に対するバイオフィルム産生の著しい増加が見られた（図S8b）。
K. pneumoniae KP6870155がMICの32倍のセフォタキシム濃度に晒されても生存しているかどうかを調べるため、512μg/mLのセフォタキシム処理共培養物および単培養物を示差寒天にプレーティングし、K. pneumoniae βガラクトシダーゼ生成細胞（赤いコロニー）と A. baumannii βガラクトシダーゼ欠損細胞（白いコロニー）を識別することが可能であった。この結果、セフォタキシム処理した共培養物、特にK. pneumoniaeが多く存在する共培養物には、KP6870155の生存集団が存在することが明らかになった（図6a）。セフォタキシムの交差防御をさらに調べるため、AB6870155とKP6870155の単独培養と共培養を512μg/mlセフォタキシムに曝露し、曝露後時間0と21時間目にMacConkey寒天培地にプレーティングして異種耐性集団が復活するかどうか確認した。しかし、512μg/mLセフォタキシムで処理したK. pneumoniae単培養物からのマッコンキー寒天培地プレートには、21時間の曝露後、コロニーが成長しなかった（図S10a）。したがって、共培養物内で生き残ったKP6870155集団は、ヘテロ耐性細胞ではなかったと思われる。さらに、512μg/mlのセフォタキシムで培養したAB6870155共培養体から代表的なKP6870155を再単離すると、セフォタキシムに対するMICが16μg/mlから8μg/mlと2倍減少していた（図6a）。さらに、交差防御の様式を解明するために、KP6870155をAB6870155から物理的に分離し、同じ培地とその中の分泌分子を共有できるMillicell hanging insert実験を実施した。KP6870155の成長は、セフォタキシム（CEF）処理存在下で、単独で成長したときよりもAB6870155と培地を共有したときに著しく高かったが（図6b）、ベータラクタマーゼ阻害剤のスルバクタムをセフォタキシムと併用したとき（CEF：SUL）には、見られなかった。A. baumanniiによるセファロスポリナーゼの分泌は、CEF：SUL併用処理で減少した（図S10b）。これは、AB6870155によるKP6870155の交差防御が、分泌セファロスポリナーゼを介して行われることを示すものである。
図6：抗生物質耐性および病原性に対する共培養の効果。
図6
a 512μg/mLセフォタキシムにおける抗生物質交差防御アッセイ。A＋Kは、それぞれ30：70の比率でのAB6870155およびKP6870155の共培養を示す。MacConkey寒天培地プレートの挿入図は、KP（KP6870155）のコロニーがK. pneumoniae β-ガラクトシダーゼ活性により赤く見えること、AB（AB6870155）はこの酵素を欠いており白いコロニーとして見えることを示す。 b 光学濃度（OD600）で測定したセフォタキシムのみ（＋CEF）およびセフォタキシムとサルバクタムの併用（＋CEF：SUL、2：1）時の K. pneumoniae KP6870155の生育。「KPのみ」は、A. baumannii AB6870155と培地を共有せずにウェル内で増殖したK. pneumoniae KP6870155を示し、「KP ( + AB insert)」はMillicell hanging insertを介してAB6870155と物理的に分離され、培地を共有できるKP6870155を示す（n = 3）。データは平均値＋/- SEMで示した。有意性はpaired Student's t-test (two-tailed) で測定し、*はp < 0.05 (p = 0.03) を、ns (not significant) はp > 0.05 を表す。 c G. mellonellaにおいてAB6870155 (AB) とKP6870155 (KP) を1：1の比率で単独注入および共注入 (A + K) の Kaplan-Meier Curve を測定した結果、AB6870155とKP6870155は、AB6870155と共注入 (KP) と比較して有意性が認められた。baumannii AB6870155 と K. pneumoniae KP6870155 の相互作用の BioRender と ChemDraw (v22.0.0) で作成した模式図です。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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K. pneumoniaeとA. baumanniiの共培養における病原性遺伝子と薬剤耐性遺伝子の発現
次に、SLMMで共培養したA. baumanniiとK. pneumoniaeのバイオフィルムにおいて、抗生物質耐性、分泌系、鉄獲得、ポリアミン合成、フェニル酢酸（PAA）経路に関わる遺伝子など、様々な病原性関連遺伝子の発現パターンを検討した。全体として、AB6870155ではほとんどの分泌系経路の発現量がKP6870155との共培養で減少し、KP6870155ではタイプ4分泌系（T4SS）タンパク質をコードするvirB4遺伝子の転写レベルが有意に減少した以外はこれらの遺伝子に大きな変化は観察されなかった。VI型分泌システム（T6SS）は、A. baumanniiが拮抗するグラム陰性菌と競合する際に組み立てられる多成分の装置であり、通常は病原性に必要ではないが13、細菌競合における固有の役割は、多菌感染症に影響を与えるはずである。この武器のような機構はエネルギー的に高価であり、A. baumanniiはその発現を制御するための制御機構を備えている62。ある株は、T6SSの発現を負に制御するリプレッサーをコードする大きな共役型多剤耐性プラスミドを持ち63、他の株は、重要なT6SSタンパク質をコードするvgrG遺伝子に単一のL749Rアミノ酸置換を持っており、この置換が存在するとT6SSの阻害剤として作用する62。ゲノム可塑性の領域に見られるvgrG（NH10_02760とNH10_02562）の両転写物は、KP6870155と共培養したAB6870155では著しく高かったが、他のほとんどのT6SS遺伝子、tssB、tssF、tssC、tssEとチューブタンパク質遺伝子hcp（NH10_02523）は著しく転写レベルが低かったので（Fig. S15, Supplementary Data 10)から、vgrG遺伝子はいずれもT6SSの阻害に関与している可能性があると思われる。AB6870155株のvgrG遺伝子を他のA. baumannii株のものとアラインメントしたが、L749Rのアミノ酸置換は見いだせなかった。AB6870155は2つのvgrG遺伝子を持ち、それらはA85 vgrGと高度に保存されており、100%のアミノ酸同一性を有していた。これらはACICU vgrG遺伝子とも非常に類似しているが、ATCC 17978 vgrG2とはより遠縁である(Fig. S14)。AB6870155とACICU vgrG遺伝子のアミノ酸の違いの大部分は、T6SSの構築に必須であることが証明されているタンパク質のC末端領域で生じた62。AB6870155 vgrG遺伝子がT6SSの阻害に関与しているかどうかを明らかにするために、さらなる調査が必要である。KP6870155と共培養したバイオフィルムでは、ほとんどのT6SS遺伝子の発現レベルが低下していることから、これら2つの細菌間にT6SSに基づく競合が存在しないことが示唆された。
これらの病原体の間の共栄養的相互作用にもかかわらず、共培養におけるストレス遺伝子の過剰発現（図5a）は、そのダイナミックさにあるレベルの緊張があることを示している。AB6870155とKP6870155の両菌株をバイオフィルムで共培養した場合、純粋培養に比べ、特定の抗生物質耐性遺伝子の著しい過剰発現が観察された（Fig. S11）。K. pneumoniaeは、アミノ配糖体ストレプトマイシンに対する抗生物質耐性を付与するemrE multidrug transporter (log2FC 3.6) とstreptomycin 3"-adenylylltransferase, ant1 (log2FC 2.3) の発現を著しく増加させていた。同様に、A. baumanniiは、RGP3上に位置し（補足データ1）、ClustalW64のNeedleman-WuncschペアワイズアラインメントによりKP6870155 ant1と89.4%の塩基同一性を有し、ストレプトマイシンに対する耐性も付与するアミノグリコシド核酸転移酵素ANT（3インチ）-IIaの発現を3.5倍増加した（図S11）。AB6870155はまた、ゲンタマイシン3-N-アセチルトランスフェラーゼであるaacC1を適度に1.6倍過剰発現していた（Supplementary Data 10）。これらの細菌はいずれもアミノグリコシド系抗生物質を生産する能力がないことが知られている。したがって、種混合増殖中にこれらの耐性遺伝子の発現が増加したことは、aaC（2'）酵素がペプチドグリカンのアセチル化にも機能する結核菌で観察されているように、別の役割の可能性を指摘している65。共培養で転写レベルが最も低下したAB6870155抗生物質耐性遺伝子は、AdeI、AdeJ、AdeA、そしてAdeKの中程度の発現低下（-1.6倍）であった。AdeIJKは、臨床的に重要なResistance-Nodulation-Division（RND）抗生物質排出系で、幅広い種類の抗生物質に耐性を与え66、殺生物剤耐性67の役割を持ち、おそらく脂肪酸輸出を通して脂質の恒常性維持に関与している68。AB6870155と共培養したK. pneumoniae KP6870155は、ftsI、bla_2、msbA、acrAおよびmdtJの発現が著しく減少した（図S11、補足データ8）。ftsIとblaSHV遺伝子はそれぞれペプチドグリカンD,D-トランスペプチダーゼとβ-ラクタマーゼSHV-12タンパク質をコードしており、β-ラクタム抗生物質とセファロスポリンに対する耐性を可能にするものである。これらの遺伝子の転写レベルが共培養で低いことは、AB6870155のβ-ラクタマーゼに依存している可能性を示している。
興味深いことに、共培養バイオフィルムで増殖したAB6870155は、ポリアミン、スペルミジン、スペルミンを天然基質とするmajor-facilitator superfamily (MFS) multidrug efflux pumpをコードするamvAの発現量が増加した69。さらに、AceI排出ポンプをコードするAB6870155のaceI遺伝子の転写レベルも、共培養細胞では単培養細胞に比べて有意に高かった（log2FC 5.5）。AceIはもともと殺生物剤クロルヘキシジンに対する耐性を付与するポンプとして同定されたが70、その後プトレシンやカダベリンなどのポリアミンを輸送することが判明した71。amvAの発現が増加し、混合種バイオフィルムで高発現していることは、共培養環境におけるポリアミン濃度の高さを反映している可能性がある。この仮説は、KP6870155のSapBプトレセンエクスポーターの転写量が約2倍増加したことからも支持される。さらに、A. baumannii AB6870155とKP6870155を共培養した場合、4-アミノブチレート-2-オキソグルタル酸トランスアミナーゼをコードするgabT遺伝子の発現が13倍増加した。この遺伝子は、プトレセンの恒常性維持に機能すると提案されている72。ポリアミンは、バイオフィルム形成、病原性、シデロフォア合成など、細菌における多機能を有している73,74。K. pneumoniaeと共培養したA. baumanniiで転写量が30-60倍と最も激減した遺伝子は、アシネトバクチンシデロフォアの生合成と輸送を担う bas (A. baumannii acinetobactin biosynthesis) 遺伝子、bau (A. baumannii acinetobactin utilisation) 遺伝子および bar (A. baumannii acinetobactin release) 遺伝子に属していることが印象的である75。これらの遺伝子はAB6870155ゲノム内でオペロンのクラスターを形成している（図S12b）。さらに、ヘムオキシゲナーゼであるhemOとともにRGP16に位置する鉄取り込み制御因子fecIとfecR、およびいくつかの仮説的遺伝子も発現レベルが著しく低下していた（図S13、Supplementary Data 1）。鉄獲得遺伝子の発現が低下しているにもかかわらず、鉄依存性のクラスIフマル酸ヒドラターゼ遺伝子fumAが3倍近く発現し、鉄非依存性のクラスIIフマルラーゼfumCが2倍低く、鉄制限条件下で増殖したA. baumanniiで観察されてきたことと正反対である76。したがって、K. pneumoniae が鉄の新たな競合相手として存在するにもかかわらず、共培養は鉄が豊富な条件下で予想される転写パターンを反映していた。細菌は、主要なシデロフォアオペロンに見られる鉄獲得遺伝子の他に、ゲノム中にランダムに分布するシデロフォア受容体遺伝子も持っており、外来で生産されたシデロフォアを認識することができる77。A.baumanniiを含む多くのグラム陰性菌では、TonB依存性の受容体がシデロフォアを輸送することが知られており78、この遺伝子はシデロフォアを取り込む能力があることが示唆された。興味深いことに、KP6870155におけるシデロフォア産生は、ほとんどの遺伝子でそれほど劇的に変化しておらず、フェリエンテロバクチン受容体のfepA_2の発現が2倍増加した（Fig. S12a）。このことは、分泌型シデロフォアと同様にK. pneumoniaeのシデロフォアがA. baumanniiと共有されていることを示唆している79。最後に、paaオペロン遺伝子の発現には分岐があり、AB68970155はフェニル酢酸（PA）異化経路の発現が有意に増加し、KP6870155は発現が有意に減少した。この経路は、芳香族化合物の代謝とA. baumanniiの病原性に関与している80。
A. baumanniiとK. pneumoniaeの共感染はin vivoでの病原性を増加させる
A. baumannii と K.neumoniae の共培養が、感染時の宿主の病原性にどのように影響するかを理解するために、我々はワックスガ幼虫 Galleria mellonella を生体内感染モデルとして使用した。G. mellonellaは、細菌の共感染を研究するのに適していることから、感染モデルとして選択された81。K. pneumoniae KP6870155とA. baumannii AB6870155をそれぞれ1×105個ずつ注入し、注入直前に等量ずつ混合（各菌種の合計数は105個ずつで一定）し、10日間幼虫の生存率を観察した。2株の共感染は最も毒性が強く、10日目までに33%の幼虫が死亡した。K. pneumoniaeの単独感染は次に毒性が強く、10日目までに7%の幼虫が死亡したが、A. baumannii AB6870155は毒性が弱く、生存率は100%だった（Fig. 6c）。このことから、2 種類の菌株を組み合わせて注射した場合、相乗的な殺傷効果が認められ、幼虫の総死亡数は両菌株を単独で注射した場合のそれを大幅に上回った。この効果は、単回感染の接種量と二回感染の接種量が一致した場合にも、程度は低いものの認められた（Fig. S16）。
考察
嚢胞性線維症、尿路感染症、肺炎、創傷感染症、炎症性腸疾患などのヒト疾患では、多菌種感染が蔓延しており、抗菌薬療法が効きにくくなり、疾患の重症化を招くことがある82,83,84。複数種感染症は、共存する病原体間の相乗的な相互作用によって可能となる。この相互作用のメカニズムには、交差摂食、化学シグナルによるコミュニケーション、バイオフィルムによる直接接触、環境ストレスに対する交差防御などがある4,52, 82,85. 本研究では、A. baumannii AB6870155とK. pneumoniae KP6870155の間で、クロスフィーディング、バイオフィルム生産、クロスプロテクションが相乗効果を生むメカニズムであることを見いだした。このような共生的相互作用は、細菌の観点からは友好的であるが、多剤耐性菌感染症の文脈では感染宿主に大混乱をもたらすことがある。
Ramseyら（86）は、病原体Aggregatibacter actinomycetemcomitansの生体内での持続性は、共存する病原体Streptococcus gordoniiからL-乳酸を相互供給されることに依存していることを証明した。クロスフィーディングと継代共食実験により、A. baumannii AB6870155はK. pneumoniae KP6870155発酵副産物であるエタノールと乳酸を消費できることを明らかにした。バイオフィルム・マトリックスは、相互摂食を通じたより効率的な代謝物の交換のための媒体として機能することができる87。本研究の共培養では、K. pneumoniaeの割合が増えるにつれて、バイオフィルム産生のレベルが上昇した。なぜK. pneumoniaeの比率が高いとバイオフィルム形成が増加するのかは不明であるが、バイオフィルム形成誘導シグナルが共培養体内で分泌されている可能性が考えられる。この現象は、Keoghらによって観察されている。Enterococcus faecalisは、L-オルニチンを分泌し、それが共培養パートナーである大腸菌のバイオフィルム生産を促進するシグナルとして作用している88。彼らの研究では、大腸菌によるシデロフォア産生は、腸球菌の存在によって促進されることも明らかにされた。興味深いことに、K. pneumoniaeと共培養したA. baumanniiで最も発現量が低下した遺伝子はシデロフォアをコードする遺伝子であり、K. pneumoniaeではシデロフォアの発現がそれほど激減しなかったことから、シデロフォアを共有している可能性が示唆された。この結果は、シデロフォアが私有化されるよりも公共財として利用されたときに発現が低下するというシデロフォア生産の生態進化モデルとよく一致している89。この共有化により、種間で生産されるシデロフォア間の鉄の盗用が緩和される一方で、A. baumanniiはエネルギー的に高価なシデロフォア生産をトレードオフして、成長へのエネルギー配分を行うことができるようになるであろう。鉄獲得制御因子fecIとfecR、ヘムオキシゲナーゼhemOなど、A. baumanniiで発現レベルが低い鉄獲得経路遺伝子のいくつかは、同じく転写レベルが著しく低い多くの仮説的タンパク質を含むRGP内に位置していた（図S13）。この結果は、このA. baumannii株と近縁の株が最近獲得した機能を示している可能性があり、他の共存病原体との混合種間相互作用に関与しているように思われるが、さらなる調査が必要である。
Adamowiczらによる以前の研究では、交差摂食による義務的相互作用に向けて設計された多生物群集は、群集の中で「最も弱いリンク」と同様の抗生物質感受性を持つことが示された。これは、MICが最も低い微生物のMICと同じであることを意味する52が、MICは定義された培地で測定されたものである。一方、今回の研究成果では、両方の菌種が炭素源にアクセスできる複合培地（MH）で培養した共培養株のMICは、より耐性の高いA. baumannii AB6870155株のものと高いか同じであることが示された。Adamowiczらは、この「最弱リンク」ルールの例外として、群集のメンバーの1人が抗生物質分解化合物を環境中に排泄するか、近隣のメンバーの耐性機構を活性化することにより、抗生物質の交差防御を行う場合があると説明している52。Liaoらは、K. pneumoniae、P. aeruginosa、E. coli、Enterobacter cloacaeなどの様々なカルバペネム感受性株が、カルバペネマーゼ産生A. baumanniiによって交差防御され、抗生物質治療の効果を阻害することを見出した90。同様に、Smithらは、黄色ブドウ球菌とカルバペネム耐性A. baumanniiの共培養91が、黄色ブドウ球菌に対する抗生物質メロペネムの殺菌活性を有意に低下させることを見出した。本研究では、A. baumannii AB6870155がK. pneumoniae KP6870155に対して、このK. pneumoniae株を通常殺すはずのセフォタキシムの阻害濃度に対して交差防御することが確認された。しかし、A. baumanniiがセフォタキシムに対してより感受性である場合、KP6870155とA. baumanniiの共培養体のMICはKP6870155の純粋培養体のそれよりも低く（補足データ12）、どの株が交差防御を行うか、またそれぞれの株がどれだけその恩恵を受けているかの間には微妙なバランスがあることを示している。これらの先行研究と今回の研究は、A. baumannii が同居する特定の病原体を殺すのではなく、むしろ庇護する傾向があることを示している。
A. baumanniiのこのような共栄養的な行動には、ある種の競争的形質が抑制されていることが必要である。A. baumannii は、厳密に制御された T6SS を備えており、これが活性化すると、競合するグラム陰性菌やグラム陽性菌を効果的に殺すことができ、同じ種内の菌株を殺すこともできる92,93。しかし、ある種のA. baumannii株では、多剤耐性プラスミドに保有されたネガティブレギュレーター63、あるいはVgrGスパイクタンパク質の変異体62によってT6SSの発現が抑制される。本研究で報告したA. baumannii AB6870155株は、K. pneumoniae KP6870155との共培養によりT6SSの発現を低下させた。このT6SSの武装解除はKP6870155の観点からはそれほど顕著ではなかったが、KP6870155の予測されるT6SS遺伝子の大半（補足データ8）は、共培養内で有意な発現変化を示さなかった。したがって、両菌がバイオフィルムで共培養されると、様々なストレス応答遺伝子の転写レベルが有意に高くなるにもかかわらず、菌株間の相乗的相互作用は、種間の細菌戦争よりもむしろ協力の方にバランスを傾けるようである。細菌のストレス応答は病原性につながる可能性があり94 、我々はこれら2つの菌株の共感染が生体内で病原性を高めるかどうかを検討した。その結果，K. pneumoniae KP6870155 と A. baumannii AB6870155 を共感染させた G. mellonella は，単株感染と比較して生存率が有意に低下し， K. pneumoniae と A. baumannii を共感染させることにより，in vivo で病原性が高まることが示唆された．
K. pneumoniaeがA. baumanniiに代謝産物を提供する代わりに、環境ストレスから保護されるという共生関係（図6e）は、地衣類型の共生を彷彿させ、臨床環境における多菌感染からこれらの病原体が共分離する理由に対する我々の理解はより強固なものとなった。この研究結果は、抗生物質の投与に先立ち、多剤耐性菌感染症を特定し、共存する病原体の交差防御能を検査する必要性を示している。これにより、共存する病原体間の交差防御による治療抵抗性の可能性を最小限に抑えた、最も効果的なレジメンを割り当てることができるようになる。
方法
細菌株と増殖条件
AB6870155株およびKP6870155株は、肺感染症患者の喀痰から以前に分離されたものであり1、要望に応じて入手可能である。これらの菌株の細胞培養は、すべて37 ℃で行った。特に断らない限り、本研究で行ったすべての実験において、細胞は、37℃で200rpmで振盪しながら好気的に培養した一晩培養細胞から再培養した後、ログ相半ばで回収した。澱粉、カゼイン酸加水分解物およびアミノ酸を豊富に含む牛肉抽出物を含む、世界中の研究室で抗菌薬感受性試験に日常的に使用されている豊富な培地であるミューラーヒントン（MH）培地、グルコース、乳酸およびアミノ酸を有効炭素源として含むより明確な培地（SLMM）95およびM9最小培地を指示通りに細胞の増殖に使用した。
抗生物質感受性試験および交差防御試験
抗生物質感受性試験は、Mueller-Hinton（MH）陽イオン調整培地を用い、先に述べた96.Broth microdilution 法で行った。簡単に言えば、培養物を凍結グリセロールストックからMH寒天培地プレート上にストリークし、37℃で一晩インキュベートした。5つのコロニーを選び、MHブロスで1×106 CFU/mlに標準化した。共培養試験では，A. baumannii AB6870155とK. pneumoniae KP6870155を定められた比率で混合し，試験した。純粋培養と共培養を試験した抗生物質の2倍連続希釈液に加え，最終的に5×105 CFU/mlの接種量とした。接種した96ウェルプレートは37℃で18時間培養し、細胞増殖は分光光度計を用いてOD600で測定した。A. baumannii AB6870155とK. pneumoniae KP6870155の2つの種が物理的に接触したときの交差保護を調べるために、純粋培養と共培養を512μg/mlセフォタキシムに暴露し、時間0（セフォタキシムへの最初の暴露時）および37℃で21時間の静置培養後の拡散プレートのコロニーカウントを介して生存率を測定した。培養液はMHブロスで1×103 CFU/mlに希釈し，MacConkey寒天培地に展開した．K. pneumoniae（コロニーはβ-ガラクトシダーゼ活性により赤く見える）とA. baumannii（コロニーはβ-ガラクトシダーゼを含まないため白く見える）を識別することができるように，MHブロスに展開した．Millicell hanging insert (Millipore) を用いて、A. baumannii AB6870155 を、5 × 105 CFU/ml の K. pneumoniae KP6870155 を接種した 24-well plate の wells に入れた insert に接種した交差保護実験も実施した。様々な濃度（8〜32 μg/ml）のセフォタキシムおよびセフォタキシム：スルバクタム（2：1比）を試験し，37℃で21時間培養後，分光光度計を用いてOD600で細胞増殖を測定した。A. baumanniiのセファロスポリナーゼが分泌されているかどうかを調べるために、細胞ペレットと細胞外分泌画分を調製し、ニトロセフィンディスク（メルク社）に塗布し、赤色の出現がセファロスポリナーゼの存在を示すようにした。セフォタキシムおよびセフォタキシム：スルバクタム存在下で増殖したA. baumanniiを、同じOD600に標準化し、3000gで10分間ペレット化した。上清を0.2μmフィルターでろ過滅菌し（細胞濾液画分）、細胞ペレットを1xPBSで2回洗浄し、洗浄間に3000gの遠心分離を10分間行った（細胞ペレット画分）。細胞濾液と洗浄した細胞ペレットを10μlずつニトロセフィンディスク上に滴下し、室温で5分間インキュベートした後の色変化を記録した。
種特異的qPCRによる共培養割合の決定
A. baumannii AB6870155とK. pneumoniae KP6870155のシングルコロニーを別々にMHまたはSLMMに接種し、37℃で一晩好気的に増殖させた。各菌株を新鮮な培地に再培養し、指数関数的な中位期（OD600 0.3～0.7 ）まで増殖させた。このサブカルチャーは、MHブロスでの増殖とSLMMでの増殖の各条件で3つの複製に分けられた。共培養は、20mlの新鮮な培地に合計で5×105CFU/ml（各株2.5×105CFU/ml）接種し、37℃、120rpmで培養した。各時点で1-2 mlのサンプルを取り、10,000 x gで10分間スピンダウンし、上清を廃棄した。細胞ペレットは、gDNA抽出を行うまで-30℃で凍結しておいた。
細胞ペレットを解凍し、10,000 x g、1分間で再遠心し、残った培地をピペットで除去した。gDNAは、DNeasy UltraClean Microbial Kit（Qiagen）を用いて、製造元の説明書に従って、以下の修正を加えて抽出した：サンプルは溶液SLの添加後10分間70℃でインキュベートし、密度の高い培養（OD600 ~0.8以上）については1 mlの入力培養を使用した。抽出したgDNAサンプルは、Qubit 4 Fluorometer (Invitrogen) でQubit dsDNA Broad Range assayを使用して定量し、すべてのサンプルを5 ng/µlに希釈した。qPCRは、QuantiNova SYBR Green PCR Kit（Qiagen）を用いて、製造元の説明書に従って、総反応量10 µl、gDNA鋳型5 ngで実施した。AB6870155に特異的なプライマー（Integrated DNA Technologies Inc.）は、blaOxa-53遺伝子（AB_oxa-53）を標的とし、順配列5'-GGAAGTGAAGCGTGTTGGTT-3'と逆配列5'-CAAACTGTGCCTCTTGCTGA-3'であった。KP6870155標的acrBに特異的なプライマー（Integrated DNA Technologies Inc）（KP_acrB）、順方向配列5'-GTCGATTCCGTTCTCGGTTA-3'、逆方向配列5'-GCAGACCCACCTGGAAGTAA-3'を使用した。サーモサイクルの条件は次の通り：イニシャル95℃2分、サイクリング95℃5秒、60℃10秒、40サイクル。プライマー効率はAB_oxa-53が97.83 %, R2 = 0.999、KP_acrBが97.92 %, R2 = 1.000であった。共培養比率は、式（1）の計算式で算出した。
$$\left(1\right){{{{{\rm{AB}}}}}}:{{{{{\rm{KP; ratio}}}}}}={2}^{-({{{{{{\rm{AB}}}}}}}{{{{{{\rm{Cq}}}}}}}-{{{{{{\rm{KP}}}}}}}{{{{{{\rm{Cq}}}}}}})}$$
ここで ABcqはABの平均Cq値、KPcqは各時点でのKPの平均Cq値である。共培養における各菌株の比率は、1の分数に換算して算出した。
DNAの塩基配列決定とゲノム解析
CHROMagarプレート上で増殖したコロニーから採取したK. pneumoniaeおよびA. baumanniiの一晩培養物（純粋培養の確認）から、Qiagen DNeasy UltraClean Microbial Kitを用いてDNAを単離した。Microbial Genome Sequencing Center (MiGS) において、Nexteraキットを用いたOxford NanoporeロングリードシーケンスおよびNextSeq 550プラットフォームでのIlluminaシーケンスが実施されました。配列データの品質は、FastQC v 0.11.9 (available from http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc) で評価しました。NanoporeリードはFiltlong v 0.2.0でmin_lengthパラメータを1000、keep_percentを90、target_basesを50000000097に設定してquality filteredし、Illuminaリードはnextseq-trim = 20パラメータでquality filteredして、adapt v 1.18 でパラメータ -a CTGTCTCTTATACATCT -A CTGTCTTATACATCT、最小長36：36 (Martin, 2011, https://doi.org/10.14806/ej.17.1.200) でアダプタをtrimedした。Unicycler v 0.4.9b98 (N50値は各菌株の染色体サイズと等しい)を用いて配列リードを完全ゲノム配列にハイブリッドアセンブリし、アセンブリグラフをBandage99で可視化した。アノテーションはProkka 1.14.6で行い、-rfamパラメータを使用してncRNAを検索した100。ゲノム配列はGenBankデータベース（BioProject ID PRJNA263680; Accession number JRWO00000000 v02 for AB6870155, TBA for KP6870155）に寄託されている。仮説的と注釈されたタンパク質の推定機能を見つけるために、eggNOG-mapper tool101,102 を使用した。A. baumannii のパンゲノム構築には 172 株の A. baumannii の完全ゲノム、K. pneumoniae のパンゲノム構築には GenBank から 530 株の完全ゲノムをダウンロードした（Supplementary Data 3-4）。パンゲノムの構築には、PPanGGOLiN31 v1.1.108を使用し、panrgpコマンドで可塑性のある領域を検索しました。プラスミドマップの作成にはSnapGene®ソフトウェアv 3.1.4 (insightful Science社製; snapgene.comで入手可能)を、非互換群の判定にはPlasmidFinderを用いた27。FastANI103 を用いて、配列決定された 172 の A. baumannii ゲノムと 530 の K. pneumoniae ゲノムの平均塩基同一性 (ANI) とアライメント分数 (AF) を計算した。FastANI の出力から R の parseDistanceMatrix 関数で距離行列を生成しました。この距離行列にR関数hclustのward.D2法を適用し，R ape (v5.5) パッケージのas.phylo() 関数を用いてデンドログラムに変換して出力した104. A. baumannii AB6870155 および K. pneumoniae KP6870155 ゲノム中の抗菌性遺伝子の同定には、Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) 105 v.2.0.3 をクエリで使用した。A. baumannii AB6870155とK. pneumoniae KP6870155のゲノムに予測されるトランスポーターを同定するため、ゲノムをTransporter Automated Analysis Pipeline (TransAAP; www.membranetransport.org) 106に提出した。K. pneumoniae KP6870155 の組み立てられたゲノムは、K. pneumoniae species complex (KpSC), ICEKp virulence loci and plasmid virulence loci, K (capsule), O antigen (LPS) serotype and resistance genes を特徴づけるために --kaptive parameter107を使用して Kleborate30 に提出された。ClustalW64を用いてNeedleman-Wuncschペアワイズアラインメントを行い、Clustal Omega108を用いて多重配列アラインメント（図S14)を実施した。
シデロフォアのゲノム同定
臨床分離されたK. pneumoniae（enterobactin, aerobactin, yersiniabactin）およびA. baumannii（acinetineabactin） に共通するシデロフォアを含むかどうかを確認するために、我々の菌株を用いた。baumannii ATCC17978 (GenBank accession CP000521.1) および K. pneumoniae で特徴づけられたこれらの遺伝子のコード配列を含むファスタファイルを、AB6870155 および KP6870155 のゲノムに対して BLASTn109 を用いて検索したところ、A. baumannii のゲノムには、acinetobactin、baumannoferrin および fimsbactin のような、臨床分離された K. pneumoniae に共通するシデロフォアが含まれていた。これらのシデロフォアを含むゲノム領域をArtemis110ゲノムブラウザで可視化し、遺伝子領域の模式図の構築を支援した。鉄関連遺伝子（補足データ11）は、供給されたHMMデータベースを用いてFeGenie111バージョン1（2020年11月）を使用して同定した。
Biolog表現型マイクロアレイ
AB6870155 および／または KP6870155 の唯一の炭素源として機能し得る化合物を同定するために、製造元の指示112 に従って Biolog 表現型マイクロアレイ (PM) を実施した (PM1-2; 190 種類の化合物)。また、MH または SLMM を含む別の 96 ウェルプレートに、A. baumannii AB6870155 および K. pneumoniae KP6870155 の単独および共培養体を、テトラゾリウム系色素を含む場合と含まない場合に接種し、これらの培地で細胞呼吸と増殖を監視した（図 S4）。MHおよびSLMMプレートに共培養菌を添加する場合、各菌株に対して単株接種で使用した接種量の半分を使用した。細胞をプレートに接種した後、Omnilog incubator/reader (Biolog)で48時間培養し、15分ごとに、細胞呼吸に関連するテトラゾリウム系色素（無色）のホルマザン（紫色）への還元に伴う各ウェルの色の変化を読みとった。データはOmnilog-PMソフトウェアで分析され、色形成の時間経過曲線が作成された。平均高さのしきい値は、101 任意オムニログ単位（AOUs）を選択し、菌株が使用する炭素源を特定した。ロジスティック曲線下の面積（auc_l）の算出には、growthcurver R パッケージ113 を使用した。プロットを作成するスクリプトは、R (v.4.0.5) で ggplot2 パッケージ114 を用いて記述した。
Millicell吊り下げ式細胞培養インサートを用いたクロスフィーディング実験
一晩培養した共分離菌のアリコート（50μl）を、OD600：0.6の細胞密度になるように振盪しながら新鮮なMH培地にそれぞれ植菌した。次に、KP6870155を、唯一の炭素源を含むMillicell hanging insert（Merck社）に接種した。このインサートは、少量分泌される代謝物を通過させるだけで、細菌細胞を通過させることはできなかった。AB6870155は、それによって利用できない単一の炭素源を含む6ウェルプレートに直接接種し、その後、KP6870155を含むインサートと組み合わされた。組み立てた6ウェルプレートを37℃で24時間振とう培養した。Fluorostar Omega分光計（BMG Labtech）を使用して、AB6870155の成長を判定した。各炭素源は3連で評価した。
逐次共培養と HPLC
2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2 および 20 mM のグリセロール、ラクトース、マン ニット、スクロースのいずれかを添加した M9 培地（Amresco、VWS Life Science、米国）を唯一の炭素源として逐次 共培養実験を行った。KP6870155の一晩培養物をMHブロスで培養し、その後、滅菌M9塩類培地で3回洗浄した。洗浄した細胞は、Genesys 10 S UV-VIS spectrophotometer (ThermoScientific, USA) を用いて光学密度を読み取り、OD600 0.01 に希釈し、各炭素源を添加したM9培地に植菌した；これは未植菌対照を含む3時点の炭素源当たり3回行った。チューブは密栓し、37℃で静置培養して、減圧酸素環境を作った。CLARIOstarPlusプレートリーダー（BMG Labtech、ドイツ）を用いて、接種後8時間および24時間の時点で吸光度の読み取りを実施した。また、接種後の各時点で1 mlを取り出し、室温で10,000 x g、10分間遠心分離し、上清を0.22 µmフィルターでろ過し、後の分析まで-80 °Cで保存した。接種後48時間目に、分光光度計の読み取り用に100 µlのサンプルを取り出した後、15 mlの培養物全体を10,000 x gで10分間、室温で遠心分離した。上清を0.22 µmシリンジフィルターで濾過し、分析用に1 mlのサンプルを取り出した。残りの約13 mlのKP6870155代謝培地に、M9培地、2 mM MgSO4および0.1 mM CaCl2を添加した。10mlのアリコートを新しい滅菌済み50mlチューブに移し、AB6870155の増殖に使用し、残りの〜2mlはコントロールとして保存した。AB6870155をMH-ブロスで一晩培養した後、1 mlを取り出し、滅菌M9培地で3回洗浄した。洗浄した細胞は、OD600 0.01に希釈した接種物をKP6870155代謝培地に接種するために使用された。成長チューブは、コントロールとともに、密閉して37℃で静置培養した。サンプルは、上記のように接種後8時間、24時間、48時間に採取した。サンプル中のエタノールおよび乳酸の濃度は、屈折率検出器を備えたAminex HPX-87Hカラム（BioRad、米国）を用いて、Prominence UFLCシステム（Shimadzu、日本）上の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により決定した。カラム温度は60 ℃，移動相は0.01% (w/v) 硫酸，注入量は10 µl，流速は0.6 ml/分で維持されました。データの解析にはLabSolutionsソフトウェア（Version 5.54 SP3、島津製作所）を使用した。各種A. baumannii株（AB6870155、AB5075、BAL062）に各種K. pneumoniae株（KP6870155、SGH10、NTUH-K2044）の使用済み培地を継代培養する場合は、上記のK. pneumoniae使用済み培地の採取とA. baumanniiの一晩培養物の調製の手順で全て実施した。このとき、各K. pneumoniae使用済み培地100 µlを含む96ウェルマイクロプレート（Sarstedt）に、OD600 = 0.01で洗浄したA. baumannii細胞を植え付けた。マイクロプレートの蓋の結露を防ぐため、前述115 のように蓋を100%エタノール中の0.05% Triton X-100で処理した。成長プレートは、各条件で 3 回の生物学的複製を行い、3 回の技術的複製を行った。曲線下面積 (AUC) は、RStudio の Growthcurver パッケージ (v0.3.1) を用いて、全プレート成長曲線用のデフォルト設定で計算した113。データ処理とグラフは、RStudio で tidyverse パッケージ (v1.3.1) を用いて作成した。
RNA抽出と配列決定
AB6870155とKP6870155を合成肺模倣培地（SLMM）中でバイオフィルムとして別々に、また共培養として6ウェルのマイクロタイタープレートで増殖させた。24時間後、バイオフィルムをPBSバッファーで2回洗浄し、バイオフィルムに付着した細胞を回収した。RNeasy® Mini Kit (Qiagen®)を用いてTotal RNAを抽出した。RNAは260 nmで定量し、アガロースゲル電気泳動でその品質を評価した。リボソームRNAは、配列決定前に製造元の指示に従ってRibo-Zero rRNA removal kit（Illumina®）を用いて除去した。mRNAライブラリー調製とIllumina NextSeq-500配列決定はRamaciotti Centre for Genomics（UNSW、オーストラリア）で行い、各RNAサンプルの約1000万のペアエンドリード（75 bpリード長）を生成した。
トランスクリプトーム解析
RNAシーケンスリードは、STAR v 2.3.7a alignment tool116を用い、パラメータをgenomeGenerateコマンドで--sjdbGTFfeatureExon CDSと--genomeSAindexNbases 8、マッピングコマンドで --alignIntronMax 1に設定して、それぞれのハイブリッドアセンブリしたゲノムをマッピングした。Samtools v 1.9117 を用いてアライメントファイルのソートとインデックス付けを行い、featureCounts118 に入力してカウントテーブルを生成しました。DESeq2 v 1.30.1 R package (65) と ashr shrinkage estimator119 を用いて、リードカウントデータを正規化し、DEF解析を実施した。このように、サンプルのリードカウントは、シーケンスの深さや高発現遺伝子による歪みについて正規化された。2つの条件間の発現差の有意性を検定するために、負の二項モデルを使用した。FDR (False Discovery Rate) が0.05未満、かつlog2 fold changeが1.0以上というカットオフ値を用いて、有意に差のある発現遺伝子を決定しました。様々な細胞パスウェイにおける遺伝子発現の差は、Biocyc120で可視化された。
バイオフィルム定量アッセイ
バイオフィルム形成アッセイは、以前に記載された方法121に従って、いくつかの変更を加えて実施した。MH寒天培地上のオーバーナイトストリークプレートから4〜5個の代表コロニーをMHブロスに再懸濁し、CFU（5×105細胞／mL）に等しくした。これらを96ウェルのポリスチレン製マイクロタイタープレート（100μl/ウェル）に個々の培養物として、また混合共培養物として接種し（2株の比率は様々）、プレートを512μg/mLセフォタキシム添加および無添加で37℃、18時間インキュベートした。バイオフィルムの定量は、Fluorostar Omega spectrometer（BMG Labtech, Offenburg, Germany）を用いて、ウェル内に保持されたクリスタルバイオレット染料の量（550 nmの吸光度）を測定することにより行った。結果は、それぞれ少なくとも3つのテクニカルレプリケートによる3つの独立した実験の平均を表す。成長をOD600nmで定量化し、バイオフィルムOD550nm対成長OD600nmの比率を計算し、サンプルあたりの細胞総数に対して正規化したバイオフィルム形成のレベルを決定した。
共焦点レーザー走査型顕微鏡（CLSM）
バイオフィルムは、以前に記載されたようにフローセルチャンバーで培養され122、いくつかの変更が加えられた。AB6870155株およびKP6870155株を，バイオフィルム付着のための基質となるガラスカバースリップで覆われたフローセルチャンバー（Biocentrum-DTU，個々のチャンネル寸法：1×4×40 mm）に個別または混合で同様のCFUで植菌した．細菌懸濁液（500μl）をフローセルチャンバーに接種した後，細胞を周囲温度で1時間培養し，その後，高精度ペリスタルティックポンプIPC-12（Ismatec）を用いてMHブロスを0.07 ml/minの一定速度でフローセルに送液した．バイオフィルムは3日間培養後，製造元のプロトコールに従ってLive/Dead BacLight細菌生存率プローブ（ThermoFisher）で染色し，CLSM用に準備した．バイオフィルムの破壊を最小限に抑えるため，実用濃度（500μl）のプローブをフローセルチャンバーに静かに注入した．バイオフィルムは15分間染色し，その後，増殖培地のフローを再開して30分間フラッシングすることにより余分な色素を除去した。バイオフィルムの顕微鏡観察および画像取得は，励起波長488nmおよび543nmのアルゴンレーザーおよびヘリウムネオンレーザーを装備したFV1000 CLSM（オリンパス社製）を用いて実施した．510nmから530nmの干渉フィルターおよび610nmのロングパスフィルターを発光に使用した．撮影したバイオフィルム画像は、Imarisソフトウェア（Bitplane社製）を用いてさらに処理した。
走査型電子顕微鏡(SEM)
走査型電子顕微鏡（SEM）のために、MH寒天上の新鮮なストリークプレートからのAB6870155およびKP6870155の各3コロニー（各3生物学的複製）を、10mlのMHブロスに接種し、37℃で、200rpmで振とうしながら一晩培養した。一晩培養したものを5000rpmで遠心分離してペレット化し、SLMMで2回洗浄した。洗浄したペレットをSLMMに再懸濁し、OD600 1.0に標準化した。丸いカバースリップをアセトンで洗浄し、完全に乾燥させ、紫外線滅菌した。その後、カバースリップを6ウェルプレートに、1ウェルにつき1枚ずつ加えた。各ウェルに5 mlのSLMM培地を加え、その後、各ウェルに50 µlの正規化・洗浄した複製培養物を接種した。三重共培養に指定した3つのウェルには、AB6870155とKP6870155の各株を25μlずつ接種した。プレートは、カバースリップ上にバイオフィルムが形成されるように100rpmで振盪しながら、37℃で21時間インキュベートされた。カバースリップ上に成長したバイオフィルムを21時間後に採取し、0.01 M PBSで穏やかに3回洗浄した。サンプルは3%グルタルアルデヒドで1時間、室温で固定し、その後4℃で一晩インキュベートした。30%エタノール 10 分、50%エタノール 10 分、70%エタノール 10 分、80%エタノール 10 分、90%エタノール 10 分、100%エタノール 10 分とエタノール洗浄を段階的に行い、Leica EM CPD300 で臨界乾燥させた。サンプルは、金スパッタコーティング（Emitech K550）を施し、Phenom XL SEM（Thermo ScientificTM）で可視化した。画像は、ImageJ ソフトウェアと MicrobeJ plugin47 を用いて解析し、細胞長の定量的測定と統計的検定を行った。このデータを表すbeeswarmプロットは、beeswarm (v 0.4.0) とRserve (1.8-10) Rパッケージで作成した。
In-vivo Galleria mellonella試験
G. mellonella 注入プロトコルは、いくつかの修正を加えて、以前に記載された123 ように実施した。A. baumannii AB6870155 および K. pneumoniae KP6870155 のいずれか1×105 個の細胞を用いて、それぞれ5匹の幼虫（200-250 mg）からなる3つの技術的複製アッセイを単一感染について実施した。共感染の場合は、注入前にAB6870155とKP6870155のそれぞれ1×105個を混合したものを作成した。注入後、幼虫を37℃でインキュベートし、注入後10日まで毎日検査し、G. mellonella Health Index Scoring System124に従って生存率をスコア化した。別のバッチ試験では、いずれかの株の1×107個の細胞を用いて、5匹の幼虫からなる3〜4個の技術的複製を実施した。共感染では、注入前にAB6870155とKP6870155のそれぞれ5×106の混合物を作成した。幼虫はすべて同じ年齢（5齢幼虫期）であった。注入後、幼虫を37℃でインキュベートし、注入後10日まで毎日検査し、生存率をスコア化した。生存率分析は、Survminer (v 0.4.9) R パッケージを使用して行った。
統計学と再現性
統計はR統計ソフトとMicrosoft Excel (version 16.67)を用いて行った。実験は独立した3つの培養反復で行い、すべてにおいて同様の結果が得られた。
報告書の概要
研究デザインに関する詳細な情報は、この記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryに掲載されています。
データの入手方法
シーケンスリードは、プロジェクト番号PRJNA263680でGenBankに提出されました。A. baumannii AB6870155 genome BioSample accession SAMN03105183, K. pneumoniae KP6870155 genome BioSample accession SAMN23708555. RNAシーケンスリードは、NCBI Sequence Read Archive (SRA) にアクセッション番号 SRR20379129, SRR20379130, SRR20379131, SRR20379132, SRR20379133, SRR20379134, SRR20379135, SRR20379136, SRR20379137で寄託されたもの。ソースデータは本紙に添付しています。補足データファイル1-12は、GitHub（https://github.com/amycainlab/coinfection_project）からアクセスできます。ソースデータはこの論文で提供されています。
コードの入手方法
スクリプトとバイオインフォマティクスパイプラインはGitHub（https://github.com/amycainlab/coinfection_project）からアクセスでき、Zenodo（https://doi.org/10.5281/zenodo.7430526）からも入手可能です。
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このような場合、「遺伝子とゲノムの比較表示」をRで行うことができます。
論文
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謝辞
菌株を提供してくださったフリンダース大学のMelissa Brown教授に感謝します。また、SEMの作成にご協力いただいたMacquarie University Microscopy UnitのSue Lindsay氏に感謝する。この研究は、National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia から A.K.C. への Project Grant 1159752、NHMRC Grants 1124917, 1120298, 1060895 から I.T.P. 、University of Newcastle CESE Excellence grant から K.A.H., A.K.C., L.S. and C.J.D. へ一部支援を得たものです。K.A.H.はオーストラリア研究評議会フューチャーフェローシップ（FT180100123）の支援を受けている。
著者情報
著者ノート
これらの著者は等しく貢献した。Lucie Semenec, Amy K. Cain, Catherine J. Dawson.
これらの著者はこの研究を共同で監修した。Karl A. Hassan, Ian T. Paulsen.
著者および所属
ARC Centre of Excellence in Synthetic Biology, School of Natural Sciences, Macquarie University, North Ryde, NSW, 2113, Australia（マッコーリー大学自然科学部、オーストラリア
Lucie Semenec, Amy K. Cain, Hue Dinh, Anahit Penesyan, Ram Maharjan, Karl A. Hassan & Ian T. Paulsen
マッコーリー大学自然科学部、ニューサウスウェールズ州ノースライデ、2113、オーストラリア
Lucie Semenec, Amy K. Cain, Qi Liu, Hue Dinh, Hannah Lott, Anahit Penesyan, Ram Maharjan & Ian T. Paulsen
ニューカッスル大学環境・生命科学学部、オーストラリア、ニューサウスウェールズ州、キャラハン、2308
Catherine J. Dawson & Karl A. Hassan
モナシュ大学微生物学部、バイオメディシン・ディスカバリー研究所、クレイトン、ビクトリア州、3800、オーストラリア
フランチェスカ・L・ショート
寄稿
全著者がこの研究の様々な側面を考案した。L.S.とH.L.はクロスプロテクションアッセイを行った。Q.L.はRNA-seq、Biolog PMおよびクロスフィーディング実験を行った。L.S.はゲノム配列の決定とRNA-seqおよびゲノム解析を行った。C.D.は継代共食実験とHPLC実験を行い、C.D.とL.S.がデータを解析した。C.D.はqPCR実験を行った。A.P.とL.S.はSEM実験を実施し、データを解析した。A.P.とQ.L.は共焦点顕微鏡検査と分析を行った。H.L.はバイオフィルム実験を行い、H.L.とL.S.はデータを分析した。H.D. と R.M. は G. mellonella の in vivo 感染実験を行い、H.D., L.S., R.M. と A.K.C. はデータを分析した。F.L.S.はKleborateおよびFeGenie解析ツールを用いてバイオインフォマティクス解析に貢献した。I.T.P.、K.A.H.、A.K.C.は資金を提供した。L.S.、A.K.C.、I.T.P.、K.A.H.は、原稿を執筆した。また，全著者が原稿の確認と編集を行った。
対応する著者
Karl A. HassanまたはIan T. Paulsenに連絡すること。
倫理的宣言
利益相反
著者らは、競合する利益を宣言していない。
倫理承認
Klebsiella pneumonia KP6870155 と Acinetobacter baumannii AB6870155 は、通常の病院関連診断検査で採取された未同定検体の残りから分離されたものである1。そのため、インフォームドコンセントや倫理委員会の承認は不要であった。
ピアレビュー
査読情報
Nature Communicationsは、この研究の査読に貢献した匿名査読者に感謝します。査読者の報告書はこちら。
追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して、中立的な立場を維持しています。
補足情報
補足情報
査読ファイル
追加補足ファイルの説明
補足データ1
補足データ2
補足データ3
補足データ4
補足データ5
補足資料6
補足資料7
補足資料8
補足資料9
補足資料10
補足資料11
補足資料12
報告書概要
ソースデータ
ソースデータ
権利と許可
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転載と許可
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この記事の引用
Semenec, L., Cain, A.K., Dawson, C.J. et al. Klebsiella pneumoniae と Acinetobacter baumannii の間の交差防御と交差摂食は、それらの共存を促進する. Nat Commun 14, 702 (2023)。https://doi.org/10.1038/s41467-023-36252-2。
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受付終了
2022年2月21日
受理済
2023年1月20日
公開
2023年2月9日
DOI
https://doi.org/10.1038/s41467-023-36252-2
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微生物群集
微生物学
病原体
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