妊娠時期の異なるヒト新生児糞便の宿主由来タンパク質プロファイル

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妊娠時期の異なるヒト新生児糞便の宿主由来タンパク質プロファイル



ネイチャー・コミュニケーションズ 第15巻、論文番号：5543（2024）この記事を引用する

概要

胎内物質の蓄積を反映する非侵襲的生体物質であるエコニウムは、新生児の健康状態について貴重な洞察を与える可能性がある。しかしながら、妊娠月齢を超えたメコニウムの包括的なタンパク質プロファイルは依然として不明である。そこでわれわれは、さまざまな妊娠月齢の新生児259人の初回糞便のプロテオミクス解析を行い、タンパク質の組成を明らかにし、新生児疾患との関連性を明らかにした。その結果、宿主由来のメコニウムタンパク質は5370種類であり、性別と妊娠月齢によって異なっていた。特に早産児の糞便は、細胞外マトリックスに関連するタンパク質の濃度が高かった。さらに、メコニウムのタンパク質プロファイルは、消化器疾患、先天性心疾患、母体の状態など、特定の疾患によって独自の変化を示した。さらに我々は、メコンタンパク質を用いて妊娠年齢を予測する機械学習モデルを開発した。このモデルは、消化器疾患と先天性心疾患を有する新生児は、消化器系が未熟である可能性を示唆している。これらの知見は、臨床パラメータとメコニウム蛋白質組成との間に複雑な関係があることを浮き彫りにし、新生児の消化管の健康状態を評価する新たなアプローチの可能性を提供するものである。

はじめに

ヒトの生存可能期間は、生存の可能性が50％となる妊娠期間を指し、現在先進国では23〜24週と推定されている。技術の著しい進歩や小児医療専門家の努力にもかかわらず、極早産児（妊娠28週未満の児）や極低出生体重児（体重が1000g未満の児）は、依然として死亡や障害の高いリスクに直面している1,2,3。さらに、これらの乳児は、壊死性腸炎（NEC）やメコニウム関連イレウス（MRI）のような、生命を脅かす外科的腸疾患に対して脆弱である2,4,5。これらの乳幼児の血液、尿、組織について多くの研究がなされているが5,6、これらの腸疾患の根本的なメカニズムは不明なままであり、診断バイオマーカーはまだ得られていない。
プロテオーム解析は、様々な体液や組織中のタンパク質組成を包括的に解析することが可能であり7,8,9,10、新生児を対象とした数多くの臨床研究に広く応用されている11,12,13,14,15。近年、質量分析は著しい進歩を遂げ、細胞や組織サンプル中の10,000を超えるタンパク質を1回の分析で検出できるようになった16,17,18。この方法を利用して、われわれは以前、便プロテオーム解析で2000以上のタンパク質を同定した19。さらに、羊水プロテオームは、性別、妊娠年齢、特定の疾患（消化器疾患（GID）、先天性心疾患（CHD）、染色体異常（CA）、先天性感染症（CID）など）に関連する子宮内環境の解明に用いられてきた20,21,22,23,24,25。
エコニウムは、妊娠第12週から胎児の腸内に存在する、粘性のある無臭の緑黒色物質である。満期の新生児では、最初のメコニウムは通常、出生後48時間以内に排出される。そのため、出生後に非侵襲的に採取することができ、新生児の消化管の病態生理学的状態を調べるのに理想的な臨床サンプルとなる26,27,28,29,30。
胎便は妊娠中はほとんど排泄されないが、出生後に排便されるため、その成分は子宮内胎児期にのみ蓄積される31。胎便の組成は、胎便が腸内で形成される時期によって異なる可能性がある。そのため、初期糞便の組成は、出生後に排出される便の組成とは異なると考えられている32,33。さらに最近の研究では、母体に異常がなく胎児が発育した場合、出生前のメコニウムには腸内細菌叢が存在しないことが示されている34。したがって、初期メコニウムは微生物との相互作用の影響をほとんど受けないようである。初期糞便のロテインプロファイル解析は、新生児の消化管環境を解明する可能性があり、子宮内環境を表す検査パラメータに関する情報を提供する可能性がある35,36,37。

そこで我々は、糞便のプロテオミクス解析を用いることで、便のバイオマーカーを同定し、新生児疾患と関連するこれまで知られていなかった病因を明らかにする新たなアプローチが可能になると考えた。本研究では、様々な妊娠月齢にわたる初回糞便のヒト由来タンパク質プロファイルを確立し、糞便バイオマーカーを同定し、深層プロテオーム解析を通じて新生児の疾患の根本的原因を明らかにすることを目的と

した

。

結果

包括的プロテオミクス解析により、様々な組織由来の宿主由来タンパク質が糞便中に豊富に凝縮していることが明らかに

なった

。

臨床研究7,8,9,10においてヒト由来の様々なタンパク質を定量化するのに非常に有効な手法であるDIA（data-independent acquisition）プロテオーム解析を、259人の新生児から採取した初回糞便サンプルについて実施した（図1a）。本研究で用いた初回糞便サンプルの大部分（76.4％）は哺乳前に採取され、一部（23.6％）は哺乳後に採取された。東京大学医学部附属病院の新生児集中治療室（NICU）または保育室で治療を受けた早産児163人を含む259人の新生児を対象とした（表1、表2、図1b、および補足表1）。 この研究では、DIA-p型新生児を対象とした。本研究では、DIAプロテオーム解析により、259名の新生児の初回糞便中に散在する5370個のヒト由来タンパク質を定量することに成功した（図1c）。しかし、同定された5370個のタンパク質の中には、限られたサンプルでしか検出されなかったものもあった。そこで、少なくとも100サンプルで検出された3433個のタンパク質に焦点を絞り、これらをその後の解析に使用した（図1c）。その結果、初排泄物には、消化管由来だけでなく、様々な組織由来（図1d）の、多くの生物学的機能を持つヒト由来の多様なタンパク質が含まれていることが明らかになった（図1e）。したがって、DIAプロテオーム解析は、バイオマーカーを同定し、新生児の疾病のとらえどころのない病因を、糞便中のヒト由来タンパク質を通して解明する方法として、計り知れない可能性を秘めて

いる

。
図1：データに依存しない初回糞便のプロテオーム解析

a
メコニウムプロテオームの包括的解析に使用された分析プロセスの化学的概要。b新生児選択プロセスのフローチャート。U 新生児集中治療室。cプロテオーム解析を用いたヒト由来の糞便タンパク質の検出。dHuman Protein Atlas（HPA）を用いて同定された3433個のタンパク質の由来を検証。棒グラフは組織特異的タンパク質の数を、折れ線グラフは各組織で同定されたタンパク質の割合を示す。e同定された 3433 タンパク質の Gene ontology (GO) term over-representation analysis。棒グラフは各カテゴリーに関連するタンパク質の数を示す。は濃縮の有意性を表す。有意に濃縮された上位 20 の GOタームが示されている。数値はBenjamini-Hochberg補正を用いた片側超幾何学的検定を用いて計算した

。
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le 1 研究参加者の詳細な新生児臨床特性

Fu
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表2 試験

参加

者の

母親の臨床的

特徴詳細

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男女

間のメコニウム蛋白シグネチャーの差異

REP
X染色体の不活性化に起因する全ゲノムのDNAメチル化38,39,40。
新生児学的にみると、女性の新生児は男性よりもNECやMRIなどのGIDに対する耐性が高く、特に早産児において顕著である41,42,43。そこで、性別とメコニウム蛋白質プロファイルとの関連性を検討した。その結果、男女間で有意差（P< 0.05）を示した77個のタンパク質が特定された。そのうち67個のタンパク質が女性で多く、男性で多かったのは10個だけであった（図2aおよび補足データ1）。すなわち、膜貫通プロテアーゼセリン11D（TMPRSS11D）、セルピンB4（SERPINB4）、デスモグレイン-3（DSG3）、短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼファミリー9Cメンバー7（SDR9C7）、シスタチン-A（CSTA）、セルピンB3（SERPINB3）、シスタチン-B（CSTB）、ウリ ine phosphorylase 1 (UPP1)、Transmembrane protease serine 11E (TMPRSS11E)、Serpin B13 (SERPINB13)は新生児の男性よりも女性で多く、接着Gタンパク質共役型受容体L1 (ADGRL1)は新生児の女性よりも男性で多かった。 これらのタンパク質は一貫して新生児の男性よりも女性で多かった。これらのタンパク質は、79人の非疾患新生児からなる独立したコホートでは、一貫して女性または男性に多く存在していた（補足図1）

。
2：宿主由来のメコニウム蛋白質のオスとメスでの組成の違い

。
雌雄間のメコニウムプロテオームの変化を示すlcanoプロット。x軸は係数で示される効果の大きさを表し、y軸は-log10(P-value)で示される統計的有意性を表す。係数が正の場合はメスの方が多く、負の場合はオスの方が多いことを示す。P-v 各係数の値は、多重検定の調整なしで、両側t検定を用いて計算した。bメス（赤）とオス（青）に豊富に存在するタンパク質を特異的に発現する組織の有意な濃縮（調整後P< 0.05）を示す棒グラフ。c女性（赤）と男性（青）に豊富に存在するタンパク質の、有意に濃縮された遺伝子オントロジー（GO）用語のトップ10を示す棒グラフ。 NES 正規化濃縮スコア。Rパッケージfgsea.

Fulに

実装されているGSEAアルゴリズムに基づいて、Benjamini-Hochberg補正を伴う並べ替え検定を用いて値を計算

した。

サイズ

imageTo
これらの性依存性タンパク質の起源を推定するために、まず組織特異的タンパク質のリストを遺伝子セットとして用いて遺伝子セット濃縮解析（GSEA）を行った。その結果、食道、膣、皮膚、子宮頸部などの扁平上皮組織において、雌に多く存在するタンパク質が有意に濃縮されていることがわかった（図2b）。胚発生の過程で、直腸、膣、尿道は、回腸として知られる共通の管路から分離して形成されることを考慮すると、女性に豊富なこれらのタンパク質は、膣に由来すると考えられる44。性依存性タンパク質に濃縮された生物学的プロセスを探索するために、GSEAが実施された。女性では、エンドペプチダーゼ活性の調節、ペプチダーゼ活性の調節、ペプチダーゼ活性の負の調節、ヒドロラーゼ活性の負の調節、エンドペプチダーゼ活性の負の調節、タンパク質分解の負の調節、表皮の発達、体液性免疫応答、タンパク質分解の調節、細胞間接着が、遺伝子オントロジー（GO）の上位10語であった。一方、男性では、small GTPase mediated signal transduction, microtubule-based process, regulation of cellular components biogenesis, organelle assembly, mitotic cell cycle process, organelle fission, mitotic cell cycle, nuclear division, cell cycle, and mitotic nuclear divisionがGOタームのトップ10であった（図2c）。男性では、体液性免疫応答を含む免疫応答に関連するタンパク質が豊富であった。メコニー内のタンパク質プロファイルの男女差は、生後発達初期の消化管のストレス耐性に影響を与える可能性が

ある

。

早産妊娠新生児における様々な妊娠月齢、細胞外マトリックスタンパク質およびムチンプロファイルのタンパク質プロファイルを調査

した

。
妊娠年齢（GA）は粘度45、ミネラル成分46、糖タンパク質組成47のような糞便の特徴と相関することから、妊娠年齢（GA）と糞便タンパク質プロファイルの潜在的関連性を検討した。そこで、GAによるタンパク質レベルの変化を分析するために、単純な線形フィッティングアプローチを利用した（補足図2a）。 A〜A その結果、1158個のタンパク質のうち、348個のタンパク質がGAによって有意に減少し、348個のタンパク質がGAによって増加した。さらに、局所推定散布図平滑化（LOESS）回帰モデル48を使用して、血漿や房水中のタンパク質の加齢パターン48,49で観察されたような、GAに関連した起伏のある非線形のタンパク質軌跡を調査した（補足図2b）。 この回帰モデル48を使用して、GAに関連したタンパク質軌跡を調査した（補足図2b）。教師なし階層クラスタリングにより、タンパク質はその軌跡パターンに従って6つのクラスターに分類された（図3a、b、補足データ2）。 クラスター ers1とers2は妊娠初期に増加パターンを示し、いずれも細胞膜の組織化、膜分裂、または有糸分裂の細胞質分裂に富み、この段階で細胞の成長、分裂、修復に関連するプロセスが活発に行われていることを示唆していた（図3c）。 Nota 腸型アルカリホスファターゼ、胎盤型アルカリホスファターゼ、生殖細胞型アルカリホスファターゼを含むアルカリホスファターゼファミリーがこれらのクラスター内に存在することは、メコニウムアルカリホスファターゼ活性とGA50の間に有意な正の相関があることを強調した先行研究と一致している。 Addi イオン性では、クラスター4がユニークなパターンを示し、GAとともに単調減少した。タンパク質は、細胞外マトリックス（ECM）と細胞外構造関連タンパク質の両方に特異的に濃縮されていた（図3cおよび補足データ3）。 Nota また、早産児の糞便中には、ラミニンサブユニットγ-1（LAMC1）、インテグリンα-1（ITGA1）、インテグリンα-2（ITGA2）、インテグリンβ-1（ITGB1）、コラーゲンVIα-3鎖（COL6A3）、コラーゲンIα-1鎖（COL1A1）などのタンパク質が顕著に多く含まれていた（補足図2c）。 さらに、これらの所見は、早産児の糞便中にも認められた。さらに、これらの所見は79人の新生児からなる独立したコホートでも裏付けられた（補足図2d）。 デュリ 胎生期には、ラミニンやインテグリンなどのECMタンパク質が、消化管に沿った絨毛と陰窩の両方で発現していた51。したがって、これらの所見は、胚発生段階における発生の経過を反映していると考えられた

。
3：妊娠加齢に伴う宿主由来の糞便タンパク質の軌跡のクラスタリング

aUn
b同定された6つのクラスターのタンパク質軌跡。c各クラスター内のタンパク質の遺伝子オントロジー（GO）項濃縮分析。P-va。

ueは、

Benjamini-Hochberg補正を用いた片側超幾何学的検定を用いて計算した。
サイズイメージメコ
粘性の高い排泄物である尿は、粘性の増加により通過が遅れることがある26。腸の運動性が生理的に未熟であることに加え、未熟児の便の水分含量が低下すると、粘液粘液症が増加するため、MRIの一因となる可能性がある27,52。 粘液 ムコ粘液症は、粘膜表面にみられるゲル状の物質で、主に1つ以上のゲル形成性ムチンからなり、MRIの潜在的な原因と考えられている53。 Howe しかしながら、胎便の包括的なムチンプロファイルは、いまだ不明である。ロテオミクス分析により、初回メコンに含まれる複数のムチンが同定された。Mucin-1、Mucin-2、Mucin-3A、Mucin-6、Mucin-7はクラスター1に、Mucin-5ACとMucin-16はクラスター4に、Mucin-4とMucin-17はクラスター5に、Mucin-5B、Mucin-12、Mucin-13はクラスター6に分類された（補足表2）。 Amon ムチン-2は主に小腸と大腸で合成され、欠損すると炎症性腸疾患などの腸疾患と関連するため、広く研究されている54,55。プロテオームデータセットの解析を行うため、個々の糞便タンパク質を正確に定量できる酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を用いた。初回糞便サンプルのLISA分析により、ムチン-2レベルとプロテオームデータとの顕著な一致が明らかになり、この相関は別々のコホートでさらに確認された（補足図3a）。 これらのELISAによる知見は、プロテオームデータセットに関する貴重な洞察を与えるものである。ELISAで得られた知見は、Mucin-2の発現パターンと、さまざまな妊娠月齢の新生児におけるその潜在的な関連性について、貴重な洞察を与えるものであっ

た

。
補足すると、PG乳児の糞便には、ECMと結びついた凝縮したタンパク質が認められ、Mucin-1とMucin-2が少なく、Mucin-5ACとMucin-16が多いという特徴的なムチンプロファイルが認められた（補足図3b）。 これらのユニークな糞便プロファイルは、PG乳児の新生児において、Mucin-1とMucin-2が少なく、Mucin-5ACとMucin-16が多いという特徴的なムチンプロファイルを示す。ユニークなメコニンプロファイルは乳児の成熟度に影響され、生後早期の新生児によくみられる重篤な腸疾患の病因に関与している可能性がある

。

e-依存性メコニウムタンパク質プロファイルわれわれは

ai
GID、CHD、CA、CID20,21,22,23,24,25のような様々な疾患の根本的な病因を明らかにするために、疾患とメコニウムプロテオームとの潜在的な関連性を明らかにすることを目的とした（補足図4a、補足データ4）。 その結果、メコニウムプロテオームには、疾患によって異なる特徴が認められた。その結果、疾患カテゴリーごとに異なるメコニムタンパク質プロファイルが同定された（図4a-d）。GIDコホートでは、他の3つの疾患群では見られなかった異化過程を含む代謝過程の濃縮が観察された（図4e）。 Addit さらに、腸管上皮の成熟に不可欠なRasタンパク質のシグナル伝達56が、GIDコホートでは有意に低下している。 このRasタンパク質の機能低下は、腸管上皮の成熟を阻害している可能性が高い。Rasタンパク質の機能低下は、消化管組織の異常の一因であると考えられる。 結果 近年、GIDに関連する解剖学的異常は、メコニムタンパク質の機能的役割に影響を及ぼす可能性がある。 CHD群では、メコニムタンパク質の機能的役割が低下していた。CHD群では、膜内局在に関連するタンパク質が減少し、オルガネラ局在も減少した（図4f）。 CA群では、膜内局在に関連するタンパク質が減少し、オルガネラ局在も減少した（図4f）。CA群では、微小管ベースのプロセスや微小管細胞骨格の構成に関連するタンパク質が減少した（図4g）。 CA群では、Tr. 私たちのCAコホートでは、トリソミー21が顕著に多く（補足データ4）、微小管が重要な役割を果たす繊毛症などの特徴的な特徴が見られた57。これらのコホートにおける糞便の位置は、このような臨床的特徴を反映しているのかもしれない。CIDコホートでは、上位10位までの濃縮過程が感染に対する反応と関連していた（図4h）。 これまでの研究で、CIDコホートとCIDコホートでは、感染に対する反応が異なることが報告されている。また、乳児が羊水を摂取することはよく知られており、その結果、糞便の組成に影響を与える。 この発見は、羊水が感染症に直接影響することを強調するものである。このことは、羊水が糞便組成に直接影響することを強調している。 ファース さらに我々は、妊娠糖尿病（GDM）および妊娠高血圧症候群（HDP）の症例におけるメコニウムプロテオームの解析を行った。 その結果、妊娠高血圧症候群（HDP）の症例において、メコニウムプロテオームの濃縮が見られた。その結果、妊娠糖尿病（GDM）の母親から生まれた赤ちゃんは輸送機能に富んでいるのに対し、妊娠高血圧症候群（HDP）の母親から生まれた赤ちゃんは生合成と代謝機能に富んでいることが明らかになった（補足図4b、c）。メコニウムに関する我々の研究結果を踏まえれば、羊水サンプルを利用することで疾患予測に向けて研究を拡大できる可能性がある。つまり、これらのユニークな糞便タンパク質プロファイルは、子宮内の状態を反映し、特定の新生児疾患の病因の指標となる可能性がある

。
胎生期疾患のメコニウムタンパク質プロファイルを探る.

Volca
GID（a）、CHD（b）、CA（c）、CID（d）によるメコニウムプロテオームの変化を示すOプロット。軸は係数で示される効果の大きさを表し、Y軸は-log10(P値)で表される統計的有意性を示す。係数がプラスの場合は、疾患サンプルの存在量が多いことを示し、係数がマイナスの場合は、存在量が少ないことを示す。P値 各係数のESは、多重検定の調整なしで、両側t検定を用いて計算された。 バー p 疾患サンプル（赤；GID(e)、CHD(f)、CA(g)、CID(h)）でより豊富に存在し、疾患サンプル（青）でより少ないタンパク質のGene ontology (GO)用語が有意に濃縮された上位10位を示すots。P値 esはRパッケージfgseaに実装されているGSEAアルゴリズムに基づき、Benjamini-Hochberg補正を用いた並べ替え検定を用いて計算した。 NES n 計算された濃縮スコア。

ize

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メコニウムプロテオーム解析によるGA予測の

試み
メコニウムタンパク質の組成がGAの予測因子となりうるかどうかを調べるために、最小絶対縮小選択演算子（LASSO）回帰を適用した。 まず、最初に、 トレーニング・コホートとバリデーション・コホートのアプローチを用いてモデルを構築し、259検体を2：1の割合でランダムに分割して検証し、初期の妊娠予測モデルを作成した（補足図5a）。その結果、予測値と実際の検体の間に食い違いが生じたが、これは特定の疾患の影響によるものであった。 メコ ニウム検体では、妊娠期間中に妊娠が確認された。GID、CHD、CA、CIDの4つのコホートから得られた胎便サンプルは、固有のタンパク質プロファイルを有していたため（図4参照）、これら4つの特定の疾患に罹患したサンプルを除外することで、GA予測モデルを改良した。 サ すなわち、149検体の非疾患検体（特定疾患検体を除く）からなるトレーニングコホート、55検体の非疾患検体からなるバリデーションコホート、55検体の特定疾患検体からなるバリデーションコホートである。トレーニングコホートデータを用い、57のタンパク質（補足データ5）に基づいてGA予測モデルを開発した（R = 0.98、RMSE = 1.00；図5a）。 このモデルは、特定疾患サンプルの予測に高い精度を示した。非疾患サンプルの検証コホートのGAを予測する精度は高かったが（R = 0.93, RMSE = 1.36; 図5b）、特定疾患サンプルの検証コホートのGAを予測する精度は低かった（R = 0.81, RMSE = 2.57; 図5c）。 Notabl しかし、55の特定疾患サンプルからなる検証コホートには、予測された年齢が実際の年齢よりも低い外れ値が存在した。 これらの外れ値は、実際の年齢よりも不釣り合いであった。外れ値は、GIDとCHDのサンプルに偏って見られた（補足図5b）。 これらのGIDとCHDのサンプルは、予測年齢が実際の年齢よりも低かった。IDおよびCHDサンプルは、非疾患サンプルと比較して有意に低いGA不一致（予測GA-実GA）を示し（それぞれP= 0.002および0.0002；図5d）、GIDコホートの新生児は胃腸が未熟である可能性がある一方、CHDコホートの成長遅滞は血流および酸素供給の異常に二次的であることが示唆された58。 最後に 我々は、79人の非疾患新生児からなる外部コホートを評価することで、我々の予測モデルを検証し、GA推定における有効性を確認することに成功した（R = 0.88、RMSE = 2.24；補足図

5

c）。
メコニウムプロテオーム解析による妊娠時期の予測可能性

。
トレーニングコホート（特定疾患を除く、149サンプル）における妊娠年齢（GA）予測 RMSE r 平均二乗誤差。b検証コホート（特定疾患を除く、55サンプル）におけるGA予測。 RMSE r ot-平均2乗誤差。c検証コホートにおけるGA予測（特定疾患，55サンプル）． Bl eと赤の点はそれぞれ男性と女性を表す。実際のGAと予測されたGAとの相関係数と両側P値を示す。 RMSE： 平均二乗誤差。回帰直線の周りの領域は95％信頼区間を表す。d実際のGAと予測GAとの差のコホート間比較：Traini g 非疾患（149サンプル） vs. バリデーション 非疾患（55サンプル） vs. 特定疾患（GID：11サンプル、CHD：42サンプル、CA：10サンプル、CI：4サンプル）。 GID ga 腸疾患、CHD 先天性心疾患、CA 染色体異常、CID 先天性感染症 統計解析 Validation Non-diseaseコホートとの比較分析はWilcoxon順位和検定を用いて行った；***P = 0.002,***P= 0.0002。箱ひげ図内の数値は中央値を示す。 箱ひげ図内の数値は中央値を示す。

は

25パーセンタイルと75パーセンタイルを示し、ひげは25パーセンタイルと75パーセンタイルのIQRの1.5倍まで伸びる

。
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w
ヒト由来のタンパク質プロファイルを確立し、新生児疾患との関連性を解明するために、259人の新生児から採取した糞便の広範なプロテオーム解析を行った。 その結果、宿主由来のタンパク質が5370個存在することが明らかになった。その結果、5370個の宿主由来のメコニウムタンパク質が検出され、3433個のタンパク質に着目することで、性別やGAによって異なることが示された。 また、新生児を対象としたプロテオミクス研究と同様に、新生児を対象としたプロテオミクス研究も実施した。また、羊水に関するプロテオミクス研究と同様に、糞便のタンパク質プロファイルも、GID、CHD、CA、CIDなどの特定の疾患や、GDM、HDPなどの母体の状態によって異なることが示された。 これらの知見は、新生児疾患との複雑な関係を浮き彫りにするものである。この結果は、臨床パラメータと糞便タンパク質組成の間に複雑な関係があることを浮き彫りにし、新生児の胃腸の健康状態を評価する新たなアプローチの可能性を提供するものである。 さらに、我々は機械学習モデルを開発した。さらに、我々は、メコニウム蛋白質を用いてGAを予測する機械学習モデルを開発した。超音波検査は依然として妊娠初期のGAを評価するためのゴールドスタンダードであるが、低・中所得国ではその精度に課題がある59。このような状況において、メコニウムプロテオーム解析を活用したわれわれの革新的なアプローチは、有望な解決策を提供するものである。 メコニウムプロテオーム解析により、GAを正確に推定することができる。GAを正確に推定することで、出産後の医療介入に情報を提供し、世界的な公衆衛生基準を高めることができる

。
本研究にはいくつかの限界がある、 特にNECやMRIのような疾患については、サンプルサイズが限られていた。さらに、特定疾患コホート内のPGサンプルが乏しく、本研究は単一の施設に限定されていた。また、絨毛膜羊膜炎（CAM）コホートでは、欠損値の割合が高かったため、これらのサンプルを含めることができなかった。 結論 そのため、メコニウム蛋白質とこれらの疾患との潜在的関連性を調査することはできなかった。しかし、より大規模なコホート研究によって、これらの重要な新生児疾患に関連する特定のメコニウム蛋白質バイオマーカーが明らかになることが期待される。 第二に、本研究はメコニウム蛋白質のみに焦点を当てた。本研究では、羊水や血漿のような他の重要な臨床プロテオームを見落として、糞便蛋白質のみに焦点を当てた。 しかし、我々は、妊娠中に糞便を採取することはできない。胎児の状態を評価するために妊娠中に糞便を採取することは非現実的であるが、最近の報告では、胎児の羊水に微量の糞便が含まれていることが示されている31。羊水と胎便のプロテオミクスに相関関係があることを明らかにすることは、今後の研究の基礎となるであろう。第3に、羊水採取のタイミングである。しかし、初回メコニウムを採取するタイミングは我々のコホート間で異なっており、より洗練された方法を用いて我々の知見を検証する必要があるかもしれない。 前報 乳児の腸内細菌叢研究において、直腸スワブサンプリングは自然排便によるサンプリングに代わる信頼性の高い方法となりうることが、他の研究によって示唆されている60。メコニウム研究におけるサンプリング方法に特化した先行報告はないが、乳児の安全性を優先しながらサンプリング方法に関する研究を行うことが、この問題の解決に役立つと考えられる。 最後に ショットガンプロテオーム解析は、タンパク質に由来する特定のペプチドを検出することでタンパク質を同定する、 しかしながら、ショットガンプロテオーム解析は、サンプル中の全タンパク質の存在やその機能を決定的に決定するものではない。ショットガンプロテオーム解析は、サンプル中の短いペプチドを検出することができるため、バイオマーカーを検出するための優れた方法であることに変わりはない。 さらに、本研究で示されたように、バイオマーカーを検出するためには、ショットガンプロテオーム解析が有効である。さらに、我々の研究で実証されたように、これらの不確実性は、ELISAや選択反応モニタリングのような他のターゲットベースのハイスループットアプローチのような方法を用いたバリデーションによって対処することができる。 ES 本研究で同定された Mucin-2 のような糞便タンパク質を定量するための ELISA システムを構築することで、臨床の場で新生児を対象とした新規の非侵襲的検査法を提供できる可能性が

ある

。

私たちは、ディーププロテオミクス解析を用いて、様々な妊娠月齢における初回糞便中のヒト由来の頑健なタンパク質プロファイルについて報告した。 その結果、以下のことが明らかになった。宿主由来タンパク質に着目した糞便の解析は、新生児の消化管生理の解明のみならず、GID、CHD、CA、CIDなどの全身疾患の病態生理を明らかにし、臨床ケア戦略を導く上で大きな可能性を持っている。 宿主由来タンパク質の詳細な検討 糞便中の宿主由来タンパク質の研究は、新たなバイオマーカーの発見や未知の新生児疾患の病因の解明につながるだけでなく、新生児の消化器系を評価する新たな方法の確立にもつながる。

本研究で

得られた知見の妥当性と有用性を確立するためには、メコニウム蛋白に関する大規模な研究が必要である

。

特徴

ヒトコホートにおけるメコニウムの性状

評価
259人の新生児から採取したサンプルを用いて、糞便のタンパク質組成を分析した（表1および表2）。 このプロ 図1bに示すように、東京大学医学部附属病院で治療を受けている新生児を対象とした。この研究では、両親の同意が得られない新生児、初回メコニウムが採取できない新生児、院外で出生した新生児は対象から除外した。本研究では、参加者の生物学的属性である性別に関するデータのみを収集し、一貫して正確な用語で表記した。 性別は、以下のように分類した。性別は、「男性」と「女性」の2つのグループに分類した。女性」と「全体」である、 本研究では、男性112名、女性147名を対象とし、男女比は43.2％対56.8％であった。 評価の目的 外部検証コホートでは、79人の非疾患新生児（GA：34.1±4.3週）から採取されたサンプルを分析した。 このコホートでは、男性40人、女性147人から採取されたサンプルを分析した。男性40名、女性39名で、男女比は50.6％対49.4％であった。 追加 また、男性22名、女性18名（男女比55.0％対45.0％）から、ELISA分析用のムチン2 40検体が提供された（GA：31.9±5.5週）。 特筆すべきは、ムチン2に関する情報を収集していないことである、 対象者が出生後間もない新生児であったため、3つのコホートとも性自認に関する情報は収集して

いない

。

様々な

疾患に対する

方法

GID、CHD、CA、CIDのような様々な疾患に関連するサンプルを対象とした（Suppleme 様々な診断法が採用された。GIDは腹部CTを用いて診断した。CHDは腹部X線、超音波（US）、手術所見を用いて診断された。主に出生後のUSで同定され、大半の症例は胎児超音波検査で発見された。 いくつかの症例では CAと診断された症例は、状態が安定した後、造影CT検査でさらなる評価を受けた。Gバンディングや蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)のような技術を用いて診断された。CIDの場合、サイトメガロウイルス（CMV）感染は尿検体のPCR分析で同定され、細菌感染は鼻腔、便、血液、皮膚検体の培養所見で確認された。 これらのダイア X線画像診断、血液検査（白血球数やC反応性タンパク値などの炎症マーカーを含む）、臨床評価によって、診断手順を補完

した

。

出産予定日の

決定

分娩予定日の推定には、「産科診療ガイドライン2023年版」に概説されている様々な方法が用いられる。一般的には、胚移植日や特定可能な排卵日、正常月経周期や最終月経日、特定の妊娠段階における頭殿長（CRL）などの要因を考慮する、 CRLの計算には、1週間後の頭頂直径（BPD）の測定が含まれ、分娩予定日は通常、妊娠13週6日前後に特定される。 日本の産科医療では このような産科医療のシナリオでは、妊娠が確認されると、妊娠者は速やかに産婦人科を受診する。 したがって、GA判定は、多くの場合、妊娠13週と6日目に行われる、 その際、最終月経日からの推定値だけでなく、CRLの測定値に頼ることが多い。 本論文 最終月経とUS測定の両方を統合した最適化されたアプローチにより、正確なGAを決定することができる。

eome測定

メコニウム

サンプルは338個体から採取され、そのうち259個体がスクリーニング研究用、79個体が検証研究用であった。したがって、プロテオーム解析は338個の生物学的複製を用いて行われた。
サンプルは完全性を保つために-20℃で保存した。 プロテオーム分析 メコニウムサンプルの分解は、すでに確立されたプロトコール19 に従って行った。Tween20およびプロテアーゼ阻害剤（CAT# 5892791001, complete ULTRA Tablets, Sigma-Aldrich）を含むトリス緩衝生理食塩水で、糞便からタンパク質を抽出した。 抽出工程は、ピペッティングおよび濾過を行った。その後、サンプルを氷上で30分間インキュベートした後、ピペッティングと反転を行った、 抽出された蛋白質は、ピペッティング後、転倒混和し、15,000×g、15分間、4 ˚Cで遠心分離し、上清を回収した。 抽出された蛋白質は、ピペッティング後、転倒混和した。タンパク質は、Pierce™ BCA Protein Assay Kit（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いて、300 ng/μLで定量した。 還元的アルキル化 回収したサンプルについて、SP3法を用いて洗浄を行った。 酵素消化 トリプシン/Lys-C（Promega, Madison, WI, USA）を用いて37 ˚Cで一晩静置した。 消化物 ペプチドは、GL-Tip SDB（GLサイエ ンス、東京、日本）を用いて、製造元のプロトコールに従って精製した。 ペプチド 消化物を0.1%トリフルオロ酢酸を含む2%アセトニトリル(ACN)に再溶解し、BCAアッセイを用いて200 ng/μLで定量した。ショットガンプロテオーム解析のために、ペプチド（400 ng）を15 cm × 75 μm, C18, 1.6 μm (Aurora Column, Ion Opticks, Australia)の分析カラムに直接注入し、90分間のグラジエントで分離した（移動相A = 0.1% ギ酸 (FA)、B = 0.1% FA in 80% ACN)で90分間分離した。 UltiMate 3000 RSLCnano LCシステム(Thermo Fisher Scientific)を用い、流速150 nL/minで0分6% B、78分36% B、84分65% B、90分65% Bからなる。 ペプチド カラムから溶出した試料は、Orbitrap Exploris 480（Thermo Fisher Scientific）を用いて、オーバーラップウィンドウを用いたDIA法61 に従って分析した。 スプレー電圧 質量分析(MS)のエージとキャピラリー温度は、それぞれポジティブイオンモードで1.5 kV、275 °Cに設定した。質量分解能15,000でm/z 495-785のフルスキャンに設定し、オートゲインコントロール（AGC）ターゲットを3×106、最大注入時間を「Auto」に設定した。 MS2は、m/z 495-785で収集した。質量分解能30,000でm/z 200-1800を選択し、AGCターゲットを3×106、最大注入時間を60ms、段階的に正規化した衝突エネルギーを22、26、30%に設定した。 アイソレーション MS2のidthは4 Thに設定し、Xcalibur 4.3（Thermo Fisher Scientific）を用いて最適化したウィンドウの配置には、500～780 m/zのオーバーラップウィンドウパターンを採用した

。
DIA-NN v1.862を使用して、ヒトスペクトルライブラリに対して測定ファイルを検索した。 ヒトスペクトルライブラリ ライブラリーは、DIA-NNを使用して、ヒトタンパク質配列データベース（UniProt ID UP000005640、レビュー済み、canonical、2021年3月31日ダウンロード）から作成した。 以下のパラメータを使用した。DIA-NNの検索パラメータは、消化酵素、トリプシン、切断ミス、1、ペプチド長範囲、7-45、前駆体電荷範囲、2-4、前駆体m/z範囲、490-790、フラグメントイオンm/z範囲、200-1800、"FASTA digest for library-free search/library generation"、"deep learning-based spectra, RTs, and IMs prediction"、"n-term M excision"、"C carbamidomethylation "です。rchパラメータは以下の通り：質量精度、10ppm；MS1精度、10ppm；タンパク質推論、遺伝子；ニューラルネットワーク分類、シングルパスモード；定量化ストラテジー、ロバストLC（高精度）；クロスラン正規化、RT依存；および "unrelated runs"、"use isotopologues"、"MBR"、"heuristic protein inference"、および "no shared spectra "が有効化された。 タンパク質同定閾値は1%に設定された。entificationの閾値は、プレカーサーとタンパク質のFDRの両方で1%以下に設定した。 を持つタンパク質。少なくとも1つのユニークなペプチドが選択さ

れた

。

タンパク質発現レベルの表現型

合計343
少なくとも100サンプルで検出されたタンパク質をその後の解析に使用した。 タンパク質の発現レベルは、前駆体およびタンパク質FDRの両方で1%以下とした。発現レベルは対数10変換した。 欠測値 検出されなかったタンパク質は、検出されたタンパク質の実測データ分布の中央値から低発現に向かってシフトした中央値を持つ正規分布に基づいてインプットされた（ダウンシフト1.8、幅0.3）63。 組織特異的タンパク質のリスト e 特異的タンパク質は、Human ProteinAtlas64(https://www.proteinatlas.org/humanproteome/tissue/tissue+specific; 2024年2月28日ダウンロード)の'total elevated'遺伝子リストから得た。 GO term over-r RパッケージclusterProfiler（v4.6.2）65のenrichGO関数を用いてタンパク質のプレゼンテーション解析を行った。ベンジャミン・ホッホベルグ

法を用いて

調整した。

GA、性別、タンパク質発現量間の関連については、以下の線形モデルを用いた

：$${{{{rm{Prot
in}}}}; {{{{rm{expression}}}}; {{{rm{level}}}}} ￢sim {{{{rm{level lpha }}}}}+{{{rm{gestational}}}}}}}1, {{{rm{gestational}}}}}}}}}+{{{rm{age}}}}}}}2, {{{rm{sex}}}}}+{{{rm{varepsilon

}}}}}}$$

同様に

タンパク質発現レベルに対する特定の疾患の影響を評価するために、以下の線形モデルを当てはめた

：$${{{rm{Prote
n}}}}; {{{{rm{expression}}}}}; {{{rm{level}}}}} ⊖Sim {{{rm{a


(効果量)と、GA、性別、疾患に関する関連するP値が、適合した各モデルから抽出された。 ボルケーノプロットわれわれ Rパッケージggplot2(v3.4.3)を用いて可視化した。 GO項のGSEA rmsはRパッケージclusterProfilerのgseGO関数を用いて行い、遺伝子（タンパク質）をP値と係数に基づいてランク付けした。 組織特異的発現のGSEA 組織特異的発現は、Rパッケージfgsea（v1.24.0）66を用い

、

組織特異的タンパク質のリストを遺伝子セットとして

用いた。


妊娠加齢に伴うeinの軌跡タンパク質

発現

レベル


各タンパク質について、妊娠加齢に伴うタンパク質の軌跡をz-スコア化し、LOESS回帰を行った。 階層的クラスタリング リング解析は完全連鎖とユークリッド距離を用いて、類似した軌跡を持つタンパク質をグループ化

した

。

プロテオームデータデータセットを分割

した。

プロテオームデータをトレーニング群と検証群に分け、LASSO回帰を行った。Rパッケージのglmnet（v4.1.8）67に実装されている方法を用いて、GAとメコニムプロテオームデータの関係をモデル化した。 モデルのトレーニングには、149名の非プロテオームデータを用いた。疾患関連でない149サンプルを使用した。 クロスバリデーション 最適な正則化パラメータλを決定するために、GAを予測した。学習したLASSOモデルを用いて、訓練コホートと検証コホートについて

測定

した。

C2濃度

メコニウムサンプル
メコニムMUC2濃度を測定するために、最初にTBSで60μLあたり10μgの濃度に希釈し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を加えた。 ピペッティング後、メコニムMUC2濃度を測定した。得られた上清を、氷上で 30 分間保持した後、15,000g、4 °C で 30 分間遠心した。ELISA 法には、タントを使用した。 補足図3 MUC2の定量化 濃度は、Human MUC2 ELISA Kit（Cloud Clone Corp）を使用し、製造者の説明書に従った。 サンプルはアプ MUC2に特異的なビオチン結合抗体を含むプレコートプレートに添加し、1時間インキュベートした。 十分に洗浄した後、HRPに結合したアビジンを30分間プレートに添加し、さらに洗浄とTMB反応を行った。 酵素-基質反応 硫酸溶液を加えて反応を停止させ、その結果生じた色の変化を波長450 nmで分光光度計（パーキンエルマー社製）により測定した。 MUC2の濃度を測定した。サンプル中のMUC2は、サンプルの光学密度（OD）を標準曲線と比較することにより決定した。 サンプル希釈は、以下の方法で行った。標準曲線と一致するように調整した。

研究情報
研究デザインは、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryで入手可能

で

ある。
tを支持するデータ
本研究で得られた知見は、原稿とその補足情報で入手可能である。 259サンプルのMSデータ 本研究で使用されたplesおよび79の外部サンプルは、ProteomeXchange ConsortiumのjPOSTパートナーリポジトリ68で、それぞれProteomeXchangeではPXD047426、jPOSTではJPST002405、ProteomeXchangeではPXD050164、jPOSTではJPST002961のアクセッションコードで入手可能である。 その他の生データについて ソースデータは本論文とともに提供される。

コード利用可能

性

コード利用可能性コード利用可能性コード利用可能性コード利用可能性コード利用可能性コード利用可能性コード利用可能性

本論文で使用したコード
論文はGitHub(https://github.com/my0916/meconium)から入手できる。

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ナレッジメンツWe

e
謝辞

メコニウムに関連する問題への対応に尽力し、研究コホートの両親に本研究の概要を説明した看護師および主治医に心から感謝する。 私たちは、研究コホートの両親とその家族に対し、以下の謝意を表明する。本研究に貴重な参加をしてくれた両親に感謝する。 E.W.は以下の資金援助を受けている。J.F.は日本学術振興会科学研究費補助金（No.19K24007およびNo.23K15465）、公益財団法人川野正徳小児科学振興財団、公益財団法人群馬県医学・健康科学振興財団の助成を受けた。 J.F.は日本学術振興会科学研究費補助金（No.19K24007およびNo.23K15465）の助成を受けた。日本学術振興会科学研究費補助金（No.20K20469）。
または

  1. 注
    貢献者
    等しく編：設楽義彦、亮 今野, 吉原正人.

著者と

所属


  1. 小児科
    東京大学医学部、日本、東京
    設楽義彦、今野亮、吉原正人
    鹿島、伊藤敦、向井武夫、木本剛、垣内さつき、高橋直人

  2. 応用

  3. ゲノム科学研究部門

  4. nomics, Kazusa DNA Research Institute, Chiba, Japan
    Ryo Konno, Masaki Ishik
    wa, Osamu Ohara & Yusuke Kawashima

  5. (財)先端科学技術研究センター(IAIST)

  6. 千葉大学学術研究（IAAR）, 千葉, 日本
    吉原正人 & 英
    川上 陽

  7. 人工知能

  8. 医学専攻

  9. 千葉大学大学院医学研究院 知能医学部門, 千葉, 日本
    Masahito Yoshihara & Ei
    川上 陽

  10. プレミアム

  11. 総研

  12. 大阪大学大学院医学系研究科 人工知能医学講座（WPI-PRIMe）, 大阪府吹田市, 日本
    吉原正仁

  13. Depa
    小児外科学分野
    東京大学医学部外科学
    柿原友、藤純
    hiro & Eiichiro Watanabe

  14. 産婦人科学教室
    国際医療福祉大学医学部産婦人科（日本、千葉）
    永松 毅

  15. Advan
    データサイエンスP

  16. 理化学研究所

  17. 情報・戦略研究機構 情報・戦略研究領域
    川上

  18. 英亮

  20. 部長
    外科
    群馬県立こども医療センター
    渡辺

栄一郎

Contr
ブチオンズY

.S.

W.コントリビューション

Y.S.、K.K.、A.I.、T.M.、G K.、S.K.、E.W.が臨床解析を行った。 M.Y.、R.K.、M.I.、E.K.、a d Y.K.がプロテオーム解析を行った。 Y.S.、K.K.、A.I.、T.M.、T 初稿はY.K.、R.K.、M.I.、E.K.、Y.K.が作成した。N.T.、J.F.、O.O.が監修した。Y.K.とE.W.は、本研究の責任者である。本試験の責任

著者

。

川村祐輔
渡辺栄一郎またはwashima.

Ethics

declarationsCompet
利害

関係

au

著者らは競合利益なしを宣言する。

倫理倫理

承認は

以下の通りである

。

承認

東京大学医学部附属病院施設審査委員会（番号2019010NI-13）。 さらに、インフォームド・コンセントを得た。参加者全員の両親または法定後見人から承認を得た。 すべての方法は、東京大学医学部附属病院において実施された。

査読

査読は

、「人を

対象とする医学系および生物学系研究に関する倫理指針」に記載されている倫理指針に従って

行われた。

論文

Nature

ommunicationsthanks Br
ce Gaudilliere氏、および他の匿名の査読者の方々には、本著作の査読にご貢献いただいた。 査読ファイルが利用可能です。

追加情報

掲載
注

補足情報

Suppl
補足情報

査読

者
査読

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, Y..

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nno, R., Yoshihar
NatCommun15, 5543 (2024).http ://doi.org/10.

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    2024年7月

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