水圏環境由来のElizabethkingia種のゲノム解析： 臨床伝播の可能性を示す証拠
微生物科学における現在の研究
第3巻、2022年、100083号
水圏環境由来のElizabethkingia種のゲノム解析： 臨床伝播の可能性を示す証拠
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666517421000638
著者リンク オーバーレイパネルを開くSopheak Hem a b, Veronica M. Jarocki a b, Dave J. Baker c, Ian G. Charles c d, Barbara Drigo e, Sarah Aucote e, Erica Donner e, Delaney Burnard f, Michelle J. Bauer f, Patrick N.A. Harris f, Ethan R. Wyrsch a b, Steven P. Djordjevic a b
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https://doi.org/10.1016/j.crmicr.2021.100083Get 権利と内容
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ハイライト
臨床および環境水中のElizabethkingia anophelis分離株の近縁種（SNV 50未満）を同定した。
新種Elizabethkingia umarachaの同定（暫定）。
Elizabethkingia spp.の新規 blaGOB および blaB カルバペネマーゼと拡張スペクトルβ-ラクタマーゼ blaCME アレルが同定されました。
Elizabethkingia spp.の世界的な系統とパンゲノムの解析 - Elizabethkingia spp.
Elizabethkingia spp.の水生環境の67 / 94 (71.3%)において、未特性の遺伝子カーゴを持つ新規ICEエレメントが同定された。
概要
エリザベスキンギア属菌は、水生環境に遍在し、医療現場の水系に定着し、6大陸25カ国で報告されている新興の日和見病原体である。エリザベスキンギア感染症は治療が困難であり、症例致死率も高い。カルバペネマーゼとセファロスポリナーゼをコードする染色体BlaB、BlaGOB、BlaCME遺伝子はエリザベスキニア属に特有のもので、アミノグリコシド、フルオロキノロン、スルファメトキサゾール-トリメトプリムに併用耐性を示す報告がある。今回、オーストラリアの水環境から分離された複数の広域スペクトル型メタロ-β-ラクタマーゼ（blaBおよびblaGOB）および拡張スペクトル型セリン-β-ラクタマーゼ（blaCME）遺伝子を有する94株の全ゲノム配列の特徴を明らかにし、国内臨床株および国際株との比較系統樹解析を行った。 qPCRはソース環境におけるエリザベスキニア種のレベルを定量するために行った。抗生物質のMIC検査では、カルバペネム系とセファロスポリンの耐性が顕著であったが、フルオロキノロン、テトラサイクリン、トリメトプリム・スルファメトキサゾールに感受性があった。系統解析の結果、環境中のE. anophelis 3株はオーストラリアの臨床分離株のE. anophelisと近縁であり（約36SNP）、新種E. umeracha sp. novelが発見された。また、国内外から分離されたE. umeracha sp.novelのゲノム解析から、E. umeracha sp.novelの起源や移動性遺伝子の伝達能力に関する知見を得ることができた。
図解抄録
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はじめに
環境は日和見病原体と抗菌薬耐性（AMR）菌の両方のリザーバーとして知られている（石井、2019）。著名な広域スペクトルβラクタマーゼ（ESBL）、キノロン耐性遺伝子およびカルバペネマーゼは海洋および土壌細菌に由来し、その後、水平遺伝子移動（HGT）を通じて臨床分離株に流入しており（Poirel et al., 2005; Wyres and Holt, 2018）、環境微生物集団を調査するとともに、感染の伝達経路と考えられるものを特定することは重要です（Ishii, 2019）．
Elizabethkingia種は、環境、特に土壌や淡水体、および昆虫や両生類で一般的に見られるWeksellaceaeの好気性、グラム陰性桿菌のメンバーです（Dworkinら、2006；García-Lópezら、2019；Jeanら、2014；Leyら、2019）。現在、6種のElizabethkingiaが確認されているが、いずれも様々な分類学的および命名法の転換が行われている（Lin et al.、2019a）。1959年に分離されたElizabethkingia meningosepticaは、Flavobacterium meningosepticumおよびChryseobacterium meningosepticumとして知られてきた（King、1959；Vandamme、1994）。のロシアの宇宙ステーションから分離されたElizabethkingia miricolaは（Liら（2003））、Chryseobacterium miricolaおよびElizabethkingia genomospecies 2として知られている（Holmesら、2013；Nicholsonら、2018）。2011年に分離されたElizabethkingia anophelisは、Elizabethkingia endophyticaおよびElizabethkingia genomospecies 1として記載されています（Doijad et al., 2016; Holmes et al., 2013; Kämpfer et al., 2015; Nicholson et al., 2018）。さらに、2017年にはElizabethkingia bruuniana、Elizabethkingia ursingii、Elizabethkingia occultaの3種が新たに定義され、これまで前者はElizabethkingia genomospecies 3、後者2種はともにElizabethkingia genomospecies 4としてまとめられていました（Holmes et al., 2013; Nicholson et al.、2018）。
エリザベスキンギア属は、病院や医療環境内で治療が困難な新興病原菌を構成するため、関心が高まっています（Green et al., 2008; Lau et al., 2016; Teo et al.、2013）。エリザベスキン類感染症は、新生児や免疫不全患者に多く発生し、最も多い症状は敗血症です（Sarma et al.、2011）。しかし、髄膜炎（E. meningosepticaおよびE. anophelisによる）、肺炎、尿路感染、皮膚・軟部組織感染の報告もよくあります（Lin et al., 2009; Venkatesh et al., 2018）。エリザベスキンギア属の症例致死率は、すべての種で約25.2%と高く（Seong et al., 2020）、敗血症や髄膜炎の症例ではE. meningosepticaで54%（Moore et al., 2016）、 E. anophelis感染で28.4%と高い（Lin et al.、2018b）。エリザベスキンギアの病原性はほとんど不明ですが、カプセルタンパク質、アドヘシン、鉄取り込みタンパク質、バイオフィルム形成に寄与するタンパク質など、いくつかのビルレンスファクターのホモログが報告されています（Chen et al., 2015; Janda and Lopez, 2017; Li et al.）
エリザベスキニア感染症の治療は、ほとんどの種がカルバペネムや他のβ-ラクタム、アミノグリコシドを含む臨床的に重要な抗生物質に本質的に耐性であるため、複雑です（Janda and Lopez, 2017; Li et al, 2015; Lin et al., 2019a）。フルオロキノロンおよびスルファメトキサゾール-トリメトプリムに対する耐性も観察されている（Lin et al.、2018a）。一貫して、これまでに配列決定されたElizabethkingia種ゲノムは、カルバペネム系薬剤への耐性に関連する遺伝子blaBおよびblaGOB、すべてのセファロスポリンへの耐性を付与する拡張スペクトルβラクタマーゼ遺伝子blaCMEなどの複数の染色体抗菌薬耐性遺伝子（ARGs）を保有しています（González and Vila，2012）。フルオロキノロン耐性については、DNAジャイレースサブユニットA（GyrA）の保存領域内にSer83IleやSer83Argなどの変異が確認されています（Jian et al., 2018）。ARGはまた、Elizabethkingia integrative and conjugative elements (ICEs) (Xu et al., 2019)、宿主ゲノムに統合することができ、染色体複製や細胞分裂時に伝播する移動遺伝要素 (MGEs) にも同定されている (Wozniak and Waldor, 2010). Elizabethkingiaの2つの種から、たった2つのプラスミドが報告され、配列が決定されています： E. anophelis strain F3201（Xuら、2019）およびE. miricola strain EM_CHUV（Opotaら、2017）です。
エリザベスキンギア感染の症例は過去数十年にわたって増加しており、6大陸の25カ国で報告が表面化している（Breurec et al., 2016; Burnard et al., 2020; Hsu et al., 2011; Lau et al., 2015; Lin et al., 2019b; Perrin et al., 2017; Reed et al., 2020; Teo et al., 2013）。エリザベスキアの感染様式は依然として不明ですが、汚染された環境、特に水辺、医療機器、血液透析装置や機械換気装置、病院内のフォマイト、水栓、医療従事者の手への曝露がすべて関与しています（González and Vila, 2012; Lin et al., 2018a）。さらに、E. anophelisによる感染は、中央アフリカ共和国の蚊に関連した感染イベントと関連している（Frank et al., 2013）；しかし、この仮説は、母親から乳児への垂直感染の報告（Lau et al., 2015）により論争になっている。
Elizabethkingia種は、多剤耐性新興病原体であり、高い症例致死率を示します。これまで、Elizabethkingiaに関する研究のほとんどは、臨床分離株を特徴付けるものでした（Eriksen et al.、2017）。しかし、水域はリザーバーであり、エリザベスキンギアの感染経路に関与していることを考慮し、本研究では、南オーストラリアの水域環境に由来する94のエリザベスキンギア分離株由来の全ゲノム配列（WGS）のゲノム解析、ならびにそのゲノムおよび抗菌薬耐性プロファイルの特性評価および他の公開されたエリザベスキンギアの環境および臨床菌株との比較を行っています。材料と方法
2.1. サンプルの収集と細菌の分離
南オーストラリア州で2018年7月から2019年7月まで、水サンプル（約10 L）を毎月3回採取した。4つの場所は、2つのソースを表していた： (i)停滞水(サイトA)と(ii)季節的な降雨/流出流入(サイトBとC)または川(サイトD)によって涵養される内陸湿地。サイトAは、自然の雨水集水域を堰き止めて作られた田舎の小さな貯水池である。フェンスで囲まれており、家畜の出入りや影響はないが、鳥類、特にカモが定期的に訪れていた。サイトB（湿地）は、19.4ヘクタールの面積を持つレクリエーション保護区である。サイトC（湿地）の面積は172ヘクタールで、最大容量は1200メガリットルでした。2つの湿地帯の間の距離は約10kmでした。サイトDは、全長2508kmの河川で、サンプリングされた場所は、合計42ヘクタールの湿地近くの流水であった。サイトDはレクリエーション目的でのみ使用されていた。すべてのサイトで、表面水サンプルは、3つの滅菌済み10Lコレクションタンクを水面下に浸漬することで採取されました。すべてのサンプルは採取後、直接氷上に保存され、2-3時間以内に処理された。
2.2. カルバペネム耐性Elizabethkingia属菌の単離
サンプルは採取当日に処理した。まず、水試料を連続希釈し、2～3回の連続10倍連続希釈液から500μlをOxoid Brilliance™ CRE Agarプレート（Thermo Fisher Scientific Australia, Adelaide, SA）に3連でプレーティングした。次に、あらかじめ滅菌した爪楊枝を用い、CRE寒天培地で成長した単一コロニーをPlate Counting Agar (PCA; Thermo Fisher Scientific)にプレーティングしました。PCA培養物は、37℃で18〜24時間、または十分な細菌増殖が起こるまでインキュベートした。合計667個の細菌を分離し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF MS）（Bruker Daltonics）で同定し、グリセリンストック（40％v／v）で-80℃に保存した。
2.3. MALDI-TOF MSによる菌種同定
新鮮な細菌単離株（<24時間齢）を1mlの70％エタノールに再懸濁し、1分間ボルテックスし、13,000 rpmで2分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを5μlの70％ギ酸（Baker；90％ストック）および5μlのアセトニトリル（CAN、LC-MSグレード、Merck）で再溶解した。13,000rpmで2分間遠心分離した後、上清1μlをターゲットプレートにスポットし、乾燥させた。α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（HCCA）（1μl）マトリックス（10mg/ml-1）と重ね合わせ、室温で結晶化させた。2.5％（v/v）トリフルオロ酢酸を含む50％（v/v）ACN中のBacterial test standard（Bruker Daltonics）（LC-MS Grade; Thermo Fisher Scientific）1μlをスポットし、乾燥させて、キャリブレーション用にHCCAと重ね合わせた。MALDI-TOF MS分析は、MALDI Biotyper 3.0 Real-time Classification (version 3.1, Bruker Daltonics) およびFlexControl (version 3.4, Bruker Daltonics) ソフトウェアの下、線形ポジティブモードで動作するautoflexTM speed MALDI-TOF/TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics) で取得しました。スペクトルは、レーザーパワーを可変にして2000～20000Daの質量範囲で取得し、40ショットステップで合計1200個の合計スペクトルを収集した。サンプルのスペクトルは、MSPデータベースライブラリ（5989のMSPエントリ）に対して同定された。同定スコアが2.300-3.000の場合は種同定の可能性が高い、2.000-2.299の場合は属同定の確実性と種同定の可能性が高い、1.700-1.999の場合は属同定の可能性が高い、1.699以下の場合は信頼できないことを示す。
2.4. DNA抽出
水試料は、0.2μmのニトロセルロースフィルター（ミリポア社製）で真空濾過して濃縮し、DNA抽出まで-80℃で保存した。各0.2μmフィルターからの全ゲノムDNAは、DNeasy PowerWaterキット（Qiagen）を用いて、製造者の説明書に従って抽出した。MALDI-TOF MSで同定されたスコア2.000-3.000のコロニーからのDNAは、DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)を用いて、製造者の指示に従って抽出されました。核酸の品質（すなわち、260/280比）は、Nanodrop 1000 spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific）を用いて測定した。すべてのサンプルのDNA濃度は、Qubit装置とHigh Sensitivity dsDNA HS Assay kit（Thermo Fisher Scientific）を用いた蛍光定量法により測定し、精製したDNA抽出物は使用するまで-20℃で保存した。
2.5. Elizabethkingia spp.、E. anophelisおよびE. meningosepticaの絶対定量化
Elizabethkingia spp.、E. anophelisおよびE. meningosepticaアッセイの絶対量、効率、直線範囲および再現性を決定する標準曲線を、American Type Culture Collection (ATCC) strain E. meningoseptica ATCC 13,253 および MALDI-TOF および全ゲノム配列決定による臨床分離株 E. anophelis DSM 23,781 を用いて作成しました。ATCC株と臨床分離株は、QIAamp DNA MiniおよびBlood Miniキットを用いて、細菌プレート培養物からのゲノムDNAの分離に関する製造者のプロトコル（56ページ、ハンドブック05/2016、Qiagen、シドニー、NSW）に従って精製しました。DNAの濃度と品質は、Qubit 2.0 fluorometer (Life Technologies)を用いて決定した。標準品は、DNAを連続希釈し、E. anophelisおよびE. meningosepticaのコピー数を以下の式で計算することにより調製した：
Elizabethkingia コピー数 = (テンプレートの濃度 (ng) × NL) / (n × 109 × 660) ここで、NL はアボガドロ定数 (6.02 × 1023) 、n は標準のゲノム長 (塩基対またはヌクレオチド)、660 は二本鎖 DNA の平均分子量である。
標準物質の連続希釈液のコピー数を定量化するために、Digital droplet PCR（ddPCR）を使用しました。ddPCRは、QX200™ ddPCR™ Supermix for Probes（No dUTP、Biorad、オーストラリア）と自動液滴生成機能付きQX200™ Droplet Digital™ PCR System（Bio-Rad, Pleasanton, CA, USA）で行いました。すべてのddPCR増幅は、10μLのProbe Supermix、1μLの各プライマー（100nM）、2μLのテンプレートDNA、および6μLの超純PCRグレード水を含む20μL反応混合物中で行われました。ddPCRの増幅条件は以下の通りである： 25℃、3分、95℃、10分、94℃、30秒、60℃、1分、98℃、10分、4℃、ホールドの40サイクル。
すべてのqPCR分析は、ポジティブ、ネガティブ、および非テンプレートコントロールを含むLightCycler® 480 Instrument II（Roche Life Science）で二重に実施された。個々のリアルタイムqPCRアッセイは、表1に記載のプライマーとプローブを用いたマルチプレックスプローブアッセイを用いて、E. anophelis、E. meningosepticaおよびElizabethkingia属のゲノムコピーを定量化しました。
表1. 本研究で使用した遺伝子ターゲット、プライマー、プローブ。
遺伝子ターゲット標的生物プライマー／プローブID蛍光剤／クエンチャー最終反応液濃度（μM）プロダクトサイズ（bp）プライマー配列（5′-3′）文献ecYElizabethkingia spp. SECYF1_40.01GTTTTTACGTTCACGCTCATCTTGGTKelly et al. (2019)SECY R20.07146AGTAAGCCTAAAAGCCCAGAAGSECYP2_5FAM/BHQ10.05TTGCAAGTATACAGAACCAAGGAGGAAGCAAGpheTE. meningosepticaTIGR472_F70.1TTTAAACTGGATGTGGAAGATGCTGATKelly et al. (2019)TIGR472_R1_20.0590CCACTCTGGGACTCTTACCTGTTIGR472_P3Quasar 670/BHQ30.05GCGTTATCTGAGCTGTAATTGAAGGlepAE. anophelisTIGR1393F220.07CATGTGAAGGGCGCTACTTATTGTKelly et al. (2019)T1393R3WT0.1142TCAGGGTTCAGAGAAGGTCTIGR1393P1CalRed 610/BHQ10.02ACCTGGCTTTGGAAAATGACCTTACC
増幅は、LightCycler® 480 SYBR Green I Master（Roche Life Science）10μl、DNAse/RNAse free water（Roche Life Science）5μl、プライマー-プローブ混合物5μl、40～50 ng/μlの濃度範囲のテンプレートDNA5μlで構成する25μl反応容量で行いました。サイクリング条件は以下の通りである：95℃で3分間の初期変性、次いで95℃で10秒、64℃で30秒の40サイクル（Kelly et al.、2019）。蛍光データは、各サイクルのアニーリングステップの終了時に取得した。すべてのミックスは、ピペッティングエラーを避けるために、Biomek Automated Liquid Handler（Beckman Coulter）を使用して行われた。異なるリアルタイムPCRの効率は、97から100％の範囲であった。二次構造は、どのランでも遭遇しなかった。各シングルランの閾値は、あらゆるベースライン活性を上回り、指数関数的な増加段階内に置かれた。サイクル閾値（CT）は、Roche Life Science社製のソフトウェアを用いて、得られた曲線の数学的解析により決定した。非テンプレートコントロールのCT値は、常に40以上であり、増幅がないことを示した。解離曲線は、プロダクトの完全性とPCR阻害剤の不在を確認するために、qPCRプロダクトについて決定した。さまざまなqPCR係数の中で、線形回帰分析によって得られた標準曲線を分析するために使用されるR係数に注目した。ほとんどのサンプルとすべての標準物質は、定量化の再現性を確認するために、最低2回のランで評価された。
Real-Time PCRのデータセットは、分散分析（ANOVA）を用いて解析した。水試料中の遺伝子コピー数の絶対量を評価するために、F-testを使用して分散を比較しました。正規性はShapiro-Wilks検定と残差の検査で、分散の均質性はLevene検定で検証した。データがこれらの検定のいずれかを満たさない場合、適切な変換（対数変換または平方根変換）が適用された。0.05のグループ分けを基準として、Tukeyの正直有意差（HSD）法およびサンプルサイズが不均等な場合の修正版（Unequal N HSD）をポストホック比較に使用した。グラフは、GraphPad Prism version 9 (GraphPad Software Inc.)を用いて作成した。
2.6. 全ゲノムシークエンス
全ゲノム配列決定は、以前に記載されたように行った（Foster-Nyarkoら、2020）。簡潔に言えば、WGSは、修正Nextera低入力タグメンテーションアプローチを用いて、Illumina NextSeq 500プラットフォームで実施した。ゲノムDNAは、ライブラリー調製の前に10mM Tris-HClで0.5ng µl-1に正規化した。プールされたライブラリーは、イルミナ推奨の変性およびロードパラメーターに従い、ミッドアウトプットフローセルで最終濃度1.8pMで実行した。データはBasespace（www.basespace.illumina.com）にアップロードし、生データを各サンプルのFASTQファイルに変換した。
2.7. 系統解析
最尤系統樹は、PhyloSift (Darling et al.)を用いて構築した、 2014）、一塩基多型（SNP）ベースの系統樹は、Snplord（github.com/maxlcummins/pipelord/tree/master/snplord）、snippy (github.com/tseemann/snippy), Gubbins (Croucher et al., 2012) を利用する自動snackmake（Köster and Rahmann, 2012）パイプラインを用いて作製しました、 2015）、SNP-sites（github.com/sanger-pathogens/snp-sites）を利用している。すべてのツリーはFastTree2（Priceら、2010）を使用して解決し、Interactive Tree Of Life（iTOL）ソフトウェアv4（LetunicとBork、2019）を使用して視覚化した。本研究で提示された94のElizabethkingiaドラフトゲノムに加えて、Genbank（Leray et al.、2019）から調達した54のElizabethkingiaゲノムを系統解析に含めた。Elizabethkingia pangenomeはRoary v3.11.2 (Page et al., 2015)を用いて計算し、Phandango v1.3.0 (Hadfield et al., 2018)を用いて可視化しました。新規Elizabethkingia属分離株のパンゲノムワイド遺伝子関連研究をScoary (Brynildsrud et al., 2016)を用いて実施しました。ペアワイズゲノム距離行列をMash（Ondov et al.、2016）を用いて生成し、R Studio v4.0.2 および gglot2 v3.3.0 パッケージを用いて古典的（メトリック）多次元尺度法（MDS）プロットを作成するのに用いた。病原性関連遺伝子とARGのMDSプロットも、遺伝子存在／不在マトリックス（1＝存在、0＝不在）を用いて、Rで作成した。
2.8. ジェノタイピング
インシリコによる種の同定は、SpeciesFinder 2.0 (Larsen et al., 2014) およびKraken2 (Wood et al., 2019) を用いて実施した。新規Elizabethkingia種を決定するために、種区切りのための95％カットオフ値（Gorisら、2007）を用いて、JSpeciesウェブサーバー（Richterら、2016）で利用できる平均塩基同一性BLASTn（ANIb）およびANI MUMer（ANIm）アルゴリズムの両方を使用してペア単位のゲノム比較を実施した。予測されるDNA-DNAハイブリダイゼーション（DDH）結果は、推奨される数式2を用いて、種の区切りのための70％のカットオフ値で、ゲノム間距離計算（GGDC）ツール（Meier-Kolthoffら、2013）を使用して確認された。完全な16S rRNAおよびrpoB配列はClustal Omegaを使用して整列し、それぞれ99.5%（Sievers and Higgins, 2018）および97.7%（Adékambi et al., 2009）の類似度カットオフ値を使用した。ウイルス性関連遺伝子、ARG、プラスミドレプリコンは、以下のデータベースと連携してAbricate（github.com/tseemann/abricate）を用いてスクリーニングを行った： VFDB (Chen et al., 2005), CARD (Alcock et al., 2019), NCBI AMR FinderPlus (Feldgarden et al., 2019) and PlasmidFinder (Carattoli et al., 2014). また、実験的に決定されたビルレンスファクターのVFDB Set Aと、アミノ酸配列の同一性が40％以上、E-10カットオフ値を持つBLASTpを用いて、ビルレンスファクターをスクリーニングした。
2.9. ゲノムのアノテーション
ドラフトゲノムは、Prokka v1.14.6 (Seemann, 2014)を用いてアノテーションし、SnapGene v4.1.9 (snapgene.com)を用いて管理した。また、RASTアノテーションパイプライン（Brettin et al.、2015）を各クレードを代表する8ゲノムで利用し、アノテーションをクロスチェックした。推定ゲノムアイランド（GI）およびICEは、以下の参照ゲノムを用いて、Islandviewer 4（Bertelliら、2017）により同定した： E. anophelis strain CSID_3,015,183,681 (CP015068.2), E. anophelis strain F3543 (CP014340.1), E. miricola strain EM798-26 (CP023746.1) and E. genomospecies 4 strain G4123 (CP016377.1). BLASTnは、本研究で同定された推定GI、ICEおよびAMR領域がNCBIに過去に寄託されているかどうかを調べるために利用された。AMR遺伝子の配列アライメントを見るために、Aliview software v3.0 (GPLv3) (Larsson, 2014)を使用した。
2.10. 最小発育阻止濃度（MIC）試験
各エリザベスキニア・クレードからの代表的な分離株、およびBlaBおよびBlaGOB遺伝子のユニークな組み合わせを保有する分離株を、以前に記載したように38種類の臨床的に関連する抗菌剤に対するMIC試験（n = 10）のために選択した（Burnard et al., 2020）。抗生物質試験用プレートは、AS ISO 20,776.1-2017に従って手作業で準備し、接種し、培養した。抗生物質および試験分離株の品質管理は、Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M100 ED31:2021に準拠し、プレートの読み取りは、European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) reading guide v 3.0 2021に準拠した。AMR表現型解析には、EUCASTの薬物動態-薬力学（PK-PD）「非種」ブレークポイントのガイドライン（Kahlmeterら、2006）およびCLSIの非腸菌科ブレークポイント（Jorgensenら、2007）の両方を使用しました。結果
本研究では、2018年から2019年にかけて、南オーストラリア州の水生環境から94のElizabethkingia分離株が収集された。湿地（サイトB＆C）から供給された株は大多数［n＝70（B＝50、C＝20）；75％］を占め、次いでダム（サイトA、n＝22；23％）、そして川（サイトD、n＝2；2％）のサンプルとなった。系統解析および遺伝子スクリーニング解析に使用したこのコレクション以外からの54株を含む、使用したすべての分離株の関連メタデータは、補足データ1に掲載されている。
3.1. ゲノムのアセンブリ
ドラフトゲノムはshovill v1.0.4を用いてアセンブルした。ゲノムサイズは4,039,979 bpから4,660,922 bpで、平均サイズは4,459,168 bpであった。ゲノムあたりのコンティグ数は25から160で、平均は55。リードデプスは23.26から80.63で、平均は38.79であった。完全なアセンブリ統計は、Supplementary Data 2で見ることができます。
3.2. Elizabethkingia属、E. anophelisおよびE. meningosepticaの絶対的定量化
一般的なElizabethkingia spp.遺伝子マーカーとE. anophelisおよびE. meningosepticaマーカーを対象とした定量データを用いて、4つの水域からのサンプルにおけるそれぞれの絶対量を推定した。ダム試料におけるElizabethkingia spp.の絶対量は、平均7.6×103遺伝子コピー/mLで、全細菌群集（16S rRNA qPCRベース）の1.36×10-6を占めた。湿地試料では、Elizabethkingia属は3.5×104遺伝子/mLから4.6×104遺伝子/mLで、全細菌群集の6.25×10-6から8.21×10-6を占めた（図1）。いずれの場合も、E. anophelisの絶対量は、Elizabethkingia属の絶対量よりも10分の1程度低く、水中環境において支配的な種ではないことが示された。E. meningosepticaは検出され、遺伝子コピー/mLは平均で23（サイトA；ダム）から50コピー/mL（サイトB、C、D；湿地）であった。
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図1. ろ過水（サイトA、B、C、D）から抽出した全DNAのqPCR分析により決定したElizabethkingia属、E. anophelis、E. meningosepticaの平均絶対存在量。データはlog10遺伝子コピー/mL、サンプル（n = 32）で表されます。アスタリスクは、* = P < 0.05; ** = P < 0.01を表します。
3.3. エリザベスキンギア種の同定
Elizabethkingia分離株の種同定は、実施したタイピング技術によってかなり差があった（表2）。オーストラリアの水環境から得られた94株のうち、MALDI-TOF MSで同定された最も顕著な種はE. miricola（n = 54; 57%）、Kraken2ではE. anophelis（n = 93; 99%）、SpeciesFinder 2.0 E. genomospecies 4では最も優勢（n = 77; 82%）である。系統的な特徴づけ（詳細は後述）を行った結果、71株がE. miricola（76％）、16株がE. anophelis（17％）、7株が新種の可能性がある種（7％）として分類されました。
表2. MALDI-TOF MS、Kraken2、Species Finder、および系統解析により同定された水生環境Elizabethkingia種（n = 94）。
種同定MALDI-TOF MSKraken2SpeciesFinder2.0系統解析E. anophelis093 (99%)16 (17%)E. meningoseptica11 (12%)000E. miricola54 (57%)01 (1%)71 (76%)E. ursingii*01 (1%)77 (82%)0 Elizabethkingia spp.16 (17%)007 (7%)non-Reliable Identification13 (14%)000
⁎
E. genomospecies 4とも呼ばれる。
3.4. 系統樹の解析
Phylosiftを用いて、オーストラリアの水圏環境から分離された94株（本コレクション）、オーストラリアの臨床サンプルおよび病院環境から分離された27株、Genbankから入手可能な海外株27株からなるElizabethkingia 148株の系統樹を作成した（図2）。メタデータがある場合、Elizabethkingiaの分離株は、環境（n = 102）、ヒト（n = 42）、Anopheles gambiae（n = 2）、Zea mays（トウモロコシ）とカエルから各1株ずつでした。系統樹における種の分布は、E. anophelis（n = 52）、E. meningoseptica（n = 5）、E. miricola（n = 78）、E. bruuniana（n = 3）、E. ursingii（n = 2）、 E. occulta（n = 1）とElizabethkingia属（n = 7）の新しいクレードだった。Elizabethkingia属の7種は互いに明確に分離しており、E. meningosepticaが他の種から最も離れているように見えた。
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図2. エリザベスキンギアの系統樹。Phylosiftを用いたElizabethkingia種の中点根付最尤系統樹と地理的データ。本コレクションからのサンプルは紫色で着色されている。
水環境調査から分離されたエリザベスキンギアは、国際分離株や臨床分離株と並んで、5つのクレードを形成していました。クレード1には、オーストラリアの臨床分離株（EkS2、EkQ5、EkQ17）と近縁のE. anophelis 3株（ER-QUAD-EK_54、QUAD-EK_14、QUAD-EK_22）が、コアゲノム（EkS2が参照）の87％にわたって平均36SNV（一塩基変異）、病院環境分離株EK2、EK6では平均42SNVの値で入っていました。ダムサンプルからの2つのE. anophelis分離株、QUAD-EK_14とQUAD-EK_22は2SNVで分離し、オーストラリアの湿地サンプルからのER-QUAD-EK_54はダム分離株と平均33SNVで異なっていた。クレード2は、我々の研究で得られた13のクローンE. anophelisからなり、互いに平均2SNVの差があり、クレード1に位置する我々のE. anophelis分離株とは807SNVの差がある（E. anophelis分離株のペアワイズSNPマトリックスは補足データ4に記載）。クレード3は、オーストラリアのダムから分離された7つの分離株（ER-QUAD-EK_21、QUAD-EK_08、QUAD-EK_09、QUAD-EK_10、QUAD-EK_16、QUAD-EK_07、QUAD-EK_05）で表される新規クレードである。この新しいクレードに属する分離株は、E. bruunianaに最も近いが、ProgressiveMauve解析では遺伝的に異なるように見え（補足データ3）、E. bruuniana分離株EkQ11とは平均124,216SNPsの差があった。クレード4は、コアゲノムの83%にわたって平均66SNV（範囲0〜197SNP）の相互関係を持つ10個のE. miricola分離株からなる（EkQ1を参照）。これらの分離株は、オーストラリアの臨床サンプルから得られた3つのE. miricola分離株（EkQ10、EkQ13、EkQ1）と共に分岐しているが、これらの2つの分岐間のSNVは約21,539である。クレード5は、オーストラリアの湿地帯から分離された61株のクローンE. miricola（平均7SNV）であり、最も近縁の台湾の水試料からのCP03929株とは、約21,629SNPの差がある。E. miricola分離株のペアワイズSNPマトリックスは補足データ4に記載されている。
3.5. 新種Elizabethkingia umeracha sp.novの同定
E.bruuniana分離株EkQ11に対して平均124,216SNVを有するクレード3の7株について、E.bruunianaと近縁であるが別種であるか否かを検討した。この目的のために、16S rRNAとrpoBの配列同一性、ANIb、ANIm、GGDC値（後者はDDH値を模倣）を計算した（平均値は表3、全解析は補足データ5参照）。ER-QUAD-EK_05 16S rRNA配列の同一性（99.7%）を除き、他のすべての値から、これら7つの分離株は新規Elizabethkingia種であると判断された。したがって、我々はこれらの7つの分離株を暫定的な新規種とし、Elizabethkingia umeracha（ウメラチャ）という名前を提案する。我々は、これらの分離株の起源となったアデレードヒルズの水と土地の伝統的な所有者であり、管理者であるペラマンク族に敬意を表するものである。
表3. E. umeracha sp. nov.は、ANIb、ANIm、GGDC、16S rRNAおよびrpoBの配列同一性から、E. bruunianaとは別種であることが証明された。
空セルE. umeracha sp. nov.7株の平均値空セルANIb（>95%カットオフ）ANIm（>95%カットオフ）Predicted DDH（>70%カットオフ）16S rRNA（>99.5% cutoff）rpoB（>97.7% cutoff)E. bruuniana str. ATCC 33,958 (CP035811)76.70 ± 0.73 SD78.18 ± 0.57 SD49.23 ± 0.04 SD99.28 ± 0.17 SD97.59 ± 0 SDE. bruuniana str. G0146 (CP014337)76.41 ± 0.71 SD77.90 ± 0.65 SD45.18 ± 0.07 SD99.28 ± 0.17 SD97.59 ± 0 SDE. bruuniana str. EkQ11 (SRS5502615)76.57±0.70 SD78.27±0.65 SD49.17±0.43 SD99.41±0.18 SD97.62±0 SD
3.6. パンゲノム解析
入手可能なすべてのElizabethkingia属ゲノム（n = 148）のパンゲノム解析により、高い遺伝的多様性が示された（図3）。Elizabethkingia属のパンゲノムは28,240遺伝子からなり、コアゲノムはわずか76遺伝子、アクセサリーゲノムは28,164遺伝子（ソフトコア443遺伝子、シェル6057遺伝子、クラウド21,664遺伝子）でした。
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図3. Elizabethkingia pangenome。オーストラリアの環境から採取した148種のElizabethkingiaと臨床分離株、および国際的な菌株のパンゲノム解析。
図4）Elizabethkingiaゲノムのペアワイズゲノム距離MDSプロットでは、すべてのE. anophelis分離株は緊密にクラスタリングされており、E. meningoseptica分離株は他の種と、E. meningoseptica分離株間の両方で、最も区別されていました。残りのElizabethkingia種は、より拡散したクラスターを形成し、ヒト由来と環境由来の明確な区別はなく、E. umeracha sp. nov.分離株は周辺に位置していた（図4、ピンク色の三角形）。
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図4. Elizabethkingia のペアワイズゲノム距離。Mashを使用して計算された一対のゲノム距離を示すデータシート。種ごとに色分けし、図形は分離元を表す。赤い部分が今回のコレクションから分離されたものである。
Roaryで作成した遺伝子有無マトリックス（補足データ6）をScoaryに入力し、E. umeracha sp. nov.分離株に存在する差別化遺伝子を算出した。合計1886個の遺伝子が、これら7つの分離株においてのみ同定された（特異度100%、感度100%; Supplementary Data 7）。これらの遺伝子の半分以上（n = 1110; 58.8％）は仮説的なタンパク質をコードしているが、残りの遺伝子のうち537はSTRINGに入力され、いくつかの機能濃縮を同定し、最高スコアはトリプトファン生合成（1.04強度）とモリブデン補酵素生合成（1.04強度）である（完全解析結果は補足データ8を参照）。
3.7. ウイルス性遺伝子の同定
VFDBを用いると、今回のコレクションでは合計107の推定病原性因子が同定され、そのうち62（56％）は同定された3つの種で共有されていた（図5A）。しかし、いくつかの病原性因子は種特異的であった。E. miricolaでは、ユニークな病原性因子として、接着剤/侵入剤Cj1136のホモログ（すべてのE. miricola分離株で発見、n = 71; 100%、このコレクション以外のE. miricola分離株では特に存在しない）（Javed et al、 2012）、カプセルタンパク質Cps41（n＝71；100％）（Augerら、2018）、アデニル酸シクラーゼCyaB（n＝8；11％）（Anteら、2021）、ABC-トランスポーターHlyB（n＝8；11％）（Benabdelhakら、 2003）、毒素RtxB（n＝11；15％）、RtxE（n＝10；14％）（Ramamurthyら、2020）およびSmcL（n＝71、100％）（González-Zornら、2000）、免疫回避タンパク質GtrB（n＝8；11％）（Xiao et al、 2021）、細胞内増殖タンパク質PrsA2（n＝1）（Alonzo and Freitag, 2010）、鉄分取り込みタンパク質YbtP（n＝71；100％）（Fetherston et al., 1999）。E.アノフェリス分離株においてのみ同定されたビルレンス因子は、カプセルタンパク質WbaPのホモログ（n＝1）（Ernstら、2020）、Cj1440c（n＝10；63％、このコレクションからのE. anophelisにおいてのみ発見）（Karlyshevら、 2005）、FTT_0790（n＝1）、FTT_0797（n＝16；100％）、およびFTT_0798（n＝3；19％）（Rowe and Huntley, 2015）、リポ多糖タンパク質BplB、BplG（Novikov et al、 2019）、およびKfoC（Lapp et al.、2021）（すべてn＝16；100％）、免疫回避タンパク質OmpA（Vila-Farrés et al.、2017）（n＝16；100％）、およびストレスタンパク質MucD（Yorgey et al.、2001）（n＝1）です。E. umeracha sp. nov.で同定されたユニークなビルレンスファクターホモログは、莢膜タンパク質NeuB（Feng et al., 2012）のみで、しかしそれは2つの分離株（29％）でしか同定されていなかった。
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図5. Elizabethkingia属のウイルス性因子。(A)今回同定された3種のElizabethkingia種における推定病原性因子の分布のベン図。(B) 148種のElizabethkingia分離株で同定された推定病原性因子のMDS解析。種によって色分けされている。三角形＝既知の病原体、円＝病気を引き起こす能力は不明。赤い部分＝このコレクションから分離されたもの。
このコレクションで同定された推定病原性因子と、このコレクション以外で得られたゲノムのMDS分析（図5B；病原性因子BLAST結果とヒートマップは補足データ9に掲載）により、我々のE. anophelis分離株は、既知の病原性E. anophelis分離株のサブセットとクラスター化しており、我々のE. miricola分離株はそれ自身のクラスターを作っていることが示されました。E. umeracha sp. nov.の分離株は、1つは単独で、もう1つは病原性E. bruunianaとE. miricolaの分離株とE. usingii分離株との間で、2つの別々のクラスターを形成しました。
3.8. エリザベスキン類AMR
3.8.1. β-ラクタマーゼ耐性遺伝子
このオーストラリアの水生コレクションから分離された94株のElizabethkingiaは、カルバペネム系薬剤に対する耐性をコードするBlaB（サブクラスB1）およびBlaGOB（サブクラスB3）遺伝子とセファロスポリンに対する耐性をコードするBlaCME遺伝子をすべて有していた。
種および対立遺伝子分布を比較するために、BlaBおよびBlaGOBの利用可能なすべての参照配列とのMUSCLEアラインメントを作成した（図6）。我々の分析では、すべてのElizabethkingia種がBlaGOBを持ち、異なる対立遺伝子内に2-4アミノ酸のいくつかの異なる特徴的な欠失がある興味深い分布を示した（Supplementary Data 10）。しかし、これらの欠失はいずれも3塩基の倍数で現れることから、遺伝子の読み取り枠を変更することはないと考えられる。BlaB遺伝子の分布（図6；右側の木）については、木構造において4〜5つの主要なクレードが見られ、それらは一般に種によってグループ化されていた。
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図6. エリザベスキンガのBlaGOBとBlaBアレル。すべてのエリザベスキンガのBlaBとBlaGOB対立遺伝子の系統樹。左側がBlaGOB対立遺伝子の木、右側がBlaB対立遺伝子の木である。ラベルは、E. miricolaを赤、E. anophelisを緑、E. meningocepticaを青、E. umeracha sp. novをオレンジで着色している。木と木の間のスペースは、同じ分離株からの配列を繋いでいる。利用可能な対立遺伝子番号は色のついた帯で表示されている。
メタロ-β-ラクタマーゼの対立遺伝子の組み合わせについて、E. anophelis 1株（ER-QUAD-EK_56）は新規のBlaGOB変異体を持ち、本研究の残りのE. anophelis 15株はBlaGOB-20を持っていた。これら15株のうち、13株はBlaB-11を保有していた。興味深いことに、残りの3つのE. anophelis分離株（ER-QUAD-EK-14、-22、-56）は、オーストラリアの臨床分離3株（EkS2、EkQ5、EkQ17）とオーストラリアの病院環境分離2株（EK2、EK6）と共通のblaB-1様遺伝子を持っていました。これら8つの分離株は、図2に示すように、近縁のクレード1（臨床分離株とは約36SNPs、病院環境分離株とは約42SNPs）を形成した。
クレード4のE. miricola 10株は、BlaGOB-25様遺伝子を特異的に持ち、すべての株がBlaB6様遺伝子を持っていた。これらのBlaB6様遺伝子は、オーストラリアの臨床用E. miricolaの3株（EkQ1、EkQ10、EkQ13）でも確認された。本研究で分離された残りの61株のE. miricolaは、blaGOB19様遺伝子とblaB26様遺伝子を独自に保有していた。また，E. umaracha sp. nov.の分離株は，メタロ-β-ラクタマーゼ遺伝子の新規対立遺伝子を有していた．
BlaCME-1は湿地やダムから分離されたオーストラリアの水生環境由来E. anophelis（ER-QUARD-EK_14, 22, 56）に最も近い対立遺伝子であることがわかったが，BlaCME-2は水生環境由来株と非常に高いレベルで異なることがわかった．興味深いことに、2つの異なるE. miricolaクレードはそれぞれ新規のblaCME対立遺伝子を持ち、3番目の新規対立遺伝子がE. umeracha sp. nov.に見られる（補足データ11）。
3.8.2. その他のARG
オーストラリアの水圏環境分離株では、他のARGは検出されなかった。また、シプロフロキサシンやレボフロキサシン（フルオロキノロン）に対する耐性をコードするgyrAの既知の変異（Ser83IleまたはSer83Arg）を検索したが、いずれも検出されなかった。
3.8.3. AMRの表現型解析： MIC試験
各エリザベスキンクレードのBlaB、BlaGOB、BlaCME遺伝子のユニークな組み合わせを保有するE. anophelis、E. miricola、E. umeracha sp. nov.の代表10株を臨床的に関連する38種類の抗菌薬に対してMIC試験を行った（表4）。現在までのところ、Elizabethkingia属には独自のブレークポイントがないため、EUCAST non-speciesおよびNCSI non-Enterobacteriaceae PK-PD breakpointsを用いて解釈した（補足データ12）。すべての菌株はカルバペネム系，セファロスポリン系，カルボキシペニシリンを含むペニシリン系，モノバクタム系に対して顕著な耐性を示した．BlaGOB、BlaB、BlaCMEの組み合わせの違いについては、BlaB-26様/BlaGOB-19様/BlaCME-variant E. miricola分離株のみでのピペラシリン/タゾバクタム耐性、E. anophelis分離2株（blaB-1様/BlaGOB-20/BlaCME-1とblaB-1様/blaGOB-variant/BlaCME-1でセフェパム耐性など耐性プロファイルに違いが認められた（Table4）。
表4. 南オーストラリア州の水生環境から分離されたElizabethkingiaの臨床的に関連する抗菌薬に対するMICデータ。セルの色：赤＝耐性、黄＝中間、緑＝感受性。BlaB、BlaGOB、BlaCMEアレルが分離株名の下に示されている。
空セル空セル空セルE. anophelisE. umeracha sp.nov.E. miricola抗菌剤試験範囲（μg/mL）MIC 90（μg/mL）ER-QUAD-EK_14B-1L GOB-20 CME-1ER-QUAD-EK_56B-1L GOBVCME-1ER-QUAD-EK_18B-11 GOB20 CME-1ER-QUAD- EK_08BVGOB20 EK_08BVGOBVCMEVER-QUAD-EK_09BVGOBVCMEVER-QUAD-EK_10BVGOBVCMEVER-QUAD-EK_21BVGOBVCMEVER-QUAD-EK_94B-6L GOB-25LCMEVER-QUAD-EK_64B-26L GOB-19L CMEVER-QUAD-EK_92B- 26L GOB19L CMEVAmoxicillin2–32> 32>32>3232>32>32>32>32>32>32>32Ampicillin2–32> 32>32>3232>32>32>32>32>32>32>32Amoxicillin/clavulanic acid4–128> 128881681616881616Piperacillin/tazobactam1–64> 64<1<1<12<1488Ampicillin/sulbactam8-128> 1283216163264323232Temocillin2-32> 32> 3216> 32> 32> 32> 32Cephalexin4-64N/A> 64> 6464> 64> 64> 64> 64> 64Cefazolin0. 25-32> 32> 32> 32> 32> 3232> 32Cefuroxime1-16> 16> 16> 1616> 16> 16> 16Cefoxitin8-256N/A< 8< 8163232321632Cefotaxime0.03-8> 8> 88> 8884244Ceftazidime0.12-16> 1616> 16> 16> 16> 164> 1616Ceftriaxone0. 03-4> 4> 4> 4> 4> 42> 4> 4Cefiderocol0.03-32N/A8484441148Cefepime0.06-16>16>1688444144Ceftaroline0.5-16> 16> 16> 16>16>16>16>16>16Ceftolozane/tazobactam0. 5-1616> 16> 16> 16> 16> 16> 16> 16Meropenem0.015-32> 16163232323232Tebipenem0.03-8N/A8488884> 888Etrapenem0. 015-4> 4> 4> 4> 4> 4> 4> 4Aztreonam0.5-16> 16> 16> 16> 16> 16> 16Amikacin1-643243232321616Gentamicin0. 25-16>1682> 1616888842トブラマイシン0.015-64>16>6432>64>6416646464アジスロマイシン4-64N/A8< 48< 4< 4< 4< 4< 4Ciprofloxacin0.015-4210。 120.250.250.250.120.060.50.250.25Levofloxacin0.06–810.250.1250.250.1250.1250.125< 0.060.250.250.125Trimethoprim0.5–16N/A821< 0.52< 0.5< 0.5<0. 522Trimethoprim/sulfamethoxazole0.12/2.38–32/6082.38–1528/1521.0/19.00.5/9.5> 0.12/2.380.5/9.50.25/4.75<0.12/2.38<0.12/2.380.5/9.50.5/9.5Vancomycin0. 12-32N/A8884>3244888Teicoplanin2-64N/A> 64> 64> 64> 64> 64Minocycline0.25-1610.5< 0.1250.250.50.50.5< 0.1250.50.250. 5Doxycycline0.015-64> 6420.50.50.510.250.511Tigecycline0.12-824284448424Rifamicin0.12-32N/A< 0.125< 0.1250.25< 0.1252< 0.125< 0.1250. 25< 0.125Colistin0.25-8N/A> 8> 8> 8> 8> 8> 8Polymixin B0.25-8N/A> 8> 8> 8> 8> 8> 8> 8クロラムフェニコール2-128>128128163288881688
分離株は、アミノグリコシドやグリシクリンなど、カルバペネムやESBL以外の抗生物質クラスにも耐性を示した（表4）。1つの分離株であるE. anophelis ER-QUAD-EK_14は、クロラムフェニコールとトリメトプリム/スルファメトキサゾールに高い耐性を示した。アジスロマイシンとリファンピシンはEUCASTまたはCLSIに対応するブレイクポイントがないが、試験した分離株のMICは非常に低く（試験した最低範囲まで）、感受性プロファイルの可能性を示唆していた。Vancomycinとteicoplaninもブレイクポイントがないが、MICは非常に高く、非感受性であることが示された。同様にグリコペプチドとコリスチンも、試験した濃度の上限よりも高いMICを示し、これらの抗生物質に対するElizabethkingiaの潜在的な耐性を示唆している。
3.9. 移動性遺伝要素の特性評価 ICE、プラスミド、ファージ
Genbankで公開されているElizabethkingia ICE配列と比較することで、水生環境Elizabethkingia属の67 / 94 (71.3%) で統合的結合要素が同定され、3種類のICEからなる（Xu et al., 2019）： CSID3015183678株由来のICEEaI、NUHP1株由来のICEEaII、R26株由来のICEEaIII。アラインメントは参照配列との不完全な一致を示したが、すべての一致はE. anophelis strain R26のタイプIII ICEに最も近かった。
これまでElizabethkingia種からは2種類のプラスミドが報告されているが（Accession CP016375.1 and CM003640.1）、今回の研究ではどちらも検出されなかった。今回の解析では、両方のプラスミド配列が、今回のコレクションの水生Elizabethkingia分離株、およびGenbankから入手したオーストラリアの臨床Elizabethkingia分離株とアライメントされました。クレード2の環境E. anophelisのうち13株（81％）がプラスミドCP016375.1（90％同一性で平均8％カバー）と低品質の一致を示した（Supplementary Data 13）。E. miricola株EM_CHUVの第2参照プラスミド（CM003640.1）とのアラインメントでは、ほとんど相同性がないことがわかった。
Phasterを介して94のElizabethkingiaゲノムに対してファージ解析を行ったところ、各単離株についてヒットが検出された（データは示さず）。WGSの足場が悪いため、ほとんどのヒットが「不完全」と記録されたが、14の単離株が完全なファージを検出した（Supplementary Data 14）。複数の種から分離されたこれらの14株から、ファージをグループ化するために4つのヒット長さの範囲を選択した： 48.7 kb, 21.4-27.1 kb, 10.4 -18.8 kb, および 4.9-9.7 kbである。異なるサイズのファージ間で類似のファージを特定するためにアラインメントを作成したが、最大のもの（48.7 kb）のみが複数の分離株で保存されているように見えた。当初、このファージは湿地と河川の2つのE. miricolaから検出され、アラインメントにより染色体の位置が異なることが示されました。この大型ファージをオーストラリアのElizabethkingiaの配列と照合したところ、このファージを保有する環境および臨床のElizabethkingia 17株が同定された。E. anophelis 2株（湿地とヒト気管支肺胞洗浄液から）、E. miricola 9株（湿地から7、川から2）、 E. bruuniana（ヒト血液）1、 E. umeracha sp. nov（ダム）5。ショートリードのアセンブリデータにより、これらのファージの詳細な比較はできないが、Elizabethkingiaの分離株は移動性DNAを共有していることは明らかである。考察
エリザベスキンギア属は新興の病原体であり、複数の染色体メタロ-β-ラクタマーゼ遺伝子を持ち、カルバペネムに固有の耐性を持つ唯一の生物として知られている（Hu et al.、2020）。Elizabethkingia種は環境細菌とみなされ、水域は環境リザーバーとして機能しています。汚染水はエリザベスキンギア属の感染経路に関与しているが（Booth, 2014）、昆虫（Kämpfer et al., 2011）、カエル（Hu et al., 2017; Lei et al., 2019）、爬虫類（Jiang et al., 2017）、宇宙船（Li et al., 2003）を除き、エリザベスキンギア属に関するほとんどの研究は臨床分離株と病院環境から採取した分離株に焦点を当てており、水環境に棲むエリザベスキンギア種は未調査のままだ。本研究では、南オーストラリア州のダム、河川、湿地から採取した94種のElizabethkingiaをWGSで解析し、多様な水生環境に生息するElizabethkingiaを初めて明らかにした。さらに、これらの環境分離株について、オーストラリアおよび世界各地から分離された臨床用Elizabethkingiaとの比較ゲノム解析も行っている。
エリザベスキンギア属に関する文献は、様々な命名法の変更により錯綜しているだけでなく、標準的なデータベースを用いた生化学試験や質量分析（MS）などの標準的な市販の微生物識別システムでは、現在E. anophelis, E. bruuniana, E. ursingii or E. occultaを区別できず、これらはしばしばE. meningoseptica or E. miricolaと誤識別されるので（Chen et al、 2019; Burnard et al., 2020; Lin et al., 2019b; Snesrud et al., 2019）。一貫して、私たちの最初のMALDI-TOF MSの結果は、11の分離株をE. meningosepticaとして誤認させた。興味深いことに、MALDI-TOF MS、Kraken2、SpeciesFinderを含む、私たちが使用したすべてのスペシエーション方法は、相反する結果を与えました。MSとKraken2の誤認に関する問題は、標準的なデータベース（Linら、2019a）を使用することから生じたと思われるが、SpeciesFinderは、好気性細菌について種レベルまで30％未満の精度（Tengら、2011）を実証した研究により、分類学上の目的に限定されている（Larsenら、2014）と知られている16S rRNA遺伝子塩基配列を用いる。これらのデータは、WGSの代わりに、今後のElizabethkingia属の研究では、種分化のために16S rRNAを使用することに慎重になり、利用するMSデータベースがすべてのElizabethkingia種を含むことを確認する必要があることを示唆しています。
E. anophelisが、ここと他の場所（Chen et al., 2019; Han et al., 2017; McTaggart et al., 2019; Snesrud et al., 2019）で、従来の臨床方法によってE. meningosepticumと誤認されたという事実から、 E. anophelisは過小評価されているだけではなく、実際にヒトで疾患を引き起こす主要種かもしれないという憶測が生まれた。この仮説は、アジア、オーストラリア、米国で生命を脅かすE. anophelis感染症の最近の報告によって強化されています（Burnard et al., 2020; Lin et al., 2019a）。今回、ダムと湿地帯のサンプルで同定された16のE. anophelis分離株は、約807SNPsの差で2つのクレードを形成した。単一の湿地分離株と2つのダム分離株は、オーストラリアのクイーンズランド州の敗血症患者に由来する3つのE. anophelis分離株と約36 SNPs、クイーンズランド州の病院にあるシンクに由来する2つのE. anophelis分離株と約42 SNPsだけ異なることが分かった（Burnard et al.、2020）。推定病原性因子のスクリーニングでは、3つの環境分離株と3つの敗血症分離株に特有のものは同定されなかったが、いくつかの推定病原性因子は、リポ多糖生合成タンパク質や血清耐性タンパク質OmpAなどのE. anophelis一般に特有のものであることが判明した。
本研究で得られたオーストラリアの水環境分離株の大半は、E. miricolaであった。E. miricolaは敗血症、口腔および尿路感染症を引き起こすことが知られているが（Green et al., 2008; Lin et al., 2019a; Zdziarski et al., 2017）、感染の報告はE. meningosepticaおよびE. anophelisに比べて頻繁ではない。本研究で得られた環境型E. miricolaは、2つの異なるクレードを形成していた。10株からなるクレードは、喀痰検体から採取したオーストラリアの臨床用E. miricola 3株（Burnard et al., 2020）と系統的に隣接していたが、これらの環境用と臨床用の分離株の間の平均SNP差は21,539だった。それにもかかわらず、環境E. miricolaは、カプセルタンパク質Cps4I（Mirza et al., 2018）、溶血毒素SmcL（González-Zorn et al., 2000）、鉄獲得タンパク質YbtP（Fetherston et al., 1999）などの推定病原性要因を臨床株と共有しました。残りの61のE. miricola分離株は、平均7SNPsの差でクローン性のクレードを形成していた。これらの分離株は非常にクローン性が高いにもかかわらず、約10km離れた2つの湿地から発生したものであった。野生動物を介するなど、潜在的な感染経路を特定することは、今後の疫学にとって重要である。
残りの7つのElizabethkingiaはダム湖のサンプルから分離され、系統学的にE. bruuniana株と近縁に位置していたが、SNP解析により2つの分岐は約124,216SNPsの差があることが示された。この大きな違いから、これらの7つの分離株が新規のElizabethkingia種であるかどうかを調査することが求められた。WGSベースのANIおよびin silico DDH解析は、細菌種の画定に関するゴールドスタンダードの従来のDDHよりも正確であることが証明されている堅牢な種分化法として知られている（Konstantinidis and Tiedje, 2005; Lin et al., 2019a; Meier-Kolthoff et al., 2013; Richter and Rosselló-Móra, 2009; Varghese et al., 2015）. ここでは、両方の分析により、これらの分離株が別種であることが明確に示されました。rpoB遺伝子も種分化に用いられ、16S rRNA遺伝子よりも高い分離分解能を有している（Adékambi et al.、2009）。ここでは、7つの分離株すべてがE. bruunianaに分類される97.7%の類似性のカットオフに該当した。さらに、これらの分離株に固有の1886個の遺伝子を同定し、機能的な割り当てが可能な場合、これらの遺伝子は主に細胞および代謝プロセスに関与していることが判明した。これらのデータを総合すると、E. bruunianaとは近縁だが別種であることがわかり、E. umeracha sp. novという名前を提案する。これらの分離株は、E. anophelisおよびE. miricola分離株と62の推定病原性因子を共有していることが今回示されたが、この新種が病原性を持つかどうかについては今後の検討が必要である。
メタロβラクタマーゼ（MBL）は、カルバペネム系およびほぼすべてのβラクタム系薬剤に対する耐性を付与するため（Chang et al.、2019）、MBLを保有する病原体の治療が非常に困難であることから、世界的に懸念されています。エリザベスキン類は現在、2つの染色体MBL（blaBとblaGOB）を持ち、さらにセファロスポリンに対する耐性を付与する染色体blaCME遺伝子を持つ唯一の生物として知られています（GonzálezとVila、2012）。今回、水生環境に生息する3種のElizabethkingiaは、いずれも複数の既知の対立遺伝子に加え、BlaB、BlaGOB、BlaCME遺伝子の新規変異体を保有していることが判明した。対立遺伝子の組み合わせにかかわらず、MIC試験により、すべての株がカルバペネム系、ペニシリン系、モノバクタム系に高い耐性を持つことが示された。すべての分離株はセファロスポリンにも耐性であったが、BlaCME変異体を持つE. miricolaの1株はセフェピムに感受性があった。バンコマイシン静注は、エリザベスキン類感染症の好ましい治療法として挙げられている（Jean et al.、2017）。試験したほとんどの分離株はバンコマイシンのMICが4または8μg/mLであったが、E. umeracha sp. nov.の1つの分離株は> 32μg/mLであり、従来量のバンコマイシンが有効でないことを示唆していた（Chang et al.,2019）．カルバペネムとβ-ラクタムに加え、いくつかの分離株はアミノグリコシドに耐性を示し、E. anophelis分離株1株はトリメトプリム/スルファメトキサゾールとクロラムフェニコールに高度耐性を示した。しかし、追加のAMR遺伝子は同定されず、新規のAMR機構の存在が示唆された。
環境細菌はしばしば重要なAMR遺伝子を保有しており、それが後に一般的なヒトの病原菌に取り込まれて広まることがあります。例えば、現在、腸内細菌科の間で流行しているESBL遺伝子、blaCTX-Mは、土壌細菌であるKluyvera ascorbateに由来すると考えられる（Humeniuk et al., 2002）。耐性菌や病原性遺伝子の獲得・拡散は、MGEによって促進される。ICEは、宿主の染色体に組み込まれ、新たな表現型を授けることができるMGEです（Xu et al., 2019）。敗血症が66例確認され、19名が死亡した米国での2015-2016年のE. anophelisアウトブレイクでは、アウトブレイククローンのすべてでICEが確認された。このICEは、ハイパームテーター表現型につながるmutY遺伝子を中断していました（Perrin et al.、2017）。ICEは環境中のエリザベスキニア94株中71%で同定されたが、これらは米国のアウトブレイクに関連するICEとは類似性がなく、E. anophelis株を初めて分離したR26株（Kämpfer et al.、2011）で見つかったIII型ICEとは約50%しか類似していなかった。このように、Elizabethkingia属に見られるICEのタイプに関する知見を広げることができました。
結論として、我々は水生環境で発見されたElizabethkingia属の最初のWGS解析を発表し、それらが多様なBlaB blaGOBおよびBlaCME遺伝子を持ち、カルバペネム、セファロスポリン、モノバクタムおよび他のβラクタムに高い耐性を持つことを発見しました。また、一部の菌株は他の抗生物質にも耐性を示し、まだ発見されていないAMR機構の存在を示唆している。また、環境中のE. anophelisは、敗血症の原因となる臨床株と非常に近縁であることが判明したため、水域が病原性Elizabethkingia属の重要な貯蔵庫であることが明らかになり、生息域を越えた移動の可能性があることが明らかになった。最後に，バンコマイシン耐性で，新規のメタロβ-ラクタマーゼおよびエクステンデッドスペクトルセリンβ-ラクタマーゼ遺伝子アレルを持っている新種E. umeracha s. nov.を見出した．
CRediT著者貢献声明
ソフィアック・ヘム 執筆-原案、形式分析、調査、執筆-レビューと編集。Veronica M. Jarocki: 執筆-原案、形式分析、調査、監修、執筆-校閲・編集。デイブ・J・ベイカー 調査、資料 Ian G. Charles: 調査、リソース。バーバラ・ドリゴ 調査、概念化、検証、形式分析、データキュレーション、執筆-レビューと編集。Sarah Aucote：調査、形式的分析、データキュレーション。エリカ・ドナー エリカ・ドナー：概念化、資金調達、スーパービジョン、執筆（レビュー＆エディティング デラニー・バーナード（Delaney Burnard リソース、メソドロジー ミシェル・J・バウアー リソース、メソドロジー パトリック・N.A.・ハリス リソース、スーパービジョン、ライティング - レビューと編集。Ethan R. Wyrsch：調査、方法論、バリデーション、執筆-レビューと編集。Steven P. Djordjevic：リソース、スーパービジョン、資金獲得、プロジェクト管理、執筆-レビュー＆編集。
CRediTの著者の貢献声明
ソフィアック・ヘム 執筆-原案、形式分析、調査、執筆-校閲・編集。Veronica M. Jarocki: 執筆 - 原案、形式分析、調査、監督、執筆 - 査読と編集。デイブ・J・ベイカー 調査、資料 Ian G. Charles: 調査、リソース。バーバラ・ドリゴ 調査、概念化、検証、形式分析、データキュレーション、執筆-レビューと編集。Sarah Aucote：調査、形式的分析、データキュレーション。エリカ・ドナー エリカ・ドナー：概念化、資金調達、スーパービジョン、執筆（レビュー＆エディティング デラニー・バーナード（Delaney Burnard リソース、メソドロジー ミシェル・J・バウアー リソース、メソドロジー パトリック・N.A.・ハリス リソース、スーパービジョン、ライティング - レビューと編集。Ethan R. Wyrsch：調査、方法論、バリデーション、執筆-レビューと編集。Steven P. Djordjevic：資源、監督、資金獲得、プロジェクト管理、執筆（査読・編集）。
競合する利害関係の宣言
著者らは、本論文で報告された研究に影響を及ぼすと思われる競合する金銭的利益や個人的な関係がないことを宣言するものである。
謝辞
本研究で使用した環境試料を採取した水域と土地の伝統的な所有者であり管理者であるPeramangk、Kaurna、Ngarrindjeriの人々に敬意を表し、PeramangkおよびKaurna族の長老Ivan Tiwu Copleyの知識と助言により、本研究で記載した新規細菌種をElizabethkingia umeracha（Umerachaとはペラマンク語の「素晴らしい水場」の意）と名付けたことを感謝いたします。
また、水サンプルの収集と処理に協力してくれたGianluca Brunetti、細菌の培養と分離に協力してくれたRobin Lockingtonに感謝したい。
資金提供
iThree研究所、シドニー工科大学： 本研究は、オーストラリア政府医療研究未来基金プロジェクト（MRFF75873）およびニューサウスウェールズ州第一次産業省とシドニー工科大学の共同研究であるオーストラリアゲノム疫学微生物学センター（Ausgem）により一部支援されています。
Quadram Institute Bioscience, Norwich, United Kingdom： Quadram Institute Bioscience BBSRC資金によるCore Capability Grant（プロジェクト番号BB/CCG1860/1）、BBSRC Institute Strategic Programme Microbes in the Food Chain（プロジェクト番号BB/R012504/1）。
南オーストラリア大学、Future Industries Institute： OUTBREAK (One-health Understanding Through Bacterial REsistance to Antibiotics Knowledge)の助成を受ける予定です。NHMRC MRFF Frontiers Grant。
クイーンズランド大学臨床研究センター（University of Queensland center for Clinical Research）： National Health and Medical Research Council (NHMRC) Early Career Fellowship (GNT1157530).
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© 2021 The Author(s). 発行：エルゼビアB.V.
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