免疫活性化状態は、発達全体にわたって乳児のエングラム発現を調節する

広告

サイエンスサイエンス

VOL.9へ戻る 9, NO. 45
オープンアクセス
研究論文
ニューロサイエンス
シェアする
免疫活性化状態は、発達全体にわたって乳児のエングラム発現を調節する

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adg9921?utm_source=sfmc&utm_medium=email&utm_content=alert&utm_campaign=ADVeToc&et_rid=444245156&et_cid=4979308

SARAH D. POWER HTTPS://ORCID.ORG/0000-0003-2663-256X, ERIKA STEWART HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-2149-7584, [...], AND TOMÁS J. RYAN HTTPS://ORCID.ORG/0000-0003-0121-8514 +5著者情報・所属機関
科学の進歩
8 11月 2023
9巻 45号
DOI: 10.1126/sciadv.adg9921

要旨
はじめに
結果
考察
材料と方法
謝辞
補足資料
参考文献
電子レター (0)
情報と著者
指標と引用
表示オプション
参考文献
メディア
シェア
要旨
幼児期健忘は、おそらく哺乳類において最も普遍的な記憶喪失の形態である。我々は、エングラム標識技術と乳児期健忘モデルマウスを統合することにより、発生を通じて記憶がどのように脳に蓄積されるかを調べた。その結果、自閉症スペクトラム障害の母体免疫活性化モデルにおいて、オスの子どもは幼児期健忘を経験しないという現象を発見した。母性免疫活性化は、エングラムアンサンブルのサイズと樹状突起スパインの可塑性を変化させた。われわれは、幼児期の複雑な体験の際に標識された歯状回エングラム細胞を光遺伝学的に再活性化することによって、神経型マウスにおいて、明らかに忘れてしまった同じ幼児期の記憶を復活させた。さらに、人為的に記憶エングラムを更新することで、失われた幼児期の記憶を永続的に復活させ、幼児期の健忘が可逆的なプロセスであることを実証した。我々の発見は、幼児期健忘がエングラム発現における可逆的な検索欠損によるものであることだけでなく、発達過程における免疫活性化が、幼児期健忘が起こるかどうかを決定する、生得的で可逆的な忘却スイッチを調節することを示唆している。
サイエンスアドバイザーのニュースレターを購読する
最新のニュース、解説、研究を毎日無料でお届けします。
はじめに
幼児期健忘とは、発達初期に形成された記憶を急速に忘れてしまうことであり、ほとんど無視されている記憶喪失の一形態であるが、全人類が罹患しているように思われる(1, 2)。この健忘症はヒトだけの現象ではなく、げっ歯類でも記録されており、乳児期に形成された文脈記憶や恐怖記憶の忘却を示す(3-6)。乳児期健忘の基本的な神経生物学や、特定の記憶をエンコードするエングラム細胞アンサンブルへの影響についてはほとんど知られていない。活動依存的アンサンブル・ラベリングとオプトジェネティクスの統合により、健忘症の場合でも記憶エングラムが脳内にまだ存在するか、あるいは機能しているかを調べることが可能になった(7)。この方法論を用いると、海馬や他の脳領域にあるエングラム細胞を光遺伝学的に活性化することで、健忘後に記憶の想起を誘導できることが示され、これらの記憶が脳内にまだ存在するだけでなく、回復可能であることが実証されている(8-11)。この枠組みは、発達が幼児期の記憶の保存と検索にどのような影響を与えるかを調べる機会を提供する。環境条件は学習と忘却の両方の速度に強く影響するが、発達の軌道が変化した場合に忘却がどのように起こるかについてはあまり知られていない(12)。胎生期や出生後の発達期には、発達中の脳が環境からの影響に敏感になる時期がある(6, 13-18)。乳児期健忘は、γ-アミノ酪酸アゴニスト（19-21）やコルチコステロイド（6）、あるいはニューロトロフィンの異所性投与（22）を用いた生後の薬理学的介入によって予防可能であることが示されている。免疫系の活性化やそれに続くサイトカイン放出などの胚発生中の出来事は、自閉症スペクトラム障害（ASD）や統合失調症に関連する発達の軌道の変化を引き起こすことが知られているが、エングラム機能への影響については調べられていない（13, 23-26）。ここでは、動物の発達経験によって引き起こされる幼児期健忘症の自然発生的変異を同定し、エングラム細胞機能への影響を調べた。
結果
胎生期における母親の免疫活性化は、雄子供の小児健忘を緩和する
文脈的恐怖条件付け（CFC）パラダイムを用いて（図1、AおよびB）、幼児マウス（P17）（27-30）および成体マウス（P63）を訓練し、訓練1日後または8日後に恐怖記憶の想起テストを行った（図1C）。いずれの時点でも、実験的成体ショック群はショックなし対照群よりも有意に凍りつきを示した（図1C）。訓練1日後に記憶想起のテストを行った幼児マウスは、対照群と比較して有意に高いフリーズレベルを示したが（図1C）、訓練8日後にテストを行った群では、ショックなしの対照群と同程度のフリーズレベルを示し、強固な幼児健忘を示した（図1C）。文献と一致するように、幼児マウスは訓練後1週間もすると忘却を示すが、成体マウスは継続的な記憶の保持を示す(4, 31)。

図1. MIA雄性子孫は文脈恐怖パラダイムにおいて幼児期健忘を示さない。
(A) 幼児マウスの発達軌跡。(B）行動スケジュール。黒い稲妻のシンボルは足によるショックを表す。マウスは文脈恐怖条件付け（CFC）を用いて文脈Aで訓練され、1日後または8日後に想起テストを受ける。Sはショック、NSはショックなし。(成体（P63）C57BL/6 J雄マウス（n = 8）は、訓練1日後と8日後の両方で、ショックなしの対照（n = 8）よりも、文脈Aで有意に多く固まった。幼児(P17)C57BL/6 J系雄性マウス(n=9)は、訓練1日後の想起時にショックなし対照群よりも有意に多く固まった。訓練8日後の想起テストでは、群間（n = 9）で凍りつきに有意差はなかった。(D）妊娠中のダムにおける母体免疫活性化（MIA）の代表図。E）MIA成体C57BL/6 J雄子供（n = 10）の社会的嗜好性指数（全対象物調査時間のうち社会的刺激探索に費やした時間の割合）。(F) MIA成体C57BL/6 J雄子供(n = 10)のビー玉埋没行動。ビー玉埋没指数をy軸にプロットした。(G) C57BL/6雄性MIA子孫におけるP17でのCFC後の文脈Aでの記憶想起（n = 10）。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001は、(C)二元配置分散分析(ANOVA)または(E～G)入れ子分散分析(Bonferroni post hoc検定付き)により算出した。データは平均値±SEMで示した。IL-6はインターロイキン-6、IL-17aはインターロイキン-17a、TH17はTヘルパー17。
乳幼児期の環境エンリッチメントや母親の世話から離れる時期など、外的環境の影響を変えることが、乳児期健忘症の発生に影響するかどうかを検証した（図S1）。次に、胎生期の課題から生じる発達軌道の変化の影響を調べた。妊娠中、脳の発達の重要な時期に病原体や炎症にさらされること［母体免疫活性化（MIA）］は、インターロイキン-6（IL-6）やIL-17ファミリーなどの炎症性サイトカインの放出を通じて、出生後の脳の成長や認知発達を変化させることが示されている(32)。ウイルス様化合物であるポリノシン酸：ポリシチジル酸[poly(I:C)]をE12.5に投与することは、げっ歯類におけるMIAの実験的誘導法として確立している(33-35)。さらに最近では、母体由来のサイトカインであるIL-17aが、MIAに対するポリ(I:C)効果を媒介し、子孫の脳状態の変化を誘導するのに十分であることが示されている(13, 17, 23, 24, 36)。ここでは、C57BL/6 JマウスのE12.5で妊娠したダムにMIAを刺激する2つの異なる方法として、ポリ(I:C)、または組換えIL-17aの投与を用いた（図1D）。まず、我々の方法を検証するために、雌マウスにポリ(I:C)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を注射した後のIL-17a血中血清の変化を測定した(図S2A)。ポリ(I:C)を注射すると、PBS対照と比較して血中血清中のIL-17aが増加した。発表された研究と一致して、ポリ(I:C)またはIL-17aで処置された妊娠中のダムから生まれた雄の子供は、雌ではなく、ASDを示す行動表現型である反復行動と社会的行動の欠損を示した（図1、EおよびF、ならびに図S2、BからG）(13, 23, 24)。MIAが記憶保持に何らかの影響を及ぼすかどうかを調べるため、次にMIAのダムを持つ乳児の子供に、P17でCFCを用いて訓練を行った（図1G、図S2、H～J）。トレーニングの1日後にテストしたところ、性別に関係なく、すべてのコホートが同程度の凍りつきレベルを示した（図S2、HおよびI）。しかし、妊娠したダムをポリ（I:C）またはIL-17aで処理したオスの子どもは、メスではなく、トレーニングの8日後にテストすると、成体マウスと同様に乳児期の記憶の保持を示した（図1Gおよび図S2J）。この効果は、MIA雄性子孫を訓練から15日後にCFC記憶の想起についてテストした場合にも当てはまった（図S2K）。雄性MIA子孫を訓練8日後と15日後のいずれに想起テストしても、恐怖記憶は保持された。さらに、この効果は性特異的であった（交互作用、P = 0.0119）（図S2L）。このことは、ポリ(I:C)を注射したダムから生まれた子どもは、雌ではなく雄であったにもかかわらず、文脈的恐怖記憶について幼児健忘を示さないという未知の現象を表している。この現象は、IL-17aを注射したダムの子供でも見られ、IL-17aシグナル伝達の仲介的役割を示している。
MIA雄の子孫は、DGにおけるエングラム標識とスパイン密度の増加を示す
我々は、誘導性c-fosプロモーターからiCreを発現するFosCreER（FosTRAP）トランスジェニック系統と、チャネルロドプシン-2/増強黄色蛍光タンパク質（ChR2-EYFP）を発現するAi32トランスジェニックマウスを交配することにより、幼児マウスのエングラム細胞の全脳タグ付けのためのCreベースのエングラム標識戦略を特徴付け、使用した（図2、A～C）（37, 38）。タモキシフェンの代謝産物である4-ヒドロキシタモキシフェン（4-OHT）を腹腔内（IP）注射すると、iCreがChR2-EYFP導入遺伝子を組み替えることができる（39, 40）。このエングラム標識法を用いると、4-OHT注射の3日後にエングラム細胞でChR2-EYFPの発現を検出することができる。まず、乳児マウスがP20でも記憶保持を示すことを確認するため、P17でCFCを用いて乳児マウスを訓練し、3日後（P20）に記憶想起のテストを行った（図S3A）。P17で訓練した幼児マウスは、訓練1日後または3日後にテストした場合、恐怖記憶について同様の記憶保持を示した（図S3、BおよびC）。P17（乳児）およびP42マウスにおいて、歯状回（DG）、扁桃体（AMG）、後頭葉皮質（RSC）、および脳橋周囲灰白（PAG）を含むコンテキストおよび恐怖記憶に関連する脳領域におけるChR2-EYFP+細胞の数を定量化することにより、ホームケージ、コンテキスト、またはコンテキスト恐怖記憶に対するAi32-FosTRAPエングラム標識システムの効率をP63で評価した（Fig. 2、DからF、および図S4）。文脈Aに暴露されると、P17（図2E）とP42（図S4B）の両方で、DGのエングラム標識（EYFP+細胞）が活動依存的に増加した。同様に、CFC後のAMGでは、P17（図2F）とP42（図S4C）の両方で、活動依存的にEYFP+標識が増加した。これらの結果は、Ai32-FosTRAP系統が、乳児マウスと成体マウスの両方において、活動依存的なエングラム標識のための効率的なエングラム標識系であることを示している。

図2. 幼児期に符号化された記憶に対するエングラム細胞の自然な再活性化。
(A）Ai32-FosTRAPマウスにおけるエングラム標識法。(B）乳児エングラムの全脳エングラム標識。スケールバーは400μm。(C) Ai32-FosTRAPマウスにおける歯状回（DG）エングラム細胞（ChR2-EYFP+緑）。スケールバーは100μm。(D) P17 Ai32-FosTRAPマウスにおけるホームケージ(HC)、文脈(Cxt)、文脈的恐怖記憶(CFC)のエングラム標識の行動スケジュール。黒い稲妻のシンボルはフットショックを表す。注射器のシンボルは、トレーニングの2時間後に4-ヒドロキシタモキシフェン（4-OHT）を注射したことを示す。(EおよびF）DG（N = 4～6、n = 4）および扁桃体（AMG）（N = 4、n = 4）におけるChR2-EYFP+細胞数。(G) P20およびP63における想起後のDGのChR2-EYFP+（緑）とc-Fos+（赤）の細胞数の画像例。IA、小児健忘。スケールバー、20μm。(HとK）行動スケジュール。(IおよびJ) P20およびP63における想起後または想起なし（ホームケージ）後のDG (N = 4 to 6, n = 4)およびAMG (N = 4, n = 4)におけるエングラム再活性化（c-Fos+ChR2-EYFP+/ChR2-EYFP+）。(L) MIA雄子供（N = 5から6、n = 4）のDGにおけるChR2-EYFP+細胞数。(M）EYFP＋／DAPI（4′，6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）細胞数と凍結行動（％）との関係の散布図（N＝8、n＝4）。(N）DGにおけるc-Fos+細胞数（N＝4～5、n＝4）。(O）DGの非エングラム細胞におけるc-Fos+細胞数（N = 10, n = 4）。(P）DGにおけるc-Fos+ChR2-EYFP+/ChR2-EYFP+細胞数（N = 4から5、n = 4）。(Q) P25でリコールしたMIA雄の子孫のDGにおけるエングラム細胞樹状突起棘（N = 4, n = 10）。スケールバー、40μm。(R）10μmあたりのスパイン密度。(S) 樹状突起スパイン頭部の平均直径（マイクロメートル）。(T）樹状突起スパイン頭部の平均体積（単位：平方マイクロメートル）。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001は、(E、L、N～P)入れ子のStudentのt検定、(R～T)Studentのt検定、(M)Pearsonの相関、または(F、I、J)入れ子のANOVAとBonferroni post hoc検定によって算出。データは±SEMで示した。
次に、幼児期の記憶符号化時に形成されたエングラム細胞が、訓練手がかりにさらされることによって再活性化されるかどうかを調べた（図2H）。エングラム細胞の細胞活性化は、複数の脳領域にわたって、幼児期健忘期の前（P20）と後（P63）にEYFP+ c-Fos+細胞の数を定量化することによって調べた（図2G、図S5とS6）。自然な想起の手がかりは、P20ではDGとAMGでEYFP+とc-Fos+の重なりを偶然以上にもたらすが（図2、I、J、図S5、D、G）、この効果はP63では見られなかった（図2、I、J、図S6、D、G）。次に、MIAのダムを持つ雄の子について、文脈的恐怖記憶の自然想起後のエングラム再活性化を比較した（図2K）。MIAダムを産んだ雄の子供は、雌の子供ではなく、対照と比較してDGのEYFP+エングラム細胞の数が増加しており（図2L、図S7、AおよびB）、ASDの遺伝的モデルでも報告されているエングラムのアンサンブルが変化していることを示している（41）。さらに、凍りつき行動（％）と雄性MIA児のDGにおけるエングラム細胞（EYFP+）の総数との間には正の相関があった［r(30) = 0.36, P = 0.043；図2M］。エングラムのサイズが大きいほど、P25雄性MIA子孫の文脈的恐怖記憶の想起時に凍りつき行動が増加した。細胞活性化（c-Fos+）の総レベルでは群間に差は見られなかったが（図2N）、MIA雄性子孫では、想起時にDGの非エングラム細胞活性化が特異的に減少した（図2O）。両群ともDGにおいてEYFP+とc-Fos+の重複が偶然を上回るレベルを示したため、エングラム再活性化の相対的レベルには群間で差は見られなかった（図2Pおよび図S7C）。先行研究では、乳児MIA児の大脳皮質内の樹状突起スパインの変化を調べたが(42)、我々は、想起後のMIA雄児のDG内のエングラム細胞に関連する樹状突起スパインの特異的変化を調べようとした（図2Q）。樹状突起スパイン解析の結果、MIA子孫のエングラム細胞は樹状突起スパイン密度が有意に増加し（図2R）、P25の時点で対照動物に比べてスパイン頭部の直径と体積が大きくなっていた（図2、SおよびT）。したがって、より大きなエングラムサイズ、より低い非エングラム細胞の活性化、および樹状突起の可塑性の増大の組み合わせが、MIA子孫における幼児エングラムの機能的エングラム発現の増強に寄与している可能性がある。
幼児エングラムを光遺伝学的に刺激すると、忘れていた記憶を急性かつ永続的に復活させることができる。
自然発生の乳児期健忘後の記憶の機能性を調べるために、成体マウスにおいて、乳児期に標識されたDGエングラム細胞を光遺伝学的に刺激することの行動学的効果を検証した（図3A）。P17のAi32-FosTRAPマウスにおいて、CFCを用いて文脈Aのエングラム細胞を標識した（図3、A～C）。両群ともコンテキストAに置かれたが、足ショックを受けたのは実験群だけであった（S）。P63では、両群ともCに置かれ、青色光のオン・オフを3分間ずつ4回繰り返す12分間のテストが行われた。消灯時間中、両群ともバックグラウンドレベルの凍りつきを示した（図3D）。実験群では、光照射中に有意に高いフリーズレベルを示した（図3、DおよびE）。DGでは同じ数のEYFP+細胞が標識されていたにもかかわらず（図3F）、同じ行動パラダイムを行ったが、P17でフットショックを受けなかった動物（NS）では、この光誘発性凍りつきは観察されなかった（図3、DおよびE）。一方、幼児期に標識された中立記憶を刺激しても、凍りつき行動は起こらない（図S8、A～C）。我々はこのパラダイムを、成体マウスにおいて乳児期に標識したCA1エングラム細胞を光遺伝学的に刺激することで拡張した（図S8D）(8, 43, 44)。以前の研究では、CA1エングラム細胞を活性化するために標準的な20Hzのプロトコルを適用しても、記憶の想起を効果的に誘導できないことが示された(43)。しかし、CA1エングラム細胞を刺激するために4Hzのプロトコルを実施すると、アニソマイシン誘発健忘による記憶障害の回復において同等の改善が得られた(8)。成体マウスのCA1にある幼児標識エングラム細胞を4Hz（図S8、HとI）で光遺伝学的に刺激すると（図S8F）、光による凍結が生じたが、20Hz（図S8F）では起こらなかった。これらのデータから、「失われた」幼児期の記憶は、DGまたはCA1のいずれかを光遺伝学的に刺激することで、急性に想起される可能性がある。

図3. 幼児期にコード化されたエングラム細胞の人為的な更新は、「失われた」幼児期の記憶を永続的に復活させる。
(A）幼児期のDGエングラム細胞を成人期に光遺伝学的に再活性化するための行動スケジュール。(B）Ai32-FosTRAP標識マウスにおけるDGエングラム細胞の光遺伝学的刺激の代表画像。スケールバー、400μm。(C) 幼児マウス（n = 10）の自然記憶想起時の凍結レベル。(D) ライトオフとライトオンのエポックによる、文脈C（エングラム再活性化）での記憶想起。(E)ライトオフとライトオンの2つのエポックを平均した凍結。(FとI) P63での光遺伝学的刺激後のDG (N = 4, n = 4)とAMG (N = 5, n = 4)におけるChR2-EYFP+細胞数。(GとJ）DGとAMGにおけるc-Fos+細胞数。(HとK）DGとAMGにおけるc-Fos+ChR2-EYFP+/ChR2-EYFP+細胞数。(L）幼児エングラムの人為的更新のための行動スケジュール。(M）文脈Bと文脈Aにおける想起テスト中の凍りつきレベル（n = 10）。(NおよびO) (N)DGおよび(O)RSCにおけるエングラム再活性化の組織学的表現。DAPI+（青）、ChR2-EYFP+（緑）、c-Fos+（赤）。スケールバー、20μm。(PおよびQ）文脈Aにおける想起後のDG（N=6、n=4）およびRSC（N=4～5、n=4）のc-Fos+ChR2-EYFP+/ChR2-EYFP+細胞数。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001は、(F～K、P、Q)ネステッドStudentのt検定、または(C、E、M)二元配置ANOVAとボンフェローニポストホック検定により算出。データは±SEMで示した。
成人期に忘れてしまった幼児期の記憶を光遺伝学的に刺激すると、特異的な行動反応が得られたが、その情報がどのように残っているのかは不明である。われわれは、上流のエングラム細胞を光遺伝学的に刺激した後のエングラム細胞の再活性化を組織学的に評価することによって、幼児期健忘後の下流領域のエングラム細胞間の結合性を調べた（図3、FからK）（8, 45）。その結果、CFC（ショック、S）あるいは文脈記憶（ショックなし、NS）の光活性化後の海馬では、c-Fos+数は同等であった（図3G）。対照的に、幼児CFC記憶の光活性化後には、AMGにおいてc-Fos+細胞数が有意に増加し（図3J）、AMGの活性と凍りつきの行動発現の両方が増加していることが示された。DGエングラム細胞を光活性化すると、DGでc-Fos+とEYFP+が偶然にも重なり（図3Hおよび図S9B）、AMG（図3Kおよび図S9C）、RSC（図S9、FおよびG）、PAG（図S9、JおよびK）を含む他の下流の脳領域でもc-Fos+とEYFP+が重なった。これらの結果は、CFC（ショック、S）と文脈記憶（ショックなし、NS）の両方の光活性化で一貫していた。これらの結果は、エングラムの結合パターンが幼児期の健忘を乗り越えて成人期まで持続し、失われた幼児期の記憶を光遺伝学的に刺激することで機能的結合パターンを再活性化するのに十分であることを示している。陽性対照として、小児健忘期（P29）以降にコードされたエングラムを光遺伝学的に刺激した（図S10A）。この特定の発達段階を標識に選択することで、幼児期健忘後に形成され、したがって長い遅延を経て保持されるだけでなく（図S3、DおよびE）、その後の発達過程も経た記憶エングラムを標的にすることができた。また、幼児期健忘の後（P29）にコード化されたエングラムを光遺伝学的に刺激すると、DG、AMG、RSC、PAGにおいてエングラムの再活性化が偶然のレベルを超えて増加した（図S10、B～Q）。
光遺伝学的刺激は人工的な条件下で記憶の想起をもたらすので、エングラム細胞に可塑性を誘導する光遺伝学的誘導法を採用することで、幼児期の記憶を永続的に復活させようとした（図S11、AおよびB）（8, 43）。幼児マウスは純粋な文脈記憶を形成することができ、その記憶はショック情報によって更新される（図S11、CおよびD）。P63で、新しい文脈で、P17でもともとコード化されていた文脈AのDGエングラム細胞を光遺伝学的に刺激し、同時に足衝撃を与えて、幼児期の文脈エングラムと成人の衝撃経験との誤った関連付けを作成した（図3L）。その後、動物は文脈Cでショックを受けたにもかかわらず、文脈Aにさらされると有意に凍りつくようになった（図3M）。また、文脈Aに暴露された後、DG（図3のNとP、図S12D）とRSC（図3のOとQ）において、c-Fos+細胞とEYFP+細胞の重なりレベルが増加し、永久的なエングラムの復権が細胞レベルでも反映されたことが示された（図S12のBからO）。この組織学的結果は、エンコード時に活性化していたエングラム細胞が、成体になって文脈Aに曝露された際に再活性化したことを示している。これらの所見を総合すると、幼児エングラムの標的化更新に伴う可塑性は、適切な知覚手がかりに対するそのエングラムの自然なアクセス性を回復させ、文脈特異性が成体になっても維持されることを示している。
MIAの子どもは、空間記憶や物体記憶の幼児期健忘を示さず、これらの記憶は対照の子どもで光遺伝学的に活性化することができる。
恐怖条件付けは強固なアッセイ法であるが、私たちは他のタイプの記憶に対する小児健忘の関連性を検証することで、さらに知識を広げたいと考えた。そのために次に、新規物体認識行動パラダイムで、この忘却の形態を調べた（図4A）。幼児ラットにおける新規物体の位置に関する研究はあるが、この発達段階のマウスにおける新規物体認識に関する幼児期健忘の明確な実証はない（46, 47）。幼児マウスは、他の幼児符号化記憶と同様に、新奇物体認識課題に対して急速な忘却を示した（図4B）。獲得から1日後のテストでは、成体マウスも幼児マウスも、見慣れた物体よりも新しい物体を探索する時間が長く、長期記憶が形成されたことが示された（図4B、図S13、A～C）。その8日後に再度テストを行ったところ、成体群のみが新規対象物を探索する時間が有意に長かった（図4Bおよび図S13C）。次に、MIAのダムを持つ雄の子供が物体記憶に関して幼児健忘を示すかどうかを調べた（図4C）。物体記憶の保持についてテストしたところ、MIAのダムを持つオスの子どもは、物体獲得から8日後に新奇な物体と過ごす時間が有意に長かった（図4Dおよび図S13E）。文脈的恐怖記憶と同様に、ポリ(I:C)またはIL-17aを注射した雄の子孫は、物体記憶について幼児健忘を示さない。

図4. 文脈記憶、物体記憶、迷路記憶に対する小児健忘。
(AおよびC）新規物体認識の行動スケジュール。(B) 幼児C57BL/6 Jマウスの新奇物体認識テストにおける相互作用指数(%)。(D)MIA雄子供の相互作用指数(n = 9から10)。(E) 幼児期にエンコードされたエングラムをDG光遺伝学的に再活性化するための行動スケジュール。(F）光遺伝学的刺激後の成体マウスの相互作用指数（n = 9から10）。(G) 幼児C57BL/6 Jマウスにおけるバーンズ迷路の行動スケジュール。(HおよびI)訓練から1日後または8日後のテスト(H)または(I)において各ゾーンに滞在した時間。(J）ナビゲーショナルサーチ戦略の表現例。(KとL) 訓練1日後と8日後のテストにおける幼児と成人の探索戦略。(M) 幼児C57BL/6 J雄性MIA子孫におけるバーンズ迷路の行動スケジュール。(N、P、R）訓練後8日目のテストにおけるMIA雄子供の各ゾーンでの滞在時間（n＝9～11）。(O、Q、S）（O）Ctrl、（Q）PIC、（S）IL-17a雄性MIA子孫におけるプローブテストのヒートマップ解析。(T)バーンズ迷路に対する幼児エングラムのDG光遺伝学的再活性化のための行動スケジュール。(UおよびW）試験中に各ゾーンに費やした時間（n = 8～9）。(VとX) (V)光照射なし群と(X)光照射群におけるプローブテストのヒートマップ解析。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001は、(H、I、U、W)ANOVA、(D、N、P、R)入れ子ANOVA、(B)二元配置反復測定ANOVA、または(F)二元配置ANOVAとBonferroniポストホック検定により算出。データは±SEMで示した。
次に、幼児標識されたエングラム細胞を光遺伝学的に刺激することで、失われた幼児の物体記憶を復活させることが可能かどうかを調べた（図4Eおよび図S13F）。テスト当日、テストの3分前に光刺激を受けた動物は、新規物体への選好を示した（図4F）。一方、テスト前に光刺激を受けなかった動物は、新奇な物体も見慣れた物体も同じ時間探索した。このように、これらの物体記憶エングラムは幼児期健忘を生き延び、人工的に取り出すことができ、MIAによってその忘却を防ぐことができる。
げっ歯類の空間および物体課題は、ヒトの行動実験における並行的、並列的な物体／文脈および迷路学習アッセイの開発に有用である(48)。幼児期健忘の解析を能動的な迷路ベースの課題に拡張するため、我々は幼児および成体のC57BL/6 Jマウスを用い、バーンズ迷路の手がかり版を用いて空間的位置の記憶を調べた（図4Gおよび図S14G）。すべての成体マウスは、5回の訓練で脱出孔の位置を十分に学習し、脱出孔に到達するまでの待ち時間と移動距離が徐々に減少した（図S14、A、B、H、I）。成体とは異なり、幼児マウスは8日後ではなく1日後のテストでも、逃げ穴の位置に関する記憶の保持を示した（図4、H、I、図S14、C～F、J～O）。我々の知る限り、これはバーンズ迷路パラダイムを用いた幼児期健忘の最初の実証である。我々は、課題中に動物がとったナビゲーション戦略の変化をプロファイリングし、記憶内容を評価した（図4J）。ナビゲーション戦略はランダム、手続き的、文脈的に分類できる(49-51)。訓練から1日後にバーンズ迷路で空間記憶をテストしたところ、幼児マウスは文脈的探索戦略を主に用いた（図4K）。しかし、8日後のプローブ試行では、幼児マウスは探索戦略の切り替えを示し、手続き的戦略やランダム戦略に移行した（図4K）。この探索戦略の適応は、脱出プラットフォームの位置を忘れてしまったことを反映している。対照的に、成体マウスは訓練後1日目も8日目も同様の探索パターンを示す（図4L）。他の記憶形態と同様に、MIAモデルのオスの子どもは、空間ナビゲーション課題に対して幼児健忘を示さないこともわかった（図4、M～S）。
乳幼児期のバーンズ迷路における脱出プラットフォームの位置についてエングラム・アンサンブルを標識することにより、次に、成人期におけるエングラムのDG光遺伝学的刺激が脱出ホールの位置を示すかどうかを調べた（図4T）。実験的光刺激群は、プローブテストでバーンズ迷路に置かれる前に3分間の光刺激を受けた。実験的光照射群では、ゾーン2および3と比較して、脱出孔があるはずのゾーンで過ごす時間が有意に長かった（図4W）。ゾーン4とゾーン1の総滞在時間には有意差はなかったが、各場所での平均滞在時間をヒートマップ解析したところ、訓練中に以前脱出孔があった場所の周辺に集中していた（図4X）。無照明対照群では、ゾーン間の総滞在時間に差は見られなかった（図4のUとV）。別の実験（図S14P）では、記憶エンコード中の逃避孔の位置が実験図4Tと異なる、異なるコホートのマウスを訓練した。エンコード中の逃避孔の位置は、光刺激後の逃避孔の位置の想起成功には影響しなかった（図S14、Q～T）。DGのEYFP発現ニューロン（乳児のバーンズ迷路記憶のエンコード中に標識されたニューロン）を光遺伝学的に刺激すると、バーンズ迷路の脱出孔の位置を想起できる。
IL-17aは母親のポリ(I:C)による児の健忘に必要である。
免疫活性化とその下流のサイトカインであるIL-17aの直接投与が、小児健忘症の変化を誘導するのに十分であることを立証した。妊娠中のIl17aノックアウト（KO）ダムにE12.5でポリ(I:C)を注射した（図5A）。成体の雄のIl17a KOマウスは、P63で訓練すると、CFC記憶について正常な記憶保持を示した（図S15）。このことは、Il17a遺伝子型が成体のIl17a KOマウスの長期記憶保持に影響しないことを示唆している。MIA Il17a KOダムを持つ成体雌雄の子孫は、反復行動（図S16E）や社会的行動における欠損（図S16、AからD）を示さなかった。極めて重要なことに、幼児期の子孫はP25でCFC記憶について正常な幼児期健忘を示した（図5、BおよびC）。遺伝子モデルを用いて母親のIL-17aシグナル伝達を阻止すると、幼児期健忘症に対するMIAの影響は子孫で消失した。したがって、MIA後に見られる行動学的効果は、IL-17aシグナル伝達に特異的に依存している。我々は、免疫活性化のタイミングを母体から出生後へと変えることで、記憶保持に同じ効果があるかどうかを調べた（図5D）(52)。C57BL/6 J雄マウスにおける出生後の免疫活性化は、小児健忘に影響を与えなかったことから、IL-17aと免疫活性化が哺乳類の小児健忘傾向に影響を与えうる重要なウィンドウが出生前の発達中に存在することが示された（図5、EおよびF）。MIAの子孫に炎症反応を誘導すると、ASDにおける社交性の障害が一時的に回復することが示されている(23)。そこでわれわれは、記憶の符号化（P17）または記憶の想起（P25）の時期にIL-17aを投与することで、MIAの幼児期健忘症への影響を逆転させることができるかどうかを調べた（図5G）。MIA雄性子孫には、CFC（図5H）または想起試験（図5I）の3時間前にIL-17aを注射した。IL-17aまたはPBSのいずれを注射したかにかかわらず、MIA雄性幼児子孫は、訓練8日後のCFC記憶について正常な記憶保持を示した（図5、HおよびI）。このことは、小児健忘症に対するMIAの影響は、急性IL-17a投与によって逆転させることはできないことを示している。

図5. IL-17aは小児健忘症に対するMIA効果に必要である。
(A）IL17a KOマウスにおけるMIAの代表図。(B）IL17a KO雄マウスにおけるCFCの行動スケジュール。(C) Il17a KO雄性乳児マウスの訓練1日後または8日後の想起時の凍結レベル。(D) C57BL/6 J 幼児マウスにおける生後免疫活性化の行動スケジュール。注射器の記号はP3、P7、P14におけるPIC注射を表す。(E）CFCの行動スキーマ。(F)訓練8日後の雄マウスの凍結レベル。(G) MIA C57BL/6 Jの子マウスにおいて、記憶の符号化（P17）または想起（P25）の3時間前にIL-17aを注射する行動スケジュール。(HおよびI)訓練8日後に検査したときの雄マウス乳児の凍結レベル。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001は、(F、H、I)入れ子のStudent's t testまたは(C)入れ子のANOVAとBonferroni post hoc testにより算出。データは±SEMで示した。
考察
我々は、小児期の健忘、エングラムの発現、子宮内の免疫活性化状態を三位一体とした統合的な一連の解析を行った。これらの知見を総合すると、さまざまな記憶タイプの幼児期健忘と、記憶の基質としてのエングラム細胞は、胎生期の被験者の免疫学的経験によって調節できることが示された。MIAの効果により、生後発達を経ても乳児エングラムの自然な検索性が維持される。さらに、MIAがエングラムの可塑性を構造レベルで直接調節し、エングラムのアンサンブルサイズとエングラム樹状突起スパイン密度を変化させることがわかった。さらに、MIA下では、想起時に非エングラム細胞の活動が著しく減少するため、エングラムの再活性化はより大きな潜在的特異性を示す。このことは、競合するアンサンブルの干渉が減少したことを反映しているのかもしれない(53, 54)。さらに、われわれのデータは、多くのタイプの幼児記憶は発達の過程で自然に抑制されるが、そのエングラムは持続し、成人期には光遺伝学的直接刺激によって急性に活性化できることを示している(31)。最後に、下流のサイトカインであるIL-17aが、乳児期健忘に対するMIAの効果に十分かつ必要であることを示す。
これらの知見は、光遺伝学的な幼児記憶の再活性化が恐怖条件付けに特異的なものではなく、より複雑なナビゲーションや認識タスクの記憶も救出できることを示している。さらに、エングラムを人為的に更新することで、行動レベルでも細胞レベルでも標的記憶への自然なアクセスが回復し、幼児期健忘が逆転した。また、乳幼児期に形成されたエングラム細胞間の特異的な結合パターンは、分散した脳領域にわたって、成人期になってもそのまま残っている。このような分散したエングラムの結合パターンは、他の種類の健忘症でも生き残ることが示されており、脳に保持される特定の記憶情報（エングラムそのもの）を説明できるかもしれない(8, 9, 45, 55-58)。
われわれの分析や他の分析によれば、乳児期の健忘は生得的な自然忘却の一形態であり、生後の発達過程における特定の環境経験によって調節されることはないようである。胎内での免疫活性化は、エングラムを形成する能力が変化した脳状態の発達をもたらし、乳児期健忘は起こらない。出生後の免疫活性化は乳児期健忘に影響を与えないようであり、生得的な所定の忘却スイッチが出生時から固定されていると考えるのが妥当である。しかし、MIAとASDの遺伝的危険因子との相互作用により、出生後の炎症が忘却率を変化させる可能性がある(52, 59)。
我々の知見は、ASDの免疫学的モデルにおいて、乳児期の健忘を可能にする脳の状態が存在しないことを示唆しており、これらの知見は、ASDの症例において長期記憶保持が改善されたという証拠を提供しているトランスジェニックフライ実験やヒトのレトロスペクティブ研究を想起させるものである（60, 61）。MIA児の脳の状態は、幼児期健忘を示さないと思われる前社会性の哺乳類のそれを反映している可能性が考えられる（4, 62）。幼児期健忘は、重要な時期に発達可塑性によって調節されうる、遺伝的に調整された自然忘却の一形態なのかもしれない。今後の研究では、幼児期健忘の発生時期を決定するスイッチングメカニズムの性質、免疫系との相互作用、エングラム細胞機能とエングラムアンサンブル発現に対する可逆的な影響を明らかにする必要がある。将来、MIAモデルは、げっ歯類やヒトの生涯にわたる記憶と忘却のトランスレーショナルな研究の機会を提供するかもしれない(63)。
材料と方法
実験デザイン
本研究の目的は、発生を通じて記憶がどのように脳に蓄積されるかを調べることであり、特に乳児期健忘と免疫活性化によるその調節に焦点を当てた。マウスは無作為に実験群に割り付けられ、同腹の対照群またはその他の関連する対照群に割り付けられた。行動テストの間、研究者は実験群の治療条件について盲検化された。組織学的解析は、ネスト解析を用いて各マウスについて個別に行われ、MIA実験でも同じ方法が適用され、子マウスごとに解析が行われた。すべての実験を通じて、データ収集と解析は盲検下で行われた。
被験者
野生型実験にはC57BL/6 J亜系統C57BL/6JOlaHsdを用いた。Ai32-FosTRAPマウスは、FosTRAP（37、38）マウスをAi32（RCL-ChR2（H134R）／EYFP）（39、40）と交配させ、CreETRおよびEYFP導入遺伝子の両方を有する子孫を選択することによって作製した。FosTRAPトランスジェニック系統Fos-iCreは、誘導性c-fosプロモーターからiCreを発現する。タモキシフェンの代謝産物である4-OHTをIP注射すると、iCreは核に移行する。Ai32トランスジェニックマウスは、Creリコンビナーゼに暴露されるとチャネルロドプシン-2/EYFP（ChR2-EYFP）を発現する。TRAPマウスとAi32マウスの交配により、Fos-iCreとChR2-EYFPの両方を含む安定したトランスジェニック系統を作製することが可能となった。すべてのマウスは2～5匹で社会飼育され、12時間の明暗サイクルで、餌と水は自由に摂取できた。出生日を出生後0日目（P0）とした。幼児マウス（P17）は離乳期まで親マウスと同居させた。仔マウスの大きさは管理され、6匹以上の仔マウスからなる仔マウスはいなかった。乳幼児実験では、産仔の影響を制限するため、各産仔を群間で平衡させた。各実験群は平均3～5リットルで構成された。MIA実験については、実験群ごとの正確な産仔数は表S1を参照のこと。すべてのマウスは手術を受ける前に7週齢であった。手術後、マウスは実験前に自宅のケージで最低2週間回復させた。マウスの世話と治療に関するすべての手順は、Health Products Regulatory Authority（HPRA）アイルランドのガイドラインに準拠した。
Ai32-FosTRAPマウスにおけるChR2-EYFP発現
このシステムで記憶エングラム細胞を標識するために、マウスに学習イベントの2時間後に4-OHT（50mg/kg）を腹腔内注射した。Fos-iCre株は誘導性c-fosプロモーターを発現している。4-OHTの注射はiCreリコンビナーゼを活性化する。活性化されたiCreリコンビナーゼは核に移動し、2つのlox部位に作用して、ChR2/EYFP導入遺伝子の発現を妨げる停止コドンを除去する。ChR2/EYFP導入遺伝子の発現は、4-OHT注射72時間後のiCre発現組織においてpCAGプロモーターによって駆動される。Ai32-FosTRAPマウスにおけるChR2-EYFPの活動依存的発現のために、カイニン酸（5mg/kg）を腹腔内に注射し、次いでカイニン酸注射の2時間後に4-OHTを注射した。
定位光ファイバー埋め込み
マウスはアベルチン（500 mg kg-1）を用いて麻酔した。各動物は、DG注入のために、-2.0mmの前後方向（AP）と±1.3mmの縦方向（ML）で直径0.5mmのドリルビットを用いた両側開頭術を受けた。両側のパッチコード光ファイバーインプラント（コア径200μm）を注入部位の上方［-1.9mm背腹側（DV）］に下げた。光ファイバーインプラントを頭蓋骨に固定するために接着セメントを塗布した。インプラントに保護キャップを固定し、手術部位を閉じるために歯科用セメントを塗布した。各動物に皮下（SC）注射でメロキシカム鎮痛剤（0.075 ml/5 g）を投与し、麻酔から完全に回復するまでヒーティングパッドの上に置いた。すべてのマウスは、その後の実験の前に2週間回復させた。すべての線維部位は組織学的に確認した。
免疫組織化学
マウスをペントバルビタールナトリウム50μlで過剰投与し、PBSで経心的に灌流した後、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で灌流した。抽出した脳は4%PFA中4℃で一晩保存し、PBS中で保存した。50マイクロメートルの冠状スライスをビブラトームで切断し、PBS中に回収した。スライスを0.2% Triton X-100を含むPBS（PBS-T）で洗浄し、10%正常ヤギ血清を含むPBS-Tで室温で1時間ブロッキングした後、一次抗体と4℃で一晩インキュベートした。スライスをPBS-T 0.1%で洗浄し、二次抗体で1時間インキュベートした後、PBS-T 0.1%で再度洗浄した。VECTASHIELD DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)を用いてスライスをスーパーフロストスライドにマウントし、オリンパスBX51正立顕微鏡で可視化した。細胞計数実験と樹状突起棘解析のために、PBS中DAPI（1:1000）で追加インキュベーションして核を標識し、ライカSP8ゲーテッドSTED（stimulated emission depletion）ナノスコープで画像を取得した。画像はすべて40倍の倍率で撮影した。
細胞計数
活性細胞の集団が、同じコンテクストまたは異なるコンテクストへの曝露の間で重複する程度を測定するために、DG、AMG、RSC、PAGにおけるEYFP+およびc-Fos+免疫反応性ニューロンの数を数えた。免疫組織化学的分析のため、すべての動物をアッセイまたは光刺激の45分後に安楽死させた。各動物の海馬背側から4枚の冠状標本を採取した。光遺伝学的刺激実験では、正確な埋め込み部位を有するスライスのみを計数に用いた。切片はLeica SP8ゲーテッドSTEDナノスコープで40倍の倍率で撮像した。関心領域を手作業で同定し、Fijiを用いて各関心領域の面積を算出した。DG内のDAPI細胞の総数を算出するため、DG内のEYFP陽性細胞のサンプルの平均直径を各動物から採取し、細胞の面積を算出した。細胞の総数は、DGの面積を細胞の面積で割ったものとして推定した。AMG、PAG、RSCについては、無作為に選んだ3つの関心領域におけるDAPI細胞の数を数え、その領域の総面積とともに用いてDAPI細胞の総数を求めた。c-Fos陽性細胞およびEYFP陽性細胞の総数は、Adobe Photoshop CC 2018を使用して、各領域について手作業で同定およびカウントした。各領域でEYFPを発現する細胞の割合を計算するために、EYFP陽性細胞の総数を各領域のDAPI陽性細胞の総数で割った。各領域でc-Fosを発現している細胞の割合を計算するために、c-Fos陽性細胞の総数を各領域のDAPI陽性細胞の総数で割った。非エングラム細胞の活性化は、c-Fos陽性細胞の総数からEYFPとc-Fosの両方が陽性の細胞の総数を引くことによって定量化した。エングラムの再活性化を定量化するために、EYFP陽性細胞とc-Fos陽性細胞の数を、EYFP陽性細胞またはDAPI陽性細胞の総数に占める割合として定量化した。EYFP+細胞のパーセンテージとc-Fos+細胞のパーセンテージの合計を掛け合わせ、100で割ることによって、チャンスのレベルを計算した。これにより、EYFP+およびc-Fos+標識細胞の総数に対するエングラム再活性化の可能性を決定することができた。
樹状突起スパインの解析
Ai32-FosTRAPマウスのDGエングラム細胞の樹状突起をP25のリコール後に解析した。樹状突起棘はLeica SP8ゲートSTEDスコープを用いて画像化した。50μmの冠状脳切片のZ-Stack画像（10μm）をLeica Application Suite X（LAS X）ソフトウェア（線平均、2；ズームファクター、1.7～1.9）を用いて40倍で撮影した。樹状突起スパインの解析には、Imarisソフトウェア（Oxford Instruments, Imaris v9.5）を使用した。半自動ニューロフィラメントトレーサーツールを用いて樹状突起をトレースし（10μm）、樹状突起棘を個々にハイライトし、ソフトウェアで手動でトレースした。各フラグメントは異なるChR2-EYFP+細胞を表す。パラメータはImarisソフトウェアを用いて自動生成した。樹状突起スパイン頭部の直径と体積を解析するために、各フラグメントの平均を取り、プロットした。
行動アッセイ
すべての行動実験は、1日の光のサイクル（午前7時から午後7時）の間に行われた。すべての行動対象は、連続する3日間に3分間、研究者により個別にハンドリングに慣らされた。ハンドリングは飼育室で行った。各ハンドリングセッションの直前に、マウスを別々のケージに入れて実験室付近まで移動させ、移動に慣れさせた。
文脈恐怖条件づけ
CFCには3つの異なるコンテクストを用いた。コンテクストAは31cm×24cm×21cmのアソシエイト室で、床は取り外し可能な格子状（棒の直径は3.2mm、間隔は7.9mm）、天井は不透明な三角形で、0.25%のベンズアルデヒドで香りづけした。コンテクストBのチャンバーは29cm×25cm×22cmのCoulbourne Instrumentsのチャンバーで、床はパースペックスの白色、照明は明るい白色、香りは1％酢酸であった。各セッションは330秒で、150秒、210秒、270秒の3回、2秒間0.75mAのショックを与えた。マウスは最後のフットショックの60秒後に条件付けチャンバーから出され、ホームケージに戻された。すべての想起または文脈汎化テストは180秒間行われた。テスト条件は、ショックが提示されないこと以外は訓練条件付けと同じであった。最大4匹のマウスが4つの同じチャンバーで同時に行動した。試験室の床は、試験前および試験と試験の間にトライジーンで清掃した。マウスは別々のパースペックスケージで実験室と行き来した。すべての実験群は、コンテクスト内のチャンバーについてカウンターバランスをとった。
コンテクスト事前暴露
コンテクスト前暴露のため、マウスはコンテクストA（31cm×24cm×21cmの中位アソシエイツ室、床は取り外し可能な格子状）に10分間暴露された。マウスをチャンバーから取り出し、ホームケージに戻した。翌日、マウスを再びコンテクストAに入れ、即座にフットショック（1 mA、2秒）を与えた。マウスはショックの1分後にチャンバーから取り出され、ホームケージに戻された。最大4匹のマウスを4つの同じチャンバーで同時に行動させたが、更新中は1匹ずつ行動させた。すべての想起または文脈特異性テストは180秒間であった。実験室の床は、実験前および実験と実験の間にトライジーンで清掃した。
新規物体認識
各被験者は物体獲得の前日に10分間、長方形のテストアリーナに馴化させられた。物体獲得中、2つの同じ物体がアリーナの隣接する壁に配置された。マウスは両方の物体を10分間自由に探索した後、ホームケージに戻された。テストでは、慣れ親しんだ物体を新しい物体と交換し、各被験者に5分間の探索時間を与えた。物体探索は、被験者の鼻が物体の半径2cm以内に入った時間と定義した。各試行の間に、テストアリーナと物体はTriGeneで洗浄された。エングラムラベリング実験のために、P17マウスは物体獲得2時間後に4-OHT注射を受けた。光遺伝学的再活性化実験では、動物はテストアリーナに入れられる前に直接3分間の青色光刺激を受けた。
バーンズ迷路
訓練は5回の試行からなり、1回の試行時間は10分とした。各試行の開始時、マウスは迷路装置の中央にある黒いポリ塩化ビニルのスタートチャンバーに入れられた。15秒後、スタートチャンバーを外し、脱出トンネルに入るまでの潜時間と移動距離を記録した。被験者はホームケージに戻され、各試験の間に40分の間隔をあけた。脱出トンネルの位置は室内の空間的手がかりに対して固定されたままであった。プローブ試行ごとに脱出トンネルを装置から外した。各マウスは5分間迷路の4象限を自由に探索した後、ケージから取り出され、ホームケージに戻された。取り外した脱出用トンネルの場所に到達するまでの潜伏時間と移動距離、および各四分円で過ごした時間を記録した。各試行後、装置と脱出トンネルをTriGeneで洗浄した。エングラム標識実験のために、P17マウスは5回目の試行の2時間後に4-OHT注射を受けた。光遺伝学的再活性化実験では、実験動物に青色光刺激を3分間与えた。
三室社会的相互作用
マウスは2つの空のホルダーのあるチャンバーに10分間慣らした。翌日、マウスをチャンバーの中央に置き、5分間3つのチャンバーを探索させた。このテスト期間中、1つのチャンバーのホルダーに社会的物体（新奇なマウス）を、もう1つのチャンバーのホルダーに無生物物体（レゴブロック）を入れた。物体探索と移動距離はANY-mazeビデオ追跡ソフトウェアを用いて追跡した。
反復アッセイ
大型ホームケージに深さ5cmの木材チップを敷き詰め、軽くたたいて表面を平らにした。20個の同じガラスビー玉(直径15mm)からなる一貫したパターンを、ウッドチップ敷料の表面に均等に(4cm間隔で)置いた。マウスは試験場で30分間放置された。分析のため、試験前後に写真を撮った。ビー玉の深さの3分の2が埋まった場合、ビー玉は埋まったとみなされた。
光遺伝学的エングラム再活性化
光遺伝学的エングラム再活性化は、31 cm × 24 cm × 21 cmのメド・アソシエイツ・チャンバー（白色パースペックスの床と湾曲したインサートを備え、薄暗く、0.25%アセトフェノンの香りがする）で行った。光ファイバーインプラントは45nmのレーザーダイオードファイバー光源（Doric LDFLS 450/080）に接続された。習慣化セッションは12分間であった。試験中、12分間のセッションは4つの3分間のエポックに分けられ、2つのライトオフエポックと2つのライトオンエポックに分けられた。ライトオン・エポックでは、パルス幅15msの青色光刺激（20Hz）が、3分間の全時間にわたって光ファイバー・インプラントを介して照射された。12分間のセッションが終わると、マウスは直ちにレーザーから外され、ホームケージに戻された。
人工更新
コンテクストAは、31×24×21cmのメド・アソシエイツ・チャンバーで、床は取り外し可能な黒色パースペックス、天井は黒色三角形で、0.25％ベンズアルデヒドで香りづけした。コンテクストBへの曝露は長方形のテストアリーナで行われた。文脈記憶の人為的更新は、取り外し可能な格子状の床、明るい白色照明、1％酢酸の香りをつけた29×25×22cmのCoulbourne Instruments社製チャンバー、Context Cで行われた。コンテクストA、B、Cはすべて異なる行動室に設置された。光ファイバーインプラントは45nmのレーザーダイオードファイバー光源（ドーリックLDFLS 450/080）に接続された。7分間のセッションは、2分間の順応期間の後、パルス幅15msの青色光刺激（20Hz）を5分間、光ファイバーインプラントを通して行った。2秒間に0.75mAのショックが3回、セッションの4分、5分、6分に行われた。7分間のセッションが終わると、マウスは直ちにレーザーから外され、ホームケージに戻された。
母体免疫活性化
マウスは一晩交尾させた。雌の体重を測定し、精液栓の有無を調べ、E0.5とした。E12.5に、妊娠した雌マウスに20mg/kgのポリ(I:C)HMW（高分子量）（InvivoGen）（13、64、65）、50μg/kgのrmlIL-17a（Immunotools）、または対照のPBSを単回皮下注射した。より詳細な情報については、表S2(66)を参照のこと。P17またはP25でのrmlIL-17a注射のために、マウスに50ug/kgのrmlIL-17a（Immunotools）または対照PBSを、リコール試験の3時間前に単回皮下注射した。ELISAによる血清分析のために、PBSまたはpoly(I:C)(20 mg/kg)のいずれかの皮下投与24時間後に雌マウスから血清を採取し、さらに使用するまで-20℃で凍結した。血 清をまず1:5に希釈し、ELISA MAX Deluxe Set (Biolegend) を用いてIL-17aレベルを測定した。
出生後の免疫活性化
P3、P7、およびP14に、20 mg/kgのpoly(I:C)HMW（InvivoGen）または対照のPBSをマウスに単回皮下注射した。
遺伝子型決定
各マウスの耳パンチからゲノムDNAを抽出し、遺伝子型解析のためにTransnetyx社に送付した。
統計解析
すべての実験は、実験群を盲検化して解析した。すべてのビデオはランダム化してから手動で採点した。行動はデジタルビデオカメラで記録した。ビデオは個々に手動採点され、すべての手動採点中、調査者は実験条件と試験日を盲検化した。データ解析と統計は、GraphPad Prism 6.00（GraphPad software）またはRStudio v2023.03.0+386を用いて行った。独立群間比較には、対応のないスチューデントのt検定を用いた。群内の差の評価には一対のStudentのt検定を用いた。分散分析(ANOVA)とそれに続くBonferroni post hoc 検定は、適切な場合、互いに有意な条件を決定するために使用された。外れ値は、P < 0.05のGrubbs検定を用いて検出した。細胞計数解析では、結果はマウスごとに入れ子式t検定または入れ子式ANOVAとそれに続くボンフェローニ・ポストホック検定を用いて解析し、各記号はN = 1を表す。MIA行動解析では、結果は入れ子式t検定または入れ子式ANOVAに続いてボンフェローニ・ポストホック検定を用い、リターごとに解析した（表S1）。ピアソンの相関係数を用いて2つの変数間の関係を測定した。結果は平均値とSEMで表示し、P < 0.05のときに有意と判断した。
謝辞
有益な議論をしてくれたR. CusackとM. Ramaswamiに感謝する。J. O'Leary、M. Pezzoli、L. Marks、その他Ryan研究室のメンバーの同僚としての支援と科学的な意見に感謝する。
資金提供： 本研究は、European Research Council Starting Grant, project "MEME"（助成金番号715968、T.J.R.へ）、Science Foundation Ireland - President of Ireland Future Research Leaders Award（助成金番号15/YI/3187、T.J.R.へ）、Jacobs Foundation Research Fellow（T.J.R.へ）の助成を受けた。 ジェイコブズ財団研究奨学金（T.J.R.へ）、リスター予防医学研究所研究賞（T.J.R.へ）、脳・行動研究財団若手研究者助成金（T.J.R.へ）、ベーリンガーインゲルハイム財団博士研究員奨励金（S.D.P.へ）。
著者貢献 概念化： 方法論：S.D.P.、T.J.R.： 調査：S.D.P.、C.O.-d.S.L.、L.L.、T.J.R： S.D.P.、E.S.、L.G.Z.、C.O.-d.S.L.、E.P.B.、A.D.、T.J.R. 資金獲得： T.J.R.およびS.D.P.： 原案執筆：S.D.P.、T.J.R： 原稿執筆：S.D.P.、T.J.R.： S.D.P.、E.S.、L.G.Z.、C.O.-d.S.L.、L.L.、A.D.、T.J.R.。
競合利益： 著者らは、競合する利益はないことを宣言する。
データおよび資料の入手： 本論文の結論を評価するために必要なすべてのデータは、論文および/または補足資料に記載されている。
補足資料
このPDFファイルには以下が含まれている：
図S1～S16
表S1およびS2
ダウンロード
4.02 MB
参考文献および注釈
1
C. Rovee-Collier, 幼児の記憶の発達. Curr. Dir. Psychol. Sci. 8, 80-85 (1999).
参考文献へ
クロスリファレンス
検索
Google SCHOLAR
2
N. ニューカム、A.B.ドラムミー、N.A.フォックス、E.リー、W.オッティンガー-アルバーツ、幼児期の記憶：どの程度、どのように、そしてなぜ（あるいはなぜ）記憶しないのか。Curr. Dir. Psychol. サイエンス 9, 55-58 (2000).
参考文献へ
クロスリファレンス
検索
Google SCHOLAR
3
B. 幼児および成体ラットにおける学習恐怖の保持と消失。J. Comp. Physiol. Psychol. 55, 1-8 (1962).
参考文献へ
クロスリファレンス
グーグルスクーラー
4
K. 海馬の神経新生は成人期と幼児期の忘却を制御する。Science 344, 598-602 (2014).

クロスリファレンス
パブメド
ISI
Google SCHOLAR
(0)
eレターズ
eLettersは継続的な査読のためのフォーラムです。eLettersは編集、校正、索引付けはされませんが、選別はされます。eLettersは論文について実質的で学術的なコメントを提供する必要があります。図表を埋め込んで投稿することはできませんし、eレター内での図表の使用は基本的に推奨しません。図表が不可欠な場合は、eレターの本文中に図表へのリンクを含めてください。eレターを投稿する前に、利用規約をお読みください。

この記事に関するeレターはまだ発行されていません。

TrendMDのおすすめ記事
忘れられてはいるが、失われてはいない
レスリー・K・フェラレッリ、サイシグナル、2016年
侵害受容器活性が非イオン性NMDA受容体シグナル伝達を誘導し、脊髄の再固定化と病的疼痛の逆転を可能にする
Hantao Zhangら、Sci Adv誌、2023年
無条件刺激による記憶更新と条件付き刺激による記憶更新の根底にある恐怖エングラム符号化の変化
Shuai-Wen Tengら、Sci Adv誌、2023年
牛乳から記憶へ
レスリー・K・フェラレッリ、サイ・シグナル、2014年
成体新生顆粒細胞は、記憶検索において情動状態に依存した適応性を付与する
ボー・レイほか、Sci Adv誌、2022年
長期短期記憶ニューラルネットワークに基づく低緯度地域における電離層垂直全電子量予測モデル
Tong-Bao Zhangほか、Chinese Physics B、2022年
超伝導回路におけるハードコアホール管
Xin Guan 他, 中国物理B, 2022
縮小二層板モデルに基づく温度駆動4次元印刷二層構造の複雑変形シミュレーション
宋俊傑ほか, 応用数学と力学（英語版）, 2021
熱弾性誘電体のムーア-ギブソン-トンプソン理論
J. R. Fernández 他, 応用数学と力学（英語版）, 2021
数学的解析： メモリスタからフラクメミリスタへ
Wu-Yang Zhuほか、中国物理B、2022年
搭載
最新号
サイエンス・アドバンシスの表紙画像
散発性前庭神経鞘腫患者の血漿中における免疫関連バイオマーカー候補の同定
Sasa Vasilijic Nadia A. Atai et al.
CLIP-Seq解析によるC9ORF72 ALS/FTD poly-GR病態に対する保護リボソームRNAベイトオリゴヌクレオチドの設計
Juan A. ortega ivan r. sasselli et al.
プーチンのプロパガンダがロシア人の軍事侵攻への強い支持を引き出したという戦前の実験的証拠
Suthan Krishnarajan Jakob Tolstrup 著
広告
サイエンスアドバイザーの登録
ScienceAdviserに登録すると、最新のニュース、解説、研究を毎日受信トレイに無料でお届けします。

最新ニュース
サイエンス・インサイダー10 nov 2023
小型原子炉の建設計画が白紙に
サイエンスインサイダー10 nov 2023
医学教育にはナチスの過去を含めるべき 専門家委員会が提言
NEWS9 11月 2023
飛躍の時？サイエンス誌恒例の博士ダンスコンテスト開催中
NEWS9 NOV 2023
事前登録、透明性、大規模サンプルが心理学研究の再現率を約90％に押し上げる
NEWS9 NOV 2023
ニュース一覧 魚の家系図、AIの安全性研究、オープンアクセスの次の一手
ニュース特集9 nov 2023
ウクライナとの戦争で変貌した世界で奮闘するロシアの科学者たち
広告

RECOMMENDED
REPORTMAY 2015
エングラム細胞は逆行性健忘下で記憶を保持する
研究論文2023年6月
条件付き刺激による記憶更新と無条件刺激による記憶更新の根底にある恐怖エングラム符号化の変化
研究論文2023年5月
脳の成熟期における海馬のエングラム形成を制御するメカニズムの変化
1980年6月号
幼児記憶の再活性化
広告
全文を見る|PDFをダウンロード
スライドショーをスキップする
フォローする
ニュース
全てのニュース
サイエンスインサイダー
ニュース特集
サイエンス・ニュースを購読する
ニュース・フロム・サイエンスFAQ
ニュース・フロム・サイエンスについて
採用情報
採用情報
求人を探す
雇用者ハブ
コメント
オピニオン
分析
ブログ
ジャーナル
サイエンス
科学の進歩
科学免疫学
サイエンス・ロボティクス
サイエンス・シグナル
サイエンス・トランスレーショナル・メディシン
サイエンス提携誌
著者と査読者
著者向け情報
査読者情報
図書館員
機関購読の管理
図書館管理ポータル
見積依頼
図書館員FAQ
広告主
広告キット
カスタム出版情報
求人情報を掲載する
関連サイト
AAAS.org
AAASコミュニティ
EurekAlert
教室での科学
AAASについて
リーダーシップ
AAASでの仕事
賞と受賞
ヘルプ
よくある質問
アクセスと購読
単一号の注文
別刷りと許可
TOCアラートとRSSフィード
お問い合わせ
AAASロゴ
© 2023 米国科学振興協会. 無断複写・転載を禁じます。AAASはHINARI、AGORA、OARE、CHORUS、CLOCKSS、CrossRef、COUNTERのパートナーです。Science Advances eISSN 2375-2548。

利用規約 プライバシーポリシー アクセシビリティ
参考文献1