海洋哺乳類のセンチネル種であるハイイロアザラシの仔魚と1歳魚の糞便微生物叢の比較研究

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微生物学オープン第11巻第3号e1281
原著論文
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海洋哺乳類のセンチネル種であるハイイロアザラシの仔魚と1歳魚の糞便微生物叢の比較研究

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mbo3.1281

クレイグ・A・ワトキンス、テイラー・ゲインズ、フィオナ・ストラスディー、ジョアンナ・L・ベイリー、エレノア・ワトソン、アイルサ・J・ホール、アンドリュー・フリー、マーク・P・ダグリッシュ
https://doi.org/10.1002/mbo3.1281
引用 1
について
セクション

図表による要約
ハイイロアザラシ（Halichoerus grypus）は、生息環境の状態を反映するセンチネル種として機能することがある。我々は、年齢による変化と3つの異なる出生地の陸上生息環境がアザラシの仔の糞便微生物相に及ぼす影響についてさらに理解を深めるために、仔と1歳のハイイロアザラシの直腸スワブを調べた。この予備調査は、アザラシのマイクロバイオームが年齢と、仔アザラシの場合は異なる陸上生息環境の両方によって変化するという一般的な傾向を示唆している。さらに、存在する微生物叢の種の知識は、環境質指標の決定に利用できる可能性がある。

詳細不明
概要
ハイイロアザラシ（Halichoerus grypus）は、生息環境の状態を反映するセンチネル種として機能する可能性がある。我々の以前の研究では、英国スコットランドのメイ島で生きたハイイロアザラシ（H. grypus）の仔および1歳児から採取した直腸ぬぐい液から、ヒトおよび家畜を宿主とする病原性カンピロバクターとサルモネラの菌株を同定した。同じ仔ハイイロアザラシ（n＝90）と1歳ハイイロアザラシ（n＝19）の直腸スワブを調べ、年齢による変化（仔ハイイロアザラシ対1歳ハイイロアザラシ）と3つの異なる生育地がアザラシの仔の糞便微生物叢に及ぼす影響についてさらに理解を深めた。最適化された手順で直腸ぬぐい液のサブセット（仔魚n＝23、1歳魚n＝9）からDNAを抽出し、16SリボソームRNA遺伝子のV4領域の塩基配列を決定して各個体の微生物叢を同定した。p=0.05レベルでは有意ではなかったが（p=0.062）、仔ウシのサンプルの多様性は1歳ウシ（4.66±0.39）よりも低かった（3.92±0.19）。同様に、3つの異なる陸上生息地（Pilgrim's Haven [PH]、Rona Rocks [RR]、Tarbet Slope [TS]）の仔ウシから得られた微生物叢の組成間の差は、非常に有意であった（p < 0.001）。一対検定では、3つの生息地すべてで有意差が認められた： PH対TS（p = 0.019）、PH対RR（p = 0.042）、TS対RR（p = 0.020）である。この予備調査は、アザラシのマイクロバイオームは年齢と、仔アザラシの場合は陸上の生息地の違いによって変化するという一般的な傾向を示唆している。さらに、存在する微生物叢の種の知識は、環境品質指数の決定に利用できる可能性がある。

1 はじめに
陸上動物の腸内細菌叢は、個体の健康状態や、センチネル種では生息する生態系に関係している（Hanning & Diaz-Sanchez, 2015）。海洋哺乳類は中食動物として、沿岸域や海洋生息域の健康状態を反映するセンチネル種として働くことができる（Bik et al., 2016; Bonde et al., 2004; Cook et al., 2015; Delport et al., 2016; Gulland, 1999; Jessup et al., 2004; Moore, 2008; Nelson et al、 2001; Wells et al., 2004）、これは疾病伝播、食物網の変化、気候変動、人為的汚染物質の蓄積の影響を調査するのに有用である（Apprill, 2017; Baily et al., 2015; Delport et al., 2016; Godfray et al., 2019; Jepson et al., 2005）。いくつかの海洋哺乳類種における人工化合物レベルの上昇は、人為的汚染とその海洋生態系への影響を明確に示している（Moore, 2008）。さらに、英国のハイイロアザラシの仔の糞便から、陸上および人為起源のカンピロバクター菌とサルモネラ菌の特定種と株が検出されたことから、人間の下水や農業からの流出水の管理が不十分であることが示唆された（Baily, 2014; Baily et al.）

海洋哺乳類の腸内に生息する主な細菌分類群は、陸上哺乳類のものとは異なり、ファーミキューテス門、バクテロイデーテス門、フソバクテリア門、プロテオバクテリア門、そしてより少ない程度ではあるがアクチノバクテリア門のメンバーが含まれることが、いくつかの研究で明らかにされている（Banksら、2014；Delportら、2016；Gladら、2010；Nelsonら、2013；Numbergerら、2016）。しかし、アザラシが生後1年間に受ける劇的な生理的変化（Hallら、2001；Smithら、2013）が腸内細菌叢組成に影響を与えるため、アザラシの微生物叢プロファイルはさらに複雑になっている。

ハイイロアザラシは主に北大西洋北部に生息し、その個体数の50％弱がイギリス沿岸水域に生息している（Reeves他、2002年）。メイ島はイギリス諸島で4番目に大きなハイイロアザラシ繁殖コロニーで、年間仔アザラシ生産数の約4.5％を占めている（アザラシ特別委員会報告書、2020年、http://www.smru.st-andrews.ac.uk/scos/scos-reports）。

本研究の目的は、イギリス、スコットランドのメイ島の繁殖コロニー内で、広く研究されている3つの異なる基質で生まれたハイイロアザラシの仔の糞便微生物叢プロファイルを1歳児と比較し、プロファイルへの影響を調査することである。また、微生物相プロフィールは、環境品質指標に使用するバイオマーカーとして、既知の病原性細菌属を選択して評価した。

2 材料と方法
2.1 サンプリング
2011年秋の繁殖期の6週間、スコットランドの東海岸、フォース湾に浮かぶ小さな島、メイ島で、他の進行中の研究のために身体拘束された90頭の健康なハイイロアザラシの仔魚と19頭の仔魚から直腸スワブを採取した（図1）。サンプリング直後、スワブを木炭入りアミーズ培地（Medical Wire & Equipment社製）で再加熱し、前述のようにサンプリングから12時間以内に-80℃で保存した（Baily et al.） 仔魚のサンプリングは、潮汐のある岩石のビーチ（Pilgrim's Haven [PH]、n = 30）、岩石の淀んだプール（Rona Rocks [RR]、n = 30）、泥質／草地の斜面（Tarbet Slope [TS]、n = 30）という、非常に異なる基質からなる3つの特定の場所で行った。1歳魚のサンプル（n = 19）は2つのエリアから採取した。1つは島の南西部、仔魚のいる場所とは別の場所、もう1つはRona Rocksの近く、Tarbet Slopeの南側である（図1）。

詳細は画像に続くキャプションを参照。
図1
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2.2 全核酸抽出
80℃で保存しておいた綿棒を、製造元の説明書に従ってPowerFecal DNA isolation kit（MoBio社製）を用いてDNA抽出を行う直前に氷上で静かに解凍した。簡単に説明すると、各スワブの頭部を切り取り、0.7 mm の乾燥ガラスビーズを入れた DNA フリーチューブに入れ、ビーズ溶液 750 μl、C1 溶液 60 μl、プロテイナーゼ K（20 mg/ml）10μlを加えた。サンプルを2分間ボルテックスして混合し、55℃で1時間インキュベートした。その後、MoBioボルテックスアダプターを用いてサンプルを10分間ビーズビートし、13,000gで2分間遠心した。上清を清潔な2ml採血管に移し、250μlのC2溶液を加えて短時間ボルテックスし、4℃で5分間インキュベートした後、13,000gで1分間遠心した。得られた上清（600μl）を清潔な採血管に移し、200μlのC3溶液を加え、短時間ボルテックスし、4℃で5分間インキュベートした後、13,000gで1分間遠心分離した。次に、750μlの上清を1200μlのC4溶液に加え、5秒間ボルテックスした。得られた上清（650μl）をスピンフィルターにロードし、13,000gで1分間遠心した後、フロースルーを捨てた。このステップを3回繰り返した後（総量1950 µlを濾過するため）、スピンフィルターを500 µlのC5溶液で洗浄し、13,000 gで1分間遠心した。回収チューブを交換し、13,000gでさらに2分間遠心してスピンフィルターを乾燥させた。スピンフィルターに50μlのC6溶液を加えてDNAを溶出し、室温で1分間インキュベートした後、13,000gで1分間遠心した。DNA濃度と品質はNanodrop ONE™（サーモ社製）で評価し、DNAは必要なま で-20℃で保存した。

2.3 16S rRNA遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅と次世代シークエンシング
16S rRNA遺伝子のV4領域は、Caporasoら（2012）の記述に従っ て、抽出したDNAからPCRで増幅した。簡単に説明すると、PCRマスターミックスを調製し、1×TaqバッファーにMgCl2（最終濃度1mM）を加え、4種類のdNTPをそれぞれ0.2mM、各プライマーを0. 25mMの各プライマー（同じフォワードプライマー（515F）と異なるバーコード付きリバースプライマー（806R）が使用され、リバースプライマーの配列はバーコード領域でのみ異なる）、0.05U/μlのTaq DNAポリメラーゼ、および1ng/μlの鋳型DNAを無菌条件下でPCRグレードの水を用いて総容量25μlに調製した。16S rRNA遺伝子のV4領域を以下の条件で増幅した： 94℃、3分間、続いて94℃、45秒間、50℃、60秒間、72℃、90秒間を25サイクル、続いて72℃、7分間を1サイクルとした。PCR産物はゲル電気泳動で分離し、ゲル精製し、PicoGreenアッセイ（Promega）を用いて定量し、-20℃で保存した。核酸抽出プロトコルの最適化には、多くの綿棒サンプルを使用した。しかし、最適化後は、純度が特定の閾値以上（OD 260/280 > 1.5; OD260/230 > 1.0）であり、特異的で明確なPCR産物を産生するDNAサンプルのみをMiSeqシーケンス用に選択した： PH, n = 11; RR, n = 6; TS, n = 6; 1年生, n = 9。精製したPCR産物はすべてプールしてアンプリコンライブラリーとし、各PCR産物はプール中に均等に含まれるようにしてから、Illumina MiSeq v2 2 × 250 bp paired-end sequencing（Edinburgh Genomics）に送った。綿棒のみおよびDNA抽出キットのコントロールでは、PCR産物（可視か否かにかかわらず）をアガロースゲルから予想される分子量（400 bp）で切り出し、精製し、シーケンス前に定量した。

2.4 データ解析
イルミナMiSeqシーケンスデータは、QCプロットに基づくリードトリミングを行わず、Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2（QIIME2）バージョン2019.4（Bolyen et al. DADA2プラグイン（Callahan et al., 2016）とデフォルトパラメータを使用して、QIIME2で多重化解除リードをノイズ除去およびペアリングし、Amplicon Sequence Variants（ASV）のテーブルを生成した。515F/806Rプライマーセットを用いたin silico PCRによってSILVA 132データベースから抽出された99%のASV配列で訓練されたナイーブベイズ分類器を用いて分類法を割り当てた（Bokulich et al.） Primer-Eバージョン6.1.12（Primer-E; Clark & Warwick, 2001）の相対存在量表でBray-Curtis非類似度を計算し、non-metric multidimensional scaling（NMDS）による順序化を用いてβ多様性パターンを視覚的に調べた。非類似度行列のPERMANOVAおよびPERMDISP検定（999並べ替え）は、Primer-EのPERMANOVA +アドオン（Anderson et al.） 中心対数比（CLR）および有意に豊富な分類群のWスコアは、QIIME2において、正規化されていない特徴表に対して、微生物叢の組成分析（ANCOM）テストプラグイン（Mandal et al.、2015）を用いて計算した。

3 結果
以前の研究（Baily, 2014）の一環として、採取した109個の直腸ぬぐい液のうち32個（1歳仔9個、仔仔23個）からDNAの抽出に成功し、5月島の3つの異なる場所から採取した仔仔の直腸ぬぐい液も含まれた： PH（n=11）、RR（n=6）、TS（n=6）。低品質なリードをフィルタリングした結果、対照を除いて459万リードが解析され、サンプルあたり平均139,118リード（範囲48,586-372,404）であった。DADA2によるノイズ除去およびキメラフィルターを行った結果、329万リードが残った（サンプルあたり38,355-254,966リード）。ネガティブコントロールの検査により、スワブサンプルにコンタミASVが存在しないことが判明した。コントロール除去後、残りのサンプルには1476 ASVに指定された3.21 M配列が含まれ、スワブを用いた他の研究（Budding et al.）

観察された種の希薄化曲線は、すべてのサンプルで多様性を十分にカバーしていた（データは示さず）。年齢間のアルファ多様性を比較すると、仔魚サンプルのシャノン多様性（最大希少化深度38,350配列における平均±平均標準誤差［SEM］）は、1歳児サンプルのそれ（4.66±0.39）よりも低かったが、その差は統計的有意差には達しなかった（クラスカル・ワリス検定、H = 3.48, p = 0.062）。

仔ウシと1歳ウシのサンプルでは、14の異なる細菌属がデータセット全体で1％以上の存在率で同定された（図2）。1歳魚と仔魚のサンプルはいずれも個体間のばらつきが大きかった。にもかかわらず、3つの異なる環境から採取された仔ウシのサンプルからは、微生物相にばらつきが見られた。多くのサンプルの構成は、フソバクテリウム属（最大67％）、エシェリヒア属（Escherichia）および／またはシゲラ属（Escherichia/Shigellaと略記）（最大49％）、バクテロイデス属（Bacteroides）（最大41％）で占められていた。Tarbet Slopeで仔ウシから採取した直腸スワブには、Megasphaera（図2：サンプル4および6）とPsychrobacter（図2：サンプル1および2）の両方が確認され、明確な微生物相が認められた。PHサンプル9（PH-9）は、他のPHサンプルとは明らかに異なっており、Escherichia/Shigellaはほとんど存在しなかったが、Alistipesは1歳児のサンプル1やRRサンプル5および6（図2）と同様によく存在していた。

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図2
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エシェリヒア属／シゲラ属は、サンプル1（2.8％）を除き、1歳児群では1％以上の濃度で同定されなかった。しかし、オセアニバーガ属は仔ウシよりも1歳ウシに多く含まれていた（平均5.3％1歳ウシ、平均0.2％仔ウシ）。カンピロバクター属は仔魚と1歳魚の全グループに見られた（図2）。

ANCOM分析を用いて、仔ウシと1歳ウシを比較し、2つの年齢群におけるバイオマーカーの違いを同定した。仔マウスから得られた2つのASVの分類学的割り当てを図3と表1に示します。これらのASVのうち1つはEscherichia/Shigella属に分類され、1歳仔と比較して仔魚の直腸内細菌叢で有意に高いという図2の前解析結果を裏付けている。しかし、このANCOM分析では、Clostridium sensu stricto 2と割り当てられた存在量の低いASV（1％未満）も仔魚で有意に高いことが同定された。図3および表1にも示すように、13のASVが1歳児で有意に上昇し、CLRの差は高い陽性であった。3種のRuminococcaceae UCG-005および2種のFournierella ASVが、1歳児の糞便微生物叢で有意に同定された（表1）。Fusobacterium属の同定（単一の配列として、表1）は、図2の同様の所見を支持する。

詳細は画像に続くキャプションに記載
図3
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表1. 仔ウシと1歳ウシの糞便微生物叢の存在量の違い（アンプリコン配列の変異体レベルで）。
分類学 平均％（仔） 平均％（年） CLR ANCOM Wスコア
エシェリヒア・シゲラ 13.0 0.353 -6.42 1451
コリデキストリバクター・マッシリエンシス 0.015 0.946 5.31 1403
ルミノコッカス科 NK4A214グループ 0.008 0.851 4.94 1383
フルニエレラ 0.0006 0.164 4.18 1378
[真正細菌] フィシカテナ群 0.003 0.306 4.41 1377
ルミノコッカス科 UCG-005 0.013 0.258 4.51 1377
ルミノコッカス科 UCG-005 0.0009 0.237 4.17 1375
パラシュテレラ 0.003 0.440 4.28 1360
フェカリバクテリウム 0.014 0.695 4.52 1352
フソバクテリウム 0.586 4.50 5.34 1351
[クロストリジウム）イノキュウム群 0.016 0.624 4.26 1339
オシロスピラ 0.081 1.20 4.52 1338
ルミノコッカス科 UCG-005 0.001 0.792 4.29 1337
フルニエレラ 0.029 0.162 3.81 1325
Clostridium sensu stricto 2 0.958 0.033 -4.68 1324
注：Escherichia/Shigellaは16S配列が類似しているため、このレベルでは識別されなかった。有意なASVの平均存在率は、ハイイロアザラシの仔（n = 23）と1歳児（n = 9）のサンプルについて算出した。
略語： ANCOM W：マイクロバイオーム組成分析W統計量；ASVs：アンプリコン配列変異体；CLR：中心対数比。
仔ウシと1歳ウシに存在する微生物叢の全体的な組成には有意差があり（NMDS解析、PERMANOVA擬似F = 5.152; p < 0.001;図4a）、データセットの全変動の14.7%を占めた。性別という交絡因子は変動の1.99%を占めたが、有意ではなかった（p = 0.901）。個々の仔ウシサンプル間の変動は、個々の1歳ウシサンプル間の変動に比べて有意に大きかった（PERMDISP F = 13.846; p = 0.004；図4a）。図4aのPH-9で代表されるサンプルの微生物叢が、PHグループ内の他のサンプルと比較して明らかに異なっていることは、図2で見られた結果を裏付けている。

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図4
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3つの異なる場所（PH、RR、TS）から採取した仔ウシから採取した糞便スワブ中の微生物叢組成の差は、すべての出生地陸上生息地にわたって非常に有意であった（Pseudo-F = 2.063、p < 0.001、全変動の17.1%）（図4b）。一対検定では、3つの異なる生育地間の有意差が示された： PH対TS（t = 1.446、p = 0.019）、PH対RR（t = 1.370、p = 0.042）、TS対RR（t = 1.499、p = 0.020）である。性別の交絡因子は有意な影響を及ぼさず（p = 0.991）、全変動のわずか2.06％を占めただけであった。

4 結論
本研究は英国スコットランドのメイ島で生まれたハイイロアザラシの直腸マイクロバイオームを初めて調査したもので、この個体群は長年にわたって広範囲にわたって研究され、記録されている（Smout et al. 2つ目の発見は、（仔ウシがサンプリングされた場所では土壌微生物叢が分析されなかったため、確定的なものではないが）離乳前の仔ウシの直腸微生物叢が、仔ウシが生まれた陸上生息地の基質の影響を強く受けていることを示唆するもので、この結果、微生物叢の組成も3地点間で有意に異なっていた。

直腸ぬぐい液から全DNAを抽出することが当初は困難であったため、プロセスの改良と検証を何度も試みたが、微生物叢を評価するのに十分な質と量のDNAが得られたのは109サンプル中32サンプルだけであった。にもかかわらず、全DNAが抽出された綿棒の分布には十分なばらつきがあったため、年齢群間（仔ウシと1歳ウシ）、また出生地が異なる3つの陸上生息地で生まれた仔ウシ間で統計分析を行うことができた。最適化プロセスでは、PowerFecal® DNA分離キットを用いた抽出の初期段階で、スワブのビーズビートに2種類のビーズ（0.7mmドライビーズと0.1mmシリカビーズ）を使用した。C2溶液を加える前のボルテックスプロセスも、抽出を最適化するために変更した（キットの0.7mmビーズを使用する場合は最高速度で10分間、0.1mmシリカビーズ抽出の場合はFast-Prep®マシン（Thermo社製）で6m/sで30秒間）。抽出効率は、Nanodrop定量と260:280および260:230比によって分析した。さらに、プロテイナーゼK処理の添加を評価し、抽出効率を改善することを決定した。これらの最適化実験から、セクション2に記載したように、最終的な方法が使用された。今後の研究では、ここで説明した全DNA抽出の有効な手法を用いることで、サンプルからのデータを最大化し、またこのハイイロアザラシの集団と直接比較することができる。また今後の研究では、サンプルの保存方法をさらに改善し、培地中で凍結保存するのではなく、DNA保存用緩衝液（微生物のさらなる増殖を防ぐため）中で保存することも検討すべきである。

仔ウシと1歳ウシのサンプルでは、1%以上の存在率で14の異なる細菌属が同定されたが、仔ウシの微生物叢は1歳ウシの微生物叢よりも多様性が低かった。この多様性の差は、仔魚の生息地が陸上に限定されているのに対し、1歳魚は様々な餌にさらされ、それぞれに細菌微生物叢が存在し、海洋環境全体の微生物叢が存在することを考えれば、驚くべきことではない。このことは、1歳魚の微生物叢と仔魚の微生物叢を比較すると、1歳魚の方が海への露出度が高いため、塩分環境を好む細菌属であるオセアニベルガ（Oceaniverga）の量が多いことに示されている。我々の研究でこの微生物多様性の差が統計的有意差に達しなかったのは、配列データが得られた1歳児のサンプル数が少なかったためかもしれない。これを決定的にするためには、より大規模なサンプルセットの解析が必要である。

フソバクテリウム（Fusobacterium）属は、5月島で採取された仔ウシと1歳ウシの両方の微生物相を支配していた。これはアザラシとアシカの直腸糞便微生物叢を調査した先行研究と一致しており、フソバクテリウム属は、ファーミキューテス属、プロテオバクテス属、バクテロイデーテス属、そしてアシカの研究ではアクチノバクテリウム属と並んで、最も流行している門のひとつであった（Banksら、2014；Bikら、2016；Delportら、2016；Gladら、2010；Nelsonら、2013；Numbergerら、2016）。また、1歳児と仔犬の両グループは、ヒトにアザラシ指を引き起こす人獣共通感染症病原体として知られるBisgaardia属（Sundeep & Cleeve, 2011）、ヒトの大腸内腔で同定されたカンピロバクター属、およびある程度はAlistipes属の微生物叢を共有していた（Parker et al.）

カンピロバクター属の存在は、これらの同じサンプルを用いた我々の以前の研究（Baily et al.、2015年）でも同様の所見を確認した。しかし、前回の研究では生きたアザラシの仔の51%からカンピロバクター属が培養されたが、1歳のアザラシからは1匹も培養されなかった。この明らかな食い違いは、おそらく使用した方法が大きく異なるためであろう。本研究ではPCR法を用いてすべてのカンピロバクター属を検出したのに対し、前回の研究ではヒトに病原性を示すことが知られている特定のカンピロバクター種を高度に選択した培地を用いた微生物学的培養を行った。我々の以前の研究で同定された分離株は、Campylobacter jejuni、C. coli、C. lariであり（Baily et al., 2015）、すべてヒトの疾病に主に関連しており、C. jejuniはヒトにおける胃腸炎の最も一般的な原因のひとつである（Acheson & Allos, 2001）。著者らは、分離されたカンピロバクターの種と株は、ヒトの下水に由来する汚染の指標である可能性が高いと結論づけた（Baily et al.） 常在細菌と病原性細菌との相互作用は、微生物叢全体の構成に影響を及ぼす可能性があるが（Nelson et al.、2015）、予備的な解析では、この属が検出されなかったサンプルと比較した場合、PCR法でカンピロバクターを保有していると同定された仔と微生物叢の変化との間に有意な相関関係は検出されなかった（データは示さず）。しかし、今後の研究ではこの潜在的な関連性を検討し、検出されたカンピロバクター属を正確に特定することも含めるべきである。

アザラシの仔の微生物叢は、1歳児と比較してEscherichia/Shigella属とClostridium属（sensu stricto）が有意に高かった。エシェリヒア属／シゲラ属は一般的な常在菌であると同時に、ヒトの病原体としてもよく知られており、細菌性下痢の主な原因のひとつである（Khalil et al. この属は、典型的には、若い哺乳類やまだ成熟していない哺乳類の微生物叢に多く存在し、健康で安定した微生物叢を持つ成熟した哺乳類にはあまり存在しない（Castaño-Rodríguezら、2018、Tianら、2020）。

クロストリジウム科クロストリジウム属（sensu stricto）は、ヒト乳幼児の糞便微生物叢の主要な構成要素であり、バイオマーカーとしての可能性が提唱されている乳児期の食物アレルギー（Ling et al.、2014）や幼児期のアトピー性皮膚炎（Penders et al.、2013）と強く関連している。このような疾患はアザラシでは認められていないが、クロストリジウム属は1歳児よりも仔アザラシで有意に豊富であったことから、ヒトでは健康に関して成熟したマイクロバイオームへの移行が重要であることが裏付けられた。

1歳児のアザラシのマイクロバイオームでは、プレボテラ科のアロプレボテラ属が高かった。プレボテラ（Prevotella）属は、この科のもう1つの属であり、離乳して独立して餌を食べるようになったアザラシのミルクから餌への移行のマーカーとして知られている（Stoffel et al. Oceaniverga、Fournierella、Ruminococcaceae UCG-005 ASVはすべて1歳児に多く、これはおそらく前述のように、外洋や潮間帯で広く採餌する1歳児に比べ、仔アザラシの食餌は乳汁に限られるため、食餌資源を反映していると考えられる。このことは、食餌、腸内細菌叢組成、および運用分類単位の間に有意な関係があることを見出した先行研究（Pacheco-Sandovalら、2019年）や、魚類、哺乳類の家畜種、および採食する他の動物の腸内細菌叢は、人工飼料や濃厚飼料を与えられたものよりも微生物の多様性が高いことを示した先行研究（Dhanasiriら、2011年、Ellisonら、2014年、Kohl & Dearing、2014年、Nelsonら、2013年、Sandersら、2015年）によって裏付けられている。さらに、Delportら（2016）は、放し飼いのオーストラリアアシカ（Neophoca cinerea）では、飼育下と比較してClostridiaceaeとRuminococcaceaeがより豊富であり、これらの門がグループ間の平均的な非類似度に最も寄与していることを明らかにした。食餌を比較すると、ほとんど新鮮な魚か冷凍魚しか与えられていない飼育下動物に比べ、野生動物は、小型甲殻類、イセエビ、イカ、タコ、イカなどの頭足類など、キチン質を含む多くの種を含む幅広い種類の餌を消費していることがわかった（Gales & Cheal, 1992）。

我々の研究では、微生物叢組成に対する性別の有意な影響は認められなかったが、これは、自由生活個体群における性別に基づく影響はほとんど無視できるか、まったくないとした先行研究と一致している（Bobbie et al.） しかし、性による交絡効果はより微妙なレベルで存在し、腸内微生物群集に対する食事や環境などの外的要因の影響の可能性によって覆い隠されている可能性がある。離乳後のキタゾウアザラシ（Mirounga angustirostris）において、Stoffelら（2020）は性別が腸内細菌叢の組成を強くかつ早期に決定する因子であることを発見したが、多様性ではなかったため、我々の研究とは対照的である。キタゾウアザラシで見られたような性差が見られなかった理由は不明である。両種とも、オスは出生時と離乳時にわずかに大きくなるが（Fedak & Anderson, 1982; Kretzmann et al. しかし、コロニー環境や生息地の違い、また種によって異なる雌雄間の早期探索行動変異が要因である可能性もある。したがって、今回の予備調査では、アザラシのマイクロバイオームの多様性は年齢に依存する（1歳児に比べて仔アザラシでは多様性が低い）ことが示唆された。厳密には統計的に有意ではないが、微生物叢が発達している若い動物ほど多様性が低いというこのパターンは、動物が生後1年を超えて成熟するにつれて研究される他のさまざまな哺乳類種で見られるパターンと一致している（Hopkinsら、2002年、Koenigら、2011年、Mariatら、2009年、Stoffelら、2020年、Yatsunenkoら、2012年）。

この研究から、ハイイロアザラシの仔の直腸内マイクロバイオームは、新生児期に曝露される陸上基質に影響される可能性があることも明らかになった。確定的なものではないが、3つの異なる場所（PH、RR、TS）で採集された仔アザラシの糞便スワブ中の微生物叢の組成におけるこれらの違いは非常に有意であった。潮の満ち引きのある岩石のビーチ（PH）、潮の満ち引きのない淀んだ岩のプール（RR）、泥や草の生えた斜面（TS）と、選ばれた3つの場所の基質がそれぞれ著しく異なっていることから、アザラシの仔はそれぞれ異なる環境微生物にさらされ、それを直接、あるいは哺乳中にそれぞれのダムの乳頭の汚染から摂取したと考えられる。今回の調査では、すべての地点がボートの係留場所や人の居住地から離れており、意味のある人の出入りがなかったため、3地点間の人為的な圧力の影響は結果に影響しないと思われる。

生後1年間の死亡率が高いことを考えると（Hall et al., 2001）、これらの有意に異なるマイクロバイオームが長期生存に顕著な影響を及ぼすかどうかについては、さらなる詳細な調査が必要である。しかしながら、生存に影響を与える交絡因子は内在的・外在的要因を含め複数存在するため（Grosser et al.

カンピロバクター属、エシェリヒア属／シゲラ属、クロストリジウム属の存在は、フォース湾やそ の他の場所で、水生哺乳類の健康状態や海洋環境を測定する品質指標に含まれる可能性がある。しかし、1歳児や成体のアザラシには、宿主適応種と思われるカンピロバクターが存在する（Foster et al., 2020; Gilbert et al. したがって、自由生活している野生動物のマイクロバイオームに存在するカンピロバクター属やおそらくサルモネラ属も、人為起源や汚染を示唆するものであるならば、種や場合によっては株レベルまで同定する必要がある。

海洋哺乳類は、海洋の撹乱や病原体に対してヒトと同様に迅速に反応することから、海洋のセンチネル種と考えられている（Bossart, 2011）。Apprillら（2014）をはじめ、マイクロバイオームの群集組成と動物の健康との関連を調べた研究はいくつかあるが、特定の相関関係を完全に理解するには、より詳細な研究がまだ必要である。

今後の研究では、このパイロット研究で発見された潜在的なバイオマーカーを評価し、特に子アザラシにおいて、年齢、生理学的発達、環境への適応、特に気候変動との相関関係を理解する必要がある。微生物叢と免疫系が未熟であるため（Fukuda et al., 2011; Maynard et al., 2012; Round & Mazmanian, 2009）、1歳児と比較した場合、若い仔アザラシでは潜在的な病原体と常在細菌叢の競合が少ないと考えられる。

この研究を踏まえると、統計的検出力を高めたより大規模な実験によって、アザラシのコロニーや海洋の健康の指標となる特定の属が特定され、検証されることが期待される。しかし、調査する鰭脚類の種と特定の個体群は、種に関連した生活史と採餌パターンを考慮し、評価対象の海洋環境を代表するように慎重に選択する必要がある。

著者の貢献
クレイグ・ワトキンス 概念化（同等）、データキュレーション（リード）、正式な分析支援、資金獲得支援、調査（同等）、方法論（同等）、プロジェクト管理（同等）、リソース支援、ソフトウェア支援、監督（リード）、検証支援、可視化支援、執筆（原案）（リード）、執筆-レビュー＆編集（リード）。テイラー・ゲインズ 概念化支援、データキュレーション（同等）、形式分析（同等）、資金獲得支援、方法論支援、リソース支援、ソフトウェア支援、執筆-レビュー＆編集支援。フィオナ・ストラスディー データキュレーション支援、方法論支援、スーパービジョン支援、執筆・レビュー・編集支援。ヨハンナ・ベイリー 概念化支援、データキュレーション支援、形式分析支援、調査支援、方法論支援、リソース支援、執筆・レビュー・編集支援。エレノア・ワトソン データキュレーション支援、調査支援、リソース支援、検証支援、執筆・レビュー・編集支援。アイルサ・ホール 調査サポート、リソースサポート、ライティング・レビュー＆編集サポート。アンドリュー・フリー 概念化支援、データキュレーション支援、形式分析（リード）、資金獲得（リード）、調査（同等）、方法論（同等）、プロジェクト管理（同等）、資源（同等）、ソフトウェア（リード）、監督（同等）、検証（同等）、可視化（同等）、執筆（原案作成支援）、執筆-レビュー・編集（同等）。マーク・ダグリッシュ 概念化支援、データキュレーション支援、調査支援、方法論支援、リソース提供（同等）、執筆支援（初稿）、執筆-校閲-編集（同等）。

謝辞
フィールドでのサンプリング（Simon Moss、Matt Bivins、Kelly Robinson、Paula Redman、Chris McKnight、Amanda Stansbury）、地図作成と統計的助言（Bernie McConnell、Mike Lonergan）を支援してくれたセント・アンドリュース大学のSea Mammal Research Unitに感謝したい。生きた放し飼い動物のサンプリングはすべて、英国内務省のプロジェクト（No.60/4009）および1986年動物（科学的手続き）法に基づき海棲哺乳類研究ユニットに発行された個人ライセンスに基づいて実施された。イルミナDNAシーケンシングは、NERC（R8/H10/56）、MRC（MR/K001744/1）、BBSRC（BB/J004243/1）からのコアグラントを通じて一部支援を受けているエディンバラ大学のEdinburgh Genomicsが実施した。C.A.W.、E.W.、M.P.D.はスコットランド政府Rural & Environment Science & Analytical Services (RESAS)から資金援助を受けた。本研究およびJ. L. B.の博士課程学生資格は、Moredun Research InstituteおよびRoyal Zoological Society of Scotlandから資金提供を受けた。

利益相反
申告なし。

倫理声明
生きた動物のサンプリングはすべてセントアンドリュース大学動物福祉倫理委員会の許可を得て、1986年英国動物（科学的手続き）法に基づき、海棲哺乳類研究ユニット（SMRU）に発行された英国内務省プロジェクト（No.60/4009）および関連する個人ライセンスに基づいて実施された。

公開研究
参考文献
文献の引用
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