腸内細菌叢-胆汁酸軸はアスピリンによる損傷時に腸のホメオスタシスを促進する

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細胞宿主と微生物
オンラインで入手可能 2024年1月17日
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論文
腸内細菌叢-胆汁酸軸はアスピリンによる損傷時に腸のホメオスタシスを促進する

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1931312823005103?via%3Dihub#bib15

著者リンク オーバーレイパネルを開くTing Li 1 5 6 7, Ning Ding 1 5 6 7, Hanqing Guo 2 7, Rui Hua 1, Zehao Lin 1, Huohuan Tian 1, Yue Yu 1, Daiming Fan 3, Zuyi Yuan 1 5 6, Frank J. Gonzalez 4, Yue Wu 1 5 6 8
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https://doi.org/10.1016/j.chom.2023.12.015
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アスピリン常用者は腸内細菌叢の異常が顕著であり、腸管傷害の一因となっている。

アスピリンによって減少したP. goldsteiniiは、アスピリンに関連した腸管バリア障害を緩和する。

P.goldsteiniiとその代謝物7-ケト-LCAは腸の恒常性を維持する。

FXRアンタゴニストである7-ケト-LCAは、Wntシグナル伝達と幹細胞の増殖を促進する。

まとめ
アスピリンに関連した消化管障害が懸念されている。アスピリンの使用は、腸内細菌叢や胆汁酸（BA）などの関連代謝産物を調節するが、これが腸のホメオスタシスにどのような影響を及ぼすかは不明である。今回、臨床コホートとアスピリン投与マウスを用いて、アスピリンによって増殖が抑制される腸内微生物Parabacteroides goldsteiniiを同定した。P.goldsteiniiまたはそのBA代謝産物である7-ケト-リトコール酸（7-ケト-LCA）を添加したマウスでは、アスピリンによる腸管ニッチおよび腸関門の損傷が抑制されたが、この効果は7-ケト-LCAを生成できないP.goldsteinii hdhA変異体では消失した。具体的には、7-ケト-LCAは、腸管BA受容体であるファルネソイドX受容体（FXR）によるシグナル伝達を抑制することにより、腸管上皮の修復を促進する。7-ケト-LCAはFXRアンタゴニストであり、Wntシグナル伝達を促進し、その結果、腸管幹細胞の自己再生を促進することが確認された。これらの結果は、経口アスピリンが腸内細菌叢と腸内BA代謝に影響を与え、ひいては胃腸のホメオスタシスを調節することを明らかにした。

グラフィカル抄録

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キーワード
腸内細菌胆汁酸腸管幹細胞消化管障害FXRWnt
はじめに
アスピリンは、その鎮痛作用、抗血小板作用、および潜在的な抗悪性腫瘍作用により、最も一般的に使用される薬剤となっており、心血管系の有害な転帰のリスクを低下させ、がんを予防することが推奨されている1,2,3。長年にわたり、アスピリンの胃腸障害などの副作用が懸念され続けてきた4,5,6。特に最近の報告では、アスピリンを投与された患者の90％以上が腸管毒性を発症していることが示唆されている7,8。アスピリンはプロスタグランジン・エンドペルオキシド合成酵素1（PTGS1またはシクロオキシゲナーゼ［COX］1）とCOX2を阻害し、これが胃腸障害を媒介すると考えられている6,9,10。しかし、さらなる研究により、小腸粘膜のプロスタグランジンは粘膜障害を伴わずに劇的に減少することが判明し、これはCOX1ノックアウトマウスでも確認された6,11,12。したがって、COXの阻害だけがアスピリン関連腸症に関与するメカニズムではないようである。さらに、アスピリンは経口投与薬であり、小腸で吸収される。そのため、アスピリンの有害作用の一因が腸内細菌叢の変化にある可能性は否定できない。

しかし、腸内細菌叢のどの種がアスピリンの影響を受けるのか、またアスピリンが宿主の腸内ホメオスタシスに及ぼす影響を媒介する根本的な機序はまだ不明である。近年、腸内細菌叢が、胆汁酸（BA）を含む代謝産物の調節を介して、腸のホメオスタシスと腸管幹細胞の機能に影響を及ぼすことが、蓄積された証拠によって示されている16,17,18,19,20,21,22 腸管幹細胞は、炎症性腸疾患20,24やアスピリン関連腸症の発症時に障害される腸管バリア21,23の維持に不可欠である25。腸管幹細胞の増殖、分化、自己複製を制御する上で、常在細菌が産生するBAが極めて重要な役割を果たすことが、いくつかの研究で示唆されている26,27。例えば、ファルネソイドX受容体（FXR）のようなBA受容体は、傷害に対する腸管幹細胞の新生と再生の調整において重要な役割を担っている。

本研究では、ヒトおよびマウスの統合メタゲノミクスおよびメタボロミクス解析から明らかになったように、アスピリンの経口投与により、腸内のParabacteroides goldsteinii（P.goldsteinii）が枯渇し、BAである7-ケト-リトコール酸（7-ケト-LCA）の濃度が低下したことを報告する。さらに、7-ケト-LCAが腸管FXRの内因性アンタゴニストであることを同定した。FXRは腸管幹細胞のニッチ恒常性を維持し、腸管バリアを維持する上で重要である。これらの結果は、アスピリンによる腸障害が、P. goldsteini-BAs-FXR軸によって抑制されることを示唆している。P.ゴルドスタイニと7-ケト-LCAのサプリメントは、胃腸障害の予防に応用できる可能性がある。

研究結果
アスピリンはヒトおよびマウスにおいて腸内細菌異常を誘発する
アスピリンがヒトの腸内細菌叢と代謝産物にどのような影響を与えるかを調べるため、我々は23人の健康なボランティアから、1日100mgのアスピリンを30日間ナイーブに投与する前（BA）と投与後（AA）の便サンプルを採取した（図1AとS1A）。便サンプルの全ゲノムショットガン配列決定から、Shannon指数に有意な変化はなかったが、Simpson指数は低下していた（図S1B）。アスピリン投与後、腸内細菌叢組成は大幅に再形成され（図1B）、これは部分最小二乗判別分析（PLS-DA）によって支持された。腸内細菌叢の投影における変数重要度（VIP）スコアおよび線形判別分析（LDA）スコアも、パラバクテロイデス（Parabacteroides）がグループ分離をもたらした腸内細菌叢のトップであることを示した（図1CおよびS1C-S1E）。その後の共起ネットワークと比較による解析でも、Parabacteroides属の腸内細菌が減少していることが確認された（図1D-1F）。さらに主要な種の存在量を測定したところ、P. goldsteinii、Parabacteroides merdae（P.merdae）、Parabacteroides distasonis（P.distasonis）がすべて減少していた（図1G）。さらに正準コレスポンデンス解析と冗長性解析の結果、アスピリンの使用によって微生物組成が変化することが示された（図S1FおよびS1G）。同様に、アスピリン使用群では、他の種の代わりにP. goldsteiniiの存在量が有意に減少していた（図S1H）。

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図1. アスピリンはヒトおよびマウスにおいて腸内細菌異常を誘発する。

(A）アスピリンを投与した健常ボランティアのコホート（BA-AAコホート）。便サンプルはアスピリン投与前（BA群）と口腔周囲アスピリン投与（100mg/日）30日後（AA群）に採取し、その後メタゲノミクス次世代シーケンシングを行った。

(B)相対属存在量に基づく部分最小二乗判別分析（PLS-DA）。N = 23個体/グループ。

(C)PLS-DAのVariable importance in projection (VIP)スコアは、異なる分類群のグループ間識別能力を示した。VIPスコアが1.5を超える分類群は、識別において重要であると考えられた。

(D)BA群とAA群におけるコア属（上位50の豊富な属）に基づく腸内微生物の共起ネットワーク解析。接続線はスピアマンの順位相関係数＞0.30の絶対値を示す。

(E）BA群とAA群の腸内細菌叢の相対的存在量。赤： パラバクテロイデス。

(F）BA群とAA群の間で最も有意差のあった上位12属の相対存在量の比較。

(G）メタゲノミクスの結果に基づくParabacteroides属の異なる種の相対存在量。

(H）上：C57BL/6Jマウスにアスピリン（飲料水中2 mg/mL [11.1mM]）を2週間投与し、16S配列決定のために糞便を採取した（n = 6/群）。下： 16S配列決定のPLS-DA（n = 6/グループ）（Asp 0日 vs. Asp 14日）。

(I）マウス糞便微生物叢のα多様性の3つの指標（Asp 0日 vs. Asp 14日）。

(J)アスピリン投与後の各時点におけるマウスの腸内細菌叢の上位10種の存在量。

(H-J）各実験を独立して2回繰り返したが、同様の結果が得られた。(BおよびH）PERMNOVA検定。(F）両側Wilcoxon順位和対検定の偽陽性率。(GおよびI）両側Wilcoxon順位和対検定。

さらに動物モデルを用いてアスピリンの腸内細菌叢への影響を検証したところ、PLS-DAのデータからも、アスピリンの経口投与によって腸内細菌叢の組成が変化することが示された（図1H）。同様に、α多様性（図1I）とP. goldsteiniiの存在量は時間依存的に減少した（図1JおよびS1I）。これらのデータを総合すると、アスピリンはヒトとマウスの両方において、P. goldsteiniiの存在量の減少を特徴とする腸内細菌異常を誘導することが示唆される。

アスピリンは腸のバリア機能を障害し、腸管障害を引き起こす
アスピリンによる腸内ホメオスタシスの障害におけるP. goldsteiniiの重要性をさらに明らかにするために、アスピリンを投与したマウスの腸管障害スコアを評価した（図2AおよびS2A）31,32。P. goldsteiniiの存在量と腸管障害の重症度との間に負の相関が認められた（図S2B-S2D）。注目すべきことに、腸内容物の微生物叢組成のヒートマップおよび主成分分析（PCA）により、生理食塩水群と比較して、アスピリンおよびネオマイシン投与マウスでは腸内細菌叢が異なることが示された（図2Bおよび2C）。アスピリンとネオマイシンはともに腸内細菌叢のα多様性を減少させ（図S2E）、特異的病原体フリー（SPF）マウスではP. goldsteiniiを抑制した（図2D）。さらに、過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色により、アスピリン投与後に腸粘膜が薄くなることが示されたが、これはネオマイシン投与後のマウスでも同様であった（図2F）。これは杯細胞（PAS+細胞、図S2F）の分化が抑制され、陰窩細胞（Ki67+細胞、図2E）の増殖が減少したためと考えられる。さらに、腸管透過性はアスピリンまたはネオマイシンによって増加した（図2G）。便潜血検査（FOBT）の結果から、アスピリンおよびネオマイシン処置後に腸管出血率が増加することが示唆された（図2H）。また、TdT-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL)アッセイにより、アポトーシスがアスピリンと抗生物質投与により促進されることが明らかになった（図2I）。次に、超高速液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレーイオン化/四重極飛行時間型質量分析計（UPLC-ESI-QTOFMS）により、血漿中および腸内のアスピリン濃度を測定したところ、アスピリンのバイオアベイラビリティに差はなかった（図S2G）。透過型電子顕微鏡（TEM）ではさらに、アスピリン投与後に腸管バリアが損なわれていることが示され（図2J）、これはタイトジャンクションタンパク質ZO-1およびクローディン-5のレベル低下によっても支持された（図2K）。さらに興味深いことに、常在細菌叢の糞便微生物叢移植（FMT）は、アスピリン投与マウスで観察された異常な表現型を改善したが、すでにアスピリンを投与されているマウスからのFMTは効果を示さなかった（図S2HおよびS2I）。

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図2. アスピリンは腸管バリア機能を障害し、腸管障害を引き起こす

(A）C57BL/6Jマウスに、抗生物質（ネオマイシン[Neo]）の有無にかかわらず、2mg/mL（11.1mM）の濃度でアスピリンを飲料水に添加して2週間経口投与した。各群の腸のH&E染色の代表画像と傷害スコアを示す。遠位空腸の無作為の10ヶ所を選び、全マウスの平均点を算出した（n = 10 replicates/群）。スケールバーは200μm。

(B) (A)で扱ったマウスの腸内容物中の異なる生物種のヒートマップ。

(C）示した4群の腸内容物から得られた16S配列決定結果のPCA。

(D）16S配列決定結果に基づくP. goldsteiniiの相対存在量。

(EおよびF）マウスの遠位空腸のKi67染色（E）および過ヨウ素酸シッフ染色（PAS、F）。腸陰窩のKi67染色（赤点線、n=5/群）と絨毛のPAS染色（n=10/群）の定量比較を示した。1サンプルから無作為に20点を選び、各マウスの平均値を1点として計算した。

(G）ジアミンオキシダーゼ（DAO）（左）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識デキストラン（中）、リポ多糖（LPS）（右）を用いた腸管透過性解析。N=5反復/群。

(H）4群のマウスの糞便サンプルを用いた便潜血検査（FOBT）。

(I）腸のTUNEL染色の代表画像。平均TUNEL陽性面積の統計解析を示す。N=5反復/群。1サンプルから無作為に20点を選び、各マウスの平均値を1点として計算した。

(J）（A）で処置したマウスの腸組織の透過型電子顕微鏡（TEM）。5匹中1匹の代表画像を示す。緑矢印は無傷の細胞間接合を、赤矢印は破壊された細胞間接合を示す。スケールバー、5μm。

(K）（A）で処置したマウスの腸組織におけるZO-1およびクローディン5のmRNAレベル。標的遺伝子mRNAの発現はActbとして正規化した。

(A-D）各実験を独立に2回繰り返し、同様の結果を得た。(E-J）各実験を独立して3回繰り返したが、結果は同様であった。(A, B, E-G, I, K) 一元配置分散分析（One-way ANOVA）とフィッシャーの最小有意差（LSD）事後検定。(C) PERMANOVA検定。(H) Fisherの精密確率検定。

大腸上皮がアスピリンによって傷害されるかどうかも分析した。しかし、結腸上皮の深刻な損傷は観察されなかった（図S3A）。それにもかかわらず、糞便サンプルの16S配列決定に基づくPCAでも、腸内細菌叢の明確な組成が示された（図S3B）。上記の結果と同様に、P. goldsteiniiの相対量もネオマイシン投与マウスとアスピリン投与マウスで減少した（図S3CおよびS3D）。ピアソンのr分析ではさらに、P. goldsteiniiの糞便組成と腸内組成の間に正の相関が示された（図S3E）。これらのデータを総合すると、アスピリンは腸内ディスバイオシスを誘導し、P. goldsteiniiを抑制することによって、潜在的に腸のバリア機能を損なうことが示唆される。

アスピリンは腸内細菌叢の制御を通して腸にダメージを与える
他の2種類の古典的な抗生物質、クリンダマイシンとストレプトマイシンも細菌の駆除に使用された（CS群、図S3H）。興味深いことに、P. goldsteiniiの相対量はCS群では変化しなかった（図S3FおよびS3G）。さらに、P. goldsteiniiが温存されたCS群は、腸管透過性（図S3HおよびS3I）、ムチン層の厚さ（図S3J）、陰窩細胞の増殖およびアポトーシス（図S3KおよびS3L）、およびFOBTの発生率（図S3M）に対するアスピリンの影響に対してより耐性があるようであった。これらの結果は、他の抗生物質ではなくネオマイシンによって除菌されたP. goldsteiniiが腸管傷害に関与している可能性を示唆している。

我々はさらに、これらの所見を無菌（GF）マウスで検証した。GFマウスの1群にはアスピリンを2週間直接投与し、一方、GFマウスのコホート（rGF群）にはSPFマウスと同居させることによってまず細菌を自然に再構成し、その後アスピリンを投与した（図S4A）。腸内容物の16S配列決定から、アスピリン処理rGFマウスにおいてP. goldsteiniiのコロニー形成が成功したことが明らかになった（図S4B）。アスピリンはGFマウスにおいて有意な破壊作用を示さないことがわかった。しかし、アスピリンを投与したrGFマウスでは、傷害スコアが顕著に高く、腸の表現型が悪化した（図S4AおよびS4C-S4G）。これらのデータから、腸内細菌叢の再構成がアスピリンの腸に対する破壊的作用を媒介する可能性が示された。

P.goldsteiniiはアスピリンによって枯渇し、BAスペクトルを回復させる
次に、P. goldsteiniiに対するアスピリンの抑制作用のメカニズムを調べた。このモデルにおけるアスピリンの腸内濃度は液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）により定量され、1〜4 mMであった（図S5A）。アスピリンで処理したP. goldsteiniiでは、用量依存的な増殖阻害が認められた（図3AおよびS5B）。非標的メタボロミクス解析により、アスピリン関連代謝物はアミノ酸代謝に関連する化合物に富んでいることが明らかになった（図S5CおよびS5D）。中でも、L-グルタミン、シトルリン、L-プロリンは相互作用ネットワークの中心的な構成要素であることがわかった（図3B）；これらはその後のアッセイでも検証された（図S5E）。L-グルタミンとシトルリンを補充すると、アスピリンによるP. goldsteiniiの増殖抑制が緩和されたことから（図3CおよびS5F）、アスピリンは両代謝物の生合成を阻害することによってP. goldsteiniiに影響を及ぼす可能性が示された。

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図3. アスピリンで枯渇させたP. goldsteiniiは腸内細菌叢と胆汁酸代謝物スペクトルを回復させる。

(A）アスピリン濃度を0～4 mmol/L（0.18～0.72 mg/mL）とした場合のP. goldsteinii増殖曲線。すべての統計解析はそれぞれのグループ間で行い、Aspは0 mM（黒）に設定した。

(B)アスピリンを添加または無添加で処理したP. goldsteiniiの培地から得られたメタボロミクスデータに基づく代謝物濃縮パスウェイとネットワーク。青枠：異なる代謝物。赤線：代謝パスウェイの正の相関、青線：代謝パスウェイの負の相関。

(C)アスピリンとアミノ酸の添加に対するP. goldsteiniiの成長曲線。アスピリン濃度： 4 mmol/L。n = 6 replicates/group。すべての統計解析は、それぞれのグループとAspグループ（赤）との間で行った。

(D）左：マウスにP. goldsteinii（1×108CFU/0.2mL、3回/週）を2週間摂取させ、さらにアスピリン（2mg/mL [11.1mM]）を2週間経口摂取させた。腸内容物はメタボローム解析に供された。右：胆汁酸濃度。

(E）各群における異なる胆汁酸の平均割合を示す。リング全体の面積は総胆汁酸濃度を表す。

(F）異なる群のマウスの腸内容物中のTα/βMCA、7-ケト-LCA、UDCA濃度。

(G)Asp投与マウスとコントロールマウスの腸内細菌叢の種の存在量と腸内の胆汁酸濃度との相関のヒートマップを示す。

(H）図1AのBA-AAコホートの糞便中の異なる胆汁酸濃度。

(I）BA-AAコホートの便サンプル中の7-ケト-LCAおよびUDCA濃度とP. goldsteinii存在量との相関。存在量が極端に低いサンプル（<10-4）は除外した。

(J）図1AのBA-AAコホートの個体における微生物叢の7-α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（hdhA）遺伝子の存在量。

(K）ヒトとマウスにおけるBAの合成経路。ヒトおよびマウスの腸内では、hdhAを用いて、CDCAから腸内細菌叢によりUDCAおよび7-ケト-LCAが生成された。マウスでは、肝細胞が生成する6β-水酸化酵素によってCDCAからムリコール酸（MCA）が合成され、タウリンと結合した。

(左）PacBio SequelおよびIllumina MiSeqシークエンサーを用いて、Parabacteroidesの数種のゲノム配列を決定した。これらの種で同定されたhdhAを含む遺伝子クラスターを示す。

(M) P. goldsteiniiのin vitro培養（OD=0.1）にCA、CDCA、LCA、UDCAを添加した。培地の胆汁酸濃度を分析した。7-ケト-LCAとUDCAの濃度を示す。n = 3 replicates/group。

(A-C）各実験を独立して3回繰り返し、同様の結果を得た。(D-GおよびM）各実験を独立に2回繰り返し、同様の結果を得た。(A, C, F, M) 一元配置分散分析（One-way ANOVA）とフィッシャーのLSDポストホック検定。(GとI）ピアソン相関係数。(HとJ）両側Wilcoxonマッチドペア符号付き順位検定。

次に、P. goldsteiniiの宿主代謝産物に対する制御効果を測定した。非標的メタボローム検出により、アスピリン処理後に腸内BAプールが減少することが示された（図3D）；これはP. goldsteinii移植により回復した（図3E）。特に、タウロ-α/β-ムリコール酸（Tα/βMCA）、ウルソデオキシコール酸（UDCA）および7-ケト-LCAの腸内濃度は、アスピリンにより劇的に減少したが、P. goldsteinii移植により維持された（図3F）。さらに、P. goldsteiniiの存在量とBAとの間に正の相関が認められた（図3G）。さらに、BA-AAコホート（図1A参照）における便中の代謝物プロファイリングでも、同様の変化と相関が認められた（図3Hおよび3I）。これらはマンテル検定によっても検証された（図S5G）。70人のアスピリン非使用者と105人のアスピリン使用者を含む別のコホート（asp-user-nonuserコホート）の便サンプル中のP. goldsteiniiの存在量も検出された。その結果、P. goldsteiniiの存在量はアスピリン使用者の糞便サンプルにおいて減少し（図S5H）、UDCAおよび7-ケト-LCAの糞便中濃度と正の相関を示した（図S5I）。

以上の結果は、BAパターンの調節におけるP. goldsteiniiの生物活性的役割を示唆している。以前、チェノデオキシコール酸（CDCA）を7-ケト-LCAとUDCAに変換する7-α/β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（7-α/β-HSDH）がParabacteroidesから精製され、その性質が明らかにされた。hdhA遺伝子（7-α-HSDHをコードする）のコピー数は、アスピリン投与後に劇的に減少した（図3J）。これまでの研究から、hdhAをコードする7-α-HSDHは、マウスにおいてCDCAをin vivoおよびex vivoで7-ケト-LCAおよびUDCA33,34、βMCA35に変換できることが示唆されていることから、BA代謝の合成経路を予測した（図3K）。P.goldsteinii、P.merdae、P.distasonisを含むParabacteroidesでは、hdhAにさらにオーソログな配列が同定された（図3L）。また、P. goldsteiniiはin vitroで7-ケト-LCAを産生したが、UDCAは産生しなかった（図3M）。腸内容物と糞便サンプル中のBA濃度には良好な相関が確認された（図S5J）。パラバクテロイデス（Parabacteroides）は胆汁酸塩ヒドロラーゼ（BSH）によってタウリン抱合型BAを減少させることが報告されている36。これは、BSH活性は変化しなかったが（図S5M）、BAプール中の総MCAのプールが拡大したためと考えられる（図S5K-S5M）。これらの結果から、アスピリンによって枯渇したP. goldsteiniiは、腸内BAスペクトルの恒常性を回復させることが示唆される。

P.goldsteiniiはhdhAを介してアスピリン誘発腸管障害を改善する
次に、hdhAを保有するP. goldsteiniiがアスピリンによる腸管障害を予防するのに有益であるかどうかを調べた。hdhA遺伝子をノックアウトしてhdhA欠損P. goldsteinii変異株（PGΔhdhA）を構築した（図S6A）。LC-MS分析により、この変異株はCDCAを7-ケト-LCAに変換できないことが確認された（図S6B）。両株のin vitro培養から、P. goldsteiniiの増殖に対するhdhAの影響は認められなかった（図S6C）。糞便サンプルのqPCRの結果から、P. goldsteiniiのhdhAをノックアウトしても宿主へのコロニー形成には影響しないことが明らかになった（図S6D）。次に、SPFマウスにアスピリンを投与し、P. goldsteiniiを移植した。生きたP. goldsteinii（LPG）および野生型（WT）P. goldsteinii（PGwt）は傷害スコアを改善したが、熱で殺されたP. goldsteinii（HPG）またはPGΔhdhAは改善しなかった（図4A）。さらに、HPGまたはPGΔhdhAの代わりにLPGおよびPGwtを用いると、腸管透過性が回復した（図4B）。PAS染色はさらに、LPGおよびPGwtが、HPGまたはPGΔhdhAではなく、アスピリンによって誘導された腸粘液バリアの損傷を逆転させ（図4C）、杯細胞の保存にプラスの効果を持つことを示した（図4D）。さらに、TUNELアッセイとFOBTアッセイによって明らかになった他の異常表現型は、LPGとPGwtが腸上皮細胞を保護することを示した（図4Eと4F）。さらに、腸管バリアのTEMでは、LPG群では強固なタイトジャンクションが認められた。これらのタイトジャンクションは、HPG群ではアスピリン群と同様に損傷していた（図4G）。このPCoAは、LPG移植がアスピリン誘発の腸内不健全症の回復に役立つ可能性を示唆している（図S7A）。P.goldsteiniiのコロニー形成は、アスピリン投与マウスにLPGを移植した後、16S配列決定（図S7BおよびS7C）およびRT-qPCR（図S7D）により確認された。

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図4. P.goldsteiniiはhdhAを介してアスピリン誘発腸管障害を改善する。

(A）生きたP. goldsteinii（LPG）、加熱死菌P. goldsteinii（HPG）、野生型P. goldsteinii（PGwt）、またはhdhA欠損P. goldsteinii（PGΔhdhA）（1×108 CFU/0.2mL、3回/週）を2週間マウスに経口投与し、さらに2週間アスピリン（2 mg/mL [11.1mM]）を経口投与した場合としなかった場合を比較した。各群のH&E染色腸管の代表画像と傷害スコアを示す。遠位空腸の無作為の10ヶ所を選び、全マウスの平均点を算出した（n = 10 replicates/群）。スケールバーは200μm。

(B）DAO（左）、FITC標識デキストラン（中）、LPS（右）を用いた腸管透過性分析。

(CおよびD）各群の代表的な画像を示すPAS染色（左）と、粘膜の厚さ（D）およびPAS陽性Goblet細胞（C）の統計解析（右）。

(E)腸のTUNEL染色を示し、全マウスから無作為に空腸遠位部10ヶ所を摘出した。

(F) (A)で処理したマウスの糞便サンプルを用いたFOBT。n = 15 replicates/group。

(G) LPGまたはHPGでアスピリン処理したマウスの腸管バリアの構造の代表的な画像。緑矢印は電子顕微鏡下で無傷の細胞間接合を、赤矢印は破壊された細胞間接合を示す。黄色の点線はアポトーシス細胞を示す。

(H)UDCAと7-ケト-LCAを2週間マウスに投与し、さらに2週間アスピリン（2 mg/mL [11.1mM]）を経口投与した場合としなかった場合。各群のH&E染色腸管の代表画像と傷害スコアを示す。遠位空腸の無作為の10ヶ所を選び、全マウスの平均点を算出した（n = 10 replicates/群）。スケールバーは200μm。

(I）DAO（左）、FITC標識デキストラン（中）、LPS（右）を用いた腸管透過性分析。

(JおよびK）（H）で処置したマウスの腸組織のPAS染色（n＝10反復／群）およびTUNEL＋面積（n＝5反復／群）。

(L）（H）で処置したマウスの糞便サンプルを用いたFOBT。n＝15反復／群。

(M) ZO-1（左）およびクローディン-5（右）を含む、マウスの腸組織における腸タイトジャンクションのマーカーの相対的mRNAレベル。

(A-G)各実験を独立に2回繰り返し、同様の結果を得た。(H-M)3回の実験を独立に繰り返したが、同様の結果であった。(A-E、H-K、M）一元配置分散分析（one-way ANOVA）とフィッシャーのLSDポストホック検定。(FとL）Fisherの精密確率検定。

さらに、大腸菌（E. coli）によるhdhAの機能獲得モデルを確立した（図S6E）。大腸菌DH5αにおけるhdhAの復元（EcD:hdhA）は、WT株（EcD:wt）と同様にマウス腸にコロニー形成することができた（図S6F）。EcD:wtの代わりにEcD:hdhAを用いると、腸管傷害スコアが減少し、粘液の厚さと腸管バリアが維持され、陰窩の増殖細胞数が増加し、アポトーシス領域とFOBT発生率が減少した（図S6G〜S6L）。さらに、培養液をBAについて分析したところ、大腸菌のhdhAが7-ケト-LCAの産生に機能していることが示された（図S6M）。

次に、表現型におけるUDCAと7-ケト-LCAの役割をin vivoで決定した。UDCAおよび7-ケト-LCAはともに、アスピリン誘導腸上皮損傷を防御した（図4H）。腸内BA濃度は、UDCAおよび7-ケト-LCAの増加を示した（図S7E）。さらに、腸管透過性の分析は、アスピリンに対するUDCAおよび7-ケト-LCAの相反する効果を示した（図4I）。さらに、PAS染色は、腸粘液バリア（図4JおよびS7F）の維持および杯細胞の保存（図S7G）におけるこれらのBAの保護効果をさらに支持した。両方のBAsは、アスピリン誘発損傷（図4K、4L、およびS7H）および陰窩細胞増殖（図S7JおよびS7K）に対する保護効果を示した。TEMにより、UDCAと7-ケト-LCAがタイトジャンクションの維持に役立っていることが明らかになった（図S7I）。タイトジャンクションマーカーのmRNAレベルは、LPG移植およびUDCAと7-ケト-LCAの経口投与により増加した（図4M）。これらのデータは、P. goldsteiniiおよびそれがhdhAを介して産生するBAが、アスピリン誘導腸管損傷から保護することを示した。

BA受容体FXRがアスピリンの腸への作用を媒介する
FXRはBA受容体の一種で、腸管幹細胞の増殖と腸管バリアに重要な役割を担っている28,37。以前、我々はFXR活性を調節することで、腸管細胞の腸管様表現型への分化が促進されることを見出した38。Fxr-floxedマウス（Fxrfl/fl）および腸特異的Fxr-nullマウス（FxrΔIE、図S8AおよびS8B）にアスピリンを投与したところ、腸管障害が抑制された（図5A）、 腸管バリア破壊（図5B）、成長阻害（図5C）、アポトーシス（図5D）、粘膜厚（図5E）、杯細胞減少（図S8C）、およびアスピリンによるFOBT率（図S8D）が減少した。さらに興味深いことに、β-カテニンとOlfm4が核内分布している陰窩細胞の数がアスピリン投与後に減少し、これは腸FXRのノックアウトによって減弱した（図5F）。さらに、アスピリンに反応して腸FXRをノックアウトすると、杯細胞とパネス細胞の数がともに増加した（図5G）。P.goldsteiniiの阻害がアスピリンによるものなのか、その後の腸の傷害によるものなのかを決定するために、腸の内容物を16S配列決定によって分析した。アスピリンはFxrfl/flマウスおよびFxrΔIEマウスの両方で微生物叢の主な組成を変化させた（図S8EおよびS8F）。P.goldsteiniiの相対的な存在量は、これらのマウスでともに減少しており（図S8G）、P.goldsteniiの阻害がアスピリンによって直接誘導されたのであって、腸の傷害の結果ではないことを示している。これらのデータから、FXRがアスピリンの腸に対する作用を部分的に仲介していることが示唆される。

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図5. FXRの腸管特異的ノックアウトはアスピリン誘発腸管障害を抑制する

(A）腸特異的Fxrノックアウトマウス（FxrΔIE）およびコントロール遺伝子型マウス（Fxrfl/fl）をアスピリン（飲料水中2 mg/mL [11.1mM]）で2週間処理し、各群の腸障害スコアを示した。スケールバー、200μm。

(B) 腸管透過性分析。n = 5反復/群。

(C-E) (A)で処置したマウスの腸のKi67、TUNEL、PAS染色。(C)と(D)ではn = 5反復/群、(E)ではn = 10反復/群。各ポイントは、各マウスについて無作為に10個の絨毛および陰窩を観察した平均値である。

(F）（A）で処置したマウスの腸陰窩におけるβ-カテニンとOlfm4の免疫組織化学（IHC）。白矢印は、核内にβ-カテニンが発現している陰窩の細胞を示す。

(G) (A)で処置したマウスの腸絨毛および陰窩におけるムチン2およびリゾチームの発現、それぞれ杯細胞およびパネス細胞を示す。白矢印はリゾチームが発現している陰窩の細胞を示す。各ポイントは、各マウスのランダムな20個の絨毛または陰窩の平均値を示す。

(A-G）各実験を独立に2回繰り返し、同様の結果を得た。(A-CおよびE-G）一元配置分散分析（One-way ANOVA）とフィッシャーのLSDポストホック検定（Fisher's LSD post hoc test）。(D) 両側ウィルコクソン順位和検定。

P.goldsteiniiはBA代謝を制御することにより腸の自己再生を促進する。
われわれや他の研究者らは、BAが腸管幹細胞において極めて重要な役割を果たし、組織修復に不可欠であることを以前に報告している37,39。そこでわれわれは、P. goldsteiniiとBAが自己修復中の腸管幹細胞の機能を制御しているかどうかを調べた。アスピリンは腸管ニッチにおける細胞増殖を抑制することが判明したが、これはP. goldsteiniiの移植によって促進された（図6A）。さらに、一次分離陰窩から培養した腸オルガノイドも、アスピリン投与マウスでは膨張、出芽数、表面積の減少を示したが、P. goldsteinii移植により回復した（図6B）。腸管幹細胞に対するP. goldsteiniiの影響をより詳細に観察するために、共培養装置を開発し、酸素濃度を測定した（図6C）。P.goldsteiniiの生存率が評価され（図S9A）、オルガノイドと共培養すると、オルガノイド増殖の増加が認められた（図6D）。より具体的には、HPGと共培養したオルガノイドと比較して、LPGと共培養したオルガノイドでは増殖能の増加とアポトーシスの割合の減少が認められた（図6E）。杯細胞およびパネス細胞の数も、LPG 群のオルガノイドで増加した（図 6F）。上部培地にCDCAを含まない共培養系も試験したが、オルガノイドの増殖（図S9B）、アポトーシス（図S9C）、および分化（図S9D）に有意差は観察されなかった。しかし、Lgr5、Olfm4、Ascl2などの幹細胞マーカーmRNA、および腸管透過性マーカーmRNAは、LPGとの共培養後に増加した（図6G）。

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図6. P.goldsteiniiは胆汁酸代謝を調節することにより腸の自己再生を促進する。

(A）図4Aと同様に処理したマウスの遠位空腸のKi67および5-エチニル-20-デオキシウリジン（EdU）染色。P.g、生きたP. goldsteinii。赤/白の点線は単一の腸陰窩を示す。1サンプルから無作為に10点を選び、各マウスの平均値を1点として計算した。赤はEdU、青はDAPI。n = 10 replicates/group。

(B）（A）と同様に処理したマウスの陰窩を用いて腸オルガノイドを培養した。形成率はオルガノイド／クリプト比で計算した。バッディングは赤い三角形で示した。各マウスから作製したオルガノイドのセットをランダムに10個ずつ選び、5回の生物学的反復から得られたデータを示す。

(C）腸内オルガノイドと嫌気性細菌の相互作用を可能にする共培養システムの説明。O2濃度は集合から24時間後に測定した。上部培地にはCDCAを10μMの濃度で添加した。

(D）生きたP. goldsteinii（LPG）または加熱死菌したP. goldsteinii（HPG）をC57BL/6Jマウスの二次腸オルガノイドと4日間共培養した。オルガノイドの形成速度、出芽数、および面積を比較した。

(E）HPGまたはLPGと共培養したオルガノイドのEdU染色（上段）とTUNEL染色（下段）。白点線は1個のオルガノイドを示す。スケールバー、20μm。赤： EdU；緑： TUNEL、青： n = 20生物学的複製／グループ。

(F）Mucin2とリゾチームの免疫蛍光。赤： 赤：Mucin2（Muc2）；黄：リゾチーム（Lyso）；青：DAPI： n = 20生物学的複製/群。白矢印は、染色が陽性であったオルガノイドの表面細胞を示した。

(G）共培養後、幹細胞マーカーおよび透過性マーカーをコードするmRNAのオルガノイドレベルをRT-qPCRで測定した。

(H）図4Hと同様に、UDCAおよび7-ケト-LCAのサプリメントをアスピリンとともにマウスに投与した。腸管陰窩を摘出し、初代オルガノイドを培養した。オルガノイドの形成率、出芽数、面積を解析した（右）。

(I) (H)と同様に処置したマウスから作製したオルガノイドのEdU染色（左）とTUNEL染色（右）の統計解析。

(J) (H)で処置したマウスの腸絨毛と陰窩におけるムチン2（緑）とリゾチーム（赤）の染色。各ポイントは各マウスについて無作為に30個の絨毛または陰窩の平均値を示す。白矢印はパネス細胞を示す。

(A-J）各実験を独立に3回繰り返し、同様の結果を得た。(A, B, H, I, J) 一元配置分散分析（One-way ANOVA）とフィッシャーのLSDポストホック検定。(C, D, and G) FisherのLSDポストホック検定。(EとF）両側ウィルコクソン順位和検定。

さらに興味深いことに、UDCAと7-ケト-LCAはともに、アスピリンによって誘導された初代オルガノイド細胞の増殖抑制を消失させた（図6H）。さらに、BAを投与したマウス由来のオルガノイドでは、増殖と幹細胞の拡大が回復した（図6IおよびS9E）。同様の結果が、in vitroでアスピリンとUDCAおよび7-ケト-LCAを組み合わせて処理した二次オルガノイドでも認められた（図S9F）。杯細胞およびパネス細胞の数は、いずれもin vivoでのUDCAおよび7-ケト-LCA補充によって増加した（図6J）。これらの効果は腸細胞株HT-29における効果とも一致し、アスピリン誘発腸損傷に対するUDCAおよび7-ケト-LCAの抗アポトーシスおよび増殖機能を示した（図S9GおよびS9H）。これらのデータを総合すると、P. goldsteiniiとそのBA代謝産物は、腸の自己修復時に腸幹細胞の機能維持に役立つことが示唆される。

P.ゴールドスタイニーが産生する7-ケト-LCAは、Wntシグナル伝達を促進するFXRアンタゴニストである。
微生物産生UDCAとTβMCAがともに腸管FXRアンタゴニストであることが証明されていることを考慮し37,40,41、FXRに対する7-ケト-LCAの機能を検証した。7-ケト-LCAをヒトFXRリガンド結合ドメイン（PDB: 3DCT, R4）にドッキングし、周囲の残基と結合させた（図7AおよびS10A-S10I）。次に、TR-FRET FXRコアクチベーターアッセイを適用して直接結合を決定した。7-ケト-LCAとUDCAはいずれもCDCAと比較してアゴニスト活性を示さなかった（図S10J）。さらに、7-ケト-LCA（IC50＝32.8μΜ）およびUDCA（IC50＝59.7μΜ）はいずれもFXRアンタゴニストであることが見出された（図7B）。2つのFXR下流マーカー、線維芽細胞増殖因子19（FGF19）およびスモールヘテロダイマーパートナー（SHP）の発現は、CDCAによって増加した。しかし、これは、両方の腸細胞株において、TβMCA、UDCA、および7-ケト-LCAによって阻害された（図7C、S10K、およびS10L）。ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイはさらに、UDCAおよび7-ケト-LCAがともにFXRトランス活性化活性を著しく阻害することを明らかにした（図7DおよびS10M）。この方法によって算出されたIC50（図S10N）は、TR-FRETデータと同様であった。これらの所見は、オルガノイド共培養モデルでも検証された（図S10O）。LCAはプレグナンX受容体（PXR）アゴニストとしても報告されているので42、PXR下流標的遺伝子のmRNAレベルを測定した（図S10P）。これらの結果から、PXRは確かにLCAによって活性化されたが、7-ケト-LCAでは活性化されなかったことが示され、7-ケト-LCAは疑われたようにPXRを活性化しない可能性が示唆された。

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図7. 7-ケト-LCAはWntシグナル伝達を促進するFXRアンタゴニストである。

(A）ヒトFXR結合ポケット（PDB: 3DCT）への7-ケト-LCA（赤の炭素原子）のドッキングによって明らかになったように、7-ケト-LCAはFXRアンタゴニストの可能性がある。

(B）アゴニストCDCA（20μM）の存在下で、7-ケト-LCAおよびUDCAがFXRアンタゴニストであるかどうかを評価するためのTR-FRET FXRコアクチベーターリクルートメントアッセイ。LCAは陰性対照として用いた。

(C）HT-29細胞を異なる胆汁酸、合成FXRアゴニストであるフェキサラミンD（FexD）およびGW4064で処理した。FXR標的遺伝子のmRNAレベルをRT-qPCRで定量した。

(D）FXR結合配列を含むpGL3ルシフェラーゼレポーター遺伝子ベクターを作製した（左）。ルシフェラーゼ活性は、コントロール（DMSO）、CDCA、7-ケト-LCA、UDCA処理後に検出した。

(E）二次オルガノイドをCDCA（20μM）、7-ケト-LCA（20μM）、またはUDCA（20μM）で5日間処理し、次世代シーケンシングを行った。幹細胞遺伝子シグネチャー（Lgr5-Ascl2）の変化のヒートマップを示す。

(F) (E)で示された遺伝子シグネチャーのPCA。

(G）7-ケト-LCAグループとDMSOグループの間のシークエンシング結果の遺伝子セット濃縮解析（GSEA）。

(H) (E)で示したように処理したオルガノイドにおける、FXR標的Fgf15およびShp（左）ならびにLgr5、Ascl2およびOlfm4（右）を含む腸管幹細胞マーカーによってコードされるmRNAのRT-qPCR結果。

(I）図4Aおよび4Hで処理したマウスの腸陰窩におけるCatbおよびOlfm4 mRNAの発現。白矢印は、核内にβ-カテニンが発現している陰窩の細胞を示す。各ポイントは、各マウスについて無作為に20個の陰窩の平均値を表す。

(B-D、H、I）各実験を独立に3回繰り返し、同様の結果を得た。(E-G）各実験を独立に2回繰り返したが、同様の結果であった。(B）非線形回帰曲線フィット。(C、D、H、I）一元配置分散分析（One-way ANOVA）とフィッシャーのLSDポストホック検定。

UDCAと7-ケト-LCAが腸の幹細胞性を制御するかどうかを評価するために、BAで処理した腸オルガノイドのRNA配列決定を行った。興味深いことに、UDCAと7-ケト-LCAはともに幹細胞シグネチャー（Lgr5-Ascl2）の発現を促進した（図7E）。これに対応するPCAでは、コントロール群とCDCA群の間でクラスターが分かれていた（図7F）。さらに、7-ケト-LCAで処理すると、観察された多くの遺伝子、特にWntシグナル伝達経路と増殖関連経路に関与する遺伝子の抑制が打ち消されたが、アポトーシス経路には関与しなかった（図7GとS10Q）。これらの結果は、FXR拮抗薬がどのようにして幹細胞の増殖を維持するのかについて、メカニズム的な洞察を与える可能性がある。この結果は、オルガノイドにおけるFXR標的遺伝子mRNAの発現低下と幹細胞マーカーmRNAの発現上昇を示すPCRの結果と一致していた（図7H）。さらに、β-カテニンの核内転位は、7-ケト-LCAで処理した細胞株とオルガノイドで増加した（図S10RとS10S）。in vivoの結果でも、7-ケト-LCAとP. goldsteiniiの移植はともに、腸陰窩におけるアスピリンによるβ-カテニン活性の抑制を無効にした（図7I）。考えられる説明は、FXRとβ-カテニンとの物理的結合がBAによって調節されたことであろう。共免疫沈降（coIP）は、UDCAおよび7-ケト-LCA処理後にFXR-β-カテニン相互作用のレベルの増加を示した（図S10T）。これらのデータは、Fxrアンタゴニスト7-ケト-LCAがWntシグナル伝達を促進し、腸陰窩細胞の幹性を維持することを示唆している。

考察
微生物叢が腸内BAプール組成33,37,43および腸管幹細胞機能の重要な制御因子であることは、以前に確立されている。これは、アスピリンによる特定のBA不足を改善し、腸管幹細胞の機能を維持する能力によるものであった。

最近の研究では、薬剤が微生物叢の変動に大きく寄与することを示す証拠が増えつつあるが44,45、腸内常在細菌叢とアスピリンの相互作用について検討した研究はない。ここでは、健康なボランティアを対象とした単剤介入コホートを構築した。その結果、パラバクテロイデス存在量の一貫した減少は、アスピリン治療の直接的効果によるものであることが明らかになった。興味深いことに、パラバクテロイデス類は腸の炎症に対する防御と相関することが示されている47,48,49。しかし、これらの報告の中で、パラバクテロイデス類が宿主のBA代謝に及ぼす影響に焦点を当てたものはほとんどない。パラバクテロイデス属のうち、P. goldsteiniiのみがUDCAおよび7-ケト-LCAレベルと強い相関があり、アスピリン投与後に両者とも低下することがわかった。腸内細菌叢は、主に代謝経路、特にBA代謝を介して、宿主の腸内ホメオスタシスに影響を与えることが知られている37。本研究で内因性FXRアンタゴニストとして同定されたUDCAおよびその前駆体7-ケト-LCAレベルが、アスピリン投与後に低下することがわかった。腸内CDCAは腸内微生物の7-α/β-HSDHによって7-ケト-LCAとUDCAに変換される37。ここで我々は、P. goldsteiniiのhdhA遺伝子とin vivoおよびin vitroにおける7-ケト-LCAに対する活性を同定した。興味深いことに、hdhA遺伝子の減少はP. goldsteiniiの存在量の減少ほど顕著ではなく、他の腸内常在菌はこの遺伝子を保持しているが、アスピリンには影響されないことが示唆された。腸を保護できなかった理由のひとつに、異なる細菌においてhdhA遺伝子がコードする対立酵素の酵素活性が低いことが考えられる。他の微生物のゲノムにコードされているhdhA遺伝子の機能と、7-keo-LCAを産生する活性を探る今後の研究が必要である。

しかし、本研究で明らかになったFXRアンタゴニストの7-ケト-LCAは、ヒトの腸内に比較的豊富に存在することが判明しており、ヒトの腸におけるFXRシグナル伝達において重要である可能性が示唆された。この点から、7-ケト-LCAとUDCAはヒト腸内でマウスにおけるTβMCAと同様の役割を果たしている可能性がある51。もう1つの問題は、最近の報告では、BSHによって触媒されるTα/βMCAからのタウリン基の脱共役におけるパラバクテロイデスの役割の可能性が示唆されている36。1つの可能性として、α/βMCAの同化がP. goldsteinii garagingによって促進されたことが考えられる。

この研究は、腸管透過性に対するP. goldsteiniiの効果を示した以前の研究と一致している。47,48しかし、我々の知る限りでは、腸内障害とアスピリンによる腸内細菌叢の形成およびそれに続くBAsの制御を関連づけた研究はほとんどない。ここで得られた知見から、アスピリンは、腸内細菌叢-BA軸への影響を通じて、少なくとも部分的に腸管バリアに損傷を与えることが示唆される。これらの影響は腸の透過性を高め、上皮細胞のアポトーシスと腸の修復能力の低下をもたらす。アスピリン・ユージノールエステルは、肝臓のFXRシグナル伝達に影響を与えるメタボローム変化を誘導することが報告されている。対照的に、我々の研究は、アスピリン自体が腸内の微生物叢-BA軸を制御することを示唆している。我々は、アスピリンによって枯渇したP. goldsteiniiが、7-ケト-LCAを産生することによって腸管幹細胞の増殖を維持する上で重要な役割を果たしていることを発見した。UDCAなどのBAは、長年臨床的に使用されてきた。したがって、本研究は、アスピリン関連腸症を予防するための実用的な戦略を開発するための光明となるかもしれない。以前の研究では、いくつかの細菌がアスピリンの吸収に大きな影響を及ぼす可能性が指摘されていたが14、今回のデータでは異なる結果が示された。これは、マウスの飲料水に使用したアスピリンの濃度、採用した動物モデル、異なる抗生物質の使用によるものと考えられる。

様々な研究により、アスピリンが複数のがんモデルにおいて腸細胞の増殖を抑制することが証明されているが、そのほとんどは、COX1/2の阻害が、増殖を促進する炎症性シグナルを永続させる予防メカニズムの中心であると考えている。腸とその持続的な増殖と分化の相互作用は、主に分泌される代謝産物を通じて、その微生物組成によって大きく左右されることが認められている。26,53。特に最近我々は、コール酸がペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（PPARα）を阻害し、その結果、腸管幹細胞の再生が損なわれることを報告した。FXR活性とWntシグナル伝達の相互作用は、以前の研究で検証されている28。ここでは、腸管幹細胞の自己再生の維持に重要な7-ケト-LCA-FXR-Wntシグナル伝達カスケードと、アスピリン処理とそれに続くP. goldsteiniiの枯渇によるその阻害の証拠を提供する。

腸管オルガノイドを嫌気性細菌と共培養するためのツールがないことは、培養に必要な酸素条件が相反するため、微生物-宿主相互作用を探索する上での課題となっていた。オルガノイドに細菌を注入する方法54や、オルガノイドから単層細胞を作製する方法55,56など、いくつかの方法が報告されている。これらの方法は有望ではあるが、システム構造が複雑であるため、技術的に応用が難しい。ここでわれわれは、簡単に組み立てられるトランスウェルインサートの改良に基づいて、シンプルで実用的な共培養法を開発した。このシステムは、培地を酸素条件の異なる2つの物理的空間に部分的に分離し、嫌気性細菌とオルガノイド間の代謝物相互作用を可能にする。細菌が上皮細胞に直接付着することがないため、この方法の応用は制限されるかもしれないが、細菌代謝産物が腸内微小環境に及ぼす影響を評価するためのトランスウェルベースのバリアシステムとしては有用である。

この研究の限界について議論する必要がある。潜在的な機能を持つ他のアスピリン抑制菌種も無視できない。例えば、P. distasonisはTGR5およびFXRアゴニストとして機能しうるBA代謝産物を産生することが報告されており、炎症性関節炎57および肝線維症の治療におけるプロバイオティクスの代表となりうる可能性がある36。したがって、さらなる研究は、腸内ディスバイオシスおよび微小環境の制御におけるこれらの腸内常在菌の機能に焦点を当てるべきである。さらに、P. goldsteniiまたは7-ケト-LCAによるFXR拮抗作用の可能性を支持するためには、in vivoでの直接的な証拠が必要である。もう1つの問題は、Cre+マウスを対照群として含めることで、Cre発現が発現している腸管細胞に対して毒性を示す可能性を排除することができるが、今回のデータではそのような相互作用は支持されていない。

結論として、本研究は、腸内細菌叢とBAとの相互作用が、酵素を介した非共役BAの修飾を通じて、腸管幹細胞の機能と腸管バリアの維持に重要であることを立証した。これらの知見は、微生物叢に基づく治療が、アスピリンによってBAを代謝する腸内常在細菌叢が減少することにより、BAのパターンを変化させる可能性があることを示唆している。胃腸疾患における腸管バリア機能と幹機能の障害というその後の表現型は、常在腸内細菌だけでなくBAsの補充によって可逆的である可能性がある。

STAR★方法
主要リソース表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
抗体
ウサギ抗NR1H4 Abcam Cat# ab235094；
ウサギ抗 NR1H4 Proteintech Cat#25055-1-AP; RRID: AB_2879874
ウサギ抗β-カテニン Cell Signaling Technology Cat# 8480： RID： AB_11127855
Ki67 抗体 Abcam Cat#ab15580
ウサギ抗 Muc2 抗体 Abcam Cat# ab272692; RRID: AB_2888616
ウサギ抗リゾチーム C-1/2 Cell Signaling Technology Cat# 60487
ウサギ抗 Olfm4 Cell Signaling Technology Cat# 39141; RRID: AB_2650511
抗ウサギ IgG, HRP 結合抗体 Cell Signaling Technology Cat#7074; RRID: AB_2099233
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG Abcam Cat# ab150077; RRID: AB_2630356
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-rabbit IgG Abcam Cat# ab150080; RRID: AB_2650602
細菌およびウイルス株
Parabacteroides goldsteinii 日本微生物コレクション Cat# JCM13446
Parabacteroides Merdae 日本微生物コレクション Cat# JCM 13405
パラバクテロイデス ジスタソニス 日本微生物コレクション Cat# JCM13400
大腸菌 DH5α Thermo Scientific Cat#EC0112
生物試料
ヒト糞便 N/A N/A
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
アスピリン MedChemExpress Cat# HY-14654
NaCl Sigma-Aldrich Cat# 7647-14-5
FITC-デキストラン（4kDa）Sigma-Aldrich Cat# 46944
5-エチニル-20-デオキシウリジン（EdU） MedChemExpress Cat# HY-118411
L-グルタミン Sigma-Aldrich Cat# 49419
L-プロリン Sigma-Aldrich Cat# P0380
L-シトルリン Sigma-Aldrich Cat# C7629
T-β-ムリコール酸（TβMCA） MedChemExpress Cat# HY-135103
ウルソデオキシコール酸（UDCA） MedChemExpress Cat# HY-13771
7-ケトリソコール酸（7-ケト-LCA） MedChemExpress Cat# HY-W018512
フェキサラミンD MedChemExpress Cat# HY-10912
GW4064 MedChemExpress Cat# HY-50108
チェノデオキシコール酸（CDCA） MedChemExpress Cat# HY-76847
コール酸（CA） MedChemExpress Cat# HY-N0324
リトコール酸（LCA） MedChemExpress Cat# HY-B0172
DMEM 培地 ThermoFisherScience Cat# 11965126
IntestiCult オルガノイド増殖培地 Stemcell Technologies Cat# 06005
Gentle Cell Dissociation Reagent Stemcell Technologies 社製 Cat# 07174
D-PBS Stemcell Technologies 社製 Cat# 37350
DMEM/F12 Stemcell Technologies 社製 Cat# 36254
GFR Matrigel コーニング Cat# 356231
24 ウェル、ポリスチレンプレート Corning Cat# CLS3526
DAPI シグマアルドリッチ Cat# D9542
Difco Fluid Thioglycollate 培地 BD Biosciences Cat# 0048064
Opti-MEM 培地 ギブコ Cat# 31985-070
リポフェクタミン™ 2000 Invitrogen Cat# 11668-019
重要な市販アッセイ
ToxinSensor Chromogenic LAL エンドトキシンアッセイキット Make Research Easy Cat# L00350
マウスジアミンオキシダーゼ（DAO）ELISA キット Bioswamp Cat# MU30134
便潜血検査（FOBT）キット ABON Cat# V277200
TdT介在dUTPニックエンドラベリング（TUNEL）キット BIOSCIENCE Cat# T6013L
RNeasy Micro キット Qiagen Cat# 74004
Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR Accurate Biology Cat# AG11705
SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR キット Accurate Biology Cat# AG11701
過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色キット Solarbio Life Sciences Cat# G1280
修飾ヘマトキシリン-エオシン（HE）染色キット Solarbio Life Sciences Cat# G1121
アネキシン V-FITC アポトーシス検出キット BD Biosciences Cat# 556547
CCK8 キット MedChemExpress Cat# HY-K0301
LanthaScreen® TR-FRET FXR コアクチベーターアッセイキット ThermoFisherScience Cat# PV4833
共免疫沈降
(Co-IP） キット ThermoFisherScience Cat# 26149
実験モデル 細胞株
HT29 ATCC Cat#HTB-38
イエック-6 ATCC CRL-1592
寄託データ
16S / メタゲノムシークエンシングのための生データファイル 本著作物 PRJCA018155
メタボローム解析用Rawデータファイル 本著作物 MTBLS8146
P. goldsteinii ゲノムシーケンス用Rawデータファイル 本作業 PRJCA018155
オルガノイドのRNA配列決定用Rawデータファイル 本著作物 OMIX005261
実験モデル 生物/系統
マウス C57BL/6J 北京バイタルリバー実験動物技術 N/A
Nr1h4 flox [Fxrfl/fl] マウス Cyagen Biosciences Cat# S-CKO-04890
PVillin-Cre マウス Cyagen Biosciences Cat# T000142
オリゴヌクレオチド
プライマー 表S4参照 N/A N/A
組み換えDNA
pGL3-basic Shanghai Sangon Biotech N/A
pGL3-2000bp∼+500bp DNA sequence of SHP Shanghai Sangon Biotech N/A
pGL3--2000bp∼+500bp FXR NA 配列 Shanghai Sangon Biotech N/A
ソフトウェアとアルゴリズム
Graphpad Prism 9 GraphPad Software N/A
FlowJo Tree Star,Inc. https://www.flowjo.com/
R v4.3.0 R 開発コアチーム https://www.r-project.org/
MetaboAnalyst 5.0 Xia et al.58 https://www.metaboanalyst.ca/
Fast QC v0.11.8 FastQC https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/
プロジェクト/fastqc/
MetaPhlAn2 v2.7.7 Truong et al.59 https://huttenhower.sph.harvard.edu/metaphlan2/
ImageJ National Institutes of Health(NIH) https://imagej.nih.gov/ij/
その他
4-well Chamber Slide w/ removable wells ThermoFisherScience Cat# 154917
トランスウェル 12mm（0.4um） CORNING Cat# 3460
Falcon® 70μm セルストレーナー CORNING Cat# 352350

リソースの有無
連絡先
さらなる情報および試薬のリクエストは、対応する著者 Yue Wu (yue.wu@xjtu.edu.cn)までお願いします。

材料の入手可能性
この研究によって新たにユニークな試薬は得られていない。

データおよびコードの利用可能性

メタゲノムシークエンシング、16S rRNAシークエンシング、メタボロミクスのデータはNGDCデータベースに寄託されている： PRJCA018155）またはMetaboLightsデータベースに寄託されている： MTBLS8146)に掲載されている。オルガノイドのRNA配列決定データはNGDCデータベースに寄託されている： OMIX005261。これらのデータは公開日現在公開されている。これらのデータのアクセッション番号はkey resources tableで確認できる。

本論文はオリジナルコードを報告していない。

本論文で報告されたデータを再分析するために必要な追加情報は、対応する著者であるYue Wu (yue.wu@xjtu.edu.cn)から合理的な要求があれば入手可能である。

実験モデルと被験者の詳細
倫理声明
本研究は西安交通大学倫理委員会の承認を得ており（承認番号2020-299）、ヘルシンキ宣言の原則および現地の法律を遵守している。すべての動物実験は、米国国立衛生研究所のGuide for the Care and Use of Laboratory Animalsを遵守した。菌株培養実験は、西安交通大学バイオセーフティ管理委員会の承認を得たプロトコルに従って行った。ヒト便サンプルのメタボロミクスおよびメタゲノム研究は、病院の被験者保護委員会の承認を得て実施した。

被験者
欧州心臓病学会（European Society of Cardiology）では、経皮的冠動脈インターベンション（PCI）後のすべての患者に対して、アスピリンの経口投与量を75～150 mgとすることが望ましいと推奨されている3。したがって、腸内細菌叢への影響を調べるために、すべてのボランティアに対して低用量のアスピリン（100 mg q.d.）を使用した。登録された被験者はすべて以下の基準を満たしていた： 40～60歳の健康なボランティアで、本研究の1年前にアスピリンによる治療を受けていない。アスピリン使用者／非使用者コホート（図S5H-S5I）のヒト糞便サンプルは、西安交通大学第一付属病院健康検査センターから採取した。このコホートには、70人のアスピリン非使用者と105人のアスピリン使用者（100mgを1～3ヵ月間、表S2）が含まれる。被験者はすべて黄色人種で、祖先は東アジア系、民族は漢民族である。被験者の性別に関する情報を表S1およびS2に示す。研究参加者の社会経済状況は記録していない。糞便は採取後、ドライアイスで急速凍結し、分析まで-80℃で保存した。この研究プロトコールは、西安交通大学第一付属病院保健研究倫理委員会の承認を得ており、研究はヘルシンキ宣言の原則に従って実施された。すべての参加者は、書面によるインフォームド・コンセントを提供した。健常対照者と心代謝性疾患患者30を対象とした報告研究のメタゲノムデータを検索し、アスピリンの使用歴に応じて2群（アスピリン非使用者N=321、アスピリン使用者N=573）に分けた（図S1H）。これらの患者の検索された微生物データと性別を含む基本情報をTable S3に示した。参加者の性別、人種、祖先、民族および社会経済的地位の情報は、一次データベースから検索できなかった30。

マウス
8～10週齢の雌性C57BL/6Jマウス（体重約20g）をBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd.から入手した。予備調査の結果、アスピリンによる腸管傷害はマウスの性別に関係しないことが明らかになった。メスマウスは一般的にオスマウスよりもおとなしいため、メスマウスを用いてモデル動物を作製した。Nr1h4=flox [Fxrfl/fl]およびPVillin-CreマウスはCyagen Biosciences Inc（中国、北京）から購入した。これら2系統のマウスを交配し、Fxrfl/fl Villin-Cre（+）遺伝子型とFxrfl/flコントロールマウスを作製し、既述のように腸特異的ノックアウトマウス（FxrΔIE）とした。すべてのマウスは標準的な特定病原体フリー（SPF）環境で飼育された。8週齢の雌性C57BL/6Jマウスに、0、1、3、7、14日間、ビヒクルまたは2mg/ml（11.1mM）のアスピリンを添加した普通食と飲料水を与えた。非絶食動物を麻酔し、各時点でそれぞれ犠牲にした。腸内容物と小腸組織を採取した。図2では、2群のマウスに3日間ネオマイシン（飲料水中1mg/ml）を前投与し、ビヒクルまたは2mg/ml（11.1mM）のアスピリンとともにさらに2週間投与した。他の2群のマウスには、ビヒクルまたは2mg/ml（11.1mM）のアスピリンを加えた飲料水を投与した。マウスのアスピリン投与量を決定するために、ヒトの投与量（100mg/日/個体）を調整し、体表面積に基づいて変換して算出した。体表面積はMeeh-Rubnerの式で計算した：

したがって、ヒトの投与量（100mg/60kg/日）は、マウスの投与量11.1mg/20g/日に相当する。マウス1匹あたりの1日飲水量は平均4～6mLと報告されている。計算の結果、飲料水中のアスピリン濃度は2mg/mL（11.1mMに相当）となった。

無菌マウス実験では、マウスに滅菌生理食塩水またはアスピリンを指示通りに投与した。雌性GFマウスは、ケージをSPF環境に移し、SPFマウスと2週間同居させることで腸内細菌を自然に再構成させ（1ケージに3匹のSPFマウスと2匹のGFマウスを同居させる）、rGFマウスを作製した。アスピリンを投与したGFマウスまたはrGFマウスの腸管内容物を採取し、16S配列決定を行った。P.goldsteiniiの経口投与については、マウスに生理食塩水または細菌を1日おきに経口投与した。

胆汁酸介入（図4H）については、2群のマウス（10週齢の雌性C57BL/6J）にUDCA（50mg/kg/d）または7-ケトLCA（50mg/kg/d）を毎日経口投与し、次いで2mg/ml（11.1mM）のアスピリンとUDCA（50mg/kg/d）または7-ケトLCA（50mg/kg/d）を毎日経口投与した。経口投与前に胆汁酸を調製する際には、まず胆汁酸をジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、次にDMSOを含む胆汁酸を生理食塩水に溶解した。他の2群については、10週齢の雌性C57BL/6Jマウスにビヒクルまたは2mg/ml（11.1mM）のアスピリンを含む飲料水を2週間投与した。図5およびS8のFxr遺伝子機能実験では、8週齢の雌性Fxrfl/flおよびFxrΔIEマウスに、アスピリン（2mg/ml、11.1mM）またはビヒクルを含む飲料水を2週間投与し、実験終了時に麻酔をかけて犠牲にした。

細菌
P.goldsteinii、P.Merdae、P.distasonisおよびE.coliは、日本微生物コレクション（JCM、主要リソース表参照）から入手した。

オルガノイドと細胞培養
小腸は、2%BSAを含む氷冷PBSで洗浄した。腸を縦に開き、冷PBSで静かに洗浄して管腔内容物を除去した。組織を2 mm2 の断片に切断し、さらに冷PBSで上清が透明になるまで20回洗浄した。その後、腸管サンプルを20mlのGentle Cell Dissociation Reagent（#07174、NovoBiotechnology社、中国北京）と共に20rpm、室温で15分間インキュベートし、溶解バッファーを0.1%BSAを含む冷PBSに交換した。断片を激しく振盪し、懸濁液を70mmフィルターでろ過した。濃縮した陰窩を冷PBSで1回洗浄し、DMEM/F12培地（Gibco）で再懸濁した。陰窩を数え、Matrigel（Corning #356231 ）とIntestiCult Organoid Growth Medium with Supplement 1 and 2（STEMCELL Technologies #06005 ）でプレーティングした。オルガノイドをDMSO、アスピリン（2mM）、UDCA（20μM、MCE#HY-13771）、7-ケトLCA（20uM、MCE#HY-W018512 ）、TβMCA（20μM、MCE#HY-135103）またはCDCA（10μM、MCE#HY-76847）に5日間、または指示通りに曝露した。ヒト腸癌細胞株HT29およびラット小腸細胞株IEC-6はATCCから入手し、供給者の指示に従って培養した。図7B〜7Dにおいて、細胞を無血清培地中で12時間同期させ、フェキサラミンD（FexD、10μM、MCE＃HY-10912）またはGW4064（1μM、MCE＃HY-50108）の存在下で、TβMCA（20μM、MCE＃HY-135103）、UDCA（20μM、MCE＃HY-13771）および7-ケト-LCAに24時間曝露した。曝露後、TRizolを用いてRNAを抽出した。

方法の詳細
DNA抽出および調製
臨床的に採取したヒトの便検体から、Stool Genomic DNA Kit（#CW20925, CWBIO, China）を用いてゲノムDNAを抽出した。DNAの分解と汚染は1%アガロースゲル上でモニターした。DNAの純度はNano-Photometer spectrophotometer（IMPLEN, CA, USA）を用いてチェックした。Qubit 2.0 Fluorometer（Life Technologies, CA, USA）のQubit DNA Assay KitでDNA濃度を測定した。

メタゲノム配列決定
60サンプルあたり700 ngのDNAをサンプル調製に用いた。シーケンスライブラリーはNEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (# E7370L, NEB, USA)を用いて作成した。断片化したDNA末端を修復し、ポリAテール化し、イルミナシーケンス用アダプターでライゲーションした。PCR増幅と精製（AMPure XPシステム）を行った。DNA濃度はQubit 2.0 Fluorometer（Life Technologies, CA, USA）のQubit DNA Assay Kitで測定し、2 ng/μLに希釈した。ライブラリーのインサートサイズは、Agilent Bioanalyzer 2100システムを用いて評価した。qPCRにより、ライブラリーの正確な濃度（> 3 nM）を確認した。インデックスコードされたサンプルのクラスタリングは、HiSeq 4000 PE Cluster Kit（イルミナ社製）を使用し、cBot Cluster Generation Systemでメーカーの指示に従って行った。クラスター生成後、ライブラリー調製物をIllumina HiSeq 4000プラットフォームでシーケンスし、150bpペアエンドリードを作成した。

16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンス
図1H-1JおよびS1Iでは、微生物叢の経時的変化の解析および比較のために糞便サンプルを採取した。図2および3では、盲腸内容物を含む腸内容物を16S配列決定およびメタボローム解析のために採取した。簡単に説明すると、マウスを殺し、小腸の全長と盲腸を採取した。盲腸内容物を含むすべての腸内容物を腸から除去するために、腸を冷PBSで3回洗浄した。腸内に残った糞便を含む腸内容物は、以下の実験用に回収した。共通のアダプター配列を持つプライマーを用いてV4可変領域をPCR増幅し、アンプリコンライブラリーを作成した： 515Fおよび806R.63 バーコード・リバースおよび非バーコード・フォワード・プライマーは、Taq DNAポリメラーゼ・マスターミックス（TONBO Biosciences）と共に、メーカーの指示に従って使用した。16S rRNA遺伝子のアンプリコンは、Mag-Bind RxnPure Plusビーズ（Omega Bio-tek）を用いて洗浄した。イルミナのMiSeqプラットフォームで2×250 bpペアエンドランを用いてシーケンスする前に、サンプルを等モル量で混合した。得られたASVは、SILVA 132データベースとのマッピングにより分類を割り当てた65。

α-多様性、β-多様性およびネットワークの可視化
α-多様性解析は、記述されているようにsearchソフトウェアを用いて行った66。一方、β-多様性解析は、R v 3.6.1の'vegan'パッケージを用いて行い、BA-AAコホート個体またはマウス糞便における特徴の豊かさを評価した。α多様性指数（Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数）は、各分類群の相対的な存在量に基づいてusearchで算出した。Chao1指数は、検出された種の数を表し、種の豊かさに相当し、各種の存在量は無視される。一方、シャノン指数とシンプソン指数は、種の豊かさと各種の相対的存在量に関係する。シャノン指数は種の豊かさに重きが置かれ、シンプソン指数は各種の相対的な存在量に重きが置かれる。β-多様性分析は、部分最小二乗判別分析（PLS-DA）またはBray-Curtis非類似度指数行列に基づく主成分分析（PCA）を用いて行われた。種間相関のネットワークは、Cytoscape v3.9.1とChiPlot (https://www.chiplot.online/)を用いて可視化した。マンテル検定はR v3.6.1（主要リソース表参照）で "ggcor "パッケージを用いて実施し、可視化した。

胆汁酸分析
この研究では、四重極型飛行時間型（QTOF）と組み合わせた超高速液体クロマトグラフィー（UHPLC）を利用して、ヒトとマウスの糞便中の胆汁酸を同定した。100倍のダイナミックレンジを持つトリプル四重極を利用し、真正標準物質（標準曲線）を用いて胆汁酸を正確に定量した。便サンプルまたは腸内容物サンプルを溶解し、沈殿により細菌培地サンプルを調製した。上清中の胆汁酸濃度は、UPLC/Synapt G2-Si QTOF MSシステム（Waters Corp. クロマトグラフィ分離は、Acquity BEHC18カラム（100 mm × 2.1 mm i.d.、1.7 μ m、Waters Corp.）で行った。カラム温度は45℃、流速は0.4ml/分であった。移動相は水中0.1%ギ酸とアセトニトリル中0.1%ギ酸の混合液。グラジエント溶出が適用され、MS検出はネガティブモードで進行した。m/z 50から850の質量範囲を取得した。LC-MSで検出された異なる胆汁酸代謝物を同定するために、すべての胆汁酸の標準物質が使用された。

糞便微生物叢移植（FMT）
図S2HおよびS2IのFMT実験では、ドナーマウス（8週齢、雌、n＝7）を未処置（NC群）、生理食塩水（Saline群）またはアスピリン（Asp群）で2週間以上処置した。各マウスの糞便サンプル（150mg以上）を14日目から20日目まで採取し、滅菌チューブに保存した後、1mlのPBSでホモジナイズした。遠心分離（2,000g、10分間）後、細菌濃縮上清を回収し、遠心分離（15,000g、5分間）した。細菌ペレットをPBSで2回洗浄し、20％（v/v）グリセロールを含む700μLの生理食塩水に再懸濁し、-80℃で保存した。レシピエントマウスには、コントロールマウスおよびアスピリン投与マウス（2週間、生理食塩水またはアスピリンを飲料水［2 mg/mL］に溶解）を用い、各ドナー群からの糞便微生物叢移植を2週間毎日経口投与した（1日1回200 ul）。

P.goldsteiniiおよび大腸菌の移植については、遠心分離により細菌を回収し、滅菌生理食塩水に懸濁した。マウスに、2×108コロニー形成単位の生きたP. goldsteinii（200μL、LPG）、野生型P. goldsteinii（PGwt）、hdhA欠損P. goldsteinii（PGΔhdhA）、野生型大腸菌DH5α（EcD:wt）、およびhdhAをトランスフェクトした大腸菌（EcD;hdhA）を、前記のように1日おき（週3回）に経口投与した47。ヒートキルドP. goldsteinii（200μL、HPG）は、細菌を水浴中で100℃で15分間加熱することにより調製した。6群に分け、4群にLPG/HPG/PGwt/PGΔhdhAを投与した後、FMTとともに2 mg/ml (11.1 mM)のアスピリンを飲料水中で2週間(3回/週)投与した。他の2群には、2週間の生理食塩水投与後、ビヒクルまたはアスピリン（2mg/ml、11.1mM）を含む飲料水を2週間投与した。

P.goldsteiniiとオルガノイドの共培養
0.4umのトランスウェルチャンバーを用いて嫌気環境チャンバーをデザインし、そこでP. goldsteiniiを培養した。培地は1日おきに交換した。細胞インサートと上部嫌気培地は48時間ごとに交換し、培地の嫌気状態をできるだけ長く保つようにした。図6D-6Gでは、CDCA（10μM）を上部培地に添加した。オルガノイドの画像をオリンパスの顕微鏡で撮影し、芽の数を数えた。クローン形成能（コロニー形成効率）は、150個のクリプトをプレーティングし、培養開始から3～7日後、または指定された通りにオルガノイド形成を評価することにより算出した。二次オルガノイドアッセイでは、一次オルガノイドをGentle Cell Dissociation Reagent（GCDR、STEMCELL Technologies）で解離し、遠心分離して冷DMEM/F12で再懸濁した。細胞は前述のようにマトリゲル上に播種した。二次オルガノイドは、特に指定のない限り、3～5日目に計数した20。

細菌株と培養条件
細菌は、5%の水素、10%の二酸化炭素、85%の窒素からなる混合ガスを使用し、嫌気性ガス注入器を用いて水素を約3.3%に維持したCOYタイプB嫌気チャンバー内で、培地中37℃で定常培養した。すべての培地とプラスチック容器は、使用前に少なくとも24時間、嫌気チャンバー内で予備還元した。必要に応じて、OD測定はバルチ型嫌気チューブでGENESYS 30 spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。図3における細胞懸濁液の代謝物分析では、P. goldsteiniiを、アミノ酸（L-グルタミン #49419 、L-シトルリン #C7629 、L-プロリン #P0380 、すべてSigma-Aldrich、中国から購入）添加または無添加のアスピリン（0～4 mmol/L）添加培地で、指示された時間培養した。その後、遠心分離によって細胞を回収し、基質を添加する前にODが約1.0になるまで再懸濁した。

hdhA欠損P. goldsteiniiの構築
hdhA内部断片（789 bp）遺伝子を、P. goldsteinii（ermG）および大腸菌（Bla）選択マーカーを含むpGERM自殺ベクターに、記載されているように形質転換した。P. goldsteinii レシピエントはYCFA培地でOD600が1.0になるまで37℃で嫌気培養した。ドナー培養液（1.0 ml）とレシピエント培養液（1.0 ml）を混合し、さらに遠心分離して交配ミックスを調製し、これをYCFA培地寒天プレートに置いた。好気条件下で培養後、プレートを嫌気ステーションに移し、得られた細菌を5mlの岐阜嫌気培地に懸濁した。培養後、細胞懸濁液をエリスロマイシンを添加したYCFA-培地寒天培地プレートに添加し、変異株選択を行った。4日間の嫌気培養後、エリスロマイシン耐性コロニーが得られた。標的遺伝子へのプラスミド挿入は、ゲノムDNAのPCRによって確認された。

大腸菌：hdhAの構築
マウスのコロニー形成のためにhdhAを発現する大腸菌株を構築するために、hdhAをコードする遺伝子をP. goldsteiniiの近縁菌分離株からクローニングし、そのシグナルペプチドをユニバースシグナルペプチドpelBに置換し、CRISPR-Cas9システムを用いて大腸菌DH5αのゲノムattB部位に組み込んだ。その後、pTargetFプラスミドを0.5 mM IPTGと50 μg/mLカナマイシンのみで30℃、14時間以上培養することで除去し、最後にpCasプラスミドをLB培地で42℃、一晩培養することで除去した。

アスピリンの検出
血漿および腸管内容物からのアスピリン濃度は、記載14 のとおり、超高速液体クロマトグラフィー-四重極飛行時間型質量分析（UPLC-QTOF-MS）により測定した。検出試料を5 mLの4-Cl-フェニルアラニン（0.39 mg/mL、内部標準）に混合した。アスピリンを 400 mL の冷メタノールで 2 回抽出した。上清は窒素気流下で乾燥させ、UPLC (1290 Infinity LC; Agilent, Santa Clara, CA) および MS (6550 QTOF-MS; Agilent) で検出した。

Chiuのスコア
スコアは、2人の独立した病理医が独立して評価し、その基準は図S2Aに記載した。平均スコアは、腸組織の1スライスから無作為に選んだ10個の視野の平均値に基づいて算出し、各群の全個体について統計学的に解析した。

EdU染色
腸管上皮細胞の増殖を測定するため、5-エチニル-20-デオキシウリジン（EdU、MCE # HY-118411）を100 mg/kgで、犠牲にする12時間前にマウスに腹腔内注射した。腸を採取し、EdU染色によりEdU陽性細胞を検出した。EDUを20 uMでオルガノイドおよび細胞株と2時間インキュベートした後、摘出した。オルガノイドと細胞株を回収し、Edu染色によりEdU陽性細胞を検出した。

免疫組織化学（IHC）
IHCでは、Ki67抗体（#ab15580, Abcam, Shanghai, China）を用いて組織上で標的分子を検出した。スライドをHRP標識二次抗体（Dako）とインキュベートした。DAB発色基質（Dako）を用いてその場でタンパク質を可視化し、その後、ヘマトキシリンでカウンター染色を行った。Ki-67陽性面積は、1スライスのランダムな10視野についてImageJソフトウェアで評価し、平均面積を算出して統計的に解析した。

免疫蛍光
細胞をガラスカバースリップにプレーティングし、4％パラホルムアルデヒドで20分間固定し、PBS中0.1％Triton X-100で15分間透過処理した。オルガノイドを最適切断温度化合物でコーティングし、凍結切片および新鮮な腸組織のホルムアルデヒド固定パラフィン包埋切片に進めた。以下の抗体を用いた： ブロッキング液は室温で1時間塗布した。一次抗体は4℃で一晩処理した。FITCまたはCy5標識二次抗体を負荷し、室温で2時間インキュベートした。10×/0.30NA対物レンズ（オリンパス）とFluoviewソフトウェア（バージョン4.3；オリンパス）を装着した共焦点顕微鏡（FV10i；オリンパス）を用いて、免疫染色シグナルとDAPI染色核を室温で可視化した。β-カテニン分布の定量は、盲検化された観察者により、各条件の100細胞についてスライドごとに評価された。より見やすくするため、Photoshopのレベルツールと明度／コントラストツールを用いて、記載されているデジタルデータの表示ガイドラインに従って画像を調整した38。

酸素濃度の測定
酸素濃度は、メーカーの指示に従い較正した光ファイバー式酸素濃度計（Microx 4 trace；PreSens社製）を用いて測定した。測定は、細胞挿入部とプレートの底部ウェル内の一定の位置で行った。共培養システム内の酸素濃度を測定する場合は、培養プレートを嫌気チャンバーに移し、プラスチックシートを剥がし、前述のように酸素濃度計を装着した。

共免疫沈降（Co-IP）
免疫沈降は、Pierce Classic IP Kit（#26146, Pierce Biotechnology, US）を用いて、メーカーのプロトコールに従って行った69。細胞をIP Lysis/Wash Bufferで5分間溶解し、溶解液を13000gで10分間遠心分離した後、上清画分をControl Agarose Resinを用いて1時間前清し、前清澄化溶解液600μlに10μgの一次抗体と40μlのProtein A/G Agarose Resinを加え、4℃で一晩インキュベートした。コントロール抗体としてノーマルIgG（10μg）を用いた。樹脂を200μlのLysis/Wash Bufferで2回、100μlの1xコンディショニングバッファーで1回洗浄した。20mM DDTを含む50μlの2xサンプルバッファーを加え、100℃で10分間インキュベートした。その後、1000 x gで3分間遠心し、溶出液を回収した。Co-IPでは、IP溶出液を抗FXR（#25055-1-AP, Proteintech, Wuhan Sanying, China）と抗β-カテニン（#8480, Cell Signaling Technology, Shanghai, China）を含む別の一次抗体でウェスタンブロットした。

過ヨウ素酸シッフ染色（PAS）
パラフィン包埋腸切片をキシレンで脱脂し、勾配アルコールで再水和した。過ヨウ素酸塩で酸性化した後、光による染色を避けるため、切片を籾殻を含む純水で洗浄し、切片を脱水して密封した。最後に、スライススキャナー（Pannoramic MIDI）を用いてデジタル切片を作成した。

フルオレセイン-イソチオシアネート（FITC）-デキストランによる腸管透過性の検出
健康なマウスでは消化も吸収もされない高分子量のグルコースポリマーであるフルオレセイン-イソチオシアネート（FITC）-デキストラン（4kDa；#46944Merck, Darmstadt, Germany）を経口投与し、in vivoで腸管透過性を評価した。動物には採血の4時間前にFITC-デキストラン（0.4mg/g）を経口投与した。全血を眼球の毛細血管静脈から採取した。血清はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈し、多目的マイクロプレートリーダーを用いて蛍光をモニターした。励起波長485 nm、発光波長528 nm。標準曲線はFITC-デキストランをPBSで希釈して作成した。FITC-デキストランを投与しなかったマウスの血清をバックグラウンドコントロールとして用いた。

血清リポ多糖（LPS）検出
血清リポ多糖は、ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay kit (#L00350 GenScript, Nanjing, China)を用い、製造者の指示に従って定量した。簡単に説明すると、血清検体をLAL試薬水で1:10に希釈し、4種類の標準品(0.01 EU/ml〜0.1 EU/ml)と検体を含まないブランク対照を調製し、製造業者のプロトコールに従って処理した。最後に試験管内の液体とよく混合し、545nmの吸光度を測定した。

血清ジアミン酸化酵素（DAO）の検出
血清DAOはMouse Diamine Oxidase ELISA Kit (#MU30134, Bio-Swamp, Wuhan, China)を用い、製造業者の指示に従って定量した。血清検体をウェルに加え、DAO抗体と結合させた。洗浄後、TMB基質溶液を加えた。硫酸溶液を加えて反応を停止させ、波長450 nmでの色の変化を分光光度計で測定した。その後、検体のODを標準曲線と比較することにより、検体中のDAO濃度を測定した。

便潜血検査（FOBT）
便潜血検査は、便中に血液が隠れていないかを調べるために行われた。新鮮な便（20mg）を通常の生理食塩水と混合し、製造元の指示に従い、キット-One step Fecal Occult Blood Test（Suzhou Abogen Biosciences、中国）の内側のディップスティックで検査した。

TdT-mediated-dUTPニックエンドラベリング（TUNEL）アッセイ
組織およびオルガノイド細胞のアポトーシスは、in-situ 細胞死検出キット（#11684817910, Roche, Swiss）を用いて、製造元の指示に従って検出した。簡単に説明すると、パラフィン包埋した腸切片をキシレンで脱脂し、勾配アルコールで再水和した。その後、0.1%クエン酸ナトリウム緩衝液中0.1% Triton X-100で15分間インキュベートし、PBSで洗浄した。次に、サンプルをTUNEL反応混合液とともに、室温で60分間、光を避けて加湿チャンバー内でインキュベートした。続いてPBS洗浄を行い、1 mg/mL DAPI（#28718-90-3, Merck, Darmstadt, Germany）と10分間インキュベートした。染色後、切片を蛍光切片スキャナーでスキャンした。

透過型電子顕微鏡（TEM）
各群のマウスから新鮮な空腸遠位端組織を採取し、3×3 mm2 の大きさに切り出し、固定試薬（#G1102, Servicebio, Wuhan, China）にて4℃で固定した。樹脂に包埋後、超薄切片（70 nm）を切り出し、染色した。日立HT-HT7700 TEMを用いて腸管切片の構造を解析した。

RNA抽出とPCR
培養細胞またはオルガノイドの全RNAは、TRizol試薬（Invitrogen, CA, USA）を用いて抽出した。新鮮な凍結組織の全RNAは、RNeasy Mini Kit（#74104, Qiagen, Hilden, Germany）を用いて抽出した。PCRプライマーは表S4に示す。逆転写（RT）PCRは、PrimeScript RT試薬キット（TaKaRa, Dalian, China）を用いて、製造元の指示に従って行った。定量的RT PCRは、SYBR Premix Ex Taq II（TaKaRa）を用い、LightCycler 480システム（Roche, Basel, Switzerland）を用いて、記載された方法で測定した38。2-△△CTは、キャリブレーションサンプルと比較した場合の1サンプルのRNA発現の倍数変化を意味する。

TR-FRET FXRコアクチベーターリクルートメントアッセイ
CDCA、7-ケト-LCAおよびUDCAを、市販のTR-FRET FXRコアクチベーターリクルートメントアッセイキット（Thermo Fisher, LanthaScreen™, Cat# PV4833）を用いて、FXRの直接活性化または抑制について試験した。

ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
Shp遺伝子のプロモーター配列（-2000bp）をpGL3-プロモーターベクターに挿入し、Shpプロモーター用のルシフェラーゼレポータープラスミドを構築した。HT-29細胞を24ウェルプレートで適切なプラスミドと共導入した。トランスフェクション後24時間後、細胞をCDCA（20μM、10μM MCE＃HY-76847）の存在下でUDCA（50〜200μM、MCE＃HY-13771）または7-ケト-LCA（50〜200μM、MCE＃HY-W018512）に24時間曝露した。その後、細胞を回収し、ルシフェラーゼアッセイのために溶解した。ルシフェラーゼ活性は、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega, WI, USA）を用いて、製造元のプロトコールに従って測定した。ホタルルシフェラーゼ活性は、内部コントロールとして用いたレニラルシフェラーゼで正規化した。トランスフェクション実験は、記述されているように、各プラスミド構築物について3連で行った38。

RNA配列決定とGSEA
オルガノイドの全RNAは記述の通りに抽出し、Agilent 2100バイオアナライザーを用いてRNAの質を確認した。RNA-seqライブラリーは、各実験条件について3つの生物学的複製から調製し、イルミナHiSeq 2500、4000、またはNextSeq500で、バーコード多重化と100bpのリード長を用いて配列決定した。画像解析と塩基コールにはIllumina CASAVA-1.8.2を用いた。リードの品質はfastqcで評価した。図7Eでは、mRNAを最小10リードでフィルターし、処理（n = 3）からフォールド変化を計算した。CDCA群におけるLGR5-ASCL2シグネチャーからの上位30個のダウンレギュレート遺伝子をヒートマップに示した。図S10では、DMSO群と比較したCDCA群のWnt/β-カテニンシグネチャーの発現差遺伝子（フォールド変化＞1.5）を示した。行のzスコア（n = 3）は、Rを用いて正規化発現のマトリックスから計算した。GSEAには、ダウンロードした遺伝子シグネチャー（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）を用いて、RSEMの結果から遺伝子マトリックスの正規化発現を用いた。GSEAはデフォルト設定（GSEA 4.2.3ソフトウェア）で行った70。

フローアポトーシスアッセイ
細胞は6ウェルプレートに2×105個/ウェルで播種し、指示した胆汁酸に暴露した24時間後にトリプシンを用いて回収した。細胞（1×104個）を無血清培地で24時間静置し、製造元のプロトコールに従って染色した後、蛍光活性化セルソーティングソーター（BD）を用いてソートし、Modfitソフトウェア（BD）を用いてデータを解析した。

CCK8アッセイ
HT-29細胞生存率アッセイでは、勾配濃度のUDCAまたは7-ケト-LCA（5uM,10uM,20uM）をCDCA（10uM）と共に72時間で投与した。細胞を96ウェルプレート（2×103/ウェル）に播種し、指示された条件で処理した。その後、無血清培地にCCK8を添加し、吸光度をVarioskan Flash Multimode Reader（Thermo Fisher, Waltham, MA, USA）で450nm、参照波長を650nmとして検出した。

代謝物の非標的定量
P. goldsteinii阻害アッセイにおけるアスピリン濃度は以下のように決定した：図S2Gが示すように、このモデルにおけるアスピリンの腸内濃度は100～400 mg/Lの範囲である。モル濃度に換算すると、腸内のアスピリン濃度は0.56～2.22 mMとなる。したがって、P. goldsteiniiに対するアスピリンの阻害効果を調べるため、in vitroモデルで0.1、0.5、1、2、4、8、16 mMと異なる濃度のアスピリンを用いた。ここでは、マウスの実際の腸内濃度に近い1、2、4 mMのアスピリン濃度を用いたP. goldsteiniiの増殖結果のみを示す。図3A-3CおよびS3における非標的代謝物の検出には、Thermo Fisher Scientific Vanquish Horizon UHPLCシステムとThermo Q Exactive HFハイブリッド四重極オービトラップ高分解能質量分析計（加熱エレクトロスプレーイオン化（HESI）イオン源を装備）を用いて、64の記載に従って高分解能LC-MS分析を行った。各サンプルは、m/z範囲が150～800のポジティブモードとネガティブモードで分析された。異なる代謝物のヒートマップは、ClustVisオンラインツール（https://biit.cs.ut.ee/clustvis/）で作成した。代謝物セットの濃縮とネットワークは MetaboAnalyt 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/ModuleView.xhtml)で構築した。

細菌の全ゲノム配列決定
Parabacteroidesの抽出ゲノムDNAを剪断してDNA断片を得た。ゲノム配列は、PacBio SequelおよびIllumina MiSeqシーケンサーを用いた全ゲノムショットガン戦略によって決定した。PacBio Sequelシーケンサーのライブラリーは、SMRTbell template prep kit 2.0 (target length = 10-15 kb)を用いてDNAのせん断を行わずに調製した。Sequelで内部コントロールの除去とアダプターのトリミングを行った後、Canu v.1.8を用いてトリミングしたリードのエラー訂正を行った。フィルターパスされたMiSeqリードと補正されたSequelリードのde novoハイブリッドアセンブリは、Unicycler v.0.4.8を用いて行った。生成されたコンティグの遺伝子予測とアノテーションは、Rapid Annotations based on Subsystem Technology（RAST）サーバーとProkkaソフトウェアツールを用いて行った。

定量化と統計解析
メタゲノム特徴（種や属など）の有意差を検定するために、偽発見率（FDR）＜5％を抑制するためにBenjamini-Hochberg手順で調整した両側Wilcoxon順位和検定を使用した。メタボロミクスデータについては、両側Wilcoxon順位和検定を行った。カテゴリー変数（喫煙や性別など）については、カイ二乗検定またはフィッシャーの正確検定を行った。動物実験および細胞実験（群数＞2）では、Shapiro-Wilk正規性検定を用いてデータ分布を決定し、Leveneの等分散検定を用いて分散の均一性を評価した。標本分布はコルモゴロフ・スミルノフ正規性検定を用いて決定した。Kolmogorov-Smirnov正規性検定とLeveneの等分散検定に合格したデータについては、一元配置分散分析（one-way ANOVA）とFisherの最小有意差（LSD）事後検定によって有意性を算出した。Shapiro-Wilk正規性検定に合格したが、分散の不均一性を示さなかったデータについては、WelchのANOVAに続いてGames-Howellの事後ホック検定によって有意性を計算した。正規分布でないデータについては、ノンパラメトリックのKruskal-Wallis検定に続いて、ペアワイズのWilcoxon順位和事後検定によって有意性を算出した。動物実験および細胞実験（群数＝2）では、Shapiro-Wilk検定およびLevene検定に合格したデータは、両側Studentのt検定を用いて差異を比較した。Shapiro-Wilk検定に合格したが分散の不均一性を示さなかったデータは、Welchのt検定を用いて差異を比較した。Kolmogorov-Smirnov検定に合格しなかったデータは、両側Wilcoxon順位和検定を用いて差異を比較した。統計処理にはGraphPad Prism version 9.0（GraphPad Software, San Diego, CA）を用いた。サンプルサイズは、StatMateバージョン2.0（GraphPad Software, San Diego, CA）を用いた検出力分析によって決定し、動物の出生数に基づいて、実験内の性別と年齢をコントロールした。実験データは平均値±SDで示した。データ解析から除外されたデータはなかった。マウス関連実験のすべての比較に、両側無対Student's t-testおよびTukeyの補正を加えた一元配置分散分析を用いた。正規分布と一致しない値の比較にはMann Whitneyのu検定を用いた。P値＜0.05を有意とみなした。腸内細菌叢と宿主メタボロームの相関分析はノンパラメトリックのスピアマンの検定を用いて調べた。解析から除外されたデータはなかった。すべての動物実験において、実験デザインを知らない研究者が同腹仔をグループ分けした。グループ分けされた同腹仔は、実験開始前に無作為に治療群に割り付けられた。

謝辞
本研究は以下の助成を受けた：中国国家重点研究開発プログラム助成金（2021YFA1301201および2021YFA0805403）、中国国家科学基金（第82000474号、第82370458号）、中国陝西省自然科学基金（第2020JM-383号）、中国陝西省自然科学基金（第2020JM-383号）。2020JM-383）、中国陝西省革新的人材育成計画（2021KJXX-04）、西安衛生委員会育成プロジェクト（2020MS01）および西安交通大学資金援助（xzy012019093）、国立がん研究所学内研究プログラム。

著者貢献
T.L.、Y.W.、Z.Y.は実験の構想および計画を行った。T.L.、N.D.、H.G.、R.H.が実験を行い、データを解析した。T.L.、H.G.、R.H.、Z.L.は修正実験を行った。T.L.、Y.W.、Z.Y.およびD.F.は本研究を計画・監督した。T.L.、N.D.、H.G.、Y.W.、F.J.G.が原稿を執筆した。著者全員が原稿を編集し、最終原稿を承認した。

利害関係
著者らは競合する利益はないと宣言している。

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これらの著者は同等に貢献した

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