15種類の門脈エストロゲンおよび代謝物の新規UPLC-ESI-MSアッセイによる検出と肝線維症への応用
671巻、2023年6月15日、115158号
15種類の門脈エストロゲンおよび代謝物の新規UPLC-ESI-MSアッセイによる検出と肝線維症への応用
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https://doi.org/10.1016/j.ab.2023.115158Get 権利と内容
アブストラクト
エストロゲンとその代謝物（EM）は慢性肝疾患に関与し、腸内細菌叢はエストロゲン代謝を制御しているが、肝疾患における腸管由来EMの役割は未だ不明である。門脈血清中のEMは極めて微量であり、EMは複数の異性体の組を含むため、門脈血清EMの正確な定量が急務である。本研究では、門脈血清EMの定量的検出法を確立し、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）関連肝線維化モデルマウスに適用しました。血清は新規誘導体化試薬4-acetyl aminobenzene sulfonyl chlorideで誘導し、UPLC-ESI-MSシステムを用いて、120分で15個のEMを定量化した。正常群に比べ、モデル群のE1、E2濃度は4〜8倍、C2、C4置換産物（2-OHE1、2-OHE2、2-MeOE1、4-OHE1、4-MeOE1、4-OHE2、4-MeOE2、2-MeOE2）は全て2〜22倍に有意減少していた。しかし、C16およびC17置換産物（E3、16-epiE3、17-epiE3、16-ketoE2）のレベルは3-5倍増加した（P < 0.01）。本研究は、NAFLDに関連する肝線維化において、門脈から肝臓に流入した腸管性EMの変化を明らかにし、エストロゲン代謝に関する他の関連研究への方法論を提供するものである。
図解抄録
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はじめに
非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）、肝線維化、肝硬変、肝がんなどの慢性肝疾患は、女性よりも男性、閉経前の女性よりも閉経後の女性で発症率が高く、著しい性差を示すことが特徴です［1］。この性差には、エストロゲンとその代謝物（EM）が大きく関与していると考えられており、これをきっかけに、EM、特に17β-エストラジオール（E2）の肝臓疾患における役割に関する研究が数多く行われています。私たちのこれまでの研究や文献報告では、エストロゲン療法が肝線維化を改善し、肝星細胞の活性化を抑制し、門脈圧を低下させることが示されています[[2], [3], [4]]．従来、エストロゲンの代謝には肝臓が最も重要な臓器と考えられていました。近年、腸-肝軸の詳細な研究により、腸内細菌叢が腸管内のEMの種類とレベルを有意に制御し、慢性肝疾患の性差を駆動することが明らかになりました[5,6]。腸管由来のEMは、門脈を経由して肝臓に再吸収されることがあります。腸内細菌叢は、β-グルクロニダスの分泌を通じてエストロゲンを制御しており、腸内細菌叢の異常は、このプロセスを阻害し、循環エストロゲンの減少につながる。循環エストロゲンの変化は、肝線維症などのエストロゲン駆動型疾患の発症に寄与すると考えられています[7]。循環動態の亢進、門脈圧亢進、細菌の移動、全身性炎症の活性化などが進行し、肝硬変の臨床経過を決定します[8]。エストロゲンは、血管収縮剤に対する腸間膜動静脈の感受性を維持し、門脈圧亢進症の脾臓血管機能を保護することができます[9]。エストロゲン代謝プロファイルと腸内フローラの間には双方向の関係があり、門脈は重要なチャネルである。しかし、肝繊維を含む慢性肝疾患の病因・病態における門脈エストロゲンと代謝物の役割は、未だ不明である。EMに基づく肝疾患の臨床応用はまだ進んでいないため、研究戦略の拡大が必要である。門脈中のエストロゲンとその代謝物を正確に検出する方法の開発が急務である。
メタボロミクス技術の発展に伴い、ハイスループット検出技術やメタボロミクスデータベースを用いて、定性・定量的に代謝物を検出することができるようになりました。ターゲットメタボロミクスは、アンターゲットメタボロミクスよりも高い精度を持ちます。現在、ターゲットメタボロミクスによる検出研究では、主にアミノ酸、胆汁酸、コレステロール、神経伝達物質、植物二次代謝産物、プリン関連代謝産物などを対象としています。標的メタボロミクス、非標的メタボロミクスにかかわらず、EMsデータベースはまだ不足しており、関連する実験および臨床研究の発展を大きく制限しています。
質量分析計（MS）が導入される以前は、ステロイドの主な測定技術はラジオイムノアッセイ（RIA）とイムノアッセイ（IA）でした。しかし、RIAはコストが高く、サンプル調製に手間がかかり、フラックスも低い。また、IAの検出過程では、マトリックスに妨害されやすく、単一の分析物しか測定することができない[10]。ガスクロマトグラフ質量分析法（GC-MS）は、ステロイド測定の特異性を著しく向上させるが、感度に限界があり、サンプル調製に時間がかかる [11,12]。より多くの研究が、ステロイド化合物の定量に液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）を使用することを好んでいます。しかし、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ESI-MS）や大気圧化学イオン化質量分析法（APCI-MS）では、ステロイドホルモンのイオン化効率が低く、固有の感度が低くなります。
サンプルのEMs濃度は通常非常に低く、ナノグラムレベル、あるいはピコグラムレベルに過ぎないため、検出方法には高い検出限界が要求されます。さらに、複雑なマトリックスによる干渉も大きく、化合物を正確に定量することが難しくなります[[13], [14], [15]]．幸いなことに、親油性基を付加することでイオン化効率を高め、ステロイド・エストロゲンやフェノール異性体の質量分析応答シグナルを増強する化学誘導体化法が開発されています [16,17]. 正電荷を持つ基の導入 [18,19] やプロトン親和性の高い基の連結 [17,20,21] を含む多くの誘導体手順は、LC-MS ステロイド分析における正イオン検出のイオン化効率を改善し、質量スペクトル応答シグナルを向上させる。したがって、LC-MSにおけるステロイドのイオン化不良という欠点は基本的に克服されています。誘導体化せずにエストロゲンを検出した文献もありますが[[22], [23], [24]]、誘導体化法は感度が高く、ポジティブモデルモニターとの相性が良いため、現在でもほとんどの関連研究で好ましい方法とされています。
本研究の目的は、腸-肝臓軸におけるエストロゲン代謝と慢性肝障害における腸内細菌叢の役割に関する研究をより良く行うために、ナノスケールあるいはピコグラムレベルで効率的かつ再現性の高いEMs検出法を開発し、EMsターゲット検出プラットフォームを確立することである。そこで、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）の肝線維化モデルマウスを作成し、超高速液体クロマトグラフィー電気泳動イオン化タンデム質量分析法（UPLC-ESI-MS）により肝門脈中のEMsの含有量を検出することにしました。
セクションの抜粋
分析用標準品、試薬、化学薬品
エストロン（E1）、E2およびエストリオール（E3）の標準物質は、中国国家薬物管理研究所（北京、中国）から購入した。2-ヒドロキシエストロン（2-OHE1）、2-メトキシエストロン（2-MeOE1）、2-ヒドロキシエストラジオール（2-OHE2）、2-メトキシエストラジオール（2-MeOE2）、4-ヒドロキシエストロン（4-OHE1）、16α-ヒドロキシエストロン（16α-OHE1）、 17-エピエストリオール（17-epiE3）、16-ケトエストラジオール（16-keetoE2）、16-エピエストリオール（16-epiE3）、4-メトキシエストロン（4-MeOE1）、4-メトキシエストラジオール（4-MeOE2）の標準物質と2種類の重水素標識エストロゲン（d-EM）です：
感度と直線性
校正用標準試料は、ブランクマトリックスに分析物を添加し、異なる濃度（0.03, 0.06, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 5 ng/mL）で調製しました。肝門脈血清中のEMの定量は、MultiQuant™ソフトウェアを用いて実施した。各EMの検量線は、検量線から得られたEM-ASC/d-EM-ASCのピーク面積の比を線形回帰（重み付け係数＝1/X2）、相関係数（R）の二乗でフィッティングして作成した。
統計解析
統計解析には、Graphpad Prism 8.0.2 ソフトウェアを使用した。グループ間の統計的な差異を決定するために、学生のt-testを使用した。P < 0.05を統計的に有意とみなした。
サンプル調製の最適化
血清中のEMs濃度は約pg/mLレベルであり[30]、C57BL/6Jマウスの限られた血清中のEMsを同時に測定することは大きな課題である。誘導体化技術はエストロゲンの検出感度を向上させるが、定量に用いられる亜イオン性フラグメントがエストロゲンではなく誘導体化試薬に由来するため、定量アッセイの特異性はまだ低い[31]。複雑なマトリックスサンプルの非特異的な誘導体化
ディスカッション
体内の内因性ステロイドであるEMsの多くは、中性で極性を持たず、イオン化効率が低く、濃度もナノグラムからピコグラムレベルと極めて低い。さらに、EMsのアイソフォームやマトリックスなどの潜在的な要因は、定量的な測定に大きな干渉をもたらし、従来のLC-MS技術によるこれらの物質の検出を困難にしている[32]。ステロイド系エストロゲンとフェノール系エストロゲンに付加された親油性基の数々
結論
門脈中のエストロゲンおよび代謝物の効率的かつ再現性の高いUPLC-ESI-MS測定法を確立した。特に、エストロゲンとその代謝物を導出するために、新しい誘導体試薬である4-アセトアミドベンゼンスルホニルクロリド（ASC）を選択し、イオン化効率を向上させてマススペクトル応答シグナルを高め、15の内因性EMを同時に定量することができました。我々の知る限り、本研究は標的検出プラットフォームを確立した最初の研究である
著者による寄稿
Jiahui Zhou、Xueping Qi： 方法論、データキュレーション、ソフトウェア、執筆- 原案作成。
Na Pan and Wanli Li: Visualization, Investigation and Interpretation of the data. Haiming Fang、Jiajia Wang、Sheng Wangは、Writing-Critical Review and Editing、Conceptizationを行った。
倫理承認と参加への同意
本研究で実施した動物実験は、安徽医科大学実験動物倫理委員会の承認を得ている。すべてのプロトコルは、安徽省実験動物管理弁法に基づき実施され、安徽省実験動物管理委員会の監修を受けた。
資金提供
本研究は、安徽医科大学基礎・臨床共同研究推進プログラム（NO.021xkjT023）、安徽省大学自然科学研究重点プロジェクト、グラント/アワード番号： KJ2021A0268、MOEライフサイクル横断的人口健康重点実験室、Grant/Award Number： JK20215、Anhui Medical UniversityFoundation Project (NO.2022xkj175).
データおよび資料の利用可能性
サポートデータは、合理的な要求があれば、対応する著者を介して入手することができる。
利益相反の宣言
著者は、本論文の研究、執筆、出版に関して、潜在的な利益相反はないことを宣言した。
謝辞
安徽医科大学第二附属病院の健康な被験者に感謝します。
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共同筆頭著者 周嘉慧、斉旭萍。
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© 2023 Published by Elsevier Inc.
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