ヒト3D脳オルガノイド：脳と神経疾患の脱分子化に舵を切る

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出版：2023年7月3日
ヒト3D脳オルガノイド：脳と神経疾患の脱分子化に舵を切る

https://www.nature.com/articles/s41420-023-01523-w

ヨギータ・K・アドラカ
細胞死ディスカバリー第9巻、論文番号：221（2023） この記事を引用する
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指標詳細
要旨
ヒトの脳の発達、機能障害、神経疾患の理解は、動物モデルでヒトの脳特有の特徴を再現することができないため、限定的で困難なままである。ヒトの脳の解剖学的および生理学的な理解は、ヒトの死後サンプルや病理学的サンプル、モデル動物を用いて目覚しい形で進んでいるが、ヒトの脳の発達や神経疾患のモデル化は、ヒトの脳が持つ独特の複雑性のために、依然として困難である。このような観点から、3次元（3D）脳オルガノイドが一筋の光明を示している。幹細胞技術の飛躍的な発展により、多能性幹細胞を3次元培養条件下で脳オルガノイドに分化させることが可能となり、ヒトの脳の特徴を様々な形で再現するとともに、脳の発生や機能障害、神経疾患について詳細に調べることができるようになった。また、脳オルガノイドのトランスレーショナルな価値も浮上しており、脳オルガノイドのスケールアップのためのプロトコールが整備されれば、社会に貢献することになるだろう。ここでは、造血幹細胞からの脈管形成組織や混合系組織を含む、より複雑な脳オルガノイドの作製法における新たな進歩を要約する。また、合成バイオマテリアルとマイクロ流体技術が、脳オルガノイドの開発をどのように後押ししているかについても強調している。早産に伴う脳機能障害、ウイルス感染を介した神経炎症、神経発達疾患、神経変性疾患の研究への脳オルガノイドの応用について論じる。また、脳オルガノイドのトランスレーショナルな価値と、この分野が直面している現在の課題についても強調する。
内容
1.
脳オルガノイドは、脳の発達、機能障害、障害を研究するための複雑なヒトベースのin vitroツールである。
2.
ヒト脳オルガノイドは、二次元単層培養や動物モデルよりも、脳の構造と機能を可視化しやすい。
3.
3.臓器間相互作用、早産や感染に伴う神経発達障害を、高度な手法で極めて詳細に研究することが可能である。
未解決の問題
ヒト脳オルガノイドは、ドーパミンのような神経伝達物質の産生にも使用できるような、トランスレーショナルなin vitroツールとなりうるか？
脳の全体的な空間的および時間的な細胞構造をその微小環境とともに表現するためには、プロトコルの進歩が必要である。
はじめに
ヒトの脳は、多細胞生物の中で最も複雑で大きく発達した器官である[1]。ゲノムの変化や長期の発達がもたらすヒトの脳の独特な複雑性により、動物モデルを用いてヒトの脳の発達や神経疾患を理解することは困難な課題となっている[2]。にもかかわらず、ヒトの脳に関する知識の大半は、死後標本や病理標本、動物モデルから得られてきた。これらの標本は、ヒトの複雑な脳の特徴や疾患の発生を完全に再現しているわけではない[3, 4]。しかし、近年の幹細胞技術や工学技術の飛躍的進歩は、ヒトの脳の発達や疾患を研究するためのヒトベースのツールの開発に弾みをつけている[5, 6]。
幹細胞技術における次の努力は、多能性幹細胞（PSCs）を所望の脳特異的細胞型に分化させる方法を開発することに集中している。先に、接着性の二次元（2D）細胞培養系が、神経細胞の発生を研究するためにPSCsから派生した。しかし、2次元モデルは内在性の組織構造を持たないため、発達中の脳のモデリングやin vitroでの複雑な細胞間相互作用の研究に課題をもたらす[7]。組織構造と細胞間相互作用は、複数の細胞タイプが影響を受ける神経発達障害を理解する上で非常に重要である[8]。このような背景から、造血幹細胞を3次元脳オルガノイドに分化させるための新しい3次元培養法の開発により、正常な脳の発達と神経疾患の病態解明が可能になった[9]。
脳オルガノイドは、特定のin vitro条件下でPSCsから誘導される三次元多細胞構造体であり、ある程度自己組織化し、in vivoの脳領域を部分的にシミュレートする[3]。近年、大脳新皮質、海馬、視床下部、中脳など、ヒトの特定の脳領域に類似した脳オルガノイドを作製する技術が飛躍的に進歩している[10, 11]（表1）。
表1 脳領域特異的オルガノイドを作製するためのさまざまな分子カクテル。
原寸大の表
脳オルガノイドは、感染症、遺伝性疾患、がんに関与する正常および異常な発生過程の研究に用いることができる。本総説では、造血幹細胞から脳オルガノイドを作製するための新しい方法の進歩について要約する。早産やウイルス感染に関連した脳機能障害や神経疾患の研究における脳オルガノイドの応用について論じる。また、脳オルガノイド分野が取り組んでいるトランスレーショナルバリューと課題についてもまとめる。
脳オルガノイド作製法の進歩
2次元単層培養による分化に関する初期の画期的な研究[12,13,14,15,16]と、笹井とクレバーのグループによる3次元培養に関する画期的な研究により、脳オルガノイドを作製するための先駆的なプロトコール[17,18]が開発される基盤が整った。一般に、脳オルガノイドは、hPSCの自己組織化と外部誘導シグナルの利用という2つの主要な技術を用いて作製することができる。笹井グループとKnoblichグループは、それぞれ神経誘導分子と細胞外マトリックス（マトリゲル）を用いた3D脳オルガノイド培養系のパイオニアである[9, 19]。ヒトの脳オルガノイドは胎児の脳の本質的な特徴をエミュレートしているが、内部低酸素や細胞死など、現在のオルガノイド法には限界があるため、胎児の後期発生段階を再現した3次元脳構造を得ることはできなかった[10]。驚くべきことに、Gordonらは、出生後段階のシグナルを示す3Dヒト皮質オルガノイドを誘導する方法を開発した[20]。さらに、脳オルガノイドの培養方法の進歩について述べる（図1、2）。
図1：脳オルガノイド作製における方法論の進歩。
A 最小限の培地と細胞外マトリックスを用いるシンプルな方法で、自己組織化した全脳オルガノイドが作製される。B パターニング分子のカクテルにより、中脳オルガノイドや海馬オルガノイドのような脳領域特異的構造が生成される。C 異なるオルガノイドの融合により、異なる脳領域の様々な細胞タイプ間の相互作用や移動を研究することができる。D 神経筋オルガノイドのような混合系統オルガノイドは、臓器間相互作用の研究を可能にする。E 合成材料はオルガノイドの成熟を促進する。F マイクロ流体工学により、オルガノイドの血管系を発達させる。
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図2：脳オルガノイドの脈管形成に関するさまざまな戦略の模式図。
A マウスの脳に脳オルガノイドをマイクロインジェクションすると、生着し、宿主の血管系に浸潤した。B造血幹細胞を内皮細胞と共培養し、C誘導性転写因子ETV2をhESCsに遺伝子導入すると、脳オルガノイドに血管系が発達した。D VEGFのような内皮因子を初期に与え、後にWNT7を与えたEBは、神経分化とともに血管形成を示した。E 脳オルガノイドの脈管形成には、（i）神経スフェロイドと中胚葉スフェロイドの融合、（ii）脳EBと血管EBをマトリゲル液滴で挟んだもの、（iii）脳EBと解離した血管オルガノイドの融合など、さまざまな融合アプローチがある。
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脳オルガノイドの細胞外マトリックス（ECM）
Lancasterらは、hPSCの自己組織化と自己パターン化の特性を利用し、ECMの存在下でhPSCから脳オルガノイドを作製した[9]。この研究は、外部からの誘導シグナルがない場合にhPSCがデフォルトの神経外胚葉運命を獲得することを示唆する、神経デフォルト経路の概念に基づいていた[21]。しかし、笹井らのグループは、初期パターニングのためにTGFβ阻害剤やWnt阻害剤などの外部誘導シグナル存在下でhESCを培養し、その後、高濃度（40%）O2存在下で低濃度のマトリゲルを使用した[19]。
領域特異的オルガノイドのための細胞外誘導シグナル
脳は、いくつかの領域からなる不均一な組織である。脳の発生は、オーガナイザー領域から分泌される形態形成因子／パターン形成因子の協奏的な働きによって神経管がパターン形成されることにより、異なる脳領域が同時に形成されることを伴う[21]。同じ原理を応用して、培養液に細胞外誘導シグナルやパターニング因子を補充することで、オルガノイド内の細胞が特定の脳領域の運命をたどるように誘導するin vitroの方法が研究者によって開発された。
特定の部位の前後極性（AP）と背腹極性（DV）に応じて、部位特異的3D脳オルガノイドのための頑健なプロトコールが開発されている[16]。2つのパターニング因子カクテルは、神経管のAP軸とDV軸に沿って神経外胚葉の同一性を誘導する。WntとTGFβは哺乳類の神経分化に悪影響を及ぼすので[22, 23]、ES細胞の胚様体様凝集体（SFEB）の無血清浮遊培養において、WntとNodalのアンタゴニスト（Dkk1とLeftyA）を最初の5日間補充すると、選択的な神経分化が起こる（約90％）。しかし、Wnt3aを後期に投与すると淡蒼球終脳に分化し、Shhを投与すると基底脳終脳に分化する[24]。永楽らは、Wnt、Nodalアンタゴニスト、およびBMPRIA-Fcを、迅速再凝集を用いた改良SFEB（SFEBq法）に用い、マウスやヒトのPSCsから極性化された皮質神経上皮を効率的に産生した[19, 25]。したがって、神経管に沿った首尾一貫した神経誘導とAPの同一性を目指した、最初のパターニング因子カクテルが確立された。いくつかの研究では、デュアルSMAD阻害法を用いてTGF-βとBMPシグナルを抑制することにより、hPSCを神経外胚葉アイデンティティに効率的に転換することが示されている [16, 26, 27]。用量依存的な初期インスリン処理とWnt活性化は、中脳、視床、視床下部、小脳などの様々な脳領域の発生に用いられてきた [27,28,29,30]。第二のパターン形成因子カクテルでは、後期にWnt活性のパルスを与えると、終脳オルガノイドができる [27, 28, 31]。海馬組織はWntとBMP処理によって作製できるが [11]、終脳、視床下部、中脳の腹側運命は、早期のSHH活性化によって作製できる [27,30,32,33,34]。これらの誘導シグナルの他にも、いくつかのモルフォゲンが分化培地に含まれている。例えば、皮質オルガノイドの吻合は、FGF8の処理によって達成された [19, 25]。同じ誘導シグナルで、異なる脳領域を密度勾配と時間的様式でパターン化することができるが、特定の脳領域に対しては、化学的に定義されたパターン化因子カクテルと、低コストで再現性のある処理順序を確立することが、最近の障害となっている [2]。こうした課題にもかかわらず、脳領域特異的オルガノイドは、遺伝子変異の影響や脳領域特異的疾患に対する治療パラダイムの解明に役立っている[30, 35, 36]。しかし、脳領域特異的オルガノイドには領域間の相互作用がないため、これらの方法を用いて領域間の相互作用を調べることは困難である。領域間相互作用を研究するための可能な解決策として、オルガノイド融合アプローチが浮上しており、この手法については他の文献でよく論じられている[2]（図1）。
オルガノイドの成熟を促進する
オルガノイドで機能的で成熟した神経細胞とグリア細胞を得るための努力の結果、オルガノイドを3次元培地で長期培養することになった。長期培養は、50日でカルシウム活性を獲得し[26, 27]、4ヵ月で自発性興奮性シナプス後電流を獲得し[37]、6ヵ月以上で成熟ニューロン、アストロサイト、シナプス、樹状突起棘とともにグリア細胞を獲得するのに役立った[38, 39]。培養期間の延長は、in vitroでの成熟細胞タイプの研究を促進する。
しかし、長期培養に伴ういくつかの課題には、オルガノイド内部への酸素供給不足、低酸素状態の内部コア、組織の細胞死などがある。インキュベーター内の酸素濃度を上げる、回転式バイオリアクターを使う、ガス透過性培養プレートを使うなど、内部コアへの酸素供給を高めるためのいくつかのアプローチが採用されてきたが、健康な脳オルガノイドの成熟は妊娠中期と同様であった。最近、Guo-Li Mingの研究グループは、45日齢の新皮質オルガノイドをスライスする方法を開発し、さらに培養を進めると、内部低酸素状態が減少し、細胞死が減少し、神経新生が持続し、長期培養で深層と上層のニューロンが形成された。スライスされたオルガノイドの構造は、妊娠第3期の胚性ヒト大脳新皮質を模倣している[10]。最近、Pascaたちは大脳皮質スフェロイドの長期培養も行い、694日まで成長させた。これらのスフェロイドは、ヒストン脱アセチル化酵素複合体とNMDA受容体サブユニットのアイソフォームスイッチングを示し、250日から300日の間に脳発達の出生前から出生後初期への移行を示した[20]。
混合系統組織オルガノイド
オルガノイドは1つの組織型を模倣するだけでなく、脳と網膜のような2つの系統組織や混合系統組織の表現型も再現するため、in vitroで臓器間相互作用を調べることができる。最近、2つの系統組織オルガノイドを開発した論文が発表された。ジェイ・ゴパラクリシュナン（Jay Gopalakrishnan）のグループは、前脳オルガノイドから両側対称性の視神経胞を開発する革新的な方法を探求した。彼らの方法には、単細胞iPSCを神経誘導培地でニューロスフェアが形成されるまで培養し、次いで酢酸レチノールを添加したニューロスフェア培地で培養するというものがある。早期に酢酸レチノールを補充することで、脳オルガノイドにおける視神経胞の早期発生が促進された[40]。Mina Goutiとその共同研究者らは、hPSC株を用いて神経中胚葉前駆細胞を作製し、いくつかの成長因子を添加したニューロベース培地中で3次元凝集体を形成させた。その結果、神経筋オルガノイド（NMO）は、骨格筋細胞、脊髄ニューロン、シュワン細胞間の機能的な神経筋接合部を同時に形成した（図1）[41]。別の研究では、iPSC株を神経中胚葉前駆細胞に分化させ、そこから感覚運動オルガノイドを誘導した。これらのオルガノイドは、感覚神経細胞、運動神経細胞、アストロサイトなどの神経細胞由来の細胞と、ミクログリア、内皮細胞、骨格筋などの中胚葉由来の細胞を含んでいた。また、運動ニューロンと骨格筋の間に生理的に活性な神経筋接合部があることも報告された [42]。
特殊化され血管新生した脳オルガノイド
これまで述べてきた方法で作製されたヒト脳オルガノイドは、血管系を欠いている。このため、オルガノイド内部への酸素や栄養分の供給が制限され、オルガノイド内部の壊死や細胞死を引き起こし、オルガノイドの成長が制限されることになる[43, 44]。血管系の欠如は、脳前駆細胞のシグナル伝達、分化、成熟にも影響を与える。したがって、オルガノイドに血管系を発達させることは、多様で分化した再現性のある細胞レパートリーを得るために重要である（図2）[46, 47]。
この方向性では、フレッド・ゲイジのグループが、ヒトの脳オルガノイドを成体マウスの脳に移植することによって、オルガノイドにin vivoの生理学的条件を与え、移植片における神経細胞の分化と成熟、グリア細胞の生成、機能的シナプス、および血管系の改善をもたらした最初の取り組みを示した[48]。次のアプローチでは、ヒトETSバリアント2（ETV2）を一過性に過剰発現するようにhESCを工学的に作製し、ヒト皮質オルガノイド内にETV2発現細胞を出現させ、最終的に皮質オルガノイド内に複雑な血管様ネットワークの形成を示した。獲得された血管系は、血液脳関門（BBB）の数多くの特徴を示した [49]。別のアプローチでは、PSCsをヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）と共培養して皮質オルガノイドを形成した。これらのオルガノイドはまた、管状血管系の形成も示した [50]。注目すべきことに、どちらの研究においても、血管オルガノイドは機能的な血管系を示し、細胞死が減少し、マウスへの移植後に成熟とシナプス結合が改善した [49, 50]。さらに、VEGFリッチ培地で培養したEBは、脳オルガノイドにおいて神経細胞とともに血管内皮細胞（EC）の共分化をもたらした。VEGFとWNT7aを添加すると、大脳オルガノイド内にBBBの特徴を持つ分離した血管様構造が形成された[51]。もう一つの方法は、神経細胞と血管細胞を別々にスフェロイドとして増殖させ、その後融合させる方法である。研究者たちは、神経と中胚葉のスフェロイド[52]、あるいは血管と脳のオルガノイド[53, 54]を融合させ、長期間培養している。融合後、血管の形成と成熟はうまくいったが、血管網は血管新生促進および抗血管新生条件に対する反応性は低かった [52]。脳オルガノイドにおける血管の局在化を避けるために、Ahnらは血管オルガノイドを解離し、神経誘導培地を用いて脳オルガノイドと共培養した。その結果、周皮細胞とともに長い血管が形成されたが、アストロサイトは血管と密接には関連していなかった[55]。これらのアプローチ以外にも、マイクロ流体技術、ECMタンパク質、合成材料が、脳オルガノイドの血管形成を促進するために用いられてきた [31, 56, 57]。
オルガノイド誘導における機能性材料
脳のECMを3次元培養で再現することは大きな課題であり、そのためマトリゲルなどの天然素材を多用するようになった[58]。しかし、その組成が明確でないこと、異種原性であること、バッチ間のばらつきがあること、再現性に欠けることなどから、研究者たちはマトリゲルに代わる材料を模索するようになった[59]。最近の合成材料の進歩により、化学的に定義され、大幅な改変が可能で、再現性があり、異種原性を持たない、より優れたECM様材料が開発されつつある [59, 60]。例えば、脱細胞化したブタの成体脳ECMは、ESC由来の脳オルガノイドの増殖に使用され、40日目には成熟した形態を示すようになった [61]。同様に、コラーゲンハイドロゲルも、興奮性、抑制性ニューロンおよびグリア細胞を共発達させた3D神経細胞オルガノイドにおいて、ニューロンネットワークの成熟を改善した [62]。次の飛躍では、組換えクモ糸とヒトラミニン111の複合体が、細胞ストレスとオルガノイド内変動を軽減し、大脳オルガノイドにおける神経細胞の成熟を促進した [63]。
研究者たちはポリエチレングリコール（PEG）を採用し、均質な3D神経管コンストラクトを作製した［64］。驚くべきことに、神経誘導シグナルを加えなくても、Cell-Mate3Dハイドロゲル（ヒアルロン酸（HA）とキトサンの混合物）はわずか10-14日で脳オルガノイドを形成した [65]。さらに、脳ECMの重要な成分であるHAは、ヘパリンと組み合わせてiPSC由来の脳オルガノイドの尾状化を引き起こす[66]。これらの材料以外に、アルギン酸単独またはHAとの組み合わせも、PSCsの3次元培養において神経宿命を刺激する[67]。合成材料はまた、脳オルガノイドの発達を調節し、長期生存を促進するVEGFのような、脈管形成と微小環境の制御に重要な様々な成長因子を送達することができる[68]。脳のECMを模倣する合成材料のこうした進歩は、改良された脳オルガノイド・モデルの開発に役立っている。
オルガノイド誘導におけるマイクロ流体工学
マイクロ流体工学とは、小型化されたマイクロ流体細胞培養装置のことであり、連続的に灌流されるチャンバー内に生きた細胞を供給することで、臓器オン・チップ・システムを可能にする [69, 70]。この技術は、組織の物理化学的な微小環境を制御し、組織の細胞構造や血管灌流を大幅に模倣することができる [56, 58]。オルガノイドの脈管形成におけるマイクロ流体技術の応用は計り知れない[71,72,73]。最近、マイクロ流体デバイスであるポリジメチルシロキサン（PDMS）チップとヒト脳のECMを組み合わせることで、3D脳オルガノイドの神経新生が改善され、電気生理学的機能が向上した [74]。Seilerらは、自動化されたPDMS作製マイクロ流体細胞培養プラットフォーム上で培養した皮質オルガノイドにおいて、解糖系ストレスと小胞体ストレスの減少を観察した[75]。マイクロ流体技術は、細胞の共同開発にも利用できる。例えば、hPSC由来の周皮細胞、内皮細胞、脳オルガノイドを3Dプリントしたマイクロ流体プラットフォームで共発達させると、組織化された血管網が形成され、脳オルガノイドと相互作用して灌流するようになる[57]。共同開発だけでなく、脳領域特異的なオルガノイドもマイクロ流体チップを用いて作製されている。例えば、マイクロカプセルに包まれたヒトiPS細胞は、脳領域特異的オルガノイドを作製し、動的な流体フローを持つ多層マイクロ流体チップを用いて脳アセンブロイドに組み立てた。これらのアセンブロイドは、皮質、海馬、視床のオルガノイドで構成され、神経の移動と相互作用を再現していた[76]。さらに、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、音響流体式ミニバイオリアクターなどを用いて、マイクロ流体チップ内の培地の流れを活発に維持することで、脳オルガノイドの灌流と酸素・栄養素の供給を改善することができる[77,78,79,80]。マイクロ流体で培養された脳オルガノイドは、最近、毒性研究にも用いられている。例えば、ワンストップ・マイクロ流体チップ上での脳オルガノイドの大麻曝露は、オルガノイドにおける神経細胞の成熟低下、神経突起の伸長低下、自発発火の減少をもたらした[81]。PDMSでコーティングされたシャーレ型マイクロコンパートメントは、ヒトの脳オルガノイドの折り畳みのモデルとして使用され、その折り畳みは発生の最初の週に見られた[82]。このように、マイクロ流体工学は、流体力学、合成高分子化学、生物学の分野を融合させ、脳の構造、生理、発達、創薬などを研究するものである。
脳オルガノイドの応用
早産に伴う神経発達障害の研究
早産とは、妊娠37週以前の出産のことである[83]。早産は、新生児死亡の約15%に関与しており、世界的に新生児死亡の主要な原因となっている [84] 。生存者のうち、～80％の超早産児（妊娠28週以前に出生）は、その後の人生において様々な程度の神経発達障害に直面する。出生後、早産児は低酸素症に遭遇する可能性があり、未熟児脳症と呼ばれる急性疾患 [85] を発症し、複雑な行動や認知機能の障害につながる（図3） [86]。
図3：脳オルガノイドの応用。
脳オルガノイドは、早産に伴う神経発達障害、SARS-CoV-2やジカ熱などのウイルス性神経栄養、神経発達障害や神経変性疾患、膠芽腫などの脳腫瘍、毒性学的研究などに利用できる。
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脳オルガノイドは、このような複雑な機能のモデル化を可能にし、臍帯組織や臍帯血を用いてiPSC由来の脳オルガノイドを作製することができる[87]。超早期早産児における低酸素を介した神経発達障害の根底にある分子機序は、よくわかっていない。最近、Pascaらは、ヒトの脳領域特異的オルガノイドを用いて、皮質形成に対する酸素欠乏の影響を明らかにした。酸素欠乏は、ヒト大脳皮質の拡大に大きく寄与する皮質中間前駆細胞の集団を減少させた。注目すべきは、この減少が未完了タンパク質応答（UPR）経路と関連していることである。UPR経路の低分子阻害剤を加えると、低酸素症後の中間前駆細胞の減少が回復するのである[85]。
ウイルス感染機序／神経向性を研究するために
感染症は病原体によって引き起こされ、パンデミックや伝染病の可能性を持って定期的に出現・蔓延し、人間の生活を破壊する。最近、中国から新型ヒトコロナウイルスSARS-CoV-2が、アメリカではジカウイルスが、それぞれパンデミック、エピデミックとして出現した。これらはそれぞれCOVID-19と小頭症を引き起こし、ヒトの種に壊滅的な打撃を与えた。
一部の患者の脳からSARS-CoV-2とZIKVのRNAが検出され、ZIKVの流行と新生児の先天性小頭症との関連が疑われたことから、これらのウイルスの向神経性と神経毒性作用が示された。SARS-CoV-2とZIKVの神経毒性と先天性小頭症をそれぞれ結論付ける直接的な実験的証拠はないため、ウイルス感染メカニズムを明らかにするために3D脳モデルを採用することになった [88, 89]。最近では、SARS-CoV-2が脳オルガノイド、iPSC由来のhNPC、ニューロスフィア、脳スフェロイド、アストロサイト、ミクログリアの皮質ニューロンに感染し、代謝の変化、ミクログリアが介在するシナプスの巻き込み、神経細胞死を引き起こすことが、いくつかの研究で検証されている[90,91,92,93,94]。これとは矛盾するが、他の研究では、SARS-CoV-2によるニューロン、アストロサイト、ミクログリアへの感染はまばらか稀であることが示唆されている［95、96］。しかし、脈絡叢オルガノイドは、SARS-CoV-2の強固な感染と、それに続く細胞死、バリアーの完全性の低下を示している。脈絡叢細胞におけるSARS-CoV-2侵入レセプターの豊富さが、脈絡叢オルガノイドの劇的な感染を引き起こしているのかもしれない［96］。同様に、大脳オルガノイドもZIKVの感染メカニズムの解明を進めている。ZIKVは脳オルガノイドで効率的に複製し、その成長を阻害する[97]。ZIKVはNPCと前脳オルガノイドに選択的に感染し、NPCの増殖低下に続いて甚大な細胞死を引き起こし、神経細胞の体積とオルガノイドのサイズを減少させる[27, 66, 67]。オルガノイドでは、ZIKVは自然免疫受容体TLR3を活性化し、NPCを枯渇させる［98］。前脳オルガノイドでは、ZIKVのNS2Aタンパク質が放射状グリア細胞の増殖を低下させ、アドヘレンス接合（AJ）複合体の欠損を引き起こす。最近、脳オルガノイドにおけるZIKV感染は、Aβ斑の蓄積、p-Tau発現の増加をもたらし、AD病態を促進した [100]。
さらに、これらのウイルスの細胞型特異的感染に関する異なる研究間の相違は、野生型、スパイク擬似型化ウイルスベクター、デルタおよびオミクロン分離株など、異なるウイルス株を使用したためである可能性がある [93, 101, 102]。これらのメカニズム研究以外にも、脳オルガノイドはZIKVの株特異的な神経対流性を明らかにし、治療法の開発に利用されている［103, 104］。例えば、脳オルガノイドにおけるSARS-CoV-2感染は、抗体でACE2受容体を停止させるか、COVID-19患者の脳脊髄液でオルガノイドを培養することで防ぐことができる［105］。最近、FDAに認可された抗ウイルス剤（抗C型肝炎剤）であるソホスブビルは、感染した皮質オルガノイドにおいて、SARS-CoV-2の複製を阻止し、神経細胞死を減少させ、シナプスの完全性を回復させた［92］。注目すべきことに、ソホスブビルはヒトNPCと3DニューロスフェアをZIKVによる細胞死から保護した［106］。驚くべきことに、ZIKVによって誘発された脳オルガノイドの欠損は、I型インターフェロンとRNAiエンハンサーのエノキサシンによって救済された［97, 107］。これらの研究により、ヒト脳オルガノイドモデルが、神経対流性を明らかにし、脳のウイルス感染の根底にある分子メカニズムを明らかにする上で、また潜在的な治療候補をスクリーニングする上で有用であることが明らかになった。
神経疾患の根底にあるメカニズムを理解する
神経疾患には神経発達症や神経変性症が含まれるが、神経疾患のメカニズム解明や薬剤開発は、疾患発症段階で患者の脳組織にアクセスできないために妨げられてきた。そのため、ヒトの脳の複雑性、生理、病理を再現できる3D脳オルガノイドの開発が進められている。ここでは、神経発達疾患および神経変性疾患（図3）の具体例を用いて説明するが、これらの疾患の多くは表2に記載したとおりである。
表2 3Dヒト脳オルガノイドを用いた疾患モデリングと課題
原寸大表
自閉症スペクトラム障害（ASD）
ASDは脳の発達異常の障害であり、小児において言語障害、社会的相互作用の低下、定型的行動をもたらす[108, 109]。遺伝的・表現的多様性が非常に高いため、動物モデルや細胞モデルでASDを研究することは困難である。しかし、ASD患者由来の大脳オルガノイドや前脳オルガノイドは、皮質板厚の肥大を示すことで、ASDの臨床的表現型を示す[110]。患者iPS細胞由来の大脳皮質オルガノイドは、細胞周期の亢進、FOXG1遺伝子の発現の増加、GABA作動性抑制ニューロンの過剰産生を示し、患者のGABA/グルタミン酸ニューロン集団が不均一であることを強調している[111]。最近では、SUV420H1、ARID1B、CHD8の3つのリスク遺伝子に変異を持つASD患者由来の皮質オルガノイドでも、GABAニューロンや興奮性投射ニューロンの非同期発達が見られる [112]。異常増殖と代替スプライシングにより、抑制性ニューロンの産生が亢進し、興奮性ニューロンの産生が遅延する [113] 。さらに、胎児iPS細胞から作製された終脳オルガノイドでは、機能的エンハンサーにASDのde novo変異が濃厚であることが明らかにされ、NR4A2、Hes1、NFIX、Sox3などのホメオドメイン転写因子の結合部位が障害されている [43]。さらに、患者の脳オルガノイドは、異なる遺伝子ネットワークや経路の活性化も示す。例えば、CHD8（自閉症候補遺伝子）ヘテロ接合体KO iPSC株由来の終脳オルガノイドでは、Wnt/β-カテニンシグナル伝達と軸索誘導が、影響を受ける重要な経路の上位に挙げられている [114]。CNTNAP2遺伝子のホモ接合体変異を有する患者の前脳オルガノイドは、神経前駆細胞の増殖の増加により、オルガノイドの容積が増大した。CRISPR-Cas9を介したオルガノイドにおけるCNTNAP2変異の修復により、皮質の過成長表現型が逆転し、転写プロファイルが部分的に回復した [115]。16p11.2コピー数変異（CNV）を有する患者の大脳皮質オルガノイドでは、神経細胞と神経前駆細胞の比率が変化しており、神経前駆細胞が欠失した場合には神経前駆細胞が枯渇している [76]。これらのオルガノイドのトランスクリプトーム・プロファイリングとプロテオーム・プロファイリングから、ニューロンの移動、アクチン細胞骨格、Wntシグナル伝達が調節異常の経路であることが明らかになった。皮質オルガノイドにおけるRhoAの阻害は、神経細胞移動の欠損を回復させたが、神経突起の長さは回復させなかった[116]。さらに、患者の大脳オルガノイドのOrgo-Seqでは、16p11.2欠失に重要な細胞として未熟な神経細胞と中間前駆細胞が同定された[117]。
アルツハイマー病（AD）
アルツハイマー病は、認知機能の低下と行動の悪化を伴い、認知症に至る主要な神経変性疾患である [118] 。早期発症の家族性ADは、ヒト神経前駆細胞のAPP遺伝子とPSEN1遺伝子を変異させ、3次元培養で分化させることにより、脳オルガノイドで初めてモデル化された。これらのオルガノイドは、アミロイドβペプチド（Aβ）と神経原線維変化（NFT）の強固な細胞外沈着を示した[119]。それ以来、PSEN1、APOE4遺伝子に変異を有し、ADの病的特徴を再現する患者大脳オルガノイドが作製されている[120, 121]。患者大脳オルガノイドのトランスクリプトーム解析により、ストレス顆粒のアップレギュレーションとRNA代謝異常が解明された[121]。
遅発性ADをモデル化するために、いくつかの新しい方法も開発されている。最近、脳オルガノイドをヒト血清にさらすことで、ADにおけるBBB漏出が驚くべき方法で模倣された。この条件下では、脳オルガノイドにおいて、Aβペプチド、p-tau、シナプス消失のレベルの上昇といったADの主要な特徴が観察された[122]。さらに、単純ヘルペスウイルス（HSV-1）を脳オルガノイドに感染させると、ADの外因性モジュレーターを加えることなく、ADの特徴が発現した [123]。神経細胞、アストロサイト、ミクログリアを3Dマイクロ流体チャンバー内で共培養すると、ADの特徴が再現され、特にミクログリアは、IFN-γとTLR4を介した機序でTNF-αと一酸化窒素を分泌して神経細胞障害を引き起こす [124]。
パーキンソン病（PD）
PDもまた、最も一般的な神経変性疾患であり、加齢に伴い振戦、下垂姿勢、筋硬直、歩行困難、認知機能低下を示す [125] 。
最近、Kwakらは、ドーパミン作動性ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを含み、非常に均質で成熟した中脳様オルガノイドを開発した。さらに、オルガノイド内に存在するアストロサイトは、代表的なドーパミン作動性神経毒である1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン（MPTP）を分解するため、PDのin vitroモデル化が容易である[126]。中脳オルガノイドの作製には、細胞数、包埋のタイミング、成熟プロトコールなど、他にもいくつかの条件が標準化されている [27, 36, 127, 128]。LRRK2-G2019S変異を有するPD患者から作製された中脳様オルガノイドでは、ドーパミン作動性ニューロンの産生に必要な転写因子であるFOXA2の発現が増加しており、中脳ドーパミン作動性ニューロンの神経発達障害が示唆された [36]。LRRK2-G2019S変異で作製されたアイソジェニック中脳オルガノイドもまた、PDの特徴を模倣していた。LRRK2-G2019S変異を導入した3Dオルガノイドの遺伝子発現プロファイリングから、チオール酸化還元酵素（TXNIP）が発現上昇遺伝子のひとつであることが明らかになり、TXNIPを阻害することでオルガノイドにおけるPD病態が救済された [35]。
したがって、これらの結果は、脳オルガノイドが神経疾患の原因や病理学的メカニズムを明らかにするだけでなく、薬剤スクリーニングや遺伝的、エピジェネティック、環境的ストレス因子の影響の解明にも利用できることを示唆している。
治療プラットフォームへの応用
部位ごとにパターン化された脳オルガノイドは、ドーパミン、アセチルコリン、GABAなどの神経伝達物質の分泌に役立つ。この圧倒的なアプローチには、オルガノイドの樹立と品質管理に関する世界的に標準化されたプロトコルが必要である。もし、これらのプロトコールが非常に堅牢で、再現性が高く、スケールアップが可能で、バクテリアよりも安価な技術であることが実証されれば、神経伝達物質を安価に生産するオルガノイド技術が確立される日はそう遠くない。この技術は、細菌システムではなく、ヒトシステムによって分泌されたドーパミンを受け取ることができるパーキンソン病患者にとって、計り知れない応用となるだろう。
現在の課題
脳オルガノイドは、発生、進化、神経疾患の研究に前例のない機会を提供するが、克服すべき課題も多い。主な制限のひとつに、バッチ間のばらつきによる再現性がある [129]。形態、分化効率、細胞組成にばらつきがあるため、非ガイドのオルガノイドではバッチ効果が顕著である [38, 130]。さらに、異なるPSC株を使用すると、オルガノイドのサイズや形態が変動し、脳オルガノイドの再現性も損なわれる。従って、疾患の病理学的表現型を明らかにするためには、患者由来のオルガノイドの大きさを比較する際に、年齢、遺伝的背景、性別が同等の適切なストリンジェント・コントロールが不可欠である。現在のプロトコルのもう一つの限界は、オルガノイドのコアへの栄養と酸素の供給が制限され、その結果、オルガノイドの壊死、成熟の制限、さらには細胞種の欠落が生じることである。この制限を克服するために、オルガノイド内で血管系を発達させる試みがいくつかなされているが、プロトコルを改良する必要がある[49, 131]。また、現在のプロトコールでは、新皮質の完全な6層の層状細胞構造や、完全に成熟したグリア細胞をオルガノイドで作製することはできない。
今後の展望と結論
3D脳オルガノイド分野は、in vivoの組織構築をディッシュ上で実現するという点で計り知れない可能性を秘めており、その結果、疾患モデリング、移植、創薬、毒性学に無数の機会を提供してきた[129]。3次元脳オルガノイドは、2次元神経ロゼットと比較して、神経前駆細胞のユニークな層と分化ニューロンの適切な移動を示すことにより、組織化された組織構造を保持するという卓越した可能性を示している。学際的なアプローチにより、脳オルガノイドを用いた薬物スクリーニングや毒性研究を促進するために、バイオリアクター、マイクロ流体デバイス、ロボットデバイス、3Dプリンターが導入されている [79, 132]。脳の特定部位を模倣した脳領域特異的なオルガノイドの作製を可能にするプロトコールがいくつか登場し、脳の発達や機能障害の根底にある生物学的メカニズムを空間的・時間的に研究できるようになった。しかし、大脳皮質オルガノイドでは皮質ニューロンの6層すべてを、海馬オルガノイドでは海馬の全領域を生成できるような、プロトコルの改良がまだ必要である[133]。さらに、人工バイオスカフォールドは、オルガノイド皮質板におけるニューロンの時空間移動を改善するのに役立つ。異なるサンプル間や同じプロトコール内での不均一性やばらつきは、依然として強固な課題である。この課題に取り組むための努力は始まっているが、均質性を高めるための外来性パターン形成分子、ミニ・バイオリアクター、ミニ・スカフォールドの探索に関する今後の研究が必要である [19, 26, 27, 31, 44]。
オルガノイド分野におけるもう一つの大きな領域は、オルガノイドの中心部への栄養と酸素の供給が非効率的であるために、オルガノイドの成熟が制限されていることである。この目標を達成するためには、オルガノイド内で血管系や成熟した非神経細胞タイプを発達させるのに役立つアプローチを確立しなければならない。内皮細胞の共培養、マイクロ流体灌流、脳オルガノイドにおけるETV2の異所性発現、in vivoでの脈管形成を達成するためのげっ歯類への脳オルガノイドの移植、ハイドロゲルやナノ粒子などの生物工学的物質など、いくつかのアプローチが採用されているが [48, 49, 132, 135]、オルガノイドの高度な成熟と生存を達成するためには、学際的な統合アプローチが必要である。脳オルガノイドにアストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリアなどの非神経細胞タイプを作製することは、神経細胞とグリアの相互作用の研究にさらに役立つ。長期培養は、オルガノイド内のグリア細胞の分化とともにニューロンの成熟を促進する[20]。加えて、この分野では、加齢に関連する神経変性疾患を研究するために、加齢の主要な特徴をモデル化する新しい戦略が必要とされている。
要するに、バイオエンジニアリング、マイクロ流体工学、オートメーションの統合は、3D脳オルガノイド分野におけるさらなる技術的進歩を可能にし、新規の疾患メカニズムを解明し、神経疾患の診断および治療法の開発に役立つであろう。
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謝辞
インド政府科学技術省科学技術研究委員会によるSERB研究員賞（SB/SRS/2020-21/45/LS）に深く感謝する。資金提供機関は原稿執筆や論文掲載の決定に関与していない。また、Translational Health Science and Technology Institute (THSTI)（ファリダバード）およびアミティ大学（ノイダ）のインフラ支援に謝意を表する。紙面の都合上、引用を見送った著者にお詫び申し上げる。図はBioRender.comで作成した。
資金提供
本研究は、インド政府科学技術研究委員会から資金援助を受けた。
著者情報
著者および所属
アミティ分子医学・幹細胞研究所、アミティ大学、ノイダ、ウッタル・プラデーシュ州、インド
ヨギータ・K・アドラカ
母子保健領域、トランスレーショナル・ヘルス・サイエンス＆テクノロジー研究所（THSTI）、ファリダバード、ハリヤナ州、インド
ヨギータ・K・アドラカ
筆者
Yogita K. Adlakhaにご連絡ください。
倫理申告
競合利益
著者は競合する利益はないと宣言している。
追加情報
出版社注：シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
権利と許可
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Adlakha, Y.K. Human 3D brain organoids: steering the demolecularization of brain and neurological diseases. Cell Death Discov. 9, 221 (2023). https://doi.org/10.1038/s41420-023-01523-w
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2023年1月5日受領
2023年6月19日改訂
2023年6月22日受理
発行2023年07月03日
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41420-023-01523-w
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