細菌によるin vivo部分リプログラミングは、線維化や腫瘍化を伴わない成体肝臓器の成長を促進する

2022年11月27日 16:26

細菌によるin vivo部分リプログラミングは、線維化や腫瘍化を伴わない成体肝臓器の成長を促進する
サミュエル・ヘス 10
ティモシー・J・ケンドール 10
マリア・ペーナ 10
リンダ・アダムス
リチャード・トルーマン
アヌーラ・ラムブッカナ 11
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脚注を表示するオープンアクセスDOI:https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2022.100820
PlumX メトリクス

ハイライト

九官鳥の成虫にMLを感染させると、in vivoで肝臓の成長が促進される

拡大した感染肝臓は腫瘍がなく、機能的にも建築的にも正常である

MLによる前駆細胞/再生細胞状態への部分的なリプログラミングが肝臓の成長を促進する

MLによる肝臓の正常な成長制限を回避することで、より安全な修復介入を可能にする。
まとめ
再生医療や健康な加齢のための理想的な治療法は、健康な臓器の成長と若返りを必要とするが、臓器レベルのアプローチは今のところない。我々は、天然の部分的細胞再プログラム能力を持つMycobacterium leprae（ML）とその動物宿主である九帯アルマジロを用いて、進化的に洗練された成体肝の成長と再生のモデルを提示する。感染したアルマジロでは、MLは肝臓全体を再プログラムし、肝細胞の増殖と血管系、胆道系の比例した拡張を含む健康な肝小葉の増加により、総肝/体重比を有意に増加させる。MLに感染した肝臓は、損傷、線維化、腫瘍化することなく、微細構造的にも機能的にも正常である。バクテリアによるリプログラミングは、肝前駆/発生/胎児遺伝子を活性化し、成長、代謝、抗老化に関連するマーカーを増加させ、老化や腫瘍形成遺伝子の変化は最小限である。これはバクテリアが恒常性維持や再生経路を乗っ取り、de novo器官形成を促進することを示唆している。このことは、肝臓臓器の成長を効果的かつ安全に再活性化する内因性経路の解明を促進し、臓器再生や若返りなどの幅広い治療効果をもたらす可能性があります。
図解要旨
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キーワード
臓器成長
肝臓再生
部分再プログラム
若返り
老化
機械学習
幹細胞
再生医療
マイコバクテリウム・レプリー
九帯アルマジロ
はじめに
成体器官の成長促進や若返りは、病気や怪我、老化による機能不全を治療するための理想的な戦略です1,2,3。in vitroモデル、オルガノイド、ミニオーガンは、創薬、疾患モデル、再生医療に応用できる可能性がありますが、4,5、必要な臓器レベルの複雑性をモデル化することはできません。その結果、このようなアプローチの進歩にもかかわらず、慢性疾患や加齢に伴うヒトの疾患において、成体臓器の効果的な再生や若返りを達成する現在の戦略はありません。
ヒトの慢性肝疾患では、繰り返される炎症性傷害と実質細胞死が、創傷治癒反応と並行して肝細胞量の再生的回復を促します8。慢性的な損傷は、悪性腫瘍のリスク上昇と関連しており、慢性的なウイルス感染で最も高くなります。9,10 損傷した肝臓を再生する内因性の経路は、まだ十分に解明されておらず、理解の欠如が再生促進の臨床戦略の欠如に寄与しています。肝疾患による健康被害や経済的負担が急速に増大する中、このような修復戦略の欠如は非常に重要です。さらに、老化した肝臓は、生理的機能が低下するため、進行性の疾患にかかりやすくなります。13,14,15 健康な肝臓を維持することは、他の臓器の機能に直接的、間接的に影響を与えるため、重要ですが、老化に伴う肝機能低下を遅らせたり回復させる若返り戦略は存在しません。
現在の肝再生研究では、短命のげっ歯類モデルを用いており、再生を促すには肝細胞の減少を必要とし、元の肝臓の大きさに達すると停止する8,16,17。このような上限規制を回避することができれば、肝臓を傷害することなく再生を研究することが可能になります。再生機構がどのようにデノボに作用するのかを理解すれば、移植を減らす、あるいはそれに代わる、パラダイムシフト的な成人臓器再生と若返りの臨床戦略が得られるであろうが、現在のところ、そのようなin vivoモデルはない。
体細胞から人工多能性幹細胞（iPSC）を生み出すOSKM因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）を過剰発現させた最近の研究18、19、20、21、22、23により、同じ系統の前駆細胞にリセットすることで組織の再生・若返りが可能になるという原理が証明された。したがって、成体組織の可塑性、増殖性、脱分化性を高める可能性のある別のアプローチも、組織の若返りや再生の戦略として検討する必要がある。
私たちは、Mycobacterium leprae（ML）-宿主間相互作用24,25,26,27の生物学的研究により、成体シュワン細胞の可塑性と再生特性を乗っ取り、細菌にとって有益な前駆細胞/幹細胞状態に部分的に再プログラムするMLの本来の能力を確認することができました28。宿主レベルでは、MLが誘発する初期化は、細菌の増殖を可能にする感染組織の成長を促進する。24,25,28,29 感染の定着期に細胞障害や副作用のないMLの宿主依存性の特徴は、進化的に適応した細菌モデルとして、未定義の宿主内因性経路を解析するためにMLの使用を可能にする 29,30,31,32,33 。
9本バンドアルマジロ（Dasypus novemcinctus）は、新世界の胎生哺乳類で、遺伝的に同一でクローン性の産子を4回産む唯一の哺乳類で、MLの天然宿主です。33,34,35 生きたMLを実験的に接種すると、播種感染を起こし、33,34,35,36,37 彼らの寿命（野生では12〜13歳、飼育下で最大20年）と中核体温（32℃-35℃）がin vivoでのML複製に最適です33,34,35。アルマジロは、ML の天然宿主として発見されて以来35 、肝臓での ML の in vivo 繁殖に利用され、研究のためにバクテリアを採取している。36 我々は、感受性宿主の肝臓におけるこの共進化細菌病原体が、自然感染時にin vivo で宿主細胞を拡大するために、成人のシュワン細胞で in vitro で観察されたものと同じ初期化戦略を利用したかどうかを調べた28。
我々は、MLに感染した九官鳥アルマジロの自然in vivoモデルとして、哺乳類成体肝臓を事前に傷害することなく臓器レベルで増殖させたことを報告する。我々は、細菌によるin vivo部分再プログラムが、感染の確立期に損傷、線維化、腫瘍化を起こすことなく、機能と建築を維持したまま肝臓サイズを有意に増加させることを示した。この臓器成長を促進する細胞タイプを特定し、サイズではなく、健全な肝小葉の数が、肝細胞量、血管系、胆管系の比例した拡大が原因であることを明らかにした。我々は、MLが組織保護や腫瘍予防の戦略を維持しながら、de novo肝器官形成を促進するために、動的な部分再プログラミング、再生、発生/胎児期のメカニズムを適応した証拠を示すために、分子詳細を明らかにした。
研究成果
九官鳥のin vivo感染による臓器成長促進効果
成体九帯アルマジロ（>1.5-2歳）の肝臓に生MLを注入し、播種感染させた（「感染」）ものを、感染に抵抗性の動物（「抵抗性」）および非感染動物のものと比較した（図1およびS1；表S1；STAR Methods）。自然感染では、ヒトの約95％、アルマジロの約20％はMLを直ちに排除するが、残りの動物では感染が進行する。アルマジロのクローン兄弟（図1A）は、完全耐性か播種性感染であり、感受性とクリアランスに強い遺伝的要素があることが示された。抵抗性動物は、血清中のML特異的フェノール糖脂質-1（PGL-1）抗体レベルによって決定される感染に対する初期反応を示したが（図S1C；STAR Methods）、細菌は肝臓で増殖できず、少数の、おそらく生存不能か死んだと考えられる細菌のみが残った（図1G；Table S1）。総肝/体重比は、10〜30ヶ月間感染したアルマジロでは、耐性動物（p < 0.0018）または非感染動物（p < 0.001）と比較して有意に増加した（図1B、1D、および1F）。ほとんどの感染動物の肝臓は高い細菌数（最大3.0E11 bacilli/g）を示した（図1C、1F、1G、S1；表S1）。肝臓/体重比は感染動物の肝臓細菌量と相関があった（Spearmanのrho [rs] = 0.5775764, p = 0.00007687; Figure 1E）。ML特異的抗PGL-1抗体による免疫染色とWade-Fite酸菌染色28,38により、感染動物のほとんどの肝細胞と小さな肉芽腫のマクロファージにMLが認められた（図1CとS1D）。
図サムネイルgr1
図1Mycobacterium leprae（ML）は、成体九帯アルマジロにおいて、肝障害を伴わない正常肝のin vivo器官成長を促進した
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アルマジロは、クローン動物と野生生まれまたは飼育下で生まれた動物から構成されていた（図1A；表S1）。クローン感染動物では、肝臓質量の増加や細菌数はほぼ同じであったが（図S1）、これらの指標に野生・飼育下生まれの動物間やオス・メスの差はなかった（表S1）。非ML感染の影響は、接種前に飼育下で1年以上の抗生物質、抗真菌薬、抗寄生虫薬治療による先行感染のクリアランスによって除外された。耐性動物と非感染動物に同一の処理を施しても肝発育は誘導されなかった。従って、MLによる肝臓の肥大化は特異的であると結論した。
拡大した感染肝臓は、損傷、線維化、脂肪沈着、腫瘍形成のない無傷の構造および血管組織を有していた
In vivo 超音波検査では、すべてのグループで同一の肝エコテクスチャーと正常な小葉が確認され、感染動物の肝臓は肥大していた（図 1B）。マクロスコピックな検査では、すべてのグループで同一の肝葉が確認され、滑らかで均一な被膜が見られた（図1D、S1A、およびS1B）。感染動物の肝臓はより大きかったが、すべての葉は同様に拡大し、その相対的な比率は正常であった（図1D、S1A、S1B）。切片では、各グループの肝臓の実質は同一であった。どの動物の肝臓にも腫瘤は見られなかった（Figure 1D、S1A、S1B）。
MLは、特徴的な肝細胞核の特徴と分布を持つ細胞の細胞質で実証された（Figure 1CとS1D）。ランダムな実質ブロックの盲検組織学的検査により、正常な哺乳類肝臓の門脈-中央血管の関係が感染動物の肝臓に存在することがわかった（図2A , 3E , 4C , 4E、およびS2）。肝細胞は洞脈管で区切られた単細胞板状に存在していた（Figure 1H, 1I, 2A-2G, and S4）。感染した肝臓は、様々な炎症と、主に細菌を含んだマクロファージからなる不規則に分布する小さな非壊死性肉芽腫を示した（図S1A-S1CおよびS10）。また、1匹の感染動物では、局所的な中心部の細胞板の双晶が認められ、再生活性が示唆された（図S5）。
図サムネイル gr2
図2細菌によるin vivo肝臓器増殖では、正常な肝小葉と血管の微細構造が維持される
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図1GR3
図3感染した九官鳥の肝臓のトランスクリプトームは、臓器再生と肝臓発生前駆細胞の再活性化、成長、分化を反映している。
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図のサムネイルgr4
図4ML感染アルマジロ成体肝臓は非線維化だが再生促進性：ヒト線維性肝疾患、ヒト胎児肝臓、ネズミの線維性・肝切除による再生モデルとの比較
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感染した肝臓には、他に異常は見られなかった（図1H、4C、4E、S1、S2、S5）。具体的には、肝細胞のバルーン化、脂肪沈着、細胞死（アポトーシス酸性体、壊死性炎症巣、TUNEL陽性細胞）、および先行細胞死の証拠（「セロイドを含んだ」マクロファージ）は認められなかった。門脈や実質の浮腫、類洞の拡張、結節はなかった。どの動物の肝臓にも異形成は見られなかった（Figure 1H、4B、4C、4E）。細胞外マトリックス（ECM）染色で証明できる瘢痕はなかった（Figure 1I and 4B）。慢性ウイルス感染、自己免疫損傷、または代謝性損傷の結果としてヒトの慢性炎症性疾患に見られる炎症性損傷、脂肪沈着、および瘢痕化（図4F）は、感染したアルマジロの肝臓には存在しなかった。肝機能酵素であるアスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）、アラニントランスアミナーゼ（ALT）、乳酸脱水素酵素（LDH）の血清レベルは、細菌増殖の初期段階において、感染動物で狂いはなく、MLに対する血清抗体反応は高いままであり、感染による肝成長の間に肝細胞損傷がないことが示された（図1J）。
感染肥大肝の建築的完全性
感染肝の構造的完全性を定量的に評価するために、H&E染色切片の画像上に門脈と中心静脈の位置を注釈し（各群10匹の例を図S2に示す）、空間点パターンを作成した（図2A）。注釈付き血管構造すべての分布を定量化し、群別解析で差がないことを示した（グループ化した点パターンに対するstudentized permutation test、Hahn統計のstudentized permutation test [999 random permutations] = 1.6353, p = 0.549）; すべての群で、大きな血管構造は均一に分散しており（完全空間ランダム性を示す黄色の線以下の経験関数プロット）、散布動物では規則正しい配置が失われない（図2B）。肥大した肝臓における胆道樹のフラクタル幾何学的構造を理解するために、2次元切片における門脈の強度を算出した。播種した感染動物の肝臓の門脈密度は、一元配置分散分析により有意に異なった (F(2,41) = 4.115, p = 0.0235); TukeyのHSD (honestly significant difference) 検定による事後比較では、感染動物の平均密度は対照動物より小さく (p = 0.01999) 、肝臓の成長中に起こる分岐に加えて、個々の枝の伸長を示唆していた (Figure 2D).
感染肥大肝における小葉の比例的拡大
肝臓の機能的な小葉単位の断面表現をモデル化するために、哺乳類の3〜7面を持つ多角形の小葉を表現するためによく用いられる六角形のパラダイムに基づいて、小葉面積が決定できるように門脈と中心静脈間の最近接距離を計算した42。この仮定が各小葉の半径の平均値を算出するのに使えるかどうかを調べるために、対照動物で別々の中心静脈プロファイルに最も近い6つの門脈の近傍を算出した（図2C）。kとk+1近傍の平均値の差が最も大きかったのはk=3:4の境界で、アルマジロ肝では最近接3門脈が次に近い門脈から分離していることが示され、各中心静脈のこれらの値の平均値を用いてモデル化した小葉の大きさを算出した。個々の小葉の大きさは、一元配置分散分析によって群間で有意な差はなかった（F(2,41) = 2.702, p = 0.079; Figure 2E）。これらの知見を総合すると、長期間のML感染と臓器肥大にもかかわらず、感染肝臓に顕微鏡的な異常がないことから、MLによる肝臓器の肥大には、血管、胆道、小葉の比例的な成長が含まれることが示唆された。
MLによる肝組織の肥大化における肝細胞の増加
vどの肝細胞タイプがML誘導肝成長に寄与しているかを評価するために、機械学習による細胞分類を用いて肝臓切片の細胞構成を定量化した（図2F；STAR Methods；Table S2）。DAPI染色した肝切片中の全ての細胞を、核形態に基づいて、大きな球状の核を持つ「古典的肝細胞」（図2Gおよび2H）、「二核化肝細胞」（図2Hおよび2I）、または非肝細胞（「その他」）として、手動学習した機械学習分類器を使って分類した（図2H-2JおよびS2-S4）。これらの代表的な領域ではいくつかの誤差が見られるが、切片全体の解析に有効であると考えられる予想範囲内である（表S2）。分類の精度は、肝細胞プレート内の肝細胞（黄色）の局在（図2H、S3、S4、S8E）と、血管壁、肉芽腫、洞窟内の紫色ラベルの「非肝細胞／その他の細胞」の局在（図S3、S4、S8E）によって裏付けられている。
肝細胞特異的転写因子（TF）HNF4αに対する異種（マウス／ヒト）抗体による標識で確認した（図2KおよびS8E）。これにより、HNF4α免疫陽性は、分類された単核または二核の肝細胞と相関することが示された。''非肝細胞／その他''に分類された細胞の核にはHNF4α免疫陽性は見られなかった。播種性感染動物の肝臓では、正常な類洞構造が、正常な肝自己蛍光から確認できた（図2IおよびS4）。
この分類を用いて、各細胞クラスの核の密度を計算した。各群の古典的肝細胞の平均密度は一元配置分散分析で有意差はなかった（F(2,26) = 0.185, p = 0.832; Figure 2K）。感染肝臓には、対照と比較してより多くの二核肝細胞が存在したが、各群の平均数は一元配置分散分析によって有意な差はなかった（F(2,26) = 3.112, p = 0.0614)．また、感染動物の肝臓では、変動する炎症と局所的な小さな肉芽腫を反映して、「その他」の細胞が多く見られた。一元配置分散分析により平均数は有意に異なったが（F(2,26) = 4.653, p = 0.0187）、感染動物の肝臓では、「その他」の細胞が多く見られた。 0187）、コントロールと感染動物の「その他」細胞の平均数には、ポストホックテューキーHSD検定（p = 0.1349992）で有意差がなく（図2K）、主に免疫細胞と内皮細胞からなる「その他」細胞は、感染肝臓の実質量増加の原因ではないことが示唆された。これらの複合的な解析により、感染拡大肝のミクロな小葉組織と肝細胞の構成は、巨視的および病理組織学的な正常と一致することが示された（図2およびS4）。播種性ML感染による肝臓の肥大は、肝細胞密度の低下に伴う小葉の病的な「膨張」の結果ではなく、正常な大きさの小葉と正常な肝細胞密度を示し、「正常な」臓器成長とMLによって促進された血管・管系の比例した拡張を示している（図2L-2N）。
ML感染肝臓のRNA配列決定とヒト遺伝子アノテーションにより、肝細胞の部分的リプログラミングを反映した大きな転写変化が明らかになった。
RNA配列決定（RNA-seq）は、MLによる肝臓増殖の基盤となる分子シグネチャーを定義するために実施されました。タンパク質コード遺伝子のうち、遺伝子記号を持つものの99.5%は、注釈付きヒト遺伝子と共通しているため、既知の哺乳類遺伝子機能を用いてアルマジロRNA-seqデータを解釈した（図3A-3C；STAR Methods）。感染肝臓で異なるアップレギュレーションを示す遺伝子のGene Ontology（GO）解析により、細胞活性化、前駆細胞マーカー、および肝細胞量の増加に概念的に関連する代謝プロセスのアップレギュレーションが示された（図3および図4）。再生」、「恒常性維持プロセス」、「創傷治癒」の濃縮は、肝臓の成長が内因性の再生、恒常性、修復経路に関与している可能性をさらに示唆している（図3C、3D、6A、および6B）。血管の発達、血管新生、胆管形成に関連するプロセスのGO用語に関連する遺伝子の濃縮、および多数のECMとコラーゲン遺伝子の発現増加は、血管系と胆道系の拡張、およびこれらの新しく形成された血管と管構造の支持マトリックスの生成に一致する（図3C、3D、およびS4）。肝臓の発生、成長、細胞周期の進行、再生に関連する遺伝子（マウスとヒトの研究に基づく）を選択し、図3Dに示している。
ヒト肝臓の単一細胞トランスクリプトームとの予測される類似性に基づき、すべての正常肝細胞型が感染アルマジロ肝臓の成長に寄与していること
MLによって誘導される肝臓の成長に対する異なる細胞型の寄与を、遺伝子発現に基づいて調べるために、アルマジロの異なる発現遺伝子をヒト肝臓の単一細胞RNA-seq (scRNA-seq) データと照らし合わせました39 。ML誘導遺伝子はアルマジロのすべての主要肝細胞型と関連しており（図3H-3L；データS1）、肝臓成長への機能貢献度は器官レベルで一致しています。
MLに感染して肥大化した肝臓は、再生促進的であるが、非繊維化的である
次に、ML感染アルマジロ肝の転写の特徴を、ネズミの線維化モデルや再生モデル、ヒトの肝疾患、ヒト胎児肝と比較した。成体肝臓では、ECMマーカーのアップレギュレーションは線維化に関連している。43 以前報告したマウスの線維化モデルと比較すると、感染肝臓の転写反応は、線維性肝疾患に共通のエフェクターイベントであるECM生成と組織化を担う筋線維芽細胞への静止肝星細胞の活性化後に見られるものと重なる（図S7BおよびS7C）。しかしながら、ML感染動物の傷のない肝臓では、異なるコラーゲン種をコードする遺伝子の数および発現上昇の程度は、組織学的線維化がないことと一致し、マウス線維症モデルにおける傷に対するプロ線維化反応（図4Aおよび図4B）と比較して少ない（図1H、1I、および図4C）。
ML感染がin vivoで肝前駆細胞様状態を誘導するという仮説をさらに支持し、ヒト肝再生との関連性を示すために、感染したアルマジロ肝臓のトランスクリプトームを、ヒト肝臓のscRNA-seq解析から定義した成人および胎児の肝前駆細胞または関連集団と比較した39, 44, 40。種、技術、生物的背景が異なるものの、肝細胞前駆細胞に起因するシグナルは明らかであった。感染したアルマジロの肝臓では、胎児および成体の肝前駆細胞様マーカーの発現が上昇し、生体内で前駆細胞集団が生成されていることが示唆されました。感染したアルマジロの肝臓では、fHepマーカーであるAFPや前駆細胞マーカーであるPROM1やFGFR2など、ヒト肝臓の胎児肝細胞（fHep）や成体肝細胞、胎児（fHHyP）や成体肝胆複合前駆細胞、成体胆汁上皮細胞の集団を規定する遺伝子の発現が上昇している（図4G）40。感染したアルマジロの肝臓で発現が増加した遺伝子とfHHyPおよびfHepを定義する遺伝子は、創傷治癒反応や代謝プロセスなどのGOタームにマッピングされている。
重要なことは、Aizaraniら39によって定義されたヒト成人肝臓の上皮細胞接着分子（EPCAM1）+前駆細胞集団の477マーカーも感染したアルマジロの肝臓で発現が上昇していることである。(PROM1、SFRP5、CLDN3、CLDN4、CLDN10、ANXA4を含む）、未委託二重性上皮前駆細胞の中心集団のマーカー（SFRP5とFGFR2）、肝細胞系（ALB、SERPINF1、FGB）および胆汁細胞系（ANXA2、BIRC3、TM4SF1）の両方の前駆細胞の定義マーカーが含まれている。ML感染アルマジロ肝で発現上昇し、正常成人ヒト肝からのEPCAM+前駆細胞クラスター（クラスター4）を定義する共有遺伝子に有意にマッピングされたGOタームを図4Hに示し、完全なg：ProfilerレポートをデータS2に提供する。
さらに、MacParlandら44は、AFP陽性細胞対AFP陰性細胞における遺伝子発現の差異を決定し、成人肝臓の小葉全体に存在するAFP陽性細胞は、肝前駆細胞の異種集団であると提唱した。AFP陽性細胞対AFP陰性細胞と感染アルマジロ肝臓で発現上昇する共有遺伝子が233あり、これらのGO用語マッピングにはマイクロRNA (miRNA) と有機窒素代謝プロセスが含まれていた。また、同じ比較で合計144の共有遺伝子がダウンレギュレートされ、RNA生合成・代謝プロセスやクロマチン構成にマッピングされた。また、g:ProfilerによるGO用語のマッピングは、データS2に示した。
MLはラット肝切除モデルと同様の肝再生関連遺伝子を活性化させる
急速な肝臓再生のモデルであるラット部分肝切除モデル41では、ML感染アルマジロの肝臓でも60の上昇した遺伝子があった。これらの共通する発現上昇遺伝子は、細胞分裂や細胞内組織に関連するGOタームにマッピングされている（図4H）。両モデル系で同等にダウンレギュレートされた遺伝子は17個だけであった。
ML感染は、肝機能マーカーを維持したまま、栄養因子／経路を選択的に誘導する
既知の肝臓栄養因子の発現を調べた（図3Dおよび図5）。FOXA TFは、胚性肝機能の制御因子であり、成体における胆道機能45,46および実質的なホメオスタシス47を制御している。感染動物の転写産物は、FOXA1、FOXA2およびFOXA3の著しい発現上昇を示した（図3Dおよび5A）。また、発生におけるWnt/β-cateninシグナルのプロモーター48であり、肝臓のサイズ、成長、ゾーニングの制御に関与するLGR4およびLGR5が、ML感染で発現上昇することを見出した5,49。さらに、肝細胞増殖因子（HGF）50、インスリン様増殖因子1（IGF-1）および2（IGF-2）、再生肝臓で発現する組織の生存、増殖、成長のための主要ニッチ因子、マウスおよびヒト肝臓器拡大にとって重要な刺激因子、5，51，52も誘導されている（図3DおよびS9）。さらに、BMP1、BMP5、BMP10、TGFB、FGFR4、IGF2R、IGFBP76、8、9、16など、発生や再生に関わる他のよく知られた成長因子やその受容体と結合タンパク質が誘導されている（図3DとS9）。
図サムネイルgr5
図5感染肝臓における肝機能の持続を伴う肝前駆/発生マーカータンパク質の活性化
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転写データをタンパク質レベルで確認するため、入手可能な交差反応性抗体を用いた（図5B-5G；STAR Methods）。その結果、発生またはホメオドメインTFであるFOXA1/2、HNF4α、SOX9、SOX17、GATA6、接着分子のE-Cadherinとβ-Catenin、およびIGFファミリータンパク質などの栄養因子のタンパク質発現が増加していた（図5B、5E-5G、S4、およびS8）。肝機能タンパク質であるアルブミン、HNF4α、AFP、CEBP/α、およびCYPメンバーは、感染動物の全肝抽出物およびin situの個々の細胞からタンパク質レベルで発現または発現上昇する（図5Bおよび5E-5G）。
FOXA1/2およびHNF4αを発現する肝細胞の分布を詳細に調べた。HNF4αは感染肝で発現が上昇し、肝細胞で特異的に発現している（図S8）。核FOXA1/2免疫陽性を有する肝細胞は、中心周囲と中帯にあったが、門脈および門脈周囲にはなかった（図5B）；どちらも非感染アルマジロおよび正常ヒト肝臓では検出されなかった（図5Cおよび5D）。しかし、感染したアルマジロの肝臓における他の機能的肝臓マーカー（アルブミン、E-カテリン、HNF4α、β-カテニン、CD68）の発現パターンは正常ヒト肝臓と同様であり（図5Gおよび5H）、ML感染肝臓は正常ヒト成人肝臓と共通の分子的および組織学的特徴を有していることが示唆された。
Hippo経路は、肝臓の成長、再生、癌の発生に関連している53。感染した肝臓では、遺伝子およびタンパク質レベルで変調をきたした経路メンバーはわずかであった。さらに、肝成長の下流制御に重要なリン酸化によるメンバータンパク質の活性化も見られなかった17,53（図S9）。検出可能なYAP/Taz標的遺伝子のうち、大部分は有意差を示さず、感染動物でわずかに発現が増加したのは数個だけであった（図S9D）。
MLがアルマジロ肝臓の抗老化関連遺伝子パターンに与える影響
感染した成体アルマジロ肝臓とヒト胎児肝臓のトランスクリプトームを比較したところ、加齢関連遺伝子と逆の関係があることがわかった（図6Aおよび図6B ）。GOターム「老化」にマップされた遺伝子（具体的にはIGFBP5、IGFBP1、IGFBP2）は、AFP陽性ヒト前駆細胞様肝細胞とML感染アルマジロ肝臓の両方で低下していた。一方、肝臓で酸化ストレスを抑制し、老化時に低下するRGN/sensescence Marker Protein-30などの既知の抗加齢マーカーは、感染肝臓とヒト胎児肝臓で著しく増加していた（図4Dと6A）。さらに、老化は老化と直接関連している55 ので、感染肝臓の老化関連遺伝子56 も調べた。感染動物では、既知の老化誘導・抑制遺伝子の発現にわずかな差異が見られただけで、p21、p16、p57などの老化のマスターレギュレーターには変化が見られなかった。老化は老化の特徴であるため、感染した肝臓で老化プログラムが誘導されないことは、細菌が自然の老化プロセスを停止させる可能性と一致する（図6C）。
図のサムネイルgr6
図6感染した肝臓は、正常な肝区域形成と代謝表現型により肝臓のフィットネスを維持しながら、生体内での動的な初期化、成長および増殖反応、ならびに再生プログラムの活性化を受ける。
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その他の肝臓成長関連遺伝子は、「再生」、「発生的成熟」、「創傷治癒」、「恒常性プロセス」、「成長因子への応答」、「上皮細胞増殖」などのGO用語にマッピングされている（図6A、6D、および6E）。重要なことは、MLが細胞外シグナル制御キナーゼ（ERK）1/2シグナル経路を用いてネズミやヒトの成体シュワン細胞の増殖を誘導することを我々が以前に示したことと一致し、感染肝臓においてML誘導遺伝子をGO用語「ERK1 and ERK2 cascade」にマッピングし（図6E）、シュワン細胞と肝細胞の両方の生存、増殖、脱分化に用いられるMLの共通シグナル機構となりうることが示唆されたことである。
細菌が誘導する肝細胞の増殖は肝臓の成長に寄与する
転写レベルでは、感染したアルマジロは8種のサイクリン（サイクリンA、D、E、G、I、J、Y）およびそのサイクリン依存性キナーゼを著しく上昇させ、多くの細胞周期関連遺伝子も低下させたことから、MLは肝細胞増殖と再分化のバランスをとるために細胞周期の動的調節を行っていることがわかった（Figure 3D, 4H, 4I, 6A, 6D, and 6E）。増殖マーカーである増殖細胞核抗原（PCNA）は、ML感染肝臓で転写レベルで上昇し（図6F）、感染肝臓ではPCNA免疫陽性肝細胞が有意に増加した（図6F-6H）。また、感染肝臓における二核細胞やE-カドヘリンの増加は、ML感染時に作られた再生様肝細胞の表現型を示すと考えられる（図6I）。また、MLがERK1/2シグナル経路を利用してシュワン細胞の増殖を誘導する能力を持つという我々の以前の知見と一致し、25,27我々はまた、感染肝臓においてML誘導遺伝子をGO用語「ERK1 and ERK2 cascade」にマッピングし（図6E）、MLが用いる共通のシグナル伝達機構の可能性を示唆した。これらの結果は、バクテリアによる臓器増殖に肝細胞の増殖が寄与していることを示す証拠となる。
感染肝臓では、免疫細胞を含む非肝細胞（「その他」）細胞集団の有意な増加は認められなかったが（図2）、マクロファージは肝臓再生や疾患との関連が知られているため、その関与の可能性を解析した16,17。アルマジロCD68のアミノ酸配列を用いて9バンドのアルマジロマクロファージに特異的な抗体を作成し特性評価を行った（図5EおよびS10、STAR Methods）。抗CD68抗体は、対照および感染したアルマジロの肝臓の両方でマクロファージ集団を検出するが、感染した肝臓では、全肝溶解物またはin situ CD68+細胞におけるCD68タンパク質の有意な増加は見られなかった（図5Eおよび5G）。
感染した肥大肝は正常なゾーニングと機能的な代謝マーカーを示す
感染肝では、アルブミン、胆汁酸-CoA：アミノ酸N-アシルトランスフェラーゼ（BAAT）（胆汁酸合成に関与）、CYP遺伝子ファミリーメンバー、その他正常肝機能に必要な肝代謝遺伝子が発現している（図5A-5C、6J、S6）。感染した肝臓では、グルコース、タンパク質、薬剤/ステロイド、胆汁酸の代謝過程など、肝細胞の代謝機能がアップレギュレートされている（図S6）。成熟肝細胞機能マーカー（GS、CPS1、Cyp3A4、Cyp2D6）を用いた肝ゾネーションのin situ解析では、感染肝は非感染アルマジロ肝に存在するゾネーションのパターンを維持するだけでなく、正常ヒト肝と同様の機能成熟を示すことがわかった（図5F、5G、6J、および6K）。
57 感染肝臓のトランスクリプトームでは、脂質代謝に関連する遺伝子が大幅に増加している（図 S6）が、特異的脂質染色では脂質の蓄積が見られず（図 S6C および S6D）、細菌の脂質利用によって目に見える蓄積が妨げられることが示唆された。肝臓は、慢性的な感染と炎症が持続すると、がん発生の高いリスクにさらされる58。しかし、我々は、感染した肝臓に異形成や新生物の病理組織学的証拠を見いださなかった（図1および4）。このことをさらに理解するために、既知の癌遺伝子および癌抑制遺伝子の発現を調べたところ、感染動物ではこれらの発現の差はわずかであり、腫瘍形成がないことを示す組織学的証拠を裏付けた（図S7）。
考察
臓器を異常なく成長させる戦略は、再生医療や加齢に伴う若返りの目標である。我々は、進化的に改良されたin vivo細菌モデル、M. lepraeとその天然動物宿主である九帯アルマジロを用いて、感染成立期に副作用なく成体肝臓を成長させるモデルを提示することができた。この天然モデルにより、肝臓の成長を効果的に再開させる生体内の内因性経路の解明が進み、より安全な肝臓再生・若返りへの治療効果が期待されます。
肝疾患は年間200万人の命を奪っている。11 再生療法の有力な候補ではあるが、肝硬変の治療のために実験室で育てた幹細胞を用いた試験から、認可された治療法は得られていない59。2D、3D、in vitroのモデルは進歩していますが、大きな固形臓器への臨床応用は限られています。
傷害や肝切除による成長は、元の肝臓の大きさに達すると停止するが、再生反応を停止させるメカニズムは不明である。このような上限の制限を回避することができれば、事前の損傷や細胞の喪失なしに、再生のメカニズムを研究することが可能になります。私たちの発見は、MLが内因性の肝臓再生経路に関与し、生体内で臓器の成長を促しながら、建築、血管系、機能性を無傷に保つことを示しています。このような進化的に洗練されたin vivoモデルは、予想外で型破りではあるが、内在する再生機構に対する理解を深め、臨床応用可能な新しい臓器再生戦略を可能にするために、どのようにde novoに関与させることができるかを決定し、再生医学においてより大きな意味を持つ概念的進歩であると考えられる。
宿主に依存した細胞内生活様式と限られたタンパク質コード化遺伝子57を考慮すると、MLが宿主細胞の増殖、再生、成長を誘導する高度な戦略を進化させてきたことは驚くにはあたらない。代謝的に豊かな肝臓の微小環境は、既知のMLの代謝的欠陥を補い、感染した肝臓に多くの代謝遺伝子を誘導する。生体内で観察される健康な肝臓の成長は、他の細菌種や薬剤処理によって刺激されないので、肝臓の成長はMLに特異的であると思われる。機能的な肝臓を維持することで、感染成立期における宿主細胞依存的な細胞内細菌の増殖が可能になる。免疫細胞の存在は様々であるが、組織学的な細胞死や線維化がないことから、MLによる宿主応答の適応の一部には、自然免疫細胞の活性を調節して組織損傷を防ぐことが含まれていると推測される。
我々は以前、MLが成体シュワン細胞の可塑性と再生能力を乗っ取り、細菌の増殖と拡散を可能にする神経前駆細胞／幹細胞様の状態に部分的に再プログラムすることを示した28, 29, 30, 32。実際、我々はMLが成体ヒトシュワン細胞の増殖を促すことも示し、この知見は感覚神経関連アルマジロシュワン細胞においても生体内で再現された62。このバクテリアによる部分的な初期化をin vivoの肝臓器増殖に置き換えると、MLは、in vivoで肝細胞を肝前駆細胞様細胞に部分的に初期化し、バクテリアの作り出す組織再生に適したマイクロ環境内で発生するニッチ因子にさらされると増殖とその後の再分化に至るという、進化的に洗練された同様の戦略を大人の肝臓で利用していることが、我々のデータから示唆された（図7）。実際、感染した肝臓では、多くの組織特異的な前駆細胞マーカーが再活性化または発現上昇した。感染していない肝臓では検出されないFoxA1/2の不均一なin situ発現が、肝ホメオスタシスにおける肝細胞補充の主要な供給源として最近同定された中帯肝細胞で容易に確認された63,64。前駆細胞および成熟/分化肝細胞集団と放出トロフィンが循環的かつ動的に生成することによって、この成長がもたらされる可能性がある（図7）。アルマジロにおけるML感染と、より一般的な肝損傷-修復アプローチの効果を比較し、特に肝損傷とMLに対する肝反応を区別する分子経路を特定するために、さらなる研究が必要である。
図サムネイル gr7
図7生体動物における細菌による肝臓器増殖モデル
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近年の細胞初期化の進展により、組織の若返りにおけるOSKM因子の可能性が見直されている。19,20,21,22 マウスでは、OSKMの肝臓特異的発現により、部分的初期化で再生が促進された。19 生体内でOSKMを長期間過剰発現させるとマウスで全能性癌が発生するので65 ヒト癌で多く発現・活性化しているOSKM因子による組織修復・増殖のための部分初期化には臨床的に検討する前に安全性を明らかにしておく必要がある。一方、天然の肝細胞を部分的に初期化する細菌モデルでは、細菌がこれらの副作用を回避するための防御機構を進化させています。これらの機構を理解することは、肝臓や他の成人老化臓器に対する新たな若返り介入策につながるかもしれない。実際、MLは老化に関連する遺伝子を低下させ、老化を促進することなく老化防止に関わる遺伝子を上昇させるという知見は、MLが成体肝臓を若返らせるために進化し、宿主機能依存の細菌の生存と複製に適した活発な代謝を持つ「若々しい」状態を長期間維持するようになった可能性を示唆している。このような進化的に洗練された細菌の戦略は、MLに感染した他の高度に再生可能な成体組織、特に皮膚や末梢神経でも起こる可能性がある。我々のこれまでの研究で、MLによる成体シュワン細胞の部分的な初期化が、感染細胞を「若い」前駆細胞／幹細胞の段階に変換することが示されており、このことに基づいて、他の研究者はMLが宿主細胞の時間を戻すことができると予言している60,61。
重要なことは、我々のモデルでは、感染した肝臓全体が、傷害、老化、線維化、腫瘍形成なしに、生体内で新しい組織を伴って大きくなり、正常な構造と機能を持つことである。このことは、成人の肝臓が傷害や細胞の損失なしに生体内で成長できることを示しており、再生医療が追求する「成長する」機能器官は、理論ではなく、自然に発生する先例であることが示された。最も重要なことは、長寿の大型哺乳類モデルにおいて再生装置がどのようにde novoで働くことができるかを理解することにより、移植の必要性を低減または代替しうる臨床的使用のための新しく安全な臓器再生戦略の開発、あるいは健康な老化を促進しうる老化肝臓の若返り戦略が可能になる可能性があることである。
研究の限界
九官鳥は一般的に使用されている生物ではないため、利用可能な分子ツールがないことが、我々の研究の限界である。既知の生物学の多くが短命のげっ歯類モデルに由来し、慢性疾患や加齢に伴うヒト疾患に対するその限界と、基礎生物学を獲得するための長命で大型の哺乳類モデルの価値を考慮すると、それらに特化した新しい試薬を開発する価値がある68。後期感染症の最終的な病原性事象については、まだ対処されていない。MLは遺伝子操作できないが、細菌ゲノムは将来の研究のための貴重な資源である。このような障害を克服する将来の進歩は、MLがどのように新しい肝臓組織の生成を促進し、肝臓の成長を促すのか、そのメカニズムの詳細を理解するための道を開く可能性がある。老化の軌跡と成熟細胞のアイデンティティを、既知の細胞老化の特徴を示すパラメータと同時に解析し、生体内での肝臓の若返りをさらに明確にする必要がある。しかし、この天然細菌のアプローチの終点は、すでに副作用なしに臓器レベルで「若々しい」肝臓組織を生成しており、これは、実験的再生・若返り介入から期待されるよりも安全な結果であると言える。
STAR★メソッド
主要資源表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
抗体
Goat anti-mouse Albumin 抗体 Bethyl Laboratories A90-134A
HNF-4α 抗体 (C-19) Santa Cruz Biotechnology sc-6556
HNF-4α 抗体 (H-171) Santa Cruz Biotechnology sc-8987
E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 3195
PGL-1 抗体 A. Kolk 博士より寄贈 N/A
抗ナインバンドアルマジロ特異的CD68ポリクローナル抗体 Rambukkana lab. 本論文 N/A
抗 FOXA2 抗体 Abcam ab23630
リコンビナント Anti-FOXA1 抗体 [EPR10881] Abcam ab170933
抗 Sox9 抗体 Merck/Millipore AB5535
ヒト SOX17 抗体 R&D Systems 社 AF1924
ヒト GATA-6 抗体 R&D Systems 社 AF1700
β-Catenin (D10A8) XP® Rabbit mAb Cell-Signaling Technology 8480
抗 CEBP Alpha 抗体 [5B7] Abcam ab128482
マウスで作製した抗β-アクチンモノクローナル抗体 Sigma-Aldrich A2228
α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb Cell-Signaling Technology 2125
MST1 抗体 Cell-Signaling Technology 3682
MST2 抗体 Cell-Signaling Technology 社製 3952
SAV1 (D6M6X) ウサギ mAb Cell-Signaling Technology 13301
LATS1 (C66B5) ウサギ mAb Cell-Signaling Technology 3477
YAP/TAZ (D24E4) ウサギ mAb Cell-Signaling Technology 8418
IGF1 抗体 GeneTex GTX100521
抗 PCNA 抗体, クローン PC10

抗 PCNA 抗体 Millipore

シグマアルドリッチ MAB424R
抗 CPS1 抗体 Abcam ab3682
抗グルタミン酸合成酵素(GS) 抗体 Abcam ab49873
抗 CYP3A4 および CYP2D6 抗体 Dr. D. Hay より寄贈 N/A
Goat anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Invitrogen/ThermoFisher Scientific A-11036
Goat anti-Mouse IgG (H + L) 高クロスアド吸着二次抗体、Alexa Fluor 488 Invitrogen/ThermoFisher Scientific A-11029
Goat anti-Rabbit IgG (H + L) 相互吸着二次抗体、Alexa Fluor 647 Invitrogen/ThermoFisher Scientific A-21244
抗ヤギ 549 二次抗体 DyLight 705-505-003
抗ヤギ IgG (H + L)、高度交差吸着、ロバで生産された CF™ 568 抗体 Sigma-Aldrich SAB4600074
抗マウスIgG, HRP結合抗体 Cell-Signaling Technology 7076
抗ウサギIgG, HRP結合抗体 Cell-Signaling Technology 7074
Donkey anti-Goat IgG (H + L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific A15999
細菌株
M. leprae: Thai-53、NHDP-63、NHDP-98（米国）、BR-4923（ブラジル）株。国立ハンセン病プログラム（NHDP）、米国 N/A
生体試料
ヒト肝組織 Lothian NRS Human Annotated Bioresource N/A
化学物質、ペプチド、リコンビナントタンパク質
RNAlater Sigma-Aldrich R0901
寄託データ
RNAseqデータ本紙Accession code: GSE216223
感染・抵抗性・対照のアルマジロ肝臓のH&E染色切片のホールスライド画像 The University of Edinburgh DataShare repository https://doi.org/10.7488/ds/3147
O.C.T. 化合物 CellPath KMA-0100-00A
PBS Oxoid BR0014G
Sucrose Sigma-Aldrich S5016
ヤギ血清 Life Technologies 10000C
BOND Polymer Refine Detection Leica Biosystems DS9800
Oil Red O Sigma-Aldrich 00625
FluorSave 試薬 Merck/Millipore 345789
T-PER™ 組織タンパク質抽出試薬 ThermoFisher Scientific 78510
Halt™ Protease Inhibitor Cocktail (100X) サーモフィッシャーサイエンティフィック社製 87786
BCAプロテインアッセイキット Boster AR0146
SeeBlue™ Plus2 プレステインドタンパク質スタンダード ThermoFisher Scientific LC5925
NuPAGE™ LDS サンプルバッファー Invitrogen/ThermoFisher Scientific NP0007
NuPAGE™ 4～12%, Bis-Tris, 1.5 mm, ミニプロテインゲル、10-well Invitrogen/ThermoFisher Scientific NP0335BOX
NuPAGE™ MOPS SDS ランニングバッファー (20X) Invitrogen/ThermoFisher Scientific NP0001
NuPAGE™ 酸化防止剤 Invitrogen/ThermoFisher Scientific NP0005
イモビロン-P PVDF メンブレンメルク/ミリポア IPVH00010
NuPAGE™ トランスファーバッファー（20X） Invitrogen/ThermoFisher Scientific NP0006
メタノール Fisher Scientific M/3900/17
脱脂粉乳 Cell-Signaling Technology 9999
TWEEN® 20 シグマ-アルドリッチ P1379
Western Blocker™ Solution シグマ-アルドリッチ W0138
リコンビナントアルマジロCD68タンパク質（rCD68）本紙 N/A
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich X100
Amersham ECL Prime ウェスタンブロッティング検出試薬 GE Healthcare RPN2232
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) Invitrogen/ThermoFisher Scientific D3571
プロロング™ ダイヤモンドアンチフェードマウンタント Invitrogen/ThermoFisher Scientific P36965
TRIzol™ 試薬 Invitrogen/ThermoFisher Scientific 15596026
クロロホルム Pure Scientific Laboratory Supplies CHE1576
2-Propanol Sigma-Aldrich I9516
実験モデル生物／系統
9本バンドアルマジロ (Dasypus novemcinctus) 米国国立ハンセン病プログラム (NHDP) N/A
Mycobacterium leprae株。THAI53、ブラジル、NHDP63、NHDP98 米国国立ハンセン病プログラム（NHDP）/N/A
ソフトウェアおよびアルゴリズム
Zen ソフトウェア Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
Image Studio Lite LI-COR https://www.licor.com/bio/image-studio-lite/download
Image J/Fiji 69,70 https://imagej.net/Fiji
GraphPad Prism (v8) グラフパッド https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
RStudio（R 3.3.3） R Core Team, 2016 https://www.rstudio.com/
TissueStudio 2.4 (Definiens AG, Munich, Germany) デフィニエンス N/A
DeveloperXD 2.7 (Definiens AG, Munich, Germany) ディフィニエンス N/A
Solexa pipeline v1.8 (Off-Line Base Caller ソフトウェア、v1.8) N/A
FastQCソフトウェア（v0.11.7） 71 N/A
cutadapt (v1.17) 72 N/A
Hisat2ソフトウェア(v2.1.0) 73 N/A
StringTie (v1.3.3) 74,75 N/A
ボールガウン（v2.10.0） 76,77,78 N/A
CPAT (v1.2.4) 79 N/A
GSEA Broad Institute, MA https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp
REVIGO 80 N/A
GOplot 81 該当なし
本研究で紹介した正常なヒト肝臓からのタンパク質のin situ発現は、Human Protein Atlas The Human Protein Atlas Project: https://v15.proteinatlas.org/about/project82 から引用したものです。
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リソースの有無
リード連絡先
リソースや試薬に関する詳細な情報やリクエストは、リードコンタクトであるAnura Rambukkana ( a.rambuka@ed.ac.uk ) までお願いします。
材料の入手方法
本試験に関するお問い合わせは、主担当者までお願いします。本研究で使用したすべての試薬は、主席研究員から自由に入手できる。
実験モデルおよび被験者の詳細
9 本足のアルマジロの入手と準備
In vivo アルマジロの研究は、米国ルイジアナ州バトンルージュにある米国保健社会福祉省、保健資源サービス局、医療システム局、国立ハンセン病プログラム（NHDP）で実施された。飼育下（アーカンソー州クラークスビル、オザーク大学、フランク・ナイト氏提供）と地元で捕獲した野生アルマジロの両方を使用した。この研究では、非感染対照12匹、感染抵抗性13匹、播種性32匹からなる合計57匹のアルマジロを使用した（Suppl data Table S1）。これらのうち、すべての播種動物、8匹の非感染対照動物および9匹の抵抗性アルマジロを、図1A〜1CおよびS1に示される肝臓：体重分析に使用した。さらに、非感染/対照4匹および抵抗性4匹を、機械学習/計算機解析のための組織学的およびDAPIスクリーニングに使用した。
野生アルマジロの飼育
放し飼いのアルマジロは、地元の捕獲者によって捕獲され、国立ハンセン病プログラム（NHDP）の動物園に運ばれ、改良型ウサギ用ケージに収容され、生存しているM. lepraeを実験的に接種できるように調整された。コンディショニングの間、動物は同時に起こる細菌および寄生虫感染の治療を受け、以下のように実験室環境に適応させた。1）アルマジロの維持に使用される処方は、1種類の抗生物質（アンピシリン）、1種類の抗蠕虫薬（イベルメクチン）、1種類の注射薬（デトミジン・キシラジン）、1種類のガス麻酔（イソルフラン）と非常に限定的である。いずれも肝臓に影響を及ぼすことはない。動物は感染する前に1年以上飼育され、非感染動物はすべて感染者と同じ薬剤に曝露された。したがって、非感染の組織は、これらおよびその他の未知の環境変数に対する適切な対照となる。
アルマジロがM.lepraeの既存感染を保有しているかどうかを調べるために、動物を3-6ヶ月間飼育し、M.leprae特異的フェノール糖脂質-1（PGL-1）に対する血清抗体について2回検査した。その後、M. lepraeに反応して形成される肉芽腫の種類をLepromin（107個の死菌が入った懸濁液）で皮膚テストし、播種性疾患を発症する可能性のあるlepromatous/multibacillary動物（組織内で広範囲に菌が繁殖するアルマジロ）を選定した。
捕獲動物の飼育
野生で捕獲した妊娠中の雌を飼育し、遺伝的に同一のクローン性兄弟を4頭出産させた。稚魚は生後約4ヶ月でNHDPの動物園に運ばれ、野生で捕獲されたアルマジロよりも長い期間（大きさと体重増加に応じて最大2年）コンディショニングされました。調整期間中、彼らは定期的に駆虫され、同時に発生する問題に対して上記のように抗生物質で治療され、レプロミン検査を受け、抗PGL1抗体のスクリーニングを受け、M. lepraeに過去に感染した証拠があるかどうか確認された。
倫理的承認
この研究は、米国農務省動植物衛生検査局と米国公衆衛生局の実験動物の世話と使用に関する方針（NHDP IACUC保証番号A3032-01）の下で概説された倫理ガイドラインの中で承認され実施されたものである。この承認は、国立衛生研究所、国立アレルギー・感染症研究所による、in vivoで増殖したハンセン病菌およびその他のハンセン病研究試薬を世界中の研究者に提供するための省庁間協定の一部である83。
ヒト肝組織を用いた比較研究
ヒト組織は、East of Scotland Research Ethics Service REC 1 の倫理承認番号 15/ES/0094 に基づき、Lothian NRS Human Annotated Bioresource に申請し、匿名かつ非同意での組織入手を許可されたものを使用した。記載された慢性肝疾患の肝臓、または転移性悪性腫瘍の切除における組織学的に正常な肝臓のホルマリン固定パラフィン包埋切片は、説明のためにH&EおよびPSR染色された。匿名化された組織切片は、バイオリソースから診断名のみが提供され（図の凡例に記載）、患者の年齢や性別は著者には不明である。
方法の詳細
レプロミンテストによる播種性感染症のアルマジロの選別
レプロミン試験は、無精子ヌードマウスの足蹠に由来するM. lepraeを丸ごとオートクレーブ滅菌し、保存料としてフェノールを含む懸濁液36,84からなるレプロミンを用いて、M. lepraeに対する組織病理反応を決定するものである。レプロミンは腹部に皮下接種され、その部位には後に識別するためのタトゥーが施された。注射から3週間後に6 mmの生検パンチで皮膚サンプルを採取し、生検を中性緩衝ホルマリンで固定して、さらなる処理とWafe-Fite染色による抗酸菌の検出を行った。この検査が陰性であれば、多剤耐性ハンセン病であり、M. lepraeに対するT細胞媒介免疫（CMI）反応が得られない（ヒト癩病型／多剤耐性ハンセン病型に類似）のに対し、陽性であれば、CMIに伴う高い肉芽腫性反応と菌の排除に成功している（ヒト結核型／白色癩に類似）ことを示しています。レプロミン検査陰性のアルマジロの大部分は完全に播種性感染に移行するが、レプロミン陽性反応を示す動物は軽症にとどまる。そこで、M.leprae感染を伝播させる可能性の高いレプロミンに反応しないアルマジロのみを用いて、最終的に生菌のM.lepraeの接種を行った。
M. lepraeの実験的接種
M. lepraeは、無症候性ヌードマウスの足蹠から新鮮な状態で採取し（48時間以内）、生存率と他の細菌との汚染度を既報の通り測定した。タイ-53（日本），NHDP-63およびNHDP-98（米国），BR-4923（ブラジル）の3つの異なる地域由来のM. leprae株を使用した．これらの菌株は遺伝子型にわずかな変異を示すが，ヒトの間では病理学的な変異は知られていない85．ML菌株を用いた感染動物からの細菌の増殖および肝臓の成長（肝臓重量：体重比）に差はなかった．接種時の平均年齢は24カ月、平均体重は8～10ポンド（4～5キロ）であった。低体重の動物やその他の異常が認められた動物は研究対象から除外した。アルマジロは、注射部位の皮膚をアルコールで洗浄した後、ケタミン（0.6 mL）とデクスドミトール（0.4 mL）を組み合わせて筋肉内に投与することで麻酔をかけました。1×109株のM. lepraeを最大0.5 mLまで伏在静脈からゆっくりと注入した．
感染経過のモニタリング
接種後、動物は3ヶ月ごとにPGL-1抗体とLID1抗体についてELISA法により血清学的にスクリーニングされた（Suppl data Figure S1）。ELISAアッセイで陽性（540nmで測定した光学密度（OD）＞0.700）が検出された場合、動物を血清学および肝機能酵素の血中濃度によって感染の進行、肝機能および播種について月単位で追跡調査した（図5H）。平均して、感染動物は、M.leprae接種後9ヶ月で抗PGL-1抗体を示している。接種後18-24ヶ月までに、ほとんどの動物が重度の感染症を発症し、1匹のアルマジロから最大1012個の菌が回収される（図1およびSuppl data図1）。アルマジロは通常、菌の全身播種に達し、動物がPGL-1 ELISAで高陽性を示した時点で犠牲となる。犠牲となった時点で、播種された動物は明らかな身体的異常を示さなかった。レプロミン陰性のアルマジロの大部分は、生存しているM.lepraeの感染に感受性がある。しかし、20％の動物がチャレンジに抵抗する。この動物は、接種後40ヶ月後にカットオフ値0.700 ODを超える血清抗PGL1抗体または播種の兆候を示さない場合に抵抗性とみなされる（補足データ図S1C）。犠牲時に、これらの動物は、播種する動物に比べ、肝臓組織においてかなり低い細菌数を示すであろう（図1BおよびS1C）。
感染中の生きたアルマジロの肝臓の超音波画像化
正常、抵抗性、播種性のM.lepraeに感染した生きたアルマジロの肝臓画像は、15MHzのトランスデューサープローブがスキャナ（MicroUS）に接続され、それがさらにサミットベースユニット（Cadwell、米国）に接続されて構成される超音波を用いて作成された。動物に麻酔をかけ、仰臥位にし、トランスデューサを腹部右側から胸部に向かって頭側に配置した。深さは、肝臓の大きさを他の臓器と比較するために70mmに設定し、動物間の比較のために肝臓の面積を測定するために50mmに設定した（図1D）。
生け贄と組織の採取
犠牲の前に、低レベルの二次的細菌汚染に対する予防措置として、動物にゲンタマイシンとペニシリンを投与した。動物は麻酔され、剃毛され、ヨウ素、アルコール、滅菌水で十分に洗浄された。安楽死後、肝臓を取り出し、滅菌ジャーに入れ、重量を測定してから氷上に置いた（Suppl data Figure S1A）。組織サンプルを採取し、組織学的検査と分子解析のために中性緩衝ホルマリンとRNAlaterで固定した。組織は無菌試験とAFB測定のために実験室に運ばれ、分子解析に使用するまで-80℃で保存された。
スズメガ染色
ホルムアルデヒド固定したアルマジロ肝組織をパラフィンブロックに包埋するか、PBS洗浄後、30％ショ糖PBS溶液で一晩インキュベートした後、O.C.T.コンパウンドで凍結した。ミクロトームまたはクライオスタットを用いて、切片をスライドグラス上に切り出した。アルマジロ肝臓のヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色では、10μmパラフィン切片を脱脂、再水和した後、既製のHarrisヘマトキシリンでインキュベートした。スライドは流水で洗浄後、1％酸性アルコールで5秒以上分化させ、Scottの水道水代替液に移した。この研究では、凍結したアルマジロの肝臓の切片もいくつか使用した。その後、スライドをエオシン溶液で染色し、流水で洗浄し、脱水し、キシレンで清拭し、Pertexとガラスカバースリップで手またはShandon Thermo Scientific™ ClearVue™ Coverslipperでマウントした。Picro Sirius Red（PSR）染色では、スライドグラス上の10μmパラフィン切片を脱脂・再水和した後、PSR溶液に2～4時間浸漬した。
デジタルスライド撮影と専門家による病理組織学的検査
図解のために、Zeiss Observer 顕微鏡（20x 対物レンズ付き）で画像を取り込み、Zen ソフトウェアでタイル領域を取り込んだ。H&E 染色切片のホールスライド画像は、Hamamatsu NanoZoomer で深さ 20 倍まで撮影した。すべてのホールスライド画像は、University of Edinburgh DataShare repository - https://doi.org/10.7488/ds/3147 から入手可能である。すべての H&E および PSR 染色切片は、国立肝移植センターに勤務する肝組織病理医（TJK）が、感染の有無について盲検下で検査し、原稿に再現したすべての写真顕微鏡写真は TJK が確認し品質を保証している。標準的なヒト臨床検体で日常的に行われているゴールドスタンダードの主観的評価/スライドレポートが提供された。
抗体、免疫標識および共焦点顕微鏡検査
免疫標識標識手順のほとんどは、我々の以前のラボのプロトコルから適応させた（Masakiら、2013；Ngら、2000）。凍結した10μmのアルマジロ肝切片を-20℃で15分間メタノール固定し、PBSで洗浄し、PBS中の10％ヤギ血清またはウマ血清で室温で1時間ブロッキングした。ブロッキング後、切片はブロッキング液で希釈した一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。なお、マウスやヒトのマーカーに対する市販の多くの抗体をアルマジロでテストしたが、反応した少数の抗体のみを以下に記録する；免疫マーカーに対する抗体はどれも活性を示さなかった。
免疫蛍光法用一次抗体
以下の抗体を使用した。アルブミン（1：100）、HNF4α（1：50〜1：100）、E-カドヘリン（1：100）、PGL-1（Ngら、2000）（1：500）。切片をPBSで洗浄し、ブロッキング液で希釈した二次抗体とともに室温で90分間インキュベートした。二次抗体には以下のものがある。Invitrogen AlexaFlour；抗ウサギ568、抗マウス488、抗ウサギ647、DyLight；抗ヤギ549、Sigma；抗ヤギ568。切片はDAPI希釈液で染色し、PBSとdH2Oで洗浄し、Fluorsaveマウントメディアを使用してガラスカバースリップの下にマウントした。肝臓のマクロファージの検出のために、我々はアルマジロ特異的CD68抗体を作製した（下記参照）。
9バンドアルマジロ特異的抗CD68抗体の作製
市販されているマウスやヒトの免疫マーカーに対する抗体は、いずれもアルマジロの免疫細胞と反応しませんでした。マクロファージは肝臓に常在し、感染時や肝臓再生時にも役割を果たすことが知られているため、ProteoGenix社のサービスを利用して、いくつかのマクロファージ亜型やクッパー細胞に共通するマクロファージマーカーCD68の9バンドアルマジロ配列に特異的に指向するポリクローナル抗体を作成した（補足データ図 S12）。以下に示すHis-tagを付加した9バンドアルマジロの細胞外ドメインのアミノ酸配列を用いて、ウサギに免疫するためのリコンビナントアルマジロCD68タンパク質（rCD68）を作製した。rCD68の作製に使用したアルマジロCD68のアミノ酸配列を以下に示す。
mgkdcphkksatllpsftvtptatestastatashrttkshkttshkttthrttthqptqsttspgptnathnatttshgnatvhptsnstqgttssphprppspspgskegdytwlngsqpcirlqaqiqirvlyptqdgeeawgisvlnpnktkaegecggahllltfpygqlsfgkqeptqvylmameynvsfprttwtflaenaslgdlqaplgrsfscrnasimlspalhvdslqvqaaqlpptgvfgssdqgshhhhhhhhhhh。
このrCD68を大腸菌で発現させ、アフィニティーカラムから精製し、ゲル電気泳動によるタンパク質分離後、クマシーブルー染色により純度を確認した。純度は、およそ35kDaまたは37kDaのタンパク質に対応する単一のバンドとして確認された。このrCD68を免疫原として、2匹のウサギでポリクローナル抗体を作製し、OD450nmのELISAでrCD68に対する血清抗体反応性をモニターした。これらの抗CD68抗体をアフィニティー精製し、2つの抗体希釈（1：8,000および1：16,000）を用いて0.5μg rCD68タンパク質に対する特異反応性をウェスタンブロットの検証によりテストした。その後、抗CD68抗体は、ウェスタンブロットにおいて、負荷濃度の範囲（20、50、100μg）において、コントロール、19ヶ月、24ヶ月、30ヶ月の感染動物のアルマジロ肝臓タンパク質抽出物に特異的に反応し、明確で単一のバンドが観察されると決定された。マクロファージの特異的な検出は、抗体対照と比較して、アルマジロ肝臓の免疫蛍光でも観察された（補足データ図S10；主図5Aおよび5Cにも示される）。
免疫蛍光
いくつかの抗体について、クエン酸緩衝液 pH6 で抗原賦活を行った。切片をPBS、PBS 0.1% Triton X-100、PBS 0.01% Triton X-100、PBSで順次4℃で洗浄した後、PBS中の5%ヤギ血清で室温で1時間ブロッキングを行った。切片を、PBS 0.01% Triton X-100 1%ヤギ血清で希釈した一次抗体中で、4℃で一晩インキュベートした。PBS洗浄後、切片をPBS 0.01% Triton X-100 1% ヤギ血清で希釈した二次抗体で室温で1時間インキュベートし、DAPI希釈染色、洗浄、マウントを行った。画像は、20x対物レンズを備えたNikon Eclipse 2100落射蛍光顕微鏡、20x対物レンズを備えた倒立広視野Zeiss Observer顕微鏡、およびZenソフトウェアを実行する40xまたは63x対物レンズを備えたZeiss LSM710共焦点顕微鏡で撮影された。
免疫組織化学
IHCは、SuRF（QMRI、エジンバラ）の専門組織学サービスにより、10μmの凍結Armadillo肝臓切片で実施された。すべてのサンプルは過酸化物ブロッキングされ、その後、一次抗体を室温で1時間インキュベートした。使用した一次抗体。FOXA1 (1:100), FOXA2 (1:200), PCNA (1:20), CYP2D6, CYP3A4 (1:400), CPS1 (1:1000), GS (1:5000), E-cadherin (1:100). 陰性対照として、無関係な抗体またはアルマジロ組織と反応しない一次抗体を使用した。一次抗体は、ポリマーとDABのインキュベーション、ヘマトキシリンカウンターステイン、カバーガラスによるマウントの順で使用された。すべてのステップの間にTBST洗浄を行い、ボンドポリマーの精製検出を利用した。画像は、Zenソフトウェアを実行する、20x対物レンズおよびタイルスキャンを備えた倒立広視野Zeiss Observer顕微鏡、またはZeiss Axioscanスライドスキャナ顕微鏡で捕捉された。
オイルレッドO染色
オイルレッド O（ORO）染色は、公表されている方法に従って、凍結した 10 μm の Armadillo 肝切片で行った。86 陽性対照として、脂肪肝のヒト肝臓の切片を使用した。スライドは室温で 10 分間平衡させ、濾過した ORO 作業溶液で 5 分間覆い、流水で 30 分間洗浄した。スライドはFluorsaveとガラス製カバースリップでマウントし、Olympus BX61正立広視野顕微鏡（10x対物レンズ付き）でイメージングする前にマニキュアで密封した。
タンパク質抽出とウェスタンブロット
タンパク質ライセートは、Haltプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む20mLのT-PER試薬あたり1gの組織をホモジナイズすることにより、新鮮に凍結したアルマジロ肝臓組織から収集した。サンプルは10,000gで5分間清澄化し、組織の残骸を除去し、上清は使用するまで-80℃で保存した。総タンパク質は、BCAアッセイで定量した。ウェスタンブロッティングは、我々が以前に記載したプロトコールを用いて行った (22, 38, 52, 53)。タンパク質ライセートと標準物質は、95℃で5分間熱処理して変性させた後、NuPAGEサンプルバッファーで適切な濃度（100μg/レーン）で処理した。タンパク質は、0.5mLのNuPAGE抗酸化剤を含む1x NuPAGE MOPS SDSランニングバッファー中、200VでプレキャストNuPAGE 4-12% Bis/Tris Gels上で実行された。タンパク質は、NuPAGEブロッティングシステムと10-20%メタノールを含む1x Transfer buffer中で、20Vで2時間、メンブレンに転写された。次に、メンブレンをPBS-T（0.5% Tween-20を含むPBS）中の5%無脂肪乳粉末、またはPBS中のBSAで、ロッキングプラットフォーム上で室温で1時間ブロッキングした。ブロッキング液を除去し、ブロッキング液またはWestern blocking reagentで希釈した一次抗体を添加した。
ウェスタンブロッティングに使用する一次抗体には、以下のものがある。アルブミン（1：250）、HNF4α（1：100）、FOXA2（1：200）、SOX9（1：100）、SOX17（1：500）、GATA6（1：25）、Eカドヘリン（1：500）、βカテニン（1：2000）、CEBP／α（1: 100）、CD68（前項参照、1：100）、β-アクチン（1：3000）、α-チューブリン（1：3000）、MST1（1：300）、MST2（1：300）、SAV1（1：300）、LATS1（1：300）、YAP／TAZ（1：300）、IGF1（1：500）。一次抗体のインキュベーションは、ベンチトップのローテーターで4℃にて一晩行った。この後、メンブレンをPBS-Tで少なくとも10分間ずつ3回、ロッキングプラットフォーム上で洗浄した。ブロッキング溶液で希釈した二次抗体を加え、ロッキングしながら室温で1時間インキュベートした。二次抗体には以下のものがある。Cell Signaling Technology；抗マウスHRP（1：3000）、抗ラビットHRP（1：3000）、ThermoFisher；抗ヤギHRP（1：3000）。膜をPBS-Tで10分ずつ3回洗浄し、製造者の指示に従ってECL Prime検出試薬に暴露した。タンパク質バンドは、Image Studioソフトウェアを使用してLI-COR Odyssey Imagerで検出し、Image Studio LiteおよびImage Jでバンドを定量化した。
血液検体中の肝機能酵素の解析
AST、ALT、LDHの血中濃度は、Element DC Veterinary Chemistryを使用して測定した。DRI-CHEMスライドを用いた熱量測定で血液を分析する診断用医療機器であるアナライザーを用いて測定した。分析は、製造元の説明書（HESKA社）に従って行った。データのグラフ化および統計解析は、GraphPad Prism (v8) ソフトウェアを使用して実施した。
アルマジロ成体肝臓の肝小葉構造解析
H&E染色切片のホールスライド画像を浜松ホトニクス製NanoZoomerで深さ20倍まで取得し、.ndpiファイルとしてエクスポートした。NDPITools suiteのndpisplitを用いて.ndpiファイルからTiled-TIFFサムネイルを生成し87、Tiled-TIFFファイルをコマンドラインImageMagickでjpegに変換し、ImageJのFIJI実装を用いてアノテーションした69, 70。それぞれの中心静脈とそれぞれの肝動脈の中心（門脈枝または胆管と一対の場合は門脈を識別）は病理医によって個別にアノテーションされた。各画像について、RImageJROI パッケージの read.ijroi() 関数を用いて血管位置をインポートし、ij2spatstat() 関数を用いて spatstat パッケージ形式に変換した90．個々の肝小葉の大きさを推定するために、正六角形として古典的な小葉の描写に基づいて、各中心静脈から最も近い3つの門脈までの距離の平均値（r）を使用して、面積を計算した。
(33√2).r2

血管構造の分布は、先に述べたようにRipleyのL-functionを用いて決定した91。
肝細胞組成解析のための組織染色および処理
アルマジロ肝の細胞組成は、DAPI核染色による特徴的な肝細胞の核の外観と、機械学習による肝細胞と非肝細胞やその他の細胞の識別を利用して評価しました。この解析のために、同じ厚さ（4μm）のアルマジロ肝臓パラフィン切片を脱脂、再水和し、dH2Oで希釈したDAPI希釈液でインキュベートし、蒸留水で洗浄し、プロングダイヤモンド抗フェードマウント剤でマウントした。すべての肝臓サンプルは、ばらつきを最小にするため、同時に処理された。DAPIで染色した肝臓組織切片を、DAPIおよびFITC（自家蛍光を取得するため）に設定した蛍光フィルターを用いて、20倍でZeiss Axioscan.Z1 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany) で撮像した。スライド全体の.cziファイルをTissueStudio 2.4 (Definiens AG, Munich, Germany)にインポートし、Tissue Studioの組み込み核検出機能による組織の自動検出と核のセグメンテーションを行った。TissueStudioのワークスペースをDeveloperXD 2.7 (Definiens AG, Munich, Germany)で開き、以下の処理と解析を行った。6つの500 X 500pixel領域（各動物群から選択した2つの組織からそれぞれ1つのROIを取得）を、肝臓病理専門医（TJK）が手動で核タイプに分類した。
細胞分類のための機械学習アルゴリズム。定量的細胞組成解析のための決定木モデルの生成と適用
次に、6つの分類されたグランドトゥルース、ゴールドスタンダード、病理学者によるスコアリングされたROIを使用して、単一肝細胞核と非肝細胞を区別するための決定木モデル（7深度、1葉あたり1サンプル、5倍クロスバリデーション）をトレーニングした（モデルパラメータおよび特徴セットの詳細は、表S2Aに記載されている）。病理学者が分類した肝細胞の70％および非肝細胞の70％をモデルの訓練に使用し（訓練集団）、各集団の残りの30％をモデルの精度をテストするために使用した（テスト集団）。表S2Aに定義された特徴を使用して、密に触れる非肝細胞核と二核肝細胞核との間の形態的類似性のために、決定木モデルの一部として二核肝細胞を確実に分類することができず、最初に機械学習を使用して肝細胞対非肝細胞を分類し、次に段階的に二核細胞を再分類する決定がなされた。したがって、トレーニングROIの細胞オブジェクトを肝細胞と非肝細胞に分類した後、形態とオブジェクトコンテキストに基づく一連の段階的自動クラス再割り当てを使用して、それらの核を二核と見なすように再分類した（段階的二核再分類パイプライン表S2Bを参照）。機械学習により分類された細胞と、テスト母集団において手動で分類された「グランドトゥルース」細胞とを比較し、エラーマトリックスを生成し、決定木モデルの各反復の統計量を計算した。最適なモデルパラメータは、トレーニング集団とテスト集団の誤差行列の統計量を最も均等にするモデルを選択することで決定された。最適なモデルの誤差行列は、表S2Cで見ることができる。テスト集団と比較して、最適な決定木モデルは、それぞれ0.92と0.88の陽性および陰性予測値を達成し、感度、特異度、精度は0.93、0.88、0.91であり、これらの値は組織全体の定量化には許容できると判断した。ルールベースの段階的な肝細胞核の二核への再分類は、定義上、学習するモデルを必要としないため、設定された学習母集団が存在しない。このため、再分類の精度は、手動で分類された基底真実の二核および非二核集団全体でテストされ、PPV 0.84およびNPV 0.99を与えた（表S2C）。各サンプルの全スライド画像から人工的なROIを手動で削除した後、最適な決定木モデルとそれに続く二核分類パイプラインを、肝臓切片のフルサイズの全スライド画像に適用した。まずTissue Studioで核を検出し、次にDeveloper XDで処理と機械学習パイプラインを適用することにより、二核分類を行った。
アルマジロ肝細胞分類のための詳細な機械学習ステップワイズワークフロー
Armadilloの組織切片をDAPIで染色し、AxioScan.Z1ホールスライドスキャナーで画像化した。CZI画像ファイルをDefiniens TissueStudio 2.4 Immunofluorescence Portalにインポート。全組織検出（自動しきい値、単一組織オプション適用）およびDAPIチャンネルで動作するTissueStudio内蔵核セグメンテーションツールによる核検出（核領域=1、Typical Nucleus Size = 70um2）。その後、全バッチを同じ組織と核検出の設定 (Sol_DetectNuclei_TS.dax) で一緒に処理しました。得られたTissueStudio Workspaceを保存し、Definiens DeveloperXD 2.4で開きました。組織と核の形態範囲をカバーする6つの画像から、それぞれ1つの候補領域が選択されました。トレーニング領域は核オブジェクトとともに切り取られ、エクスポートされて病理医に送られました。病理医は、すべての領域のすべての細胞を手動で分類し、Tissue-Studioで分割された核オブジェクトをマスクとして使用して、核クラスのカラーマスクを作成した（ImageJ）（図3A）。カラークラスマスクはDefiniens DeveloperXDワークスペースにインポートされました。(Sol_createTraining DataAndTrainModels.dcp). トレーニング領域は、未分類の核オブジェクトをそのままに、1つのモンタージュに配置、融合されました。(Sol_createTrainingDataAndTrainModels.dcp - first do loop sections 1-8 を実行). トレーニングモンタージュの核は、DeveloperXDで病理医の分類から核クラス（肝細胞、二核、非肝細胞）にマスクカラーをリンクして分類され、Definiens互換の病理医がトレーニングした核オブジェクトのセットが作成されました。(Sol_createTrainingDataAndTrainModels.dcp - execute first do loop sections 9&10) 病理医が分類した全核の30% (537 hepatocyte nuclei, 340 nonhepatocyte nuclei) はテスト/検証オブジェクトとして分類し、モデルのトレーニングに使用しません。すべてのトレーニングオブジェクトとテストオブジェクトは、モデルを適用する新しいマップ（「テストマップ」）にコピーされた。以下のセクションは、Definiens Customer Process "Sol_createTrainingDataAndTrainModels.dcp" （セクション "train and apply decision tree for morphological and intensity classification max/min" ）を用いて繰り返し学習されました。
1 - 核オブジェクトのトレーニングセットを用いて、Materials and Methodsに記載されている特徴とメトリックを使用した決定木モデルがトレーニングされました。(「train and apply decision tree for morphological and intensity classification max/min」セクションのコマンド「on elongated, hepatocyteNuc: Classifier: Train...」の設定ウィンドウを開き、変更可能なパラメータを設定します。Tree Depth, Samples Per Leaf, Cross-fold Validation を設定し、コマンドを実行する。）
2 - テストマップ上の核オブジェクトは、モデル適用に備えて一時的なクラスに変換された（コマンド "binuclear, elongated... on NuclearLevel: tempNuc" を実行 - すべての核クラスを一時クラスにリセットする）。
3- 学習したモデルを核学習モンタージュのTest Mapにある核オブジェクト（tempNucオブジェクト）に適用（execute command "tempNuc at NucleusLevel: Classifier: Apply"）した。
4 - エラーマトリクスは、各病理学者が分類した核オブジェクトを「Test Map」内のそのマッチするコンピュータ分類オブジェクトと比較し、関連する統計値を計算することによって計算された（実行コマンド：「Compute Stats for Hepatocyte Vs Elongated only（肝細胞対伸長のみ）」）。
5 - 決定木モデル構成ウィンドウの1つの変更可能なパラメータ（深さ、またはリーフごとのサンプル、またはクロスフォールドバリデーションのいずれか）を、次に段階的に調整した。
6 - ステップ 1 に戻り、モデルを再トレーニング。
内部でクロスバリデーションされたトレーニングセットのモデルの誤差行列が、テストデータセットに適用したときにバランスの取れた値になるまで、繰り返しトレーニングが行われた。つまり、トレーニングデータセットとテストデータセットの両方における誤差行列は、設定パラメータの可能な反復を考慮すると、可能な限り比較可能である。また、結果の目視確認は病理医が同意している。
トレーニング用データセットとテスト/バリデーション用データセットに適用したモデルの最適なエラーマトリックス
PPV NPV Sensitivity Specificity Accuracy falsePos/RealPos FDR FNR FOR
学習セル 0.9668 0.9165 0.9404 0.953 0.9455 0.0323 0.0332 0.0596 0.0835
テストセル 0.9239 0.8846 0.9274 0.8794 0.9088 0.0763 0.0761 0.0726 0.1154
新しいタブで表を開く
トレーニングサンプルセット肝細胞1209個、非肝細胞829個。バリデーションセット。肝細胞 537 個、非肝細胞 340 個。決定木モデルは、TissueStudioを使用してセグメント化された核の上に、すべての組織にわたって適用されました。(Sol_ApplyModelsAndExport.dcpをバッチプロセスで実行）。
アルマジロの肝臓からのRNA抽出
あらかじめ新鮮な肝臓を単離し、RNAlater中で凍結保存しておいた肝臓試料を使用前に解凍し、TRIzol中で室温でホモジナイズした。クロロホルムとイソプロパノールを用いた抽出でRNA画分を回収した。トータルRNAを蒸留したRNaseフリー水に再懸濁し、Nanodrop ND-1000 Spectrophotometerを使用して定量化した。
コントロールおよび感染したアルマジロの肝臓のRNA-配列決定
24ヶ月のML感染肝臓、30ヶ月のML感染肝臓、および2つの対照肝臓から単離した3連のRNA試料を、ペアエンドRNA-配列決定のためにArraystar Inc. 1〜2μgの総RNAを配列決定ライブラリーの調製に使用した。ライブラリーの調製には、オリゴ（dT）磁気ビーズによるmRNAの濃縮、KAPA Stranded RNA-Seq Library Prep Kitによる高鎖特異的dUTP法、Agilent 2100 Bioanalyzerによるライブラリーサイズ分布と収量QC、および絶対定量qPCRによるライブラリーの調製を行った。IlluminaNovaSeq 6000装置でライブラリをシーケンスするために、バーコード付きライブラリを混合し、NaOHで一本鎖DNAに変性させ、Illuminaフローセルに取り込んでin situ増幅し、その後両端150サイクルでシーケンスした。画像解析とベースコールは、Solexa pipeline v1.8 (Off-Line Base Caller software, v1.8)を用いて実施された。配列の品質はFastQC71ソフトウェア（v0.11.7）を用いて調べた。
シーケンスの品質管理は、イルミナシーケンサーからFASTQ形式の生データファイルを生成し、各サンプルの品質スコアをプロットしてシーケンスの品質を検討した。品質スコアQは、ベースコーリングエラー確率（P）に対して対数的に関係する。Q = -10log10(P)です。Q30は、誤った塩基の呼び出し確率が0.001、すなわち塩基の呼び出し精度が99.9%であることを意味し、Q≧30の塩基数の割合が80%以上であることが高品質データであることを示します。トリミングしたリード（cutadapt72（v1.17）を用いて5′、3′-adaptor塩基をトリミング）をHisat2ソフトウェア（v2.1.0）82を用いて参照ゲノム（Dasypus novemcinctus, Dasnov3.0, GCA_000208655.2 Ensembl）にアライメントを行った。Ensembl Dasnov3.0, INSDC Assembly GCA_000208655.2は2016年5月に最終更新/パッチされ、22,711のコーディング遺伝子でよくアノテーションされている。遺伝子レベルおよび転写レベルでのFPKMでの転写物量をアセンブルし、StringTie (v1.3.3) 83,84で計算した。遺伝子発現の差はRパッケージBallgown (v2.10.0)を用いて解析された85-87。参照ゲノム／トランスクリプトームに存在しない新規遺伝子や転写産物をStringTieで予測し、そのタンパク質コード化の可能性をCPAT (v1.2.4)でスコア化した88。
バイオインフォマティクスと発現差の可視化
ヒト（GRCh38.p13）およびアルマジロ（Dasnov3.0）参照ゲノムからタンパク質コード化遺伝子セットをEnsembl Biomartから取得し、その後、遺伝子記号で注釈された遺伝子をフィルターにかけて相互比較した。遺伝子記号のアノテーションがあるものとないものの全アルマジロタンパク質コード遺伝子を、任意のサンプルのRNAseqから検出されたすべての遺伝子に対してクエリし、ワッフル図として表示した。データのヒートマップは、R、PythonまたはShell環境（PythonおよびShell：Arraystarの社内スクリプト）でpheatmapを用いて、差次的発現遺伝子のセットから作成されました。ヒートマップ生成のために、発現遺伝子のlog2変換されたFPKM値は、発現の有意差（p <= 0.05）についてサンプル間でANOVAによって検定され、ユークリッド距離測定と「平均」凝集法を使用して教師なし階層的クラスタリングに選択された。ヒートマップは行単位でスケーリングされ、カラースケールはZスコアを表している。
遺伝子オントロジー解析は、GSEA（Broad Institute, MA）ソフトウェアを用いて、差次的に発現した遺伝子セットを、最小遺伝子セットサイズを10に設定して、倍数変化の順序で予めランク付けして実施した。REVIGO80 を使用して GO タームをバブル図で可視化し、GOplot を使用して特定の GO アノテーションに関連する発現差異遺伝子のコード図を作成した81 。肝細胞型遺伝子発現パターン解析には、39 のデータセットを使用し、特にその研究で同定された明確なクラスターに関連する遺伝子発現シグネチャーを使用した。クラスターとその遺伝子リストは、可能な限り「肝細胞」、「胆管細胞/胆道/EPCAM+」、「内皮/細胞/MyoFB」、「クッパー」、「NK、NKT、T細胞」グループにプールされた。これらのリストを、30ヶ月の感染肝臓と対照肝臓のアルマジロ肝臓の差次的発現遺伝子と相互参照し、特定の肝細胞型と関連する可能性のある差次的発現アルマジロ肝臓遺伝子を提供しました。これらの各グループの上位の差次的発現遺伝子と、選択した他の機能的遺伝子を用いて、ヒートマップを作成した（ソフトウェアは前述の通り）。一般的な癌遺伝子および腫瘍抑制因子を、独自に決定した遺伝子参照リスト（https://www.arraystar.com/lncpath-cancer-microarrays/）からコンパイルし、Armadillo肝臓RNAseqで検出された遺伝子と比較して、検出されたものが24ヶ月および30ヶ月感染Armadillo肝臓で有意に差次的に発現したかどうかを判断し、階層型クラスタリングの後にヒートマップで表示した。慢性感染アルマジロにおける遺伝子の発現の差は、線維形成のマウスモデルにおける瘢痕形成細胞の個別の系統からの遺伝子の発現の差と比較された43。感染アルマジロ肝臓およびプロフィブロティック損傷後の瘢痕形成細胞において過剰発現した差遺伝子の共通セットは、GO用語分析に使用され（参考）、REVIGOを用いて、GOplotからのコード図とともに可視化された（参考）。コラーゲン種に特異的な発現を検討した。30ヶ月の感染肝臓と非感染対照肝臓で差次的に発現している遺伝子を、推定成体および胎児肝前駆細胞の公表された遺伝子発現データ39,44,40またはラット部分肝切除モデルからの遺伝子発現データ41と比較し、上記のようにGO用語解析および視覚化に使用した共通設定遺伝子を用いた。
ML感染アルマジロ肝における老化関連遺伝子の変化を同定するため、感染アルマジロ肝（対コントロール）で有意に発現が増加または減少している遺伝子を、細胞老化遺伝子データベースのCellAgeで老化誘導または老化抑制として同定された遺伝子と比較した56。
定量化および統計解析
アルマジロ肝：体重比較、肝酵素アッセイ、ウェスタンブロット定量、in situ標識陽性細胞定量について、統計的有意性は両側t検定を用いて算出し、エラーバーは平均±SEMを表す。RNAseqデータは、ANOVAによって試験された発現遺伝子のlog2変換FPKM値における有意性で、記載されたように処理された。箱ひげ図はR環境のggplot2パッケージのgeom_boxplotで作成し、中央値、第1および第3四分位値、第3または第1四分位値から四分位間範囲の1.5倍以内の最大値または最小値に伸びるウィスカ、これを超える異常値は個別にプロットして表示した。Boxplotデータは、小葉面積解析はKruskal-Wallis一元配置ANOVA、核密度解析はANOVAとポストホックテューキーで、パラメトリック検定を行う前提でチェックされた。
データおよびコードの入手方法
本研究で得られたRNA配列データはGEOに寄託され、アクセッション・コードはkey resources tableに含まれている。Mycobacterium lepraeに慢性的に全身感染している、Mycobacterium lepraeの全身感染に抵抗性がある、または感染していない9頭のアルマジロの肝臓のH&E染色断面のホールスライド画像（Hamamatsu NanoZoomerでndpiフォーマットで取得）は https://doi.org/10.7488/ds/3147 で入手可能である。特注のデータ解析方法とコードを用いたパイプラインの詳細な説明は、公開された論文内で提供されています。本論文で報告された他のすべてのデータは、要求に応じてリードコンタクトが無制限に共有します。本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、要求に応じて主席研究員から入手可能です。
謝辞
動物実験についてはRoena Stevenson, Judith Wiles, Rachel Walley, Gregory McCormickに、組織学とイメージングについてはLyndsey Boswell, Melanie McMillan, Michael Millar (SuRF@Little France)に謝意を表する。配列決定にご協力いただいたYanggu ShiとArraystar（米国メリーランド州ロックビル）のバイオインフォマティクスチーム、Jaminson McCorrisonとJohn Glass（J Craig Venter Institute、米国カリフォルニア州）、Rahul Sharma（国立ハンセン病プログラム［NHDP］）、抗体についてはDavid HayとLuke Boulter（エディンバラ大学）に感謝する。また、Julia Martina-Rambukkanaには最新の文献からイラストを作成していただいた。この研究は、英国医学研究評議会（MR/P011292/1 to A.R.）および米国国立衛生研究所（National Institutes of Health , National Institute of Allergy and Infectious Diseases）と医療資源サービス局（Health Resources and Services Administration , Healthcare Systems Bureau）および国立ハンセン病プログラムとの省庁間協定AAI15006により支援を受けている（R.T. and L.A.)．T.J.K.はWellcome Trust Intermediate Clinical Fellowship ( 095898/Z/11/Z ) の支援を受けている。
著者による貢献
A.R.は、S.H.、T.J.K.、D.S.、M.P.とともに、コンセプトを考え、実験戦略を立案した。S.H.、T.J.K.、M.P.、D.S.、K.Y、および A.R は、データを分析した。M.P.は、R.T.、L.A.、A.R.の指導のもと、9頭のバンドアルマジロを選定・編成し、動物データの収集・解析を行った。T.J.K.は、病理組織学的評価および定量化の立案・実行を担当した。D.S.は、機械学習による解析と定量化を行った。S.H.とK.Y.は、免疫標識、イメージング、ウェスタンブロッティングを行った。A.R.、S.H.、T.J.K.は、M.P.とD.S.の貢献により論文を執筆し、全著者がその原稿を読み、承認した。
利害関係者の宣言
T.J.K.はResolution Therapeuticsのコンサルタント業務に従事している。
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データS1. ヒト成体肝臓の scRNA-seq データからの細胞タイプ別アノテーションに基づく ML 感染アルマジロ肝臓と対照アルマジロ肝臓の差次的発現遺伝子42、図 3 および図 4 に関連
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データ S2. ML感染肝臓と対照アルマジロ肝臓で発現が異なり、AizaraniらによるEPCAM+成人ヒト肝前駆細胞クラスター4、またはMacParlandらによるAFP+成人ヒト前駆細胞を定義するg:GOSt分析により返されたGO用語、44 図3と図4に関連する。
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出版年譜
出版されました。2022年11月15日
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受理：2022年5月4日 2021年6月24日
身分証明書
DOI: https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2022.100820

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図1Mycobacterium leprae（ML）が成体九帯アルマジロの肝障害を伴わない正常肝のin vivo器官増殖を促進する。
図サムネイルgr2
図2細菌による生体内肝器官増殖は、正常な肝小葉と血管の微細構造を維持する
図サムネイルgr3
図3感染した九官鳥の肝臓のトランスクリプトームは、臓器再生と肝臓発生前駆細胞、成長、分化の再活性化を反映している
図サムネイルgr4
図4ML感染アルマジロ成体肝臓は非線維化だが再生促進性：ヒト線維性肝疾患、ヒト胎児肝臓、げっ歯類の線維性・肝切除誘発再生モデルとの比較
図サムネイルgr5
図5感染肝における肝前駆/発生マーカータンパク質の活性化と肝機能の持続性
図サムネイルgr6
図6感染肝では、正常な肝区域と代謝表現型を持つ肝フィットネスを維持しながら、動的なin vivoリプログラミング、成長・増殖反応、再生プログラムの活性化が起こっている。
図サムネイルgr7
図7細菌による生体肝器官増殖モデル
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