マイクロプラスチックは、腸内細菌-ヒポキサンチン-Wnt軸を破壊することで造血幹細胞の自己再生を阻害する

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出版：2024年3月29日
マイクロプラスチックは、腸内細菌-ヒポキサンチン-Wnt軸を破壊することで造血幹細胞の自己再生を阻害する

https://www.nature.com/articles/s41421-024-00665-0

姜玲麗、葉怡山、...銭鵬秀著者表示
セルディスカバリー10巻、論文番号：35（2024）この記事を引用する

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指標詳細

要旨
マイクロプラスチック（MPs）は、地球上の生物圏に偏在する汚染物質であり、吸入や摂取によって体内に侵入し、人体に重大なリスクをもたらす。最近の研究では、MPsが骨髄に存在し、造血系にダメージを与えることが明らかになっている。しかし、MPsが造血幹細胞（HSCs）に影響を及ぼす具体的なメカニズムや、造血幹細胞移植（HSCCT）におけるMPsの臨床的意義については、いまだ不明な点が多い。我々は、MPs長期摂取マウスモデルを確立し、MPsが造血系に深刻な障害を引き起こすことを見出した。MPsの経口経口投与、あるいはMPs投与マウスの微生物叢の糞便移植は、造血幹細胞の自己複製能と再構成能を著しく低下させた。メカニズム的には、MPsは造血幹細胞を直接死滅させるのではなく、腸の構造と透過性を破壊し、最終的に腸内のリケネラとヒポキサンチンの存在量を改善し、骨髄造血幹細胞におけるHPRT-Wntシグナル伝達を不活性化した。さらに、マウスにリケネラ科植物またはヒポキサンチンを投与し、培養系でWNT10Aを処理すると、MPs誘発造血幹細胞の欠損が大幅に改善した。最後に、健康なドナーから同種造血幹細胞移植を受けたヒト患者コホートで検証したところ、患者の生存期間は、造血幹細胞ドナーの糞便中および血液中のMPsレベルと負の相関がある一方、リケネラ科植物およびヒポキサンチンの存在量と正の相関があることが明らかになった。全体として、本研究は造血幹細胞におけるMPsの有害な役割とメカニズムを解き明かし、MPsによる造血障害を予防するための潜在的な戦略を提供するとともに、臨床において造血幹細胞移植に適したドナーを選択するための基本的な批判となるものである。

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はじめに
造血幹細胞（HSCs）は毎日2,800億個の細胞を血液系に供給している1が、その理由は自己複製能と多系統分化能にある2。造血幹細胞移植（造血幹細胞移植）は、その長期的な再生能により、様々な種類の血液疾患や免疫疾患に対する根治療法となっている3。したがって、定常状態およびストレス条件下における造血幹細胞の自己複製能の根底にある制御メカニズムを明らかにすることは重要である。最近の研究では、座りがちな生活習慣、タバコの使用、アルコール摂取、食事の代謝産物、大気汚染物質などの環境因子が造血幹細胞の自己複製能の悪化に極めて重要な役割を果たし4,5,6,7,8、同種造血幹細胞移植後の再構成不全や移植片対宿主病（GvHD）の危険因子であることが示されている9。しかしながら、造血の制御におけるこれらの環境因子の役割やメカニズムについては、まだほとんど解明されていない。

マイクロプラスチック（MPs）は、長さ5mm以下のプラスチック繊維、粒子、フィルムと定義され、プラスチック廃棄物の破砕から生じるか、特殊な用途のために意図的に製造されたもので、世界の生態系の至る所で見られる新しいタイプの環境汚染物質である10,11。人間は、食事、吸入、経皮接触によって必然的にMPsを摂取しており、最近の研究では、平均して週に0.1～5gのMPsを摂取していると推定されている12。実際、いくつかの研究では、ヒトの便15、肺組織16、血液17からMPsが検出されている。マイクロプラスチックへの暴露は、消化器系、呼吸器系、生殖器系において酸化ストレスや炎症を引き起こし13、腸内細菌叢や代謝産物にも影響を及ぼす18,19。最近では、MPsが腸内細菌叢の恒常性、代謝、炎症を乱し、最終的に造血障害を引き起こすことがいくつかの研究で報告されている20,21。それにもかかわらず、造血幹細胞の自己再生におけるMPsの役割とメカニズム、および造血幹細胞移植を受けた患者の臨床転帰に関する包括的な理解はまだ不足している。

腸内細菌叢は、代謝、免疫系22,23、炎症24、老化25,26、神経精神疾患27の重要な調節因子として浮上してきた。さらに、レシピエントの微生物叢密度、生物多様性、種の構成は、造血幹細胞移植後の治療関連死亡率、感染症、臓器不全と関連している28。実際、これまでの研究で、腸内細菌叢と代謝産物が電離放射線によるダメージから造血系を保護することが明らかにされており29、また、造血系におけるストレス条件下での微生物叢-マクロファージ-鉄軸の存在も見つかっている30。しかし、微生物叢が造血に影響を及ぼす詳細なメカニズムについてはまだ解明されておらず、造血幹細胞における環境汚染物質と腸内微生物叢の関係に関するより多くのエビデンスが必要である。

研究結果
MPsの長期摂取による造血系の障害
造血系に対するMPsの生物学的影響を評価するために、我々はまず、ポリスチレン（PS）、ポリメチルメタクリレート（PMMA）、ポリエチレン（PE）など、広く応用されている市販のMPsを選んだ。その結果、平均粒子径が約500 nmの球形粒子（補足図S1a-d）、二重蒸留水中では約600-850 nmの粒子が動的光散乱法により測定された（補足図S1e-i）。MPのゼータ電位は、約-5～-14 mVのわずかに陰イオン性の表面電荷を示した（補足図S1j-n）。MPの生体内分布を調べるために、インドシアニングリーン標識ポリスチレン（ICG-PS）マウスモデルを用いた（補足図S2a）。ICGの標識は、PS MPsの物性に影響を与えず（補足図S1b, f, k）、消化管組織に主に濃縮され、腎臓にわずかに分布していたが、他の臓器には見られなかった（補足図S2b-e）。さらに末梢血中では、対照群や低用量群に比べ、高用量群で高い蛍光強度が観察され（補足図S2f）、MPが腸から血流に入る可能性があるという考えを支持した17。マウスの消化管組織および末梢血中のMPを観察することで、MPと消化管組織および造血系との関係を詳細に調べることができた。

次に、H2Oを対照として、MPを2種類の用量で短期（1週間）および長期（5週間）投与したモデルマウスを作製した（図1a）。3群のマウスの体重に有意な差は見られなかった（図1b）。驚くべきことに、長期経口摂取マウスでは、PSH群からのみ末梢血中の白血球（WBC）、顆粒球、リンパ球、単球の顕著な減少が観察された（図1c-f；補足図S3a-e）。次に、造血幹細胞に対するMPsの影響を評価したところ、MPsの長期摂取により、自己複製能31が最も高い長期造血幹細胞（LT-造血幹細胞）、および多能性前駆細胞3/4（MPP3/4）細胞の頻度と絶対数の両方が著しく減少した（図1g-i）。さらに、LT-造血幹細胞、ST-造血幹細胞、MPP2およびMPP3/4細胞のアポトーシス率は、長期PSHマウスで有意に増加した（図1j；補足図S4a、c）。細胞周期解析の結果、PSHマウスではLT-造血幹細胞、ST-造血幹細胞、MPP2およびMPP3/4細胞がG0期からG1期への移行を示した（図1k、l；補足図S4b、d-f）。さらに、PSH群ではコロニーのサイズと細胞総数が著しく小さく、コロニー形成単位（CFU）が対照群に比べて23％減少していた（図1m；補足図S4g）。対照的に、PSの短期摂取は、造血幹細胞の数とアポトーシス率、細胞周期の状態には影響を及ぼさなかった（補足図S3f-o）。これらの結果は、MPsが時間および用量依存的に造血系を抑制することを示している。

図1：マイクロプラスチックの長期摂取は造血系に深刻なダメージを与える。
図1
a MPs投与モデルマウスの概略図（各群n = 5） b 3群の各マウスの体重。c-f末梢血中の白血球（WBC）数（c）、顆粒球数（d）、リンパ球数（e）および単球数（f）。g 全骨髄（BM）におけるLT-造血幹細胞、ST-造血幹細胞、MPP2およびMPP3/4の集団頻度を示すLSKコンパートメント（Lin-Sca-1+c-Kit+）の代表的フローサイトメトリー画像。m 8日間のctrlまたはPSH LT-造血幹細胞培養後に見られたCFUの代表画像（スケールバー、500μm）（左）と統計データ（右）（各群n = 3）。n in vivoにおける限界希釈解析（LDA）の実験スキーマ。 o 移植後16週目にLDAによって決定された機能的造血幹細胞頻度（各群n = 6）。p 一次および二次移植の実験スキーマ（各群n = 5） q 一次移植におけるレシピエントCD45.1マウスのドナー末梢血キメラ率 r, s 一次移植レシピエントマウスのBMにおけるCD45.2+細胞の割合（r）および代表的フローサイトメトリー画像（s） t BMにおけるCD45.2+細胞の絶対数 u 二次移植におけるドナー末梢血キメラ率。各記号は個々のマウスを表す。データは平均値±SDで示され、対応のない両側t検定、*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, n.s.は有意ではない。

フルサイズ画像
MPの長期摂取は造血幹細胞の再構成能力を損なう
造血幹細胞の機能低下の特徴的な症状は、再構成能の低下である32。造血幹細胞のin vivoでの再増殖能力を調べるため、致死レベルの放射線を照射したマウスに、ctrl群とPSH群の異なる量のドナーBM細胞（CD45.2）とレシピエントBM細胞（CD45.1）を移植し、限界希釈、競合的再増殖アッセイ（LDA）を行った（図1n）。その結果、PSH造血幹細胞では、ctrl群と比べて競合的再増殖ユニットの数が4.5倍減少した（図1o）。

その後、造血幹細胞の長期的な再増殖能力を評価するために、一次および二次移植アッセイを行った（図1p）。移植後16週目に、PSHの全体的な再増殖率は、ctrl群と比較して目に見えて低下していることが観察された（図1q）。さらに、PSH BM細胞を投与された患者では、BMにおけるドナー由来のLT-造血幹細胞とMPP2細胞の割合と絶対数の両方が、対照群と比べて有意に減少していた（図1r-t）。二次移植では、PSH群のドナー生着率は対照群と比べてかなり低かった（図1u）。また、一次および二次レシピエントマウスの両方で、骨髄系細胞ではなく、ドナー由来のT細胞とB細胞の顕著な減少が観察された（補足図S4h-m）。このように、MPsの長期消費は、数の減少、高いアポトーシス率、異常な細胞周期、造血幹細胞の移植再建能力の低下に関連していた。

さらに、PMMAやPEなど、ポリマー組成の異なる他のMPsが、造血系に同様の影響を及ぼすかどうかを評価した（補足図S5a）。マウスに長期間摂取させたところ、PE群ではWBC、単球、顆粒球が目に見えて減少し、PMMA群ではWBCとリンパ球が減少した（補足図S5b）。同様に、造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）の頻度と絶対数は、PMMAおよびPE摂取モデルの両方で、LT-造血幹細胞のアポトーシス率が増加したのに対して、著しく減少した（補足図S5c-g）。代わりに、PMMA MPを長期摂取したST-造血幹細胞では、細胞周期のG0期からの脱落が観察された（補足図S5h-k）。全体として、異なる種類のMPを長期間摂取すると、造血幹細胞の自己複製能が損なわれることが示された。

MPsは腸の構造、透過性、微生物叢を破壊して造血幹細胞を劣化させる
MPsが造血系のホメオスタシスにダメージを与えるという初期の報告があるが20,21、MPsが造血系に直接的または間接的に影響を及ぼすかどうかは不明である。我々は、C57BL/6Jマウスから単離した骨髄細胞を様々な濃度のMPsで培養した（補足図S6a）。予想外なことに、非常に高濃度のMPsは細胞の生存率を阻害せず、7日間培養後の総細胞数をわずかに増加させることさえわかった（補足図S6b）。培養HSPCsを100μg/mLと250μg/mLのMPsで処理したところ、ST-造血幹細胞、MPP2およびMPP3/4細胞において、14日間のMPs処理後、アポトーシス率の低下とともに、HSPCsの頻度と絶対数が一定または増加することが観察された（補足図S6c-f）。ヒト血液中のプラスチック微粒子の定量可能な濃度の総和の平均が1.6μg/mLであることを示した以前の研究17に照らして、MPの造血系への直接的な影響を調べるために、1週間あたり0.1μg/100μLのMPをマウスの血液に4週間にわたって静脈内投与した（補足図S6g）。その結果、MPsの血中への投与は、血液中の細胞や骨髄中の造血幹細胞の比率や総数に影響を及ぼさないことが明らかになった（補足図S6h-k）。一方、アポトーシス率、細胞周期、造血幹細胞のコロニー形成能力（補足図S6l-n）は、対照群と比較して、MPsのマウスへの静脈内注射に反応して変化しなかった。これらのデータから、in vitroまたはin vivoでのMPsへの長期曝露は造血系にダメージを与えないことが示唆され、in vivoでのMPsの影響は間接的なメカニズムによるものである可能性が示された。

MPsは主に消化管組織に沈着することがわかったので（補足図S2b-e）、MPsが消化管系に障害を与えるかどうかを検討した。腸切片のヘマトキシリン-エオシン（H&E）染色により、小腸の絨毛構造が、特にPSH群で著しく破壊されていることが明らかになった（図2a）。腸上皮細胞の透過型電子顕微鏡（TEM）分析によると、PSH群では微絨毛の長さが著しく短くなり、微絨毛間の隙間が広がっていた（図2c）。さらに、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）-デキストランアッセイでは、PSH群では対照群と比較して腸管透過性が上昇していた（図2d）。これらの結果は、MPsが腸の構造と透過性を変化させることを示唆しており、以前の研究35と一致している。

図2：マイクロプラスチックの長期摂取はマウスの腸内細菌叢を破壊し、造血系を障害する。
図2
a ヘマトキシリン・エオジン（H&E）で染色した小腸の代表的画像。下の画像（スケールバー、200μm）は上の画像（スケールバー、500μm）の拡大である。 c 小腸の透過型電子顕微鏡（TEM）染色の代表画像。下の画像（スケールバー、1μm）は上の画像（スケールバー、2μm）の拡大である。d 腸管透過性を検出するため、ctrl、PSL、PSHマウスから採取した末梢血の生体内FITC-デキストラン取り込みを測定した。 e ctrl、PSL、PSHマウス糞便からの16s rDNA配列決定の実験スキーマ（各群n = 6）。f 3群のベン図。g, h UniFrac距離で定量した3群間の微生物組成の違い（g）を示すPcoAプロット（h）。j 代表的フローサイトメトリー画像。 k, l レシピエントマウスのBMにおける細胞の割合（k）および絶対数（l）。 m 造血幹細胞におけるアポトーシス率の割合。 n, o レシピエントマウスにおける細胞周期（n）およびLT-造血幹細胞内の割合（o）の代表的フローサイトメトリー画像。エラーバーはSDを示し、不対両側t検定、*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、n.s.は有意ではない。

フルサイズ画像
MPsの長期摂取が腸内細菌叢を変化させるかどうかを調べるため、ctrlマウス、PSLマウス、PSHマウスの糞便を採取し、16 S rDNAの塩基配列を決定した（図2e；補足表S1）。注目すべきは、PSへの曝露によって微生物叢の組成が変化することである20,35,36,37。主座標（PCoA）およびUniFrac非類似度距離解析から、MPを摂取したマウスの細菌群集は、対照マウスのそれとは異なることが示唆された（図2g、h）。以上の結果から、MP摂取による腸内環境の変化が、造血系にダメージを与える可能性があると考えられた。この可能性を検証するため、野生型レシピエントC57BL/6マウスを抗生物質で前処理し、ctrlマウスまたはPSHマウスの糞便で再構成した糞便微生物叢移植（FMT）を行った（図2i）。PSHマウスのFMTでは、レシピエントマウスにおけるHSPCsの割合と絶対数が減少し（図2j-l）、コントロールマウスに比べてアポトーシス率が上昇し、LT-造血幹細胞のG0期が短くなった（図2m-o；補足図S7）。これらのデータを総合すると、MPsは造血系の構造や腸内細菌叢に影響を与え、造血系の悪化をもたらすことが示唆される。

MPsによる造血幹細胞の欠損は、リケネラとヒポキサンチンが原因である
次に、MPが介在する造血幹細胞の欠損にどの特定の細菌が関与しているかを同定するために、細菌OTUの不偏クラスタリング解析を行った（図3a）。リケネラ科の細菌が、MPs処理後に最も存在量が多かった（図3b）。線形判別分析（LDA）では、5つの分類群（バクテロイデス目など）が濃縮されたのに対し、3つの分類群（リケネラ科、バークホルデリア科、真正細菌科）はコントロールと比較してPSHマウスで減少した（図3c）。ボルケーノプロットでは、PSHマウスで最も減少し、代表的な細菌としてRikenellaceaeが挙げられた（図3d）。これらの結果から、MPを投与したマウスの腸内細菌叢で最も多く減少したリケネラ科の細菌は、以前報告されたように、造血系を保護する効果があるのではないかと考えられた29。

図3：マイクロプラスチック摂取マウスではリケネラ科細菌が有意に減少しており、造血に関与している。
図3
a, b ctrl群、PSL群、PSH群（上位30位）における16s rDNA配列決定された微生物OUT量のヒートマップ（a）と、3群における有意差のある存在量の違いのヒストグラム（b）（各群n = 6）。c ctrl群とPSH群の微生物叢における統計学的有意差分析。d:ctrl群とPSH群間の微生物OTUの相対存在量分布を示すボルケーノプロット。x軸はPSH対ctrlの変化倍率、y軸は相対存在量、青い点はリケネラ科。i LT-造血幹細胞のアポトーシスレベル。 j LT-造血幹細胞の細胞周期。 k 8日間培養したLT-造血幹細胞のCFUの統計プロット（各群n = 3）。エラーバーはSDを示し、不対両側t検定。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

フルサイズ画像
このことを検証するため、ctrl群とPSH群のマウスにリケネラを週3回4週間経口投与した（図3e）。驚くべきことに、リケネラを接種したPSHマウスは、造血幹細胞の比率と量の両方で有意な回復を示した（図3f-h）。リケネラの注入は、MPによって引き起こされたLT-造血幹細胞のアポトーシス率の上昇とG0期の低下を大幅に回復させた（図3i、j；補足図S8a-f）。最後に、4群から造血幹細胞を選別し、生体外で8日間培養した。MPによるコロニーの数と大きさの減少は、リケネラの処理によって回復した（図3k；補足図S8g）。

MPs20,21,38に応答して代謝物が変化することから、次に、造血幹細胞におけるMPsの有害な役割を媒介する代謝物を評価するために、ctrl群とPSH群の糞便サンプルで非標的メタボローム解析を行った（図4a；補足表S2）。主成分分析（PCA）およびボルケーノプロットにより、PSH群とctrl群で代謝物プロファイルが異なることが示され（図4b、c）、中でもプリン誘導体であるヒポキサンチンとキサンチンは、ctrl群に比べPSH群でMPs長期投与後に最も顕著な減少を示した（図4d）。さらに、リケンテラ科植物の相対的な存在量とヒポキサンチンとの間に正の相関がみられ（図4e）、16s rDNA配列決定データ（図3b-d）や先行研究39,40と一致した。さらに、PSが存在すると、リケネラの上清と骨髄の両方でヒポキサンチンの濃度が低下することが明らかになった（図4f, g）。しかし、PSHマウスにリケネラを投与すると、骨髄中のこの低下は効果的に回復した（図4g）。このことは、ヒポキサンチンが腸内でリケネラの産物である可能性が高いことを示唆している。

図4：ヒポキサンチンの投与は造血幹細胞に対するMPの影響を改善する。
図4
a ctrlマウスとPSHマウス（各群n = 6）の糞便からメタボロームシークエンシングの概略図。 b PCAプロットは、ctrl群とPSH群の代謝物の組成の違いを示した。青い点はPSH群で発現低下、赤い点はPSH群で発現上昇。d 代謝物セットの濃縮解析により、PSH群で最も減少した代謝物が同定された。 e ctrlまたはPSHマウス糞便中のリケネア科植物とヒポキサンチンのピアソン相関プロット（各群n = 6）。f 理研上清中のヒポキサンチン濃度（各群n = 3） g 理研上清中のヒポキサンチン濃度 h ヒポキサンチン代謝物処理の模式図（各群n = 5）。k LT-造血幹細胞のアポトーシス率 l LT-造血幹細胞の細胞周期 m 8日間培養したLT-造血幹細胞のCFU数（各群n = 3）。エラーバーはSDを示す。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

フルサイズ画像
代謝物評価の後、C57BL/6マウスにPS MPを5週間投与した後、低キサンチン添加水を与えた（図4h）。フローサイトメトリーにより、骨髄中の造血幹細胞の頻度と絶対数の両方が、PSHマウスにヒポキサンチンを投与すると回復し（図4i, j）、アポトーシス率の低下と静止状態の増加が抑制されることが明らかになった（図4k, l；補足図S9a-f）。一方、骨髄から造血幹細胞をctrl、PS、HPX-ctrl、HPX-PSの各群に選別し、コロニー形成能を測定した。MPによるコロニー数とサイズの減少は、ヒポキサンチンの投与によって完全に回復した（図4m；補足図S9g）。さらに、マウスのBM細胞を100 pg/mLのヒポキサンチンで3日間処理したところ、造血幹細胞の比率と絶対数の両方が有意に増加し、アポトーシスが減少し、in vitroでのコロニー形成能が亢進することが観察された（補足図S9h-n）。以上のことから、リケンテラまたはヒポキサンチンの投与は、造血幹細胞に対するMPsの悪影響を改善しうることが示唆された。

MPsの長期摂取は造血幹細胞におけるHPRT-Wntシグナル伝達を不活性化する
MPs長期摂取後の造血幹細胞欠損の下流の潜在的メカニズムをさらに解明するために、ctrlマウスとPSHマウスからLT-造血幹細胞を選別し、RNA配列決定（RNA-seq）を行って、トランスクリプトーム変化を同定した（図5a；補足表S3）。注目すべきは、PCAプロットでPSH群とctrl群の間に有意な変動が見られたことである（図5b）。ヒポキサンチンレベルの低下（図4d）と並行して、ヒポキサンチンとグアニンのプリンヌクレオチドへの変換を触媒する酵素であるヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）の発現のわずかな低下が観察された（図5c）。ヒポキサンチンとHPRTが部分的に欠損していることから、プリンサルベージ経路が損なわれていることが示唆された。この経路は、以前から神経疾患や悪性腫瘍、造血幹細胞の機能障害に関係していた41,42。

図5：マイクロプラスチックモデルにおける造血幹細胞の欠損は、Wntシグナル伝達経路の欠損と関連している。
図5
c LT-造血幹細胞におけるHprtの発現。 d PSHマウスでアップレギュレートおよびダウンレギュレートされたシグナル伝達経路のKEGG解析。e Wntシグナル伝達経路の遺伝子の相対発現 f リケネラ科植物投与群またはヒポキサンチン投与群におけるHprtの相対発現（各群n = 3） g リケネラ科植物投与群またはヒポキサンチン投与群における遺伝子の相対mRNA発現。j LT-造血幹細胞の絶対数 k LT-造血幹細胞のアポトーシスレベル l, m 8日間培養したBM細胞のCFUの代表画像（スケールバー、500μm）（l）および統計データ（m）。エラーバーはSDを示し、不対両側t検定。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001。

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Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)解析では、PS処理造血幹細胞で最も濃縮された発現低下経路の1つとして「Wntシグナル伝達経路」が同定された（図5d）。これは、HPRTの欠失がWntシグナル伝達経路を協調的に調節不全にするという先行研究と一致している43。正準Wntカスケードもまた、造血幹細胞の重要な制御因子であることが示されている44。さらに、遺伝子セット濃縮解析（GSEA）により、PSH群のLT-造血幹細胞ではWnt受容体シグナル伝達経路がctrl群と比較して発現低下していることが示唆された（補足図S10a）。実際、Fzd4、Wnt10a、Wnt10bなどのWntシグナル伝達経路関連遺伝子のmRNAレベルは、MPs曝露後に著しく低下した（図5e）。次に、定量的RT-PCRおよび酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）によりWntシグナル関連遺伝子の発現を測定したところ、低下したHprtおよびWnt10aなどのWntシグナル遺伝子の発現は、リケネアまたはヒポキサンチン投与後に有意に回復した（図5f-h）。さらに、BM細胞にヒポキサンチンを添加すると、Wntシグナル伝達経路に関連する遺伝子の発現が、タンパク質レベルでもRNAレベルでも有意に増強された（補足図S9o, p）。造血幹細胞におけるWNT10Aの機能的背景を明らかにするために、コントロールマウスとPS処置マウスの骨髄細胞を培養し、培地中にWNT10Aを添加または無添加した（図5i）。培養3日後、WNT10A処理により、PSH群では造血幹細胞の絶対数が著しく増加し、アポトーシス率が低下し、コロニーが増加することが観察された（図5j-m；補足図S10b-d）。MPsへの長期曝露後、IL-17、TNF、およびNF-κBシグナル伝達経路のダウンレギュレーションが観察されたことから（図5d；補足図S10e）、MPsで処理したマウスの骨髄細胞にIL-17、TNF、またはNF-κBを投与した。にもかかわらず、これらの介入は、造血幹細胞の全体的な細胞数、細胞死、コロニー形成能などの欠乏を是正することができなかった（補足図S10f-i）。これらのデータを総合すると、MP摂取後の造血障害には、IL-17、TNF、NF-κBシグナル伝達経路ではなく、HPRT-Wntカスケードの不活性化が不可欠であることが示唆される。

健康なドナーにおけるマイクロプラスチックへの高曝露は、同種造血幹細胞移植を受けた患者における生着不全と相関する。
MPs、微生物叢、および代謝産物間の関係がヒトにおいても当てはまるかどうかを調べるため、二重盲検臨床試験を実施した。急性骨髄性白血病（AML）、急性リンパ性白血病（ALL）または骨髄異形成症候群（MDS）の患者にCD34+ HSPCを移植した14人の健常ドナーから、糞便と血液サンプルを採取した（図6a；補足表S4）。造血幹細胞移植後の患者の生着状態に基づいて、患者は移植片成功（GS）と移植片失敗または移植片機能不良（GF/PGF）の2群に分類され、患者の生存期間に大きな差が認められた（図6b）。レーザー直接赤外イメージング（LDIR）を実施し、ドナーの糞便サンプルからPS、PMMA、PEのマイクロプラスチックを検出したところ、GSドナーと比較してGF/PGFドナーでは、検出されたすべてのMPの中でマイクロプラスチックの割合が高かった（図6c-f）。さらに、熱分解ガスクロマトグラフィー/マススペクトル分析（Py-GC/MS）を行うことで、ドナーの血液試料からPSとPETを含む複数の種類のMPsを同定し、GS群と比較してGF/PGFドナーの血液中のMPs濃度が高いことを明らかにした（補足図S10j）。

図6：ドナーのマイクロプラスチックと腸内細菌叢は、患者の造血幹細胞移植の転帰と有意に関連している。
図6
a 患者検体を採取し、関連指標を検出する方法のスキーム（移植成功（GS）：7例；移植失敗／移植機能不良（GF／PGF）：7例）： b BM移植後の患者の生存率。 c-e レーザー直接赤外イメージング（LDIR）による糞便中のMPの代表的画像。）写真（左）、定義曲線（右）；PS（c）、PMMA（d）、PE（e）の同定。f 糞便中のMPの相対定量。 g 糞便中の16s rDNAのPCoA。 h 糞便を2群に分けたランダムフォレスト（RF）分析。 i 糞便中のOscillospiraceaeとRikenellaceaeの相対存在量。j 糞便中のヒポキサンチン濃度。 k-m BMT後の生存率とリケネラ科の相対存在量（k）、ヒポキサンチン濃度（l）、または糞便中のMPの割合（m）との相関。ピアソン相関係数（r）と経験的P値も示した。エラーバーはSD、対応のない両側t検定。*p < 0.05、**p < 0.01。

フルサイズ画像
次に、GSおよびGF/PGFドナーの糞便中の細菌16S rDNA遺伝子をプロファイリングした（補足表S5）。PCoAは、GF/PGFとGSドナーのサンプル間でマイクロバイオーム組成が異なることを示した（図6g）。どの腸内細菌叢が重要な役割を果たしているかを解析するために、ランダムフォレスト解析を実行したところ、OscillospiraceaeとRikenellaceaeがドナーの糞便中の最も重要な細菌であることが示された（図6h）。その結果、GF/PGFドナーの糞便中では、RikenellaceaeとOscillospiraceaeの量が著しく減少していた（図6i；補足図S10k）。一方、糞便中のヒポキサンチンレベルもGF/PGFドナーでは減少していた（図6j）。最後に、患者の生存期間とマイクロプラスチック、リケネラ属植物またはヒポキサンチンのレベルとの間のピアソン相関係数を計算したところ、患者の生存期間とリケネラ属植物の存在量（ピアソンのr = 0.67）またはヒポキサンチン（ピアソンのr = 0.7）との間に強い正の相関が観察され、患者の生存期間と糞便中のMPレベル（ピアソンのr = -0.5）との間には負の相関が観察された（図6k-m）。さらに、MP、リケネラ、ヒポキサンチンのレベルは密接に関連していた（補足図S10l-n）。まとめると、マウスで明らかにされたMPs、リケネラ科植物およびヒポキサンチンの間の関連は、造血幹細胞移植のヒトドナーにおいても当てはまり、移植の成功と相関していた。

考察
本研究において、我々は、in vitroおよびin vivoの両方で、造血幹細胞の自己複製に対するMPsへの長期暴露の有害な影響を包括的に証明した。造血幹細胞に対するMPsの影響は、短期間あるいは低濃度のMPs摂取では造血系に障害を与えないことを考えると、時間および用量依存的である。メカニズム的には、MPsは腸内リケネラ-ヒポキサンチン-HPRT-Wntシグナル軸を変化させることにより、造血幹細胞の自己複製能と再構成能を減弱させる（補足図S10o）。我々は、マウスにおけるリケネラ科植物またはヒポキサンチンの投与、および培養系におけるWNT10Aの処理が、MPs誘発の損傷から造血幹細胞を効果的に保護することを明らかにした。さらに、我々は、同種造血幹細胞移植を受けたヒト患者において、その生存期間が造血幹細胞ドナーの糞便中および血液中のリケネラ科植物およびヒポキサンチンの存在量と正の相関を示す一方で、MPsのレベルと負の相関を示すことを検証した。本研究は、造血幹細胞におけるMPsの有害な役割と正確なメカニズムを明らかにするものであり、MPsによる造血障害を予防するための潜在的な戦略を提供し、臨床において造血幹細胞移植に適したドナーを選択するための基本的な判断材料となるかもしれない。

現在までに、さまざまな大きさのMPが、MPが腸内細菌叢の組成を変化させるのと同様の機序で、マウスにおいて複数の臓器に障害を引き起こすことが、数多くの研究で証明されている18,20,21,35,36,37。0.5および50μmのポリスチレンMPを経口曝露すると、肝脂質障害が誘発された37。5μmのポリスチレンMPは腸管バリア機能障害と代謝障害を引き起こした35。10-150μmのポリエチレンMPは、腸に明らかな炎症を引き起こした36。さらに、以前の研究では、ナノプラスチック（NPs）（<100 nm）はバリアを通過して骨髄に入ることができた45。また、ナノプラスチックは骨髄で発見され、造血ホメオスタシスを破壊した20,21。対照的に、我々のデータは、MPs（500 nm）が消化管と末梢血で検出され、腸内細菌叢と代謝産物を破壊することによって造血幹細胞の自己再生を弱めたことを示している。さらに、造血幹細胞と直接共培養した場合、MPsは造血系に悪影響を及ぼさず、マウスの血液に尾静脈注射しても造血系に悪影響を及ぼさないことがわかった。これらの相反する結果は、MPsのサイズが異なることに起因しているのかもしれない。小さなNPsは骨髄に浸透するが、大きなMPsは腸内細菌叢を変化させることによって造血幹細胞にダメージを与える。今後、MPsとNPsの同条件での包括的な比較を研究すべきである。

これまでの研究で、ヒポキサンチンの濃度はリケネラのレベルと正の相関があることが報告されている39,40。その結果、MPsをマウスに経口投与したところ、腸内細菌叢中のリケネラ科植物と血漿中のヒポキサンチンが同時に減少し、MPsで処理したリケネラ科植物がヒポキサンチン濃度を低下させたことから、ヒポキサンチンはリケネラ科植物の産物である可能性が示唆された。さらに、造血幹細胞に対するMPsの作用の下流機構として、HPRTとWntシグナル経路を同定した。実際、以前の研究で、造血幹細胞はHPRTによるプリン体サルベージに依存しており、HPRT活性が低下すると、競合的再増殖能が著しく低下し、細胞周期の進行が変化することが明らかにされている42。しかしながら、造血幹細胞におけるHPRT-Wntの正確な役割については不明である。ここでは、初期の神経発達過程や神経変性疾患において、HPRT欠損や低酸素異常がWnt/β-カテニンシグナル伝達経路の異常を伴っていることから、低酸素-HPRT-Wntシグナル伝達経路が造血幹細胞において重要な役割を果たしているという新たな視点を提示する43,46。一方、幹細胞の自己再生を制御する上で、Wntカスケードが最も重要な制御因子の一つであることが、現在明らかになっている44,47,48。これらの結果は、MPsに長期間さらされると、腸内のリケネラとヒポキサンチンの含量が減少し、ヒポキサンチンが末梢血中を循環してHPRTとWntシグナル伝達を不活性化し、最終的に骨髄における造血幹細胞の自己複製能と再構成能を減弱させるという我々の仮説を補強するものである。われわれの研究は、環境汚染物質が造血系にどのような影響を与えるかについて、腸-骨髄軸が新たな制御経路であることを明らかにしている。

MPsやNPに起因する細菌種やその代謝産物の変化は、マウスにおける造血系の障害と関連することが知られている20,21が、ヒトのマイクロバイオームや代謝産物におけるMPsの役割や、それらがヒトの造血系に影響を及ぼすかどうかについては、十分な前向き臨床データが不足している。造血幹細胞移植患者のドナーが摂取するMPsの含有量もまた、移植の結果に影響を及ぼすことに我々は注目している。より多くのMPsを摂取すると、マウスモデルで見られたように、リケネラとヒポキサンチンのレベルが低下し、その結果、造血幹細胞の機能異常が生じ、ヒトでの移植成功率が悪化する。本研究では、ヒトとマウスにおけるMPs誘発造血幹細胞障害の保存性を強調し、環境汚染物質が造血系にどのような影響を及ぼすかについて、腸-骨髄軸が新たな調節経路であることを証明するとともに、腸内細菌叢と代謝産物が造血幹細胞移植患者のドナーの臨床的選択基準として使用される可能性があることを示している。

方法
マウス
C57BL/6J (CD45.2)およびC57BL6.SJL (CD45.1)マウスをジャクソン研究所から購入し、特定の病原体フリー条件下で飼育した。8～12週齢の雌雄マウスを実験に使用し、適切な環境と十分な水と餌を与えた。1週間の馴化後、各マウスを無作為に群に分け、経口投与実験では、100μLの純水、0.01mg/100μL、または0.1mg/100μLのMPを2日おきに5週間経口投与した（各群n = 5）。静脈注射実験では、MPsを尾静脈からマウスの血液中に0.1 µg/100 µLの割合で1週間ごとに4週間投与した（各群n = 5）。すべての動物実験は、まず浙江大学実験動物福祉倫理委員会（AP CODE: ZJU20220108）の承認を得た。

マイクロプラスチックの特性評価
インドシアニングリーン・ポリスチレン（ICG-PS）、ポリスチレン（PS）およびポリメチルメタクリレート（PMMA）粒子は、Suzhou Mylife Advanced Material Technology Company（中国）から入手した。ポリエチレン（PE）粒子はCospheric社（米国）から購入した。走査型電子顕微鏡（SEM、Nova Nano 450、FEI）を使用して、さまざまなMP20の一次サイズと形状を評価した。MPは、動的光散乱分析（Zetasizer, Malvern, UK）の前に超音波処理で超純水に分散させ、流体力学的サイズとゼータ電位を決定した49。

生体外臓器のイメージング
マウスを犠牲にし、心臓、肺、腎臓、脾臓、肝臓、消化管組織、骨髄など、ICG-PS投与後6時間以内に臓器を摘出した。マウスを犠牲にする1時間前に糞便を採取した。小動物用イメージングシステム50（IVIS Spectrum、PerkinElmer社製）を用いて、臓器と糞便の両方を生体外バイオルミネッセンスイメージングでモニターした。

フローサイトメトリーと細胞選別
フローサイトメトリー解析と造血幹細胞・前駆細胞の分離のために、細胞を2％ウシ胎児血清入りPBS中、氷上で30～45分間、関連抗体51で染色した。使用した抗体クローン Sca-1-PE-Cy7、c-Kit-APC、CD150-PE、CD48-BV421、CD45.1-FITC、CD45.2 PE-Cy5、Gr-1-PE-Cy5、Mac1-PE-Cy5、IgM-PE-Cy5、CD3-PE-Cy5、CD4-PE-Cy5、CD8-PE-Cy5、CD45R-PE-Cy5、Ter-119-PE-Cy5。抗体の詳細情報は補足表S6にまとめた。HSPCは系統抗体カクテル（Gr-1、Mac1、CD3、CD4、CD8、CD45R、TER119、B220）、Sca-1、c-Kit、CD150、CD48で染色した。細胞タイプは以下のように定義された： LSKコンパートメント（Lin-Sca-1+c-Kit+）、LT-造血幹細胞（LSK CD150+CD48-）、ST-造血幹細胞（LSK CD150-CD48-）、MPP2（LSK CD150+CD48+）、MPP3/4（LSK CD150-CD48+）。B細胞（CD45.2+Mac1-Gr-1+B220+）、T細胞（CD45.2+Mac1-Gr-1+CD3+）、骨髄系細胞（CD45.2+Mac1+Gr-1-）。サンプルはフローサイトメーター（CytoFLEX LX, Beckman）で分析した。造血幹細胞をソーティングするために、系統抗体カクテル結合常磁性マイクロビーズとMACS分離カラム（Miltenyi Biotec）を用い、ソーティング前にLin-細胞を濃縮した。染色した細胞は、2％FBSを含むPBSに再懸濁し、Beckman moflo Astrios EQ（Beckman社製）を用いて直接ソーティングした。フローサイトメトリーデータはFlowJo（BD）ソフトウェアで解析した。

アポトーシスおよび細胞周期アッセイ
細胞のアポトーシスは、アネキシンV染色（Yeason, China）によって検出した。マウスの骨髄から抽出した後、5×106個の細胞を異なる表面マーカーで4℃で30～45分間標識し、PBSで2回洗浄した。その後、細胞を結合バッファーで再構成し、アネキシンVを添加した。30分間のインキュベーション後、フローサイトメトリーでFITCチャンネルで検出した。細胞周期分析は、フルオレセインKi-67セット（BD Pharmingen, USA）を用い、製造元の指示に従って行った。簡単に説明すると、合計5×106個の骨髄細胞を、前述のように対応する抗体で標識した。その後、細胞を固定/透過濃縮液（Invitrogen, USA）で4℃で一晩前処理し、その後結合バッファーで洗浄した。細胞をKi-67抗体で暗所で1時間染色し、さらにDAPI（Invitrogen）で室温で5分間染色した。フローサイトメトリーデータは、フローサイトメーター（CytoFLEX LX, Beckman, USA）で収集した。

in vitroコロニー形成単位（CFU）アッセイ
造血幹細胞を実験群（ctrlマウス、PSHマウス、リケネア科植物投与群、ヒポキサンチン投与群）に従ってフローサイトメトリーで選別した。150個の造血幹細胞をメチルセルロース培地52（M3434、Stemcell Technologies, Inc.）に3連で播種した。8日後、顕微鏡でコロニー数を数えた。さらに、5000個のBM細胞を播種し、造血幹細胞と同様に解析した。細胞培養液をPBSで希釈し、400×g、5分間の遠心分離を行い、全細胞数を測定した。

競合的移植アッセイ
レシピエントマウス（CD45.1）には、移植前7日間と移植後10日間、Baytril（250mg/L）を添加した飲料水を投与した。移植前日、レシピエントは致死量の放射線（1回4.5Gy、4時間の間隔をおいて2回に分割）を受けた。一次移植では、ctrlまたはPS群（CD45.2）マウスの骨髄細胞2×105個とレシピエント型（CD45.1）マウス骨髄細胞2×105個をレシピエントマウス（CD45.1）マウスに移植した。細胞は尾静脈注射によりレシピエントに注入された。移植後少なくとも16週間、4週間ごとに末梢血細胞を用いてドナーのキメラ性を追跡した。二次移植では、移植後16週目に犠牲となった一次移植レシピエントからドナーBM細胞を採取し、照射した二次レシピエントマウス（9Gy）に2×106細胞の投与量で移植した。二次移植におけるドナーキメリズムの解析および移植周期は一次移植と同様であった。

限界希釈アッセイ
限界希釈アッセイ52では、ctrlマウスまたはPSマウス（CD45.2）から1×104、5×104、2×105のドナー由来骨髄細胞を採取し、照射（9Gy）したCD45.1レシピエントマウスに2×105のレシピエント型（CD45.1）骨髄細胞を移植した。限界希釈解析はELDAソフトウェア53を用いて行った。移植16週後、1％以上の末梢血多系統キメラを持つレシピエントマウスを生着陽性と定義した。一方、移植後16週までに死亡したレシピエントマウスも同様に生着失敗と評価した54。

小腸の組織学的分析とTEM
組織学的解析のため、小腸を採取し、4％パラホルムアルデヒドで固定後、パラフィンに包埋し、ZJU Animal Histopathology Core Facility（中国）で切片化（厚さ5μm）し、H&E染色した。Chiuのスコア33,34を用いて各サンプルの損傷を評価した。グレードは以下の通りである： 0：正常粘膜；1：絨毛の先端に上皮下Gruenhagen's spaceの発生；2：Gruenhagen's areaの拡張と中程度の上皮の浮き上がり；3：大きな上皮の膨隆と数本の剥離した絨毛；4：剥離した絨毛とlamina propriaおよび露出した毛細血管；および5：lamina propriaの崩壊、潰瘍化および出血。TEM解析のために、小腸のスライスを2.5％グルタルアルデヒドで固定し、腸上皮細胞の超微細構造観察を行った。1%四酸化オスミウムで4℃、1時間、2%酢酸ウラニルで30分間後固定し、段階的なアルコール溶液（50%、70%、90%、100%で各15分間）とアセトン（100%を2回、20分間）で脱水した。その後、エポン（Sigma-Aldrich, MO, US）で包埋し、重合した。超薄切片（60-80 nm）を作製し、TEM（Tecnai G2 Spirit 120 kV, Thermo FEI）で観察した。

腸管透過性アッセイ
MP摂取の短期および長期モデルマウスでは、FITC-デキストラン（4 kD、Sigma）を経口投与する前に、マウスを4時間絶食させた。FITC-デキストラン（50mg/100g体重）を2時間経口投与後、末梢血中の蛍光強度を測定した。蛍光はマイクロプレートリーダー（Molecular Devices, SpectraMax iD5）を用い、励起波長490 nm、発光波長520 nm29で測定した。

糞便16S rDNA配列決定
ctrlマウス、PSLマウス、PSHマウスから糞便サンプル（1サンプルあたり約30～50mg）を採取し、液体窒素で急速凍結し、-80℃で保存した。微生物群集用のDNAサンプルは、E.Z.N.A.® Stool DNA Kit (Omega, USA)を用い、製造者の指示に従って抽出した。すなわち、フォワード・プライマー341 F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）とリバース・プライマー805 R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）55を用いて、原核生物16S rDNA遺伝子V3-V4領域のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅を行った。PCRを35サイクル行った後、増幅を促進するためにシークエンシングアダプターとバーコードを入れた。PCR産物は1.5%アガロースゲル電気泳動で検出し、さらにAMPure XTビーズ（Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA, USA）を用いて精製し、標的断片はAxyPrep PCR Cleanup Kit（Axygen,USA）を用いて回収した。さらに、Library Quantification Kit for Illumina（Kapa Biosciences, Woburn, MA, USA）を用いてアンプリコンライブラリーを定量し、Illumina NovaSeq PE250プラットフォームで塩基配列を決定した。バイオインフォマティクスパイプライン29,56において、ペアエンドリードのサンプルへの割り当ては、固有のバーコードによって決定され、その後バーコードとプライマー配列を切断することによって短縮された。ペアエンドリードはFLASH (v1.2.8)で結合された。fqtrim (v0.94)に従って、高品質のクリーンタグを得るために、正確なパラメーターのもとで生リードの品質フィルタリングを行った。キメラ配列はVsearch software (v2.3.4)でフィルターした。DADA2を用いた脱複製処理後、フィーチャーテーブルとフィーチャー配列を取得した。得られた細菌配列断片をOTUに分類し、QIIME2を用いてGreengenes微生物遺伝子データベースと比較した。アルファ多様性とベータ多様性はQIIME2によって生成され、画像はR (v3.2.0)によって描画された。種のアノテーション配列アラインメントは、SILVAとNT-16Sデータベースをアラインメント参照としてBlastで行った。その他の配列決定結果は補足表S1に示す。この実験はLc-Bio Technologiesの支援を受けた。

造血幹細胞移植ドナーの糞便の解析方法は、マウスの場合と若干異なる。すべてのサンプルはGUHE Flora Storage buffer（GUHE Laboratories, China）で保存した。細菌ゲノムDNAはGHFDE100 DNA単離キット（GUHE Laboratories, China）を用いて抽出し、NanoDrop ND-1000 spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific, USA）を用いて定量した。細菌16S rDNA遺伝子のV4領域は、フォワードプライマー515 F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）およびリバースプライマー806 R（5'-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3'）を用いたPCRによって増幅した。PCRアンプリコンをAgencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter, IN)で精製し、PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, USA)で定量した。既報の手順57に従い、ペアエンド2×150bpシーケンスをIllumina NovaSeq6000プラットフォームで行った。細菌OTUの詳細は補足表S5にまとめた。配列データ解析はQIIME2とRパッケージ（v3.2.0）を用いて行った。

メタボローム解析
代謝物評価のため、マウスの糞便からサンプルを調製し、既述の方法で検出した55,58,59。簡単に説明すると、LC-MS分析の前に、あらかじめ冷却した50%メタノール緩衝液を通して糞便から代謝物を抽出し、-80℃で保存した。すべてのクロマトグラフィー分離は、超高性能液体クロマトグラフィー（UPLC）システム（SCIEX、英国）を用いて行った。逆相分離はACQUITY UPLC T3カラム（100 mm * 2.1 mm, 1.8 µm、Waters, UK）を用いて行った。カラムオーブン温度は35℃に維持され、流速は0.4 mL/minであった。TripleTOF 5600 Plus高分解能タンデム質量分析計(SCIEX, UK)を用いて、ポジティブイオンモード(イオンスプレー電圧のフローティングを5000 Vに設定)とネガティブイオンモード(-4500 V)の両方を分析した。質量分析データは、Interactive Disassembler Professional (IDA) モードで、飛行時間 (TOF) 質量範囲は60～1200 Daでした。サーベイスキャンは150ミリ秒で取得し、プロダクトイオンスキャンは電荷状態1+、100カウント/秒（counts/s）で12まで記録した。質量精度は20サンプルごとに校正され、QCサンプルは10サンプルごとに取得された。LCMSの生データファイルはXCMS（Scripps, La Jolla, CA）で処理され、ピークピッキング、ピークアライメント、ギャップ充填、サンプル正規化が行われた。オンライン KEGG を使用して、サンプルの正確な分子量データ (m/z) とデータベースのデータとのマッチングを行い、代謝物のアノテーションを行った。PCAとボルケーノプロットは、グループ間で有意差を示すイオン特性を特定するために利用されました。メタボロームの詳細は、補足表S2に記載されている。この実験は Lc-Bio Technologies 社の支援を受けた。

糞便微生物叢移植
FMTの前に、SPFマウスに200μLの抗生物質（1g/Lアンピシリン、0.5g/Lネオマイシン、0.5g/Lバンコマイシン、1g/Lメトロニダゾール）を3日間連続で経口投与した。ctrlマウスまたはPSマウスから新鮮な糞便を採取し、還元PBS（PBS中0.5g/Lシステインおよび0.2g/L Na2S）に約120mg糞便/mL還元PBSの割合で懸濁した。その後、糞便を500×gで1分間遠心分離し、不溶化粒子を除去した25。レシピエント（C57BL/6 Jマウス）には、毎週2回、異なる群の上清100mLを4週間経口投与した。最後のFMTの2日後にレシピエントを安楽死させ、造血系の変化を解析した。

リケネラ・ヒポキサンチン処理
ATCCから購入したリケネリア菌株（ATCC BAA-1961）を、BD Difco™ Dehydrated Culture Mediaを用いて嫌気チャンバーで培養した：強化クロストリジウム培地（Reinforced Clostridial Medium）を用い、温度37℃、混合ガス80% N2、20% CO2で培養した。リケネラの最終濃度は100μLあたり2×108c.f.u.で、ヒポキサンチン（200mg/kg、シグマ社、ドイツ）を二重蒸留水に溶解した29。マウスはまず抗生物質投与（FMTと同じ）を受け、その後、リケネラ科植物またはヒポキサンチン懸濁液100μLを週3回、4週間経口投与した。強化クロストリジウム培地または二重蒸留水をそれぞれビヒクルコントロールとして用いた。最後の投与から2日後、レシピエントは造血系の変化を分析するために安楽死させられた。造血幹細胞に対するヒポキサンチンの影響を調べるため、骨髄細胞を100 pg/mLの濃度のヒポキサンチンと3日間直接共培養した。

細胞培養
マウスの骨髄細胞は、2%ウシ胎児血清（GIBCO）を加えたリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でマウスの脛骨と大腿骨を洗浄して採取した。採取した細胞は、SCF（50ng/mL；PeproTech社製）とTPO（50ng/mL；PeproTech社製）を添加した新鮮な造血幹細胞培養培地（StemSpanTM SFEM；Stemcell Tec社製）を入れた96ウェルU底プレートに、37℃、5％CO2で培養した。造血幹細胞の培養では、培地は3日ごとに交換し、調整培地の半分を手作業で取り除き、新鮮な培地と交換した60。造血に対するWNT10A、IL-17、TNFおよびNF-κBの影響を評価するため、造血幹細胞を基本培地で培養し、関連タンパク質（10ng/mL；Cosmo Bio社、米国）またはコントロールとしてPBSを2日間補充し、その後フローサイトメトリー解析を行った。異なる濃度のPSを培地に添加し、培養造血幹細胞に対するMPの影響を検出するために、CCK-8とFACSを用いて試験した。

RNA-seq法
ctrl群またはPSH群のマウス骨髄細胞から、フローサイトメトリーソーティングにより1×104個の造血幹細胞を3連で取得し、RNAをRNAiso Plus（日本、タカラ）を用いてメーカーのプロトコールに従って抽出した。RNAの濃度と完全性は、それぞれQubit 2.0とAgilent 2100（Novogene、中国）で調べた。真核生物の mRNA を濃縮するために、オリゴ (dT) コート磁気ビーズ (Novogene, China) を用いた。cDNA合成とPCR増幅後、PCR産物をAMPure XPビーズ（Novogene、中国）を用いて精製し、最終ライブラリーを得た。シーケンシングには、イルミナのハイスループットシーケンスプラットフォームNovaSeq 6000を用いた。遺伝子発現の解析は、RまたはDESeq2パッケージ61を用いて計算した。RNA-seqに関する詳細情報を補足表S3に示す。

qPCRによる遺伝子発現の定量
RNA発現解析のために、骨髄細胞からTrizol（Invitrogen、米国）を用いて全RNAを抽出し、無核水に懸濁した。QuantiTect逆転写キット（Qiagen NV）を用いて逆転写を行い、ABI 7500 Q-PCRシステム62を用いて20μLのcDNA、プライマー、SYBR-green（Takara、日本）を用いてqPCRを行った。結果はRQ値（RQ = 2-ΔΔCt）を用いて算出した。マウスアクチンを正規化コントロールとして選択した。遺伝子特異的プライマー配列を補足表S7に示す。

ELISA法
各群の骨髄およびリケネラ上清を遠心分離により得た。糞便上清はヒト試料から得た。ヒポキサンチン（LANSO、中国）およびWNT10A（EIAab、中国）は、製造業者のプロトコールに従って、それぞれのキットを用いたELISAにより測定した。

臨床患者サンプル
造血幹細胞移植患者に移植片を提供した 14 名の被験者からヒト糞便および末梢血検体を得た。移植片成功群と移植片失敗（GS）/移植片機能不良（GF/PGF）群に分け、各群7名とした。ヒトを対象とした研究は、浙江大学医学部第一付属病院臨床研究倫理委員会（IIT20230067B）により承認された。参加者全員がインフォームド・コンセントを読み、署名した。患者の詳細情報は補足表S4に記載した。

LDIR
Agilent 8700 Laser Direct Infrared Imagingシステムを、ドナーから受け取った糞便中のMPsの高速自動分析に使用した。過度の硝酸濃度（68%）をサンプルに加え、加熱してタンパク質を溶解した。大きな粒子はまず大口径フィルターで遮断し、次に真空抽出でろ過した。超純水とエタノールで数回洗浄した後、MPを含む物質をエタノール溶液に分散させた。LDIR試験は、エタノールが完全に揮発した時点で実施した63。MPs試料を標準試料ステージに設置した。その後、ステージをサンプルステージに入れ、Agilent Clarity を起動してサンプルステージをサンプルチャンバーに進めた。ソフトウェアは、1800 cm-1 の一定波数を使用して選択した試験領域を高速スキャンし、選択した領域内の粒子を正確に検出し、ピンポイントで特定しました。粒子のない領域は自動的にバックグラウンドとして指定された。バックグラウンドのスペクトルが収集され、再調整された後、検出された粒子が可視化され、赤外スペクトル全体が収集された。粒子スペクトルを得た後、スペクトルライブラリを利用して、各粒子の包含画像、サイズ、面積などの定性分析を自動的に行った。本試験は、上海偉普試験技術グループの支援を受けた。

Py-GC/MS
ドナーの末梢血中のMPをPy-GC/MSで検査した。試料に硝酸を加えて110℃で1～2時間消化し、脱イオン水を用いて溶液を弱酸性にした。濃縮後、溶液をPy-GCMSの試料採取用ルツボに滴下し、ルツボ内の溶媒が完全に揮発した時点で試験を行った17。定量曲線を作成するために、MPの各種標準物質を調製し、Py-GCMSを用いて分析した。溶出には PY-3030D Frontier を使用し、溶出温度は 550 ℃に設定した。クロマトグラフィーカラムの寸法は、長さ30m、内径0.25mm、膜厚0.25μmであった。サンプルは40℃で2分間の熱保存を行い、その後320℃に達するまで毎分約20℃の速度で徐々に昇温した。試料はこの温度で14分間維持され、全プロセスは合計30分間かかった。キャリアガスはヘリウムを使用し、イオン源の温度は230℃であった。スプリット比は5:1で、m/zスキャン範囲は40～60064。この実験は、上海偉普試験技術グループの支援を受けた。

統計分析
各動物実験は少なくとも5～6反復で、各in vitro実験は少なくとも3反復で行われた。具体的な再現性の詳細は、関連する図のキャプションに記載されている。統計学的有意性は、P値が0.05未満の場合、GraphPad Prismによる対応のない両側t検定で確認した。すべての図のエラーバーは標準偏差（SD）を示す。

データの利用可能性
全てのシーケンスデータはNational Genomics Data Center, https://ngdc.cncb.ac.cn/。この研究で作成されたマウスのデータセットは、Genome Sequence Archive (GSA： CRA010086, 共有URL: https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/s/n308TgY6; GSA： CRA010069, 共有URL: https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/s/Z3XJaqeA）およびOpen Archive for Miscellaneous Data (OMIX003159, 共有URL: https://ngdc.cncb.ac.cn/omix/preview/nrD7b5Mw)に寄託されている。ヒトの腸内細菌叢のシーケンスデータは、GSA for human databaseのアクセッション番号HRA004119（共有URL: https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/s/5SMsyfid）でアクセスできる。

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参考文献のダウンロード

謝辞
本研究は、中国国家重点研究開発計画（2022YFA1103500）、中国国家自然科学基金（82222003、92268117、82370105、82000149、82161138028）、中国浙江省自然科学基金（Z24H080001、LQ21H180006）、中国博士研究基金（CPSF）（2021M702853）の助成を受けた。浙江大学医学部中核施設のChun GuoとJiajia Wangに技術的支援を感謝する。浙江大学低温電子顕微鏡センター（CCEM）のChenyu YangとDandan Songには、透過型電子顕微鏡と走査型電子顕微鏡の技術協力をいただいた。原稿中の模式図はBioRenderで作成した。

著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Lingli Jiang, Yishan Ye, Yingli Han, Qiwei Wang.

著者および所属
浙江大学医学部第一附属病院幹細胞・再生医療センターおよび骨髄移植センター（中国浙江省杭州市

姜玲麗、韓英利、王啓偉、盧煥、李錦欣、銭文昌、曾欣、張肇蔚、銭鵬旭

中国浙江省杭州市、浙江大学涼珠研究室

姜玲麗、葉怡山、韓英利、王啓偉、盧煥、李錦欣、銭文昌、曽新、張昭茹、趙燕民、史慈敏、羅毅、邱雲飛、孫淳、盛景浩、黄和、銭鵬旭

浙江大学血液学研究所・浙江幹細胞免疫治療工学実験室（中国浙江省杭州市

姜玲麗、葉怡山、韓英利、王啓偉、盧煥、李錦欣、銭文昌、曾欣、張肇、趙燕民、史慈敏、羅毅、邱雲飛、黄和、銭鵬旭

中国浙江省杭州市、浙江大学医学部第一付属病院骨髄移植センター

Yishan Ye、Yanmin Zhao、Jimin Shi、Yi Luo、Yunfei Qiu & He Huang

貢献
L.J.は実験計画、データ解析、原稿執筆を行った。Y.Y.は臨床サンプルの収集と分析を行った。H.L.はトランスクリプトームデータの解析と解釈を行った。Y.H.、Q.W.、J.L.、W.Q.、X.Z.、Z.Z.はin vitroおよびin vivo実験をサポートした。Y.Z.、Jimin S.、Y.L.、Y.Q.およびH.H.は臨床サンプル収集に協力した。J.S.とJinghao S.は細菌培養に協力した。P.Q.はプロジェクト全体を監督し、原稿を共同執筆した。最終原稿は著者全員が読み、承認した。

連絡先
He HuangまたはPengxu Qianまで。

倫理申告
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。

追加情報
出版社注：シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

補足情報
補足表S1. ctrl群、PSL群、PSH群で比較した細菌OTU分類群リスト。
補足表S2：ctrl群とPSH群で比較した代謝物分類群の発現差。
41421_2024_665_MOESM3_ESM.xlsx
補足表S3：ハイスループットRNA-seqにより、ctrlおよびMPs投与マウスから選別されたLT-造血幹細胞における全転写産物のFPKMが明らかになった。

補足表S4. 我々のコホートにおける造血幹細胞移植ドナーおよびレシピエントの臨床的特徴および情報。
補足表S5. GS群とGF/PGF群で比較した細菌OTU分類群リスト。
補足表S6. 本研究で使用した抗体のリスト。
補足表S7. 本研究で使用したqPCR解析用プライマーセット。
補足図S1 マイクロプラスチックの物理的特性。
補足図S2 マイクロプラスチックの生体内分布
補足図S3 マイクロプラスチックの短期摂取は造血系にほとんど影響を与えない。
41421_2024_665_MOESM11_ESM.pdf
補足図S4 長期摂取モデルの代表的フローサイトメトリー画像とBM細胞の移植再建の解析。

補足図S5 PMMAまたはPEの長期摂取は造血系にもダメージを与える。
補足図S6 マイクロプラスチックはin vitro培養中のLT-造血幹細胞に毒性を示さない。
補足図S7 FMT後のRecip-PS群では造血幹細胞および前駆細胞が損傷している。
補足図S8 マイクロプラスチック投与マウスでは、リケネラの投与により造血幹細胞の機能が回復した。
補足図S9 ヒポキサンチン投与はPSHマウスにおけるHSPCの損傷を部分的に緩和した。
41421_2024_665_MOESM17_ESM.pdf
補足図S10 Wntシグナル経路は造血幹細胞の機能回復に有益であり、マイクロプラスチックは造血幹細胞移植において有害な役割を果たす。

権利と許可
オープンアクセス本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを付与し、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合を示す限り、いかなる媒体または形式においても、使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものである。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表記に別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。

転載と許可

この記事について
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この記事を引用する
Jiang, L., Ye, Y., Han, Y. et al. マイクロプラスチックは、腸内細菌-ヒポキサンチン-Wnt軸を破壊することにより、造血幹細胞の自己再生を抑制する。Cell Discov 10, 35 (2024). https://doi.org/10.1038/s41421-024-00665-0

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受領
2023年7月28日

受理
2024年3月01日

発行
2024年3月29日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41421-024-00665-0

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細胞生物学
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メタボロミクス
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