グラム陽性腸内共生細菌Bifidobacterium longumの細胞外小胞は免疫調節作用と抗炎症作用を誘導する

2023年6月9日 10:22

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公開日：2023年6月3日
グラム陽性腸内共生細菌Bifidobacterium longumの細胞外小胞は免疫調節作用と抗炎症作用を誘導する

https://www.nature.com/articles/s41522-023-00400-9

ノア・マンデルバウム
リハン・ジャン（Lihan Zhang）、
...
ナーマ・ゲバ・ザトルスキー
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バイオフィルムとマイクロバイオーム9巻、記事番号：30（2023）この記事を引用する
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メトリクス詳細
要旨
腸内細菌叢が宿主の免疫系に影響を与えることは、現在よく知られている。細菌と宿主細胞とのコミュニケーションの1つの方法は、様々な荷物を含む小さな膜構造物であるベシクルの分泌である。グラム陽性腸内細菌が分泌する小胞に関する研究、宿主との相互作用のメカニズム、免疫調節作用に関する研究はまだ比較的少ない。ここでは、新たに塩基配列を決定したグラム陽性ヒト腸内共生菌Bifidobacterium longum AO44株が分泌する細胞外小胞（EV）のサイズ、タンパク質含有量、および免疫調節効果を明らかにした。その結果、B. longumのEVは、脾臓細胞および樹状細胞（DC）-CD4+T細胞共培養の両方からIL-10分泌を誘導し、抗炎症作用を発揮することがわかった。さらに、EVのタンパク質は、ABCトランスポーター、クオラムセンシングタンパク質、細胞外溶質結合タンパク質に富んでおり、これらはB. longumの他の菌株の抗炎症作用に顕著な機能を持つことがこれまでに示されていた。本研究は、腸内細菌の宿主に対する免疫調節作用を促進する細菌小胞の重要性を強調し、将来の治療薬としての細菌小胞に光を当てている。
はじめに
過去20年間、多くの研究により、腸内細菌叢がヒトの生理機能に大きな影響を及ぼすことが実証されました1,2,3。この研究では、主に免疫系の成熟と調節に関連するさまざまな有益な機能が明らかにされています3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14。免疫調節細菌は、私たちや他の研究者によって長い間同定されてきましたが15,16,17,18、しかし、細菌由来の免疫調節分子の特徴はわずかです19,20,21。細菌と宿主の両方の細胞と相互作用できる存在として、細菌ベシクルが注目されている22。小胞は、グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方から分泌される膜構造物である。小胞の大きさは20-300 nmで、タンパク質（膜性および細胞質性の両方）、ペプチドグリカン、核酸、毒素、さらにリポポリサッカライド（グラム陰性菌ではLPS）など、さまざまなカーゴを運ぶ。小胞は、細菌および宿主細胞と相互作用し、その貨物を内在化および放出する。このような相互作用により、小胞は隣接する細菌や宿主の免疫細胞へ長距離の分子伝達を行うのに適している。そのため、細菌の小胞は治療薬として利用できる可能性がある23。グラム陰性菌が産生する小胞は60年代から研究されていたが24、グラム陽性菌が細胞外小胞（EV）を産生することは、その30年後に証明された25。90年代に発見されたものの、過去10年間にグラム陽性菌の小胞形成と免疫調節作用への関心が高まり26,27, それでも、その多くは黄色ブドウ球菌28、結核菌29、炭疽菌30,31などの病原性細菌に焦点が当てられていた。いくつかの研究では、グラム陰性菌とは異なり、代謝活性の高いグラム陽性菌のみがEVを分泌することが示されました32,33。しかし、最近の研究では、「バブリング細胞死」の過程でもEVが分泌されることが示唆されています34。現在までのところ、小水疱形成の遺伝的制御に関わる因子や、EVの放出を可能にする細菌の膜状態についての理解は限られている26,35。グラム陽性腸内細菌のうち、ビフィドバクテリウム属は、ヒトミルクのオリゴ糖を分解することが知られており、母乳栄養児の消化管36や成人の腸内37に非常に多く存在することから注目されている。さらに、ビフィドバクテリウム属の種は、自然免疫系と適応免疫系の両方に影響を与え、そのほとんどが抗炎症作用であることが判明しており16,38、現在までにいくつかのエフェクター分子が特徴づけられている39,40。ビフィドバクテリウム・ビフィダム・ピリ40やビフィドバクテリウム・ブレーベのエクソポリサッカライド39など、いくつかの細胞外分子が抗炎症作用を誘導することが示されたが、これらの分子が宿主と作用するメカニズムは十分に理解されていない。ビフィドバクテリウム属の重要なメンバーとして、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）がいる。この種は、ビフィドバクテリウム属の中でも、ヒトの腸内に非常に多く存在する41。B. longumは、in vitroの細胞株42、in vivoのマウスモデル43、そして最も重要なこととして、炎症性腸疾患（IBD）44の臨床試験において、抗炎症作用を有することが判明した。これらの抗炎症作用は、酸化ストレスを軽減し、炎症性サイトカインの分泌を抑制し、腸内の短鎖脂肪酸（SCFA）含量を増加させる能力に起因していることがほとんどである45。しかし、EVと宿主との相互作用や治療効果の基盤となる分子メカニズムはまだ解明されていない。いくつかの研究により、ビフィズス菌が分泌するEVは抗炎症作用があり、アレルギー治療のアジュバントとして使用できる可能性があることが強調されている46,47. 例えば、ビフィズス菌の小胞は樹状細胞（DC）と相互作用し、制御性T細胞（T-regs）の分化を引き起こすことが判明した47。興味深いことに、最近の研究では、マスト細胞のアポトーシス誘導を通じて食物アレルギーを緩和するB. longum小胞の可能性が強調されている46。グラム陰性およびグラム陽性腸内共生生物の小胞の免疫調節効果に関する研究が出始めているが26、これらの効果の基礎となる分子やメカニズムを発見したものはごくわずかである。さらに、同じ種の複数の菌株からのEVは、異なるメカニズムで異なる免疫調節効果を誘導することが示され、ヒトの腸内に存在する何千もの細菌株から得られる小胞の大きな可能性を強調している48。ここでは、新たに配列決定され、アノテーションされたBifidobacterium longum AO44株が産生する腸内細菌ベシクルの免疫調節作用を実証した。この結果は、細菌性ベシクルの治療効果に関する今後の研究に新たな道を開くものである。
研究成果
B. longum AO44株クロロホルム画分は、他の画分と比較して脾臓細胞によるインターロイキン10（IL-10）分泌量を増加させる
B. longum AO44株のDNAを抽出し、全ゲノム配列を決定してGenBankに寄託した（アクセッション番号PRJNA908295）。どの細菌体が抗炎症性免疫応答（すなわちIL-10分泌）を刺激するかを決定するために、メタノール／クロロホルム（MeOH／CHCl3）抽出を用いて化学分画を実施した。岐阜嫌気培地（GAM）またはBrain Heart Infusion supplemented（BHIS）で培養したB. longum AO44の菌体および調整培地を採取し、疎水性／親水性画分を抽出した（図1a、b）。特定の病原体を持たない（SPF）マウス脾細胞を用いて、各化学画分の免疫調節作用を評価した。脾臓細胞は抗CD3で活性化し、各菌体画分を添加した。抗CD3で活性化したSPFマウス脾臓細胞は、脾臓に見られる免疫細胞集団全体に対する細菌体の効果を研究することを可能にする。GAMとBHISの両方で増殖した細菌のCHCl3画分は、他の画分と比較して、脾臓細胞によるIL-10分泌が最も高かった。コントロール（抗CD3で活性化した脾臓細胞）からの倍率変化を示した（図1c、d）。濃縮（10倍）されたコンディショニングメディアの画分（すなわち、コンディショニングメディア）の免疫調節効果は、CHCl3画分と同様であり、両方の画分に存在する細菌実体が、活性な免疫調節成分を含むことが示された。
図1：B. longum AO44クロロホルム画分は脾臓細胞インターロイキン10（IL-10）分泌を誘導する。
a バクテリアの増殖と細胞・上清の分離の図 b バクテリアの調整培地と細胞の化学分画の図 c BHIS培地で増殖したB. longumから生成した化学分画のいずれかに曝露した脾臓細胞におけるIL-10濃度のFold変化（対照と比較） d GAM培地で増殖したB. longumから生成した化学分画のいずれかに曝露した脾臓細胞におけるIL-10濃度のFold変化（対照と比較）. 各ドットは、3回の独立した実験のうち、技術的な繰り返しを表す。Brown-Forsythe and Welch ANOVA, *P < 0.05 and **P < 0.01. エラーバーはs.d.を表す。 CHCl3画分＝疎水性有機画分、MeOH画分＝親水性有機画分、H2O画分＝親水性極性画分、SupX10＝濃縮条件付培地。図1a, bはBioRender.comで作成しました。
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B. longum AO44のEVの分離と特性評価
CHCl3の化学的特徴から、この画分には細菌細胞膜のような疎水性分子が多く含まれています。CHCl3画分と濃縮上清画分の両方がIL-10分泌に同様の効果を示し、EVは条件付き培地に分泌された（すなわち上清に存在する）細菌細胞膜から構成されているため、活性のある細菌実体としてEVの特性評価に焦点を当てることにした。B. longum AO44のEVは、一連の濾過と超遠心分離によって分離され（図2a）、ペレットに含まれるEVを達成した。対照として、細菌を含まないBHIS培地も同じように濾過と超遠心分離を行い、免疫効果が濃縮培地そのものではなく、細菌の実体に由来していることを確認した。EVは、形態とサイズによって特徴づけられた（図2b-d）。代表的なCryo-TEM画像は、超遠心分離したペレットに小胞が存在することを確認し、その形態を実証している（図2b）。さらに、Cryo-TEMを用いて、細菌細胞膜から出芽するEVと、その成長培地中で細菌細胞を取り囲むEVが確認されました（図2c）。また、NanoSightを用いてEVのサイズ分布を測定したところ、ほとんどのベシクルが150 nmのサイズであった（図2d）。EVがB. longumによって合成されたことを確認するために、新たに合成されたタンパク質、特に細菌のペプチドグリカンを標識する蛍光性D-アミノ酸の存在下で細菌を培養した。代謝活性のある細菌は、タンパク質を合成するために蛍光D-アミノ酸を取り込みます。蛍光D-アミノ酸による代謝標識は、新たに合成された細菌EVをその製造中に標識することができる方法であり、抽出後に蛍光マーカーの痕跡を残して非特異的標識アーチファクトを引き起こす可能性のあるステップである標識を行う必要がない。標識された小胞は、小粒子を検出するために設計された特定のフローサイトメトリーによって識別され、非標識の小胞と区別された（図2e、f）。
図2: B. longum AO44細胞外ベシクルの分離と特性評価。
a 細胞外ベシクルの分離プロセスの図解。 b 同一サンプルからの異なる細菌放出EVのクライオTEM画像。b'の'S'はTEM穿孔支持膜を示す。c EV形成の様々な段階にあるバクテリアのクライオTEM画像： (1) バクテリアの先端部。アスタリスクは、細胞壁からの投影で見られる形成可能なEVを示す。(2) 細胞壁とカプセルの間に形成されたEV（矢印）。(3) 細胞壁とカプセルの間で完全に形成されたEV（矢印）。'S'はTEM穿孔支持フィルムを示す。(4) EV放出後の菌体先端部。矢印は歪んだ細胞壁、矢じりは放出されたEVを示す。右側に(4)の拡大図を追加した。d NanoSightで測定したB. longum細胞外小胞のサイズ分布と濃度（1e10）。エラーバーはs.d.を表す。 e, f D-アミノ酸標識で蛍光標識したB. longum細胞外ベシクルをフローサイトメトリーで検出。eは非標識ベシクル、fはラベル化ベシクル。図2aはBioRender.comで作成しました。
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B. longum EVsのプロテオミクス特性評価
B. longum AO44のEVを液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析計でプロテオーム解析しました。3つのリピート全てで463個のタンパク質が同定され、定量されました。濃縮されたKEGGパスウェイは、図3aおよび補足表1cにパーセンテージで示されている。その結果、代謝経路（16.9%）、リボソーム（9.4%）、二次代謝産物の生合成（7.7%）に属するタンパク質が最も多く、第4位はABCトランスポーター（6.1%）、第6位はクォーラムセンシング（4.9%）だった。さらに、ABCトランスポーターは、INTERPROデータベースによると、タンパク質数が31、p値が1e-10となり、最も有意に濃縮されたカテゴリーだった（図3b、補足表1b）。INTERPROは、ABCトランスポーターに関連する他のタンパク質カテゴリーが、膜貫通型パーミアーゼタンパク質、ヌクレオチド結合タンパク質、高特性ペリプラズム溶質結合タンパク質などのB. longum AO44 EVに富んでいることを確認しました（図3b）。これらのABCトランスポーターサブセットとクォーラムセンシングサブセットのSTRING解析と相互作用マップをKEGGで解析した結果を図3c、dに示す。クォーラムセンシングサブセットには、脂肪酸生合成、タンパク質輸出、ABCトランスポーター、および膜の固有成分に関与するタンパク質が含まれていた（図3d）。小胞で同定されたすべてのタンパク質を補足表1に示す（補足表1aは膜内在成分の全リスト、補足表1bはINTERPRO解析、補足表1cはKEGG解析）。
図3：B. longum細胞外小胞のタンパク質プロファイルのアノテーション濃縮。
a B. longumのEVに濃縮されたKEGGパスウェイ b DAVID Bioinformatics Resources (LHRI/ADRD at Frederick National Laboratory)で解析したINTERPROデータベースの濃縮ドメインとタンパク質ファミリーのカテゴリー（P値およびタンパク質数）. c KEGGパスウェイデータベースでアノテーションされたABCトランスポータークラスターのSTRING解析と相互作用マップ（紫-ABCトランスポーター、青-クオラムセンシング、灰-ATP結合） d KEGGパスウェイデータベースでアノテーションされたクォラムセンシング蛋白質のSTRING解析と相互作用マップ（青-クォラムセンシング、黄-脂肪酸生合成、茶-タンパク質輸出、紫-ABCトランスポーター、ライトブルー-膜固有成分）.
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EVのタンパク質プロファイルが細菌細胞や上清のタンパク質プロファイルと異なることを検証するために、細菌細胞や上清についてもプロテオミクス解析を実施した（補足表2）。細菌細胞のタンパク質強度プロファイルは、EVsデータおよび超遠心分離後の上清から分析されたタンパク質と比較された。各グループからの複製は、教師なしクラスタリングによって一緒にクラスタ化され、ヒートマップで表されました（図4a）。細菌細胞のプロテオミクスでは複数の強いタンパク質が同定されたが、EVでは同定されず、EVでは同定されたが上清では同定されなかったことから、EVには特定のタンパク質が含まれており、これはEVに特有のもので、細胞の総タンパク質や分泌タンパク質とは異なっていることが示された。INTERPROデータベースによると、ABCトランスポータータンパク質およびドメインは、細菌細胞と比較してEVにおいて著しく濃縮されていた（図4b）。細菌細胞（右）とEV（左）で同定された異なるタンパク質は、ボルケーノプロット（図4c）で表現されています。
図4: B. longum細胞、細胞外小胞、および上清のタンパク質プロファイル。
a Perseusソフトウェアで解析した、細菌細胞、EV、上清サンプルのタンパク質強度のヒートマップ表示。b DAVID Bioinformatics Resources (LHRI/ADRD at Frederick National Laboratory)で解析したINTERPROデータベースのドメインおよびタンパク質ファミリーのカテゴリー（P値）を、細菌細胞とEVを比較して濃縮したもの。c 細菌細胞（右）とEV（左）で同定された差分タンパク質のボルケーノプロット表示。赤-ABCトランスポーター、青-ATP結合タンパク質、緑-細胞膜、オレンジ-リボソームタンパク質。
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B. longum AO44のEVは、免疫系に抗炎症作用をもたらす
EVをSPFマウス脾臓細胞に濃度の低い順に導入し、細胞培地中のIL-10とIL-17の両濃度を測定した。IL-10の濃度は、他のすべての希釈液およびコントロールと比較して、EVの最低希釈液（1：50）で最も高かった。小胞を1:1250希釈で非有効濃度まで希釈すると、IL-10の濃度は非線形で減少した（図5a）。一方、IL-17の濃度は、すべての濃度でベシクルの影響を受けなかった（図5b）。CD8+ Ki67+ PD1+およびCD4+ Ki67+ PD1+の細胞頻度をフローサイトメトリーで測定し、細胞増殖および活性化を評価した。CD8+ Ki67+ PD1+およびCD4+ Ki67+ PD1+の両細胞頻度は、細胞が小胞の最低希釈度（1：50）にさらされたときに高く、CD8+ Ki67+ PD1+は他の希釈度および対照と比較してわずかに有意だった（図5c、d）。B. longum EVに対する抗原提示細胞およびT細胞の抗炎症反応をさらに調べるために、DC-CD4+ T細胞を細菌EVの存在下で共培養した。IL-10レベルは、濃縮BHISで活性化した細胞と比較して、B. longumのEVで活性化した細胞で有意に高かった（x1000、Fig. 5e）。IL-17の倍数変化は、濃縮BHISで活性化した細胞（x1000、図5f）と比較して、EVで活性化した細胞では有意差はなく、わずかな減少さえも示した。DC-CD4+T細胞共培養におけるIL-10およびIL-17の誘導は、いずれも全脾臓細胞アッセイにおける誘導と一致した。
図5: B. longum AO44細胞外小胞の免疫調節活性。
a 抗CD3；または抗CD3と濃縮BHIS（ライトグレー、1：50希釈）または細胞外小胞の下降希釈液との組み合わせに曝露した後の脾臓細胞培地中のIL-10濃度およびIL-17濃度。 c 抗CD3；抗CD3と濃縮BHIS（1：50希釈）または細胞外小包下降希釈液との組み合わせへの曝露後の全CD4細胞中のCD4＋ Ki67＋ PD1＋細胞数。d 抗CD3または抗CD3と濃縮BHIS（1:50希釈）または細胞外小胞の下降希釈液との組み合わせに曝露した後の全CD8細胞のうち、CD8+ Ki67+ PD1+細胞の頻度。 e, f B. longum EVまたは濃縮BHISに曝露したDC-CD4+T細胞培地のIL-10（e）またはIL-17（f）濃度の（コントロールと比較して）倍増効果。各ドットは、3回の独立した実験のうち、生物学的反復を表す。a-d 普通一元配置分散分析、e、f 不対t検定。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001. エラーバーはs.d.を表す。
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考察
腸内細菌叢は、私たちの健康に大きな影響を与える可能性があり、細菌に由来する治療用分子の金鉱と考えられるほどである19,20,21。細菌が宿主にもたらす治療効果の主な経路は、細菌と宿主の免疫系とのコミュニケーションを介するものです6,7,8,9,16,49. 例えば、腸内細菌が産生するSCFAは、T-regs50の誘導を介して、宿主に抗炎症作用を誘導することができる。しかし、このような宿主と常在菌のコミュニケーション様式や、関与する細菌の免疫調節分子については、まだほとんど知られていない。腸内細菌と宿主の相互作用の1つの可能性は、細菌小胞の分泌を介したもので、この小胞は宿主細胞に到達し、潜在的には離れた場所にある可能性もある。実際、グラム陰性細菌Bacteroides fragilisの外表面多糖（PS）は、細菌外膜小胞（OMV）を介して宿主細胞に伝達され、マウスの実験的大腸炎を緩和している51。グラム陽性腸内細菌の細胞外小胞（EV）についての研究は増えてきているが、グラム陰性OMVについての研究と比べると、まだ比較的少ない46,47。特に、最近の研究では、ビフィドバクテリウム属の細菌が産生するEVの生理作用がいくつか実証されています。この属のうち、ビフィドバクテリウム・ロンガムは、抗炎症作用や免疫調節作用を持つ一般的なグラム陽性腸内常在菌である。
ここでは、新たに分離されたヒト腸管由来のB. longum AO44株を対象に、その免疫調節作用を明らかにすることを目的とした研究を行いました。まず、B. longum AO44株の細菌細胞と上清の化学分画を行い、免疫調節活性を持つ細菌化合物の化学的特性を発見しました。ビフィドバクテリウム種の増殖に広く用いられている2種類の豊富な増殖培地（BHISとGAM）を選択した。分子を粗い疎水性画分と親水性画分、有機性画分と極性画分に分離するCHCl3：MeOH：H2O分画を実施しました。ビフィドバクテリウム属の細菌は、主に抗炎症作用を誘導することが示されているので38、活性画分による抗炎症サイトカインIL-10の誘導をスクリーニングした。濃縮上清画分とCHCl3細胞画分は、GAM培地とBHIS培地の両方で、免疫細胞によるIL-10分泌を最も促進する効果があった。CHCl3非極性有機画分には、膜部分や脂質などの疎水性分子が含まれている。したがって、活性成分は両者の中に含まれる細胞性物質であると推測された。上清は遠心分離により菌体から分離されているため、見つかった疎水性の膜部分は、菌体から培地に分泌された細胞残渣やEVである可能性が高い。そこで、次にBHISで培養した細菌からEVを分離し、全脾臓細胞培養においてIL-10の分泌を誘導する能力を確認したが、IL-17の分泌は誘導せず、抗炎症作用を強調することが確認された。
さらに、その潜在的な免疫効果を探り、これらの同じEVが、コントロールと比較してCD4+ Ki67+ PD1+およびCD8+ Ki67+ PD1+細胞頻度を増加させる能力もあることを確認しました。CD4+ Ki67+ PD1+とCD8+ Ki67+ PD1+のアップレギュレーションは、CD4とCD8の両方の細胞の活性化（PD1+）と増殖（Ki67+）を示し、これはIL-10の誘導と一致する。宿主免疫細胞に対するEVの抗炎症作用について、よりメカニズム的な洞察を得るために、DC-CD4+T細胞共培養における免疫調節作用について検討した。ここでは、脾臓細胞全体と同様に、EVはIL-10の分泌を誘導し、IL-17は誘導しませんでした。このことは、再びEVの抗炎症作用を示し、DCとCD4+T細胞がこの相互作用の主要なプレーヤーであることを特定した。EVの免疫調節作用を特定した後、プロテオミクスによってEVの内容物の特徴を明らかにした。プロテオミクス解析の結果、細菌細胞全体や上清の分泌タンパク質の含有量とは異なる、EVsのユニークなタンパク質含有量が明らかになりました。特に、ABCトランスポーターとクォーラムセンシングタンパク質の濃縮がEVsで観察された。細菌の高親和性輸送系は、細胞質膜を介した溶質の活性輸送に関与しており、膜貫通型パーミアーゼタンパク質、ヌクレオチド結合タンパク質、高度に特異的なペリプラズム溶質結合タンパク質などが小胞に存在することが知られている。なお、アレルギー46を緩和することが示された別のB. longum株のEVには、ABCトランスポーターと細胞外溶質結合タンパク質（「ファミリー5」を含む）が豊富に含まれていた。さらに、クォーラムセンシングタンパク質は、グラム陰性OMVに濃縮され、細菌のバイオフィルム形成を促進することが以前に示されている52,53。最後に、我々は細菌小胞の特異的な蛍光標識を実証し、EVと宿主の相互作用に関する将来の研究を可能にすることができます。要約すると、我々は、新たに分離された腸由来のB. longumのEVを、形態、サイズ、含有量、および免疫調節活性によって特徴付けた。EVが免疫細胞の活性化を媒介することを示す我々の結果は、今後、健康状態や疾患におけるEVの生体内での効果を評価する研究や、これらの特定のEVを将来の治療薬として検討することにつながるであろう。
研究方法
菌株の培養
B. longum AO44を、1N NaOH中の5μg/mlヘミン（Alfa Aesar）および100% EtOH中の2.5μg/mlビタミンK（Thermo Fisher Scientific）を添加したBrain Heart Infusion agar plate（BI, BD BBLTM）上で解凍し（以前はBHISと呼ばれた）、嫌気性室（N2 85%, CO2 10%, H2 5%）で37℃にて保存しました（Coy）。
フラクションの作成
B. longum AO44を37℃、嫌気条件下で前培養した。まず、10 mlのBHISまたはGAMを〜20 mlのHungate tubeに入れ、次に0.5% v/vで900 mLのBHISまたはGAMを1 Lガラス瓶に接種し、嫌気性条件下で37℃に保った。37℃で4日間培養後、遠心分離（7500×g, Thermo Fisher Scientific Sorvall R6 centrifuge with 1Lx4 bottle rotor）により上清と細胞を分離した。
上清分画遠心分離した上清をロータリーエバポレーターで1/10量まで蒸発させ、10倍上清分画（すなわち粗濃縮上清）を作成した。上清-メタノール画分は、以下のように調製した：遠心分離した上清10mlをまず凍結乾燥して乾燥させた。30mlのメタノールを乾燥残渣に添加した。スパチュラおよび超音波処理（15分）で混合した後、混合溶液を室温（RT）で一晩放置して、分子をメタノールで完全に抽出させた。メタノール溶液は、不溶性の残渣から注意深く取り除かれた。このメタノール画分（30 ml）を真空中で濃縮して乾燥させ、ジメチルスルホキシド（DMSO）1 mlに再溶解させた。上澄み-水画分は次のように調製した：上記のプロセスからの不溶性残渣を水1mlに溶解した。
細胞ペレット分画-細胞-クロロホルム画分は以下のように調製した：1L培養からの細胞ペレットを300mlのクロロホルム：メタノール＝1：1（v／v）に浸した。スパチュラおよび超音波処理（15分）により混合した後、混合溶液をRTで一晩放置し、分子を有機溶媒中に完全に抽出させた。抽出物を細胞ペレットから取り出し、濾過し、バキュオで蒸発させて乾燥させた。乾燥残渣にクロロホルム30mlを加え、スパチュラおよび超音波処理（15分）で混合し、RTで一晩放置して、分子を有機溶媒に完全に抽出させた。クロロホルム溶液を不溶性の残渣から取り除き、真空中で濃縮し、その後、3 mlのDMSOに再溶解した。細胞-メタノール画分は以下のように調製した：上記の細胞-クロロホルム抽出工程で得られた不溶性残渣を30 mlのメタノールに溶解し、スパチュラと超音波処理（15分間）で混合し、有機溶媒に完全に分子抽出させるためにRTで一晩放置した。メタノール溶液は不溶性の残渣を取り除き、真空中で濃縮し、3 mlのDMSOに再溶解した。
ベシクルの単離
B. longum AO44を10mlのBHISで37℃の嫌気条件下で一晩培養した。次に、細菌培養物を1：40で200mlのBHISに希釈し、嫌気条件下で37℃で8時間培養し、1：20の第二希釈を行い、嫌気条件下で37℃で16時間細菌を培養した。この培養液を8000×gで30分間遠心分離した後、0.45μm孔径のフィルターと0.22μm孔径のフィルターで2回濾過した。濾過した上清をCentricon® Plus-70 Centrifugal Filter Units (Merck)を用いて100-kDa-exclusionで濃縮した。残った上清を100,000×g、4℃で1時間超遠心分離し、膜小胞ペレットを得た。超遠心後、上澄みを捨て、ベシクルペレットを1mlの滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に再懸濁し、0.22μm孔径フィルターでろ過して-80℃にて凍結した。ベシクルのサイズ分布は、NanoSightを用いて測定した。
脾臓細胞培養
C57BL/6 SPFマウスから脾臓を採取し、1 mlのACK溶解バッファー（Thermo Fisher Scientific）を用いて40 µmセルストレーナー上で1-2分間機械的に破砕した。次に、細胞を20 mlの氷冷RPMI（Sartorius）培地に移し、4℃、300×gで10分間遠心分離した。細胞を10 mlの氷冷RPMIで2回洗浄し、カウントして37℃RPMIで希釈して最終濃度200万細胞／mlとした。次に、細胞を0.05 mM β-メルカプトエタノール（Merck）およびT細胞の最適でない活性化のための抗CD3（0.5 μg/ml, 145-2C11, BioLegend）で補充した。100μlの細胞を96ウェルプレートの各ウェルにプレーティングし、100μlの希釈フラクション（1：250希釈）またはベシクル（1：50〜1：31，250希釈）を加えた。細胞およびその培地を5日後に回収し、フローサイトメトリーおよびELISA分析を行った。
DC-CD4+T細胞の共培養
C57BL/6 SPFマウスから脾臓を摘出した。DCの抽出のため、脾臓にRPMI培地中1mg/mlの濃度のコラゲナーゼIIを注入し、37℃で30分間インキュベートし、40μmのセルストレーナー上で機械的に破砕した。CD4＋ T細胞の抽出のために、脾臓を、2％のウシ胎児血清（FBS）を含む1mlのPBSで40μmのセルストレーナー上で機械的に破砕した。その後、細胞を10 ml PBSまたは2% FBSと1 mM EDTAを含むHanks' Balanced Salt Solution（HBSS）で2回洗浄し、室温、300 × gで5分間遠心した。各脾臓からの細胞は、製造者の指示に従ってEasySep™ Mouse Pan-DC Enrichment Kit（STEMCELL Technologies Inc）を用いたDCを分離するために用いるか、EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit（STEMCELL Technologies Inc）を用いて CD4+ T 細胞を分離するかのいずれかである。50μlの単離DCを、最終濃度400,000細胞/mlでRPMI培地中の96ウィールプレートにプレーティングした。50μlの単離CD4+ T細胞を、200万細胞/mlの最終濃度でRPMI培地中の同じ96-ウイールプレートにプレーティングした。次に、CD4+ T細胞の最適でない活性化のために、細胞を0.05 mM β-メルカプトエタノール（Merck）および抗CD3（0.5μg/ml, 145-2C11, BioLegend）で補った。その後、DC-CD4+ T細胞共培養に、100μlの希釈ベシクル（1：50希釈）およびコントロールとしての濃縮BHIS（1：50希釈）を加えた。細胞培地は3日後に回収し、ELISA分析を行った。
クライオ透過電子顕微鏡法（クライオTEM法）
クライオTEM試料は、温度（25 ℃）および相対湿度（100％）を制御した環境ガラス化システム（CEVS）54で準備した。CEVS内で，ピンセットで保持したTEMグリッド（Lacey Formvar/carbon films on 200 mesh copper grid，Ted Pella Inc.，Redding，USA）上に支持したカーボンコート多孔膜に，4μLの溶液を滴下した．グリッドは、先にPELCO EasiGlowグローディスチャージャー（Ted Pella Inc.、Redding、USA）でプラズマエッチングし、親水性を高めた。余分な液体は、フィルターペーパーでグリッドの裏側から2回ブロットし、イメージングに適した薄膜を形成した。その後、グリッドを凝固点（-183 °C）の液体エタンに素早く突っ込むことで、溶液をガラス化した。試料は撮影まで液体窒素のデュワーで保管した。試料は、Thermo-Fisher Scientific社のTalos 200C、200kVで動作する高分解能TEM、フィールドエミッションガン（FEG）、Falcon IIIダイレクトイメージングカメラを使用して画像化されました。顕微鏡への試料の移動は、-180 ℃に保たれたGatan 626クライオホルダーを使用した。すべての画像は、電子線照射によるダメージを最小限に抑えるために低線量撮影を行い、画像のコントラストを高めるためにボルタ位相板（VPP）を用いて記録した。
小粒子のD-アミノ酸標識とフローサイトメトリー
細菌は、HADA (0.8 mM, Tocris, Bio-Techne)を添加したBHIS培地、総容量10 ml55の嫌気性チャンバーで、嫌気条件下で37℃で一晩培養した。標識菌は、7500×gで5分間遠心分離することにより培地から分離した。その後、上記のように小胞を分離し、90nmの粒子を検出できる小粒子検出器を備えたフローサイトメトリー解析装置BD FACSymphonyTM A1により検出した。使用した電圧 FS - 550, SS - 650, SP SC - 450, BV421 - 460.
フローサイトメトリー
一貫性を保つため、一定の抗体パネルを使用しました。パネルには、CD4 (RMA-5), CD8 (53-6.7), TCRß (H57-597), CD19 (6D5), Ki67 (16A8), PD-1 (29F.1A12, 全て BioLegend) に対する抗体が含まれていた。転写因子の細胞内染色は、細胞を表面マーカーで染色し、Fix/Permバッファー（eBioscience）でRT30～60分固定し、抗体の存在下、透過性バッファー（eBioscience）でRT30分透過性化した。細胞はBD BioSciences® LSRFortessaで取得し、解析はKaluza® Analysis Softwareで行いました。抗体の濃度、クローン、ソースは、染色の一貫性を確保するために一定に保たれました。
ELISAアッセイ
脾臓細胞およびDC-CD4+T細胞培地中のIL-10およびIL-17濃度は、Mouse IL-10 and IL-17 ELISA MAXTM Standard Kit（BioLegend）を用いて、メーカーの説明書にしたがって測定しました。ELISA の検出限界： IL-10-31.5-2000 pg/ml、IL-17-15.6-1000 pg/ml。
タンパク質分解および質量分析解析
EVおよび上清サンプルを10mM Dithiothreitol（DTT）、100mM Tris、および5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）に溶解し、超音波処理後95℃で5分間煮沸し、80％アセトンで沈殿させた。タンパク質ペレットを9M尿素、400mM重炭酸アンモニウムに溶解し、3mM DTTで還元し（60℃で30分間）、100mM重炭酸アンモニウム中の10mMヨードアセトアミドで修飾し（暗所で30分間）、修飾トリプシン（Promega）で2M尿素、25mM重炭酸アンモニウム中で37℃、1：50（M／M）酵素-基板比で一晩消化された。トリプシンペプチドは、自家製C18ステージチップを用いて脱塩し、乾燥させ、0.1%ギ酸に再懸濁させた。ペプチドは、Reprosil逆相材料（Dr Maisch GmbH、ドイツ）を充填した0.075×300mmの溶融シリカキャピラリー（J&W）上で逆相クロマトグラフィーにより分離した。ペプチドは、5%から28%の直線的な60分の勾配、28%から95%の15分の勾配、そして0.15μl/minの流速で水中0.1%のギ酸を含む95%のアセトニトリルで15分溶出しました。質量分析は、Q Exactive HF質量分析計（Thermo Fisher Scientific）を用いて、ポジティブモード（m/z 300-1800、MS1では分解能60,000、MS2では15,000）で、繰り返しフルMSスキャンを行った後、最初のMSスキャンから選択した最も支配的（＞1電荷）な18個のイオンについて高衝撃解離（HCD、27正規化衝突エネルギー）により行いました。質量分析データは、MaxQuantソフトウェア1.5.2.856を使用してピークピッキングを行い、Andromeda検索エンジンを使用して、UniprotデータベースのBifidobacterium longumプロテオームに対して前駆体質量が6 ppm、フラグメントイオンが20 ppmの許容範囲で検索して識別した。メチオニンの酸化とタンパク質のN末端のアセチル化は可変修飾として、システインのカルバミドメチルは静的修飾として受け入れた。ペプチドの最小長さは6アミノ酸とし、最大2回の切断ミスを許容した。データは、同じソフトウェアを用いたラベルフリー解析により定量化した。ペプチドおよびタンパク質レベルの偽発見率（FDR）は、ターゲットデコイ戦略を用いて1％にフィルタリングされた。タンパク質表は、リバースデータベースからの同定、一般的な汚染物質、および単一ペプチド同定を排除するためにフィルタリングされた57。
細菌細胞サンプルについては、0.15μl/minの流速で、5%から28%の180分の直線勾配、28%から95%の15分の勾配、0.1%のギ酸を含む95%のアセトニトリルで25分の勾配でペプチドを溶出しました。質量分析は、Exploris 480質量分析計（Thermo社）を用いて、ポジティブモード（m/z 350-1200、分解能120,000、MS1およびMS2）で、繰り返しフルMSスキャンを行った後、最初のMSスキャンから選択した最も優勢な30イオン（>1電荷）の高衝撃誘導解離（HCD、27正規化衝突エネルギー）を行いました。MSデータ解析は、EVsサンプルと同様に行われました。
DNA抽出と全ゲノム配列決定
本研究では、B. longum株AO44（ヒト分離株）を使用した16（Brigham and Women's Hospital）。ゲノムDNAはZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit（Zymo Research）を用いて抽出した。DNAはIllumina MiSeq PE 2x150で配列決定し、アセンブリー方法はSPades v3.15.3を使用した。
統計解析
ベシクルのプロテオームコンテンツの同定と量子化の質量分析解析は、Perseus 1.6.10.43 ソフトウェアを使用して行った。その他の統計解析は、Prism-GraphPadを使用して行った。
報告書の概要
研究デザインに関する詳しい情報は、この記事にリンクされているNature Research Reporting Summaryに掲載されています。
データの利用可能性
本研究で分析したデータは、論文およびその補足表ファイル内で入手可能である。B. longumの全ゲノム配列はGenBankに寄託されており、アクセッション番号はPRJNA908295です。質量分析プロテオミクスデータは、PRIDEパートナーリポジトリを通じてProteomeXchange Consortiumに寄託された（データセット識別子：PXD038667）。追加のデータは、対応する著者からリクエストに応じて入手可能である。
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謝辞
実りある議論と貢献をいただいたGeva-Zatorkyラボのメンバーに感謝します。校正をしてくれたGeva-Zatorsky研究室のRachel Herrenに特別な感謝を捧げます。テクニオン大学ラパポート医学部電子顕微鏡ユニットBCFチームのLihi Shaulov、ラパポート医学部フローサイトメトリーユニットBCFチームのAmir Grau、BD BioscienceのMarina Nudelmanに感謝する。プロテオミクスについてはテクニオンのSmolerプロテオミクスセンターに、ナノサイトについてはテクニオン生物工学・食品工学部のInna KovriginaとMarcelle Machluf教授にお世話になった。クライオTEMはTechnion Center for Electron Microscopy of Soft Matterで実施されました。ワイツマン研究所のShouval研究室のNeta Regev-Rudzki教授、Ruthie Shouval博士、Meirav Pevsner-Fischer博士には、洞察に満ちた議論と提案をいただき、特に感謝します。本研究は、テクニオン工科大学、「Keren Hanasi」、Cathedra、Rappaport Technion Integrated Cancer Center、Alon Fellowship for Outstanding Young Researchers、イスラエル科学財団（グラント1571/17および3165/20）、シーレーブ財団、イスラエルがん研究基金研究キャリア開発賞、カナダ先端研究機関（CIFAR）、Human Frontier Science Programキャリア開発賞（グラントCDA00025/2019-C）、Gutwirth foundation award、D．Dan and Betty Kahn Foundationによるミシガン大学、ワイツマン研究所、テクニオン-イスラエル工科大学共同研究への寄付、欧州連合（ERC、ExtractABact、101078712）。ただし、表明された見解および意見は、著者のみのものであり、必ずしも欧州連合または欧州研究会議執行機関の見解を反映するものではありません。欧州連合および助成機関は、それらに対して責任を負うことはできません。N.G.Z.は、Humans & the MicrobiomeプログラムのCIFARフェロー、Kavliフェロー、Horevフェロー（Taub Foundation）である。N.M.は、RTICC-Rubinsteinフェローシップの支援を受けています。L.Z.は、日本学術振興会の海外特別研究員の支援を受けている。
著者情報
著者および所属
ラパポート医学部細胞生物学・がん科学科、研究所、ラパポート・テクニオン統合がんセンター（RTICC）、テクニオン-イスラエル工科大学、ハイファ、31096、イスラエル
Noa Mandelbaum、Shaqed Carasso、Elliot Berinstein、Tal Gefen & Naama Geva-Zatorky
ハーバード大学化学・化学生物学部（米国・マサチューセッツ州ケンブリッジ
リハン・チャン＆エミリー・P・バルスカス
スモーラー・プロテオミクスセンター、ロッキー生命科学・工学学際センター、テクニオン-イスラエル工科大学、ハイファ、3200003、イスラエル
タマル・ジブ
テクニオン-イスラエル工科大学ハイファ、3200003、イスラエル、化学工学科およびラッセルベリー・ナノテクノロジー研究所（RBNI）。
サピア・リフシズ・シモン、イリーナ・ダヴィドヴィッチ、イェシャヤフ・タルモン
ベングリオン大学健康科学部微生物学・免疫学・遺伝学シュラガ・セガール学科（84105、イスラエル・ベールシェバ
イシャイ・ルズ＆トマー・クックス
ハワード・ヒューズ医学研究所、ハーバード大学、マサチューセッツ州ケンブリッジ、米国
エミリー・P・バルスカス
ヒトとマイクロバイオーム、CIFAR、カナダ・トロント
ナーマ・ゲバ・ザトルスキー
貢献度
研究のコンセプト作り：すべての実験と解析はN.M.、T.G.、N.G.Z.が行った。一部の実験はL.Z.とE.Bが行った。細菌ゲノムの組み立てはS.Cが行った。すべてのプロテオミクス解析はT.Zが行った。クライオTEMイメージングをY.T.、S.L.S.、I.D.が行い、NanoSight実験の一部をI.L.とT.Cが行った。本研究の最初の部分の概念化は、E.P.B., L.Z., N.M., T.G., N.G.Z. 原案の作成はN.M, T.G, and N.G.Z. 全ての著者は記事に寄与して、投稿バージョンを承認しました。
対応する著者
Naama Geva-Zatorskyに対応する。
倫理的宣言
競合する利益
著者は、競合する利益を宣言していない。
追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して、中立を保っています。
補足情報
補足表1および2
報告書の概要
権利と許諾
オープンアクセスこの記事は、クリエイティブ・コモンズ表示 4.0 国際ライセンスの下でライセンスされており、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズのライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可します。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する使用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された使用を超える場合、あなたは著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
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Mandelbaum, N., Zhang, L., Carasso, S. et al. グラム陽性腸内共生細菌Bifidobacterium longumの細胞外小胞は免疫調節、抗炎症作用を誘導する。npj Biofilms Microbiomes 9, 30 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00400-9
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2022年12月5日受領
2023年5月18日受理
2023年6月3日発行
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応用微生物学
細菌学
バイオフィルムとマイクロバイオーム（npj Biofilms Microbiomes） ISSN 2055-5008 (online)
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