腸内細菌叢組成のヒト血漿代謝物シグネチャのオンラインアトラス

哉百名

Nat Commun. 2022; 13: 5370. オンライン公開 2022 Sep 23. doi: 10.1038/s41467-022-33050-0
PMCID: PMC9508139PMID: 36151114
腸内細菌叢組成のヒト血漿代謝物シグネチャのオンラインアトラス
Koen F. Dekkers,#1 Sergi Sayols-Baixeras,#1,2 Gabriel Baldanzi,1 Christoph Nowak,3 Ulf Hammar,1 Diem Nguyen,1 Georgios Varotsis,1 Louise Brunkwall,4 Nynne Nielsen,5 Aron C. Eklund,5 Jacob Bak Holm,5 H. Bjørn Nielsen, 4. Bjørn Nielsen，5 Filip Ottosson，4 Yi-Ting Lin，1 Shafqat Ahmad，1 Lars Lind，6 Johan Sundström，7，8 Gunnar Engström，4 J. Gustav Smith，9，10，11 Johan Ernlöv，3，12 Marju Orho-Melander，#4 and Tove Fallcorresponding author #1（敬称略，以下同
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概要
ヒトの腸内細菌叢は様々な分子を産生するが、その一部は血流に入り健康に影響を与える。逆に、食事や薬理学的化合物は、血流に入る前に微生物叢に影響を与える可能性がある。これらの相互作用を明らかにすることは、腸内細菌叢の健康への影響を理解する上で重要なステップである。この横断的研究では、人口ベースのスウェーデンCArdioPulmonary bioImage Studyから50～64歳で招待された8583人の腸内細菌叢と血漿メタボロームの詳細な特徴づけのために、ディープメタゲノムシーケンスと質量分析にリンクした超高速液体クロマトグラフをそれぞれ使用しました。ここでは、腸内細菌叢が個人の血漿代謝物の分散の最大58％を説明することを見出し、アルファ多様性と血漿代謝物の間の997の関連、特定の腸内メタゲノム種と血漿代謝物の間の546，819の関連をオンラインアトラス（https://gutsyatlas.serve.scilifelab.se/）で提示します。食事要因や内服薬と腸内細菌との新しい関連、尿毒症毒素p-クレゾール硫酸と強く関連する微生物種を提示することで、このリソースの可能性を例証している。このリソースは、特定の代謝産物の摂動を対象とした研究や、腸内細菌叢組成の血漿バイオマーカー候補の同定のための基礎として利用することができる。

課題用語 メタボロミクス、微生物遺伝学
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はじめに
消化管に存在する細菌、古細菌、ウイルス、原生動物、真菌を総称して腸内細菌叢と呼ぶ。腸内細菌叢は、食事、病歴、抗生物質、その他の薬剤など、個人が生涯にわたってさらされるすべてのもの1、および年齢や宿主の遺伝子変異などの内因性因子によって形作られる2。一方、観察研究では、心血管疾患、肥満、2型糖尿病などの慢性疾患発症における腸内細菌叢の役割が示唆されているが、これらの効果に関する因果関係の証拠やメカニズムの理解はほとんど得られていない3-5。血漿中の小分子組成の変化、すなわち血漿メタボローム3は、腸内細菌叢が多くの分子を産生および修飾し、その一部が血流に取り込まれることから、ヒトの健康に対する腸内細菌叢効果のメディエーターとなり得ることが示唆されている。したがって、腸内細菌叢と宿主の血漿代謝産物との相互作用を特徴付けることにより、腸内細菌叢がヒトの健康に及ぼす影響について重要な知見を得ることができる可能性がある。

腸内細菌叢と循環メタボロームとの関連を報告した先行研究6-13は、サンプルサイズが小さい（例：<1000サンプル）、健康関連形質に関するデータが少ない、または腸内細菌叢組成（例：16S rRNA配列決定）および代謝系データ（例：NMRプロファイリング）の分解能に限界があることが妨げとなっています。これらの研究により、腸内細菌叢の組成が血漿メタボロームの少なくとも一部と関連していることが示されていますが、大きな疑問が残されています。特に、統計的検出力が限られているため、中程度の効果量や希少種と代謝物の関連性を評価することができませんでした。さらに、腸内細菌叢と血漿メタボロームの相互作用をより深く理解するための有用なツールとして、これらの関連性の公開リソースが切実に求められています。

ここでは、最新の高解像度ディープメタゲノムシーケンスと質量分析ベースの代謝物プロファイリングを適用し、十分に特徴的な集団ベースの研究であるSCAPISの8583人のサンプルを分析しました。その結果、腸内細菌叢と宿主血漿メタボロームとの強固な関連性を示す検索可能なGUTSYアトラス（https://gutsyatlas.serve.scilifelab.se/）を作成し、機能的な代謝モジュールを含むことを明らかにしました。

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研究成果
SCAPIS研究の腸内細菌種と血漿中代謝物プロファイリング
SCAPIS14は、スウェーデンの6つの自治体地域に住む30,154人の男女を対象とした前向き人口ベース観察研究である。2014年から2018年にかけて、人口登録に基づく50歳から64歳の個人を無作為に抽出し、ベースライン調査に参加するよう呼びかけました。マルメとウプサラの2つの調査地で得られたデータとサンプルに注目し、自宅で糞便サンプルを採取し、そこからDNAを抽出、全ゲノムショットガン配列決定、分類学的および機能的プロファイリングに成功した9818サンプルを対象としました。さらに、試験会場を訪れた際に採取した8957の空腹時静脈血漿サンプルは、質量分析にリンクした超高速液体クロマトグラフィーを用いてプロファイリングに成功した。全体として、質の高いメタゲノムおよびメタボロミクスデータ、ならびに主要なモデル共変量に関する完全な情報を有する8583人のデータが、すべての解析に使用された。分類学的プロファイリングの結果、超王国レベルで、細菌1520種、古細菌4種、真核生物2種、未分類のメタゲノム2種（以降、種と呼ぶ）が、微生物遺伝子プロファイルに基づいて特定され、サンプルあたり平均325種（範囲：26～663、補足データ1）であることがわかりました。代謝物プロファイリングでは、1321代謝物のデータが得られ、そのうち1052代謝物は114のサブクラスからアノテーションされ、サンプルあたりの平均測定代謝物は1153でした（範囲：982～1254、Supplementary Data 2）。これら8583人の主な社会人口統計学的および臨床的特徴を表1に示す。今回の調査対象者の特徴は、SCAPIS-UppsalaおよびSCAPIS-Malmöの全調査対象者の特徴と類似していた。しかし、メタボロミクス用の研究サンプルは完全なデータを持つ参加者を充実させていたため、SCAPIS-Malmöの完全な研究サンプルと比較して、Malmöのサブサンプルではライフスタイル情報が欠けている参加者が少なかった（補足データ3）。

表1
本研究の対象となったMalmöおよびUppsalaのSCAPIS研究施設の主な社会人口学的および臨床的特徴

Malmö(n = 3811) Uppsala(n = 4772)
年齢 57.4 (4.3) 57.7 (4.4)
性別：女性 2009 (52.7%) 2451 (51.4%)
出生地
北欧 2976 (78.1%) 4295 (90.0%)
北欧以外 ヨーロッパ 543 (14.2%) 184 (3.9%)
アジア 202 (5.3%) 193 (4.0%)
その他 90 (2.4%) 100 (2.1%)
肥満度、kg/m2 27.2 (4.5) 27.0 (4.4)
収縮期血圧、mmHg 122 (16.4) 125 (15.9)
推算糸球体濾過量 84.5 (12.1) 87.0 (11.5)
喫煙状況
現在640人(16.8%) 431人(9.0%)
以前は吸っていた 1460 (38.3%) 1461 (30.6%)
一度もない 1678 (44.0%) 2638 (55.3%)
欠落 33 (0.9%) 242 (5.1%)
食物繊維の摂取量、g/kcala 0.012 (0.004) 0.012 (0.004)
コーヒー摂取量
<1回/日未満 518 (13.6%) 580 (12.2%)
1-2回/日 1291 (33.9%) 1384 (29.0%)
3-4 回/日 1431 (37.5%) 2116 (44.3%)

4回以上/日 548 (14.4%) 672 (14.1%)
欠落 23 (0.6%) 20 (0.4%)
過去12ヶ月間の抗生物質の服用 786 (20.6%) 896 (18.8%)
高血圧の薬b 775 (20.3%) 883 (18.5%)
コレステロールの薬b 319 (8.4%) 352 (7.4%)
糖尿病治療薬b 170 (4.5%) 161 (3.4%)
メトホルミン処方箋（過去12ヶ月間） 163 (4.3%) 143 (3.0%)
オメプラゾールの処方箋（過去12ヶ月間） 452 (11.9%) 396 (8.3%)
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連続変数は平均値（標準偏差）、カテゴリー変数はn（%）で示した。

a食物繊維の摂取量、総エネルギー摂取量で調整。

b過去2週間の自己申告による投薬。

微生物多様性のメタボリックシグネチャー
まず、微生物のα多様性と個々の血漿代謝物との関連性を調べた。アルファ多様性は、代謝的健康のマーカーと逆相関することが以前に報告された全体的な微生物叢の豊かさと均一性の尺度であるシャノン多様性指数を用いて推定した15。年齢、性別、出生地、研究施設、微生物DNA抽出プレート、メタボロミクス配信バッチで調整したモデルでは、1321種類の血漿代謝物のうち、α多様性は565種類と正の関連、432種類と負の関連を示した（図1および補足データ4）。絶対Spearman's ρが0.15以上の関連は109件、絶対Spearman's ρが0.30以上の関連は17件であった。有意性は、Benjamini-Hochberg法16を用い、偽発見率5%で多重検定を調整したp値（q値として報告）に基づき算出した。注釈付き代謝物に関しては、代謝物の5α-アンドロスタン-3β,17α-ジオールジスルフェートで最も強い正の相関が観察された（ρ = 0.44、p値 < 10-3）。 44, p-value < 10-300）、ヒトの糞便に含まれる主要なフェノール代謝物の一つである3-フェニルプロピオネート（ヒドロシンナメート）17（ρ = 0.39, p-value = 4.0 × 10-298）、シンナモイルグリシン（ρ = 0.39, p-value = 5.6 × 10-298）に対して、最も強い正の相関が観察されました。この3つはすべて、α多様性と強く正の相関があり18、後者の2つは2型糖尿病のリスク低下と関連することが以前報告されている19。これらの結果は、腸内細菌の多様性が様々な血漿代謝物と強固に関連していることを示しており、特定の腸内細菌叢種に関するその後の詳細な調査の動機付けとなった。

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オブジェクト名は41467_2022_33050_Fig1_HTML.jpg。
Fig.1
年齢、性別、出生地、試験場所、微生物DNA抽出プレート、メタボロミクス配信バッチを調整した種α多様性と血漿中代謝物1321種の部分スピアマンの順位相関図。
スウェーデンCArdioPulmonary bioImage Studyの50歳から65歳の8583人を対象に、糞便サンプルのディープメタゲノムシークエンスに基づくShannon diversity indexと、質量分析にリンクした超高速液体クロマトグラフィーで測定した1321種類の血漿代謝物の関連性を検討した結果。Benjamini-Hochberg's methodを用い、偽発見率5％で多重検定を調整したところ、565件の有意な正の相関と432件の有意な負の相関が見られた。緑色は陽性関連、青色は陰性関連、灰色は非特異的代謝物を示す。ラベルは、最も正と負の相関がある2つの特徴的な代謝物を示しています。破線は多重検定の閾値を表す。p 値は 10-300 を上限とした。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。

腸内細菌叢と血漿メタボロームとの関連は、微生物種および代謝物のグループ間で大きなばらつきを示す
一連のネストされた交差検証リッジ回帰モデルを用いて、腸内細菌叢の変動によって説明される各血漿中代謝産物の分散を評価しました。その結果、1321代謝物のうち1179代謝物の分散は、腸内細菌叢の変動によって部分的に説明されることが分かった（図2aおよび補足データ5）。その結果、X-11850という未同定の共通代謝物が、最も大きな分散を説明することが分かりました（58%）。すべての未同定および同定代謝物の主要な特徴である質量電荷比 (m/z)、保持時間指数 (RI)、測定プラットフォームについては、補足データ 2 に報告されています。ただし、MS/MSスペクトルデータは外部ラボと共有していない（Data Availability Statement参照）。腸内細菌種によって説明される分散は、尿毒症毒素 p-クレゾール硫酸 (r2 = 46%) やコーヒー代謝物キナート (r2 = 45%) など、554 の代謝物で 15% 以上、61 の代謝物で 30% 以上となりました。また、食事と微生物叢の相互作用の最終産物であり、心血管疾患や腎疾患の発症に関与することが示唆されているトリメチルアミンN-オキシド、TMAOについては、腸内細菌叢で説明できる分散はかなり低いことが分かった（r2 = 12%）。これらの観察から、腸内細菌叢の組成と血漿中の代謝物との関連性には大きな不均一性があることが浮き彫りになった。

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図2
腸内細菌叢と血漿メタボロームとの関連は、生物種や代謝物のグループによって大きなばらつきがあることがわかる。
a Swedish CArdioPulmonary bioImage Studyの50歳から65歳の8583人から得た1321代謝物のうち1179代謝物の変動は、腸内細菌叢の変動によって部分的に説明される。各代謝物について、ネストされた10回クロスバリデーションを用いたリッジ回帰によりモデルをフィッティングした。説明される分散は、クロスバリデーションのr2統計値として計算された。代謝物は代謝経路ごとにグループ化され、縦線は各グループで説明された分散の中央値を表しています。b 年齢、性別、出生地、試験場所、微生物 DNA 抽出プレート、メタボロミクス配信バッチを調整した腸内細菌 1528 種と血漿代謝物 1321 種の部分スピアマンの順位相関を示す。Benjamini-Hochberg's methodを用い、偽発見率5%で多重検定を行った後、298,982の有意な陽性関連と247,837の有意な陰性関連に対するSpearmanのρを描いたものである。関連は分類学的な門でグループ化された。 1321の血漿代謝物について、関連する種の数に対して説明される分散。代謝産物は代謝クラスでグループ分けされている。黒字は局所的に推定された散布図平滑化線。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

腸内細菌叢と血漿メタボロームとの関連は、ライフスタイルや健康要因の範囲にわたって多数あり、かつ頑健であった
次に、年齢、性別、出生地、研究サイト、微生物DNA抽出プレート、メタボロミクス配信バッチを調整し、一連の部分スピアマンの順位相関を用いて1528種の微生物と1321種の代謝物との関連を評価しました。その結果、テストしたすべての生物種と代謝物のペアのうち546,819（27%）で有意な関連（q値<0.05）が確認され、そのうち298,982が正の方向、247,837が負の方向でした（図2bおよび補足データ6）。Spearmanのρが0.15以上の相関は10,965件、0.30以上の相関は439件であった。補足資料6では、アルファ多様性の指標としてシャノン多様性指数を追加調整した感度解析の結果も報告している。この分析では、モデル誤記定やバイアスのリスクが高まる代わりに、微生物種データの組成性による偽陽性の影響を受けにくくなる可能性がある、つまり、アルファ多様性がメディエーターやコライダーとして機能する可能性があるということである。さらに、アルファ多様性を調整すると、微生物種とアルファ多様性の共線性により、検出力が低下する可能性がある。すべての種と代謝物に少なくとも 1 つの関連性が観察されましたが、多くの種 (n = 623) が代謝物の広い範囲 (>30%) と関連しました。逆に、504種類の代謝物が幅広い（30％以上）生物種と関連していた。生物種と代謝物の関連は、肥満度（BMI）、収縮期血圧、推定糸球体濾過量21（eGFR、腎機能の指標）、食物繊維摂取量の3段階で層別しても、喫煙者やサンプリング後1年以内に抗生物質を処方された人、高血圧、脂質異常、糖尿病の薬を飲んだ人を除外しても概ね影響を受けなかった（非層別モデルと層別モデルのスピアマンρのピアソン相関r > 0.91、補足図1）。 91、補足図1）、これらの要因による大きな交絡の懸念は軽減される結果となった。しかし、コーヒー摂取量が少ない人（1日1回未満、r = 0.87）、多い人（1日4回以上、r = 0.87）、喫煙者（r = 0.84）、コレステロール（r = 0.81）または糖尿病薬（r = 0.64）では結果の相関は低くなっていました。これは、グループ（n:331-1220）が小さいため推定値の精度が低くなったか、いくつかの関連性においてこれらの要因によって効果が修飾されたためであると考えられる。一般に、腸内細菌叢によって説明される分散が大きい代謝物は、個々の生物種との関連も大きい（図2c）。これらの結果から、腸内細菌叢とメタボロームには多くの関連性があり、一般にライフスタイルや健康要因の範囲にわたって頑健であることが示されました。

特定の微生物種が複数の代謝産物に関連し、多くの場合、同じ代謝産物クラス内に存在する
同じ微生物種が同じ代謝物サブクラス内の代謝物と強い正の相関と負の相関を示す例がいくつか観察され、これらの種が特定のプロセスに影響を及ぼす可能性が示されました（図2b）。その一例として、以前から胆道感染症に関連する細菌種であるHaemophilus parainfluenzaeが、一次胆汁酸塩のコレートと強い正の相関を示し、二次胆汁酸のデオキシコール酸12-硫酸と負の相関を示していることが観察されている22。このパターンがより一般的かどうかを調べるために、単一の代謝物を代謝物サブクラスにグループ化し、各サブクラスが少なくとも5つの代謝物を含む場合に、α多様性と個々の種が同じサブクラスのいくつかの代謝物と関連しているかどうかを評価した。その結果、α多様性では2つの特定の代謝物サブクラス（正：ビタミンA代謝、負：二次胆汁酸代謝、q値＜0.05、補足データ7）、1402種の微生物では59のユニークな代謝物サブクラスが濃縮されていることを裏付ける証拠が見つかった（総濃縮量3505、q値＜0.05、補足データ8）。10の最も強い濃縮の中で、我々は、種とメタボロームの関連において、二次胆汁酸の9つの濃縮を観察した（正。Eubacteriales sp. MGS:0662, Enterocloster asparagiformis, Oscillospiraceae sp. MGS:0104, Anaerotignum faecicola；negative: 陰性：Intestinibacter bartlettii, Intestinibacter sp. MGS:0194, Turicibacter sanguinis, Clostridium disporicum および Peptostreptococcaceae sp. MGS:0200）。そこで、このアトラスを活用して、一次胆汁酸から二次胆汁酸が生成される際の主な第一段階の一つである7α-デヒドロキシル化によるコール酸からのデオキシコール酸生成速度に影響を与える生物種を特定することを目指した。これまでの研究で、胆汁酸7α-デヒドロキシル化活性は、Eubacteriales目のLachnospiraceae科のclostridial rRNA cluster XIVaの限られた細菌群に検出されている23。7α-デヒドロキシル化活性を持つ新種の可能性を特定するために、前駆体であるコール酸の血漿中濃度が低く、生成物であるデオキシコール酸の濃度が高いことと相関する腸内細菌を評価した。一次胆汁酸のコール酸（アトラスではcholateと表記）と二次胆汁酸のデオキシコール酸（deoxycholate）はともに微生物叢によって高い分散が説明され（それぞれr2 = 30%と36%）、微生物叢組成の変動が強い影響を与えることが示された。また、コール酸との負の相関が強い20種とデオキシコール酸との正の相関が強い20種のうち、7種は共通していた。デオキシコール酸／コール酸比をアウトカムとするモデルを用いて、これらの知見を確認した（すべてのp値は＜10-47）。これらの種はすべてEubacteriales目に属し、Anaerotruncus colihominis, Intestinibacillus sp. Marseille-P4005, Oscillibacter sp. PEA192, Flavonifractor plautii, Mediterraneibacter glycyrrhizinilyticusなどの胆汁酸代謝に関わる新規知見が含まれており、Lachnospiraceae属からは以前胆汁酸代謝と関連していた2種が含まれている。Enterocloster citroniaeとBlautia obeumである。この結果は、特定の近縁種が同じ代謝物クラス内の複数の代謝物と関連していることを示しており、これは特に二次胆汁酸とその前駆体について顕著であった。

複数の生物種が共有する機能は、単一の代謝物の存在量と関連している
異なる微生物種は、同じ代謝機能を実行するための遺伝的要素を共有している可能性がある。我々は、複数の種が共有するそのような遺伝的要素が、単一代謝産物量に影響を与えると仮定した。そこで、微生物の代謝機能と単一代謝産物に関連する生物種を関連付けるため、微生物遺伝子を103の腸内代謝モジュール（GMM）にマッピングしました。その結果、血漿中の1295種類の代謝物に対して、90種類のユニークな微生物機能が濃縮されていることがわかりました（総濃縮数18,339、q値 < 0.05, Supplementary Data 9）。最も強い濃縮を示した微生物機能の中には、スレオニン（例：ゲンティセートによる）、セリン（例：1-(1-1)による）など、アミノ酸や単糖の分解を触媒する酵素をコードする機能が含まれていた。 1-(1-enyl-palmitoyl)-2-arachidonoyl-GPE (P-16:0/20:4)), sucrose (chenodeoxycholate), ribose (tyramine O-sulfate), および fructose (pantothenate) などのアミノ酸や単糖の分解を触媒する酵素が最も顕著であった。全体として、これらの知見は、血漿中の代謝物量と関連する種において、複数の種に共通する特定の機能が存在することを裏付けている。

以上の解析から、腸内細菌叢と宿主の血漿中代謝産物との間に特異的な関連性が存在することが明らかになった。以下では、血漿メタボロームと腸内細菌叢の関連性についてGUTSYアトラスを使用してマイニングできる情報の事例として、特定の微生物と代謝産物の関連性に関する詳細なデータを紹介する。ヒトの健康に関与する細菌由来代謝物の例として尿毒症毒素p-クレゾール硫酸、微生物叢に大きな影響を与えると考えられている一般的な薬であるオメプラゾールやメトホルミン、微生物叢に大きな影響を与えると報告されている一般食成分の例としてコーヒー代謝物との微生物叢との関連に注目した。これらの代謝物に関するすべての結果の要約は、Supplementary Data 10に掲載されています。

Faecalibacterium prausnitziiとIntestinimonas massiliensisは尿毒症毒素p-クレゾールとフェニルアセチルグルタミンに強く関連しているが、その方向は正反対である。
本研究では、p-クレゾール硫酸の血漿中濃度変動の46％が腸内細菌叢の変動で説明されることが確認され、これは全代謝物の中で最も高い説明割合の1つであった。細菌代謝物であるp-クレゾールは尿毒症性毒素に分類され、大腸での細菌によるチロシン発酵の際に生成され、腎不全患者では蓄積し、そのレベルは予後の悪化と関連している24,25。慢性腎臓病モデル無菌マウスにおいて、末期腎不全患者からの新鮮な微生物叢を移植すると、健常人ドナーからの微生物叢を移植したマウスの血清試料と比較して、p-クレゾール硫酸などの尿毒症毒素の血清レベルが増加することがわかった26。これは、腎臓病患者の異常な腸内細菌叢が尿毒症毒素レベルを調節することによって病気を悪化させることを意味すると解釈され、尿毒症毒素産生微生物叢の特徴をよりよく把握することの重要性が強調された。我々のデータでは、eGFRが低いほど、10種の確立された尿毒症毒素および提案された尿毒症毒素のレベルが高いことが示された（Spearmanのp値 < 10-12, Supplementary Data 11）。p-クレゾール硫酸と関連代謝物p-クレゾールグルクロニド、およびグルタミン由来のフェニルアセチルグルタミン27は、Eubacteriales目のいくつかの種と非常に強い関連を示した（p値= <10-200）。Intestinimonas massiliensisとの新規の正の相関を含む）、hippurate、Indoxyl sulfate、TMAO、3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropanoic acidといった他の確立された尿毒症毒素や提案された尿毒症毒素と比較して、はるかに強い相関を示した（補足Fig.2）。2). この関連性は、かつてClostridialesと呼ばれていたEubacteriales目のメンバーが、チロシン発酵の最終生成物としてp-クレゾール硫酸を生成する最も多量のフェノール化合物生成細菌サブグループの1つであることを支持するものであった28。また、Faecalibacterium prausnitziiの数株がp-クレゾール量とフェニルアセチルグルタミンに強く逆相関していることも重要な発見であった。興味深いことに、F. prausnitziiは健常対照者と比較して腎臓病患者の微生物叢で減少している種の一つであり26、そのレベルの低下は腎臓病のより深刻なステージと関連することが分かっている29。さらにeGFRで層別化したモデルを実行したところ、腎機能の低い個体でやや強い関連が見られた（補足図2）。要約すると、我々はp-クレゾールおよびフェニルアセチルグルタミンレベルと強く正または負の相関を示す多くの種を同定し、尿毒症を軽減するための腸内細菌叢の摂動に関する今後の研究の基礎となる。

オメプラゾール使用者における口腔内細菌の増加および糖質代謝関連機能の強化
オメプラゾールは、酸関連上部消化管疾患の治療によく用いられる選択的プロトンポンプ阻害薬（PPI）であり、処方せんによる販売だけでなく、市販もされている。オメプラゾールの血漿中濃度と処方箋を比較したところ、オメプラゾールの血漿中濃度が検出された329名（4%）のうち、67%が過去12ヶ月間にオメプラゾールを処方されており、非検出者8254名では8%が処方されていました（フィッシャーの正確検定 p値 = 4.0×10-147）．本研究では、血漿中のオメプラゾールの存在と、正常な口腔内細菌叢の一部であるVeillonella属（V. parvula, V. dispar, V. atypicaなど）およびStreptococcus属（S. anginosus, S. oralis subsp oralis, S gordonii, S. salivarius, S. parasanguinisおよび S. mutansなど）に属する細菌に強い正の関連があることが確認された。これは、PPIの使用がVeillonellaや数種のStreptococcusなど、口腔内細菌叢に共通するいくつかの分類群の存在量の増加と関連することを報告した最近の研究13,30による以前の知見を拡大するものである。興味深いことに、V. parvulaは、他の糖質発酵菌の代謝産物を共凝集・変換することで、S. mutansと相互依存的な関係にあることが報告されている31。オメプラゾール関連菌の潜在的機能に関しては、フルクトース、リボース、乳酸、トレハロースの分解に関連する機能モジュールが、オメプラゾールと正の相関を持つ細菌種に強く濃縮されており（すべてp値＜10-6）、やはり糖質発酵が示唆されていることが明らかになった。我々はオメプラゾールのみを調査し、他のタイプのPPIは調査しなかったが、先行研究では、異なるタイプのPPIが腸内細菌叢に同様の影響を及ぼすことが証明されている13,30。以上のことから、本研究は、PPIの使用が腸内細菌叢の一貫した変化と関連しており、口腔内細菌叢に共通する細菌が増加し、糖質代謝に関連する細菌機能が濃縮されることを特徴とするという考えを強く支持するものであった。

メトホルミン投与による腸内細菌叢の大幅な変化とアミノ酸代謝を可能にする遺伝子を持つ細菌の高濃度化
メトホルミンは広く使用されている抗糖尿病薬であり、腸内細菌叢の組成の大きな変化と、膨満感や不快感などの消化器系の副作用との関連が指摘されている32,33。メトホルミンの処方箋と血漿中濃度（メトホルミンは体内で代謝されない）を比較したところ、血漿中濃度が検出された371名（4%）のうち、78%が過去12ヶ月間にメトホルミンの処方箋を調剤されていたのに対し、非検出者8212名では、わずか0.2%が処方されていました（フィッシャーの正確検定p値=<10-300）。血漿中メトホルミンと関連する菌種は462種で、そのうちEscherichia marmotaeとE. coliの増加、Romboutsia timonensis, Intestinibacter sp. MGS:0194, Intestinibacter bartlettiiの減少が強い関連性であった。これらの上位の知見は、メトホルミン使用者の腸内細菌叢において大腸菌が有意に濃縮され、R. timonensisおよびI. bartlettiiの存在量が減少することを報告した以前の研究13、32、33、および最近のランダム化試験で、メトホルミン治療6カ月および12カ月後に大腸菌存在量の増加およびI. bartlettiiの存在量低下を示す34と同様であった。さらに、その研究では両時点でRuminococcus torquesの増加が報告されており34、これは以前の研究13と我々の研究でも支持されている（p値=3.8×10-10）。R. timonensisは最近ヒトの腸から分離された新種であり35、Muellerらの研究34以前にはメトホルミンの使用と関連したことはない。メトホルミンと関連する種では、アミノ酸代謝に関与する細菌機能モジュール、すなわちメトホルミン投与中に増加することが以前から報告されているイソロイシンおよびアラニンの分解に強い正の濃縮を見いだした36,37。さらに、フルクトースやトレハロースの分解など、糖代謝に関わる機能モジュールも発見され、介入研究からのデータと一致した33。以上のことから、メトホルミン投与は腸内細菌叢の組成の大きな変化と関連しており、メトホルミン使用者ではアミノ酸および炭水化物代謝を可能にする遺伝子を持つ細菌がより多く存在するというこれまでの知見を確認・拡大することができた。

コーヒーの代謝産物は真正細菌（Eubacteriales）の種と強い正の相関を示す
コーヒーは世界で最も広く飲まれている飲料の1つであり、ヒトの健康との関係は複雑で十分には解明されていない38。PREDICT1 (n = 1098) 研究では、食事と微生物叢の関連性が多数明らかにされ、その中で最も強い複合的な関連性がコーヒー摂取について発見された12。我々は、GUTSYアトラスのデータを用いて、12の確立されたコーヒーメタボロームバイオマーカーを調査することにより、微生物叢の特性とコーヒーとの間の関連性をさらに調査しようとした39, 40. 我々のデータでは、これら12のコーヒー代謝物のレベルが高いほど、すべて自己申告のコーヒー摂取量が高いことと用量依存的に関連していた（スピアマンのp値＜10-24、補足データ12）。これらの12種類のバイオマーカーのそれぞれについて、異なる組み合わせの21の個別種が最も強く関連する8種を代表していることが観察された（補足図3に描かれているように）。これらの21種は、S. salivariusを除き、すべてRuminococcaceae, Oscillospiraceae, Lachnospiraceae, ClostridiaceaeのEubacteriales目からであった。3種は種レベルでアノテーションされた。C. phoceensis、Anaeromassilibacillus sp. Marseille-P3371、S. salivariusの3種は、12種類のコーヒーバイオマーカーすべてと正の方向で関連していた。C. phoeensisは、マルセイユの健康な28歳男性の腸内細菌叢で初めて同定され41、これまでいかなる表現型とも関連性がなかった。Anaeromassilibacillus sp. Marseille-P3371は、慢性腎臓病患者の食事試験において、低タンパク食の影響を受けることが判明しています。常在菌であるStreptococcus salivariusは、口腔や腸の粘膜表面に初期にコロニー形成する細菌の一つである。この種は、口腔および上気道においてポジティブな作用を持つことが提唱されている。S. pyogenes42などの他の病原体やS. mutans43などの虫歯に関与する病原性Streptococcus種のコロニー形成を抑制する可能性があり、また抗炎症特性を持つことも知られている。ある種の腸内細菌の数が、なぜコーヒーの摂取と正の相関があるのかは、今のところわかっていない。喫煙行動によるものではないようだが（補足図3）、これらの菌の代謝が関係しているのかもしれない。注目すべきは、コーヒーには抗酸化物質が豊富に含まれており44、腸の運動に影響を与えることから、サンプリングや細菌群にも影響を与える可能性がある45。以上より、これまでに報告されているコーヒーバイオマーカーと腸内細菌叢における存在量との新規な関連性を、Eubacteriales目の細菌群およびS. salivariusと報告した。

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考察
腸内細菌叢と宿主血漿代謝物に関するこれまでで最大かつ最も詳細な関連研究を実施し、その結果をオンラインのGUTSYアトラスとして発表した。このアトラスは、特定の微生物種の摂動を対象とした研究の出発点として、また腸内細菌叢組成の血漿バイオマーカー候補を特定するために利用することが可能である。この解析により、個々の微生物種と代謝物の関連性が546,819件明らかになり、この分野における先行研究6-12を確認し、大幅に拡張することができました。このリソースはノンターゲットであるため、記載されている、あるいは記載されていないヒト腸内細菌群集と血漿メタボロームの大部分を網羅し、様々な関心を持つ研究者がデータから利益を得ることができます。

腸内細菌種と血漿中代謝物の関連には大きなばらつきがあり、p-クレゾールや二次胆汁酸のように複数の細菌種と強い関連を持つ代謝物もあれば、ヌクレオチドのように関連性がほとんどない代謝物もあることが分かっています。特に、二次胆汁酸やその前駆体は、腸内細菌によって生産され、脂肪や油の消化に関与しています46。

また、特定のバイオマーカー、代謝物、薬物に関しても、多くの新しい知見が得られた。例えば、コーヒーのバイオマーカーは、Eubacteriales目に属する一連の細菌と、Streptococcus属のより病原性の高い菌株の競合とみなされるS. salivariusと関連していることがわかった。これらの結果は、世界的に最も消費されている飲料の一つであるコーヒーの摂取が腸内細菌叢の構成に影響を与えるというこれまでの知見を支持するものであり、健康との関連についてさらなる調査が必要である。

我々は、p-クレゾールの濃度と強く関連するいくつかの種を発見した。P-クレゾールは重要な尿毒症性毒素とみなされており、大腸での細菌性チロシン発酵の過程で生成され、腎不全の患者では蓄積される。これは、腎臓にさらなる障害をもたらし、透析によってわずかに除去することができるのみである24, 25。我々は、p-クレゾールとの関連性が変化するF. prausnitziiのいくつかのサブ株を同定しており、特定の株が他の株よりも大きな影響を及ぼす可能性があることを示している。GUTSYアトラスで得られた結果は、今後、慢性腎不全における腸内細菌叢の擾乱に関する研究を計画し、腎臓病の進行を抑える目的で尿毒症を軽減するための基礎として利用することができるだろう。

本研究は、PPIの使用が腸内細菌叢の一貫した変化と関連し、糖質代謝に関連する細菌機能に富む口腔内細菌叢に共通する細菌の増加によって特徴づけられるという考えを強く支持するものである。腸内細菌叢の中に口腔内細菌種を見出すことは珍しいことではありません。最近の研究では、口腔内と腸内細菌叢の間で約40％の共通種（有病率10％以上）が共有されているが、これら2つの部位間で相対的な存在比は大きく異なっていることが示されている47。PPIの使用は人口に膾炙しており、観察研究では、小腸細菌の過繁殖など、多くの形質と関連していることが判明しています。PPIに関連した腸内細菌叢の変化が健康に与える影響については、さらなる調査が必要である。

今回の結果は、過去最大規模の高解像度腸内細菌叢-血漿メタボローム研究であるTwinsUK adult twin registry（n = 859）8で報告された結果の多くを確認するものです。例えば、TwinsUKで種レベルでアノテーションされた上位10件の関連性については、我々の研究でも9件が利用でき、そのうち7件は再現性がありました。すなわち、F. prausnitziiとp-クレゾール硫酸、p-クレゾールグルクロニド、フェニルアセチルグルタミンおよびデオキシコレート、Methanobrevibacter smithiiとトレオン酸、Roseburia inulinivoransとp-クレゾール硫酸、大腸菌とフェニルアセチルグルタミン間の関連性が挙げられます。興味深いことに、Barnesiella intestinihominisの血漿中のセバシン酸（デカンジオ酸）濃度と強い相関があるという彼らの最初の発見は、我々のデータではその種と代謝物の両方が存在していたにもかかわらず、再現されなかった。さらに、本研究では、腸内細菌叢は、未特性分子X-11850の分散の58％を説明し、コーヒー代謝物キナート（r2 = 0.45）および尿毒症毒素p-クレゾール硫酸（r2 = 0.46）など他の代謝物の分散の30％超を説明している。これは、Barらによる最近の研究10と一致している。Barらは、同様の方法を用いてこれらの関連性を分析したが、イスラエルの2つの小規模コホート（n = 491、TwinsUKの1004人とIMI-DIRECTの245人で再現）10で分析したものである。例えば、Barらの研究では、X-11850は2番目に高い説明変数（r2 = 0.49）を示し、キネート（r2 = 0.45）とp-クレゾール硫酸（r2 = 0.41）も高い説明変数上位10位に入っていた。先行研究との重複が大きいことから、本研究で得られた知見は、異なる母集団や分析プラットフォームにおいても一般的に頑健であることが示された。今回の研究で統計的検出力が向上したことから、TwinsUK研究の254の関連から、GUTSYアトラスの546,819の関連に知見を拡大し、中程度の効果量の関連やより稀な種に関する関連も含めることができるようになった。また、メトホルミン治療が腸内細菌叢の組成の大きな変化と関連し、メトホルミン使用者では糖質代謝を可能にする遺伝子を持つ細菌がより多く存在するという以前の知見を確認・拡大し、介入研究からのデータとも一致する33。

長所と限界
本研究の主な強みは、サンプルサイズ、高解像度データ、使いやすいコンパニオンウェブサイトである。他の研究の知見を再現し、作成されたデータの質を確認した一方で、内服薬と腸内細菌叢の間に多くの新しい関連性を見出し、尿毒症毒素p-クレゾール硫酸のレベルと強く関連する細菌叢の種も確認した。本研究で解析したコホートは、16S配列解析とNMRによる血漿メタボロームプロファイリングを組み合わせた過去最大の研究（n = 2309）7の3倍以上、高解像度メタゲノミクスと質量分析による血漿メタボロームプロファイリングを組み合わせた過去最大の研究（n = 859）8の10倍であり、これにより、中規模および希少代謝物や種との関連も評価することができました。もう一つの強みは、SCAPIS研究の深い表現型であり、潜在的な交絡因子と効果修飾因子の詳細な感度分析を可能にしたことである14。また、腎機能の低下と尿毒症毒素濃度の上昇、処方された薬剤と血漿中濃度、自己申告のコーヒー摂取量と血漿中コーヒー代謝物濃度との間に強い一致がみられた。その結果、今回発表された関連アトラスは、十分に特性化された大規模サンプルとマイクロバイオータおよびメタボロミクスのための最先端の分析手法に基づいており、これにより、関心のある様々な細菌の潜在的代謝効果をin silicoで十分に検討し、腸内細菌叢組成の血漿バイオマーカー候補を特定することが可能になる。

しかし、本研究にはいくつかの限界があることを認識しておく必要がある。まず、この研究集団は、主にヨーロッパ系の50～65歳のスカンジナビア生まれの参加者から構成されています。このコホートの上位所見は、英国（平均年齢：65歳）およびイスラエル（年齢：18-70歳）のサンプルと同様であったが、他の集団および年齢層に対する他の種-代謝物の関連についての一般化は、さらなる調査が必要である。第二に、横断的研究デザインの観察的性質により、残留交絡が潜在的な問題となり、因果関係の推論が困難となる。それでも、コーヒー代謝物キナートのような食品由来の代謝物や、オメプラゾールやメトホルミンのような薬物については、食品や食品の摂取量と腸内細菌叢との因果関係が最も高いが、それでも食品や薬の種類と共変化する因子によって混同される可能性がある。逆に、二次胆汁酸のような腸内細菌叢が産生する代謝物については、腸内細菌叢から血漿メタボロームへの因果関係が想定されます。ただし、因果関係がある場合は、今後、実験やメンデルランダム法48,49などの因果関係推論手法で検証する必要がある。第三に、先行研究と同様に、関連はランクベースのノンパラメトリックモデルを用いて解析されたため、実際の効果量の解釈を妨げている。第四に、微生物種データの構成性のため、我々のメインモデルでは偽陽性の数が膨らんでいる可能性がある。そのため、バイアスのリスクと検出力の低下を代償に、この問題の影響を受けにくいα多様性を追加調整した感度解析の結果も報告する。この問題を完全に解決するには、微生物種の実際のレベルを正確に定量化できるメタゲノムシーケンス法が必要であろう。第五に、本研究ではアノテーションされた代謝物や生物種の数が多いものの、同定された関連性の多くは、現在参照ゲノムがない未知の代謝物や生物種の間であり、文脈におけるいくつかの新規知見の解釈を困難にしています。今後、代謝物や生物種の追加に伴い、このウェブサイトも更新していく予定です。

要約すると、我々は腸内細菌叢と血漿メタボロームとの間に非常に多くの強固な関連性を見出し、それらをGUTSYアトラスという、関連性をインタラクティブに調査できる包括的なオンラインリソースとしてコミュニティに提供しました。これらの知見は、腸内細菌叢とヒトの代謝の膨大な相互作用に関する知識を追加し、ヒトの生物学に対する洞察や腸内細菌叢組成の新規バイオマーカーの可能性を特定することにつながるでしょう。GUTSYアトラスは、科学者コミュニティにとって、自らサンプルを収集・分析する必要性を軽減し、多大な利益をもたらすものと期待されます。

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研究方法
研究サンプル
SCAPISは、スウェーデンの6つの自治体に住む50-65歳の男女30,154人を対象とした前向き人口ベース研究である。心血管疾患、慢性閉塞性肺疾患、および関連する代謝異常のリスク予測と理解を深めることを主目的として設計された14。2012年のパイロット試験の後、2014年に募集が開始され、2018年に募集が完了した。個人は人口登録からランダムに募集され、参加率は50％であった。

本研究は、Uppsala（n = 5036）およびMalmö研究施設（n = 6251）の11,287人の参加者のサブセットに基づいている。両施設の参加者は3日間の訪問方式をとり、訪問1回目に身体測定、食事アンケート、採血を行い、訪問2回目に血圧測定を行った。糞便サンプリングと健康およびライフスタイルに関するアンケートは、訪問1と2の間に自宅で行われた。糞便サンプルは採取後、来院2日まで-20℃で保存された。訪問1と訪問2の間の平均日数は、ウプサラで15日、マルメで11日であった。

これらの11,287人のうち、9831人がメタゲノム解析のために糞便サンプルの処理を行った。しかし、12サンプルは、DNA収量が低く、再抽出を1回ずつ試みてもライブラリ調製の妨げとなる特徴があったため、除外された。さらに、シグネチャー遺伝子に1473リードしかマッピングされなかった1サンプルは、配列決定後に削除された。したがって、9818人が高品質の糞便メタゲノミクスデータを有していると判断された（Uppsala、n = 4838; Malmö、n = 4980）。

メタボロームプロファイリング用に処理された8962件のSCAPIS血漿サンプルのうち、処理中に2サンプルが失われ、主成分分析に基づいてデータが外れ値と判定された2サンプルが除外され、グルコース、コレステロール、クレアチニンの値が基準実験値と比較して明らかに不一致だった1サンプルは除外されました。したがって、8957人（ウプサラ、n = 4979、マルメ、n = 3978）が高品質の血漿メタボロミクスデータを持っていると判断された。メタゲノミクスとメタボロミクスのデータを統合し、8616人（ウプサラ：n=4787、マルメ：n=3829）の重複データセットが得られました。さらに、メインモデルで共変量のデータが欠損している33人（Uppsala、n = 15; Malmö、n = 18）を除外し、8583人（Uppsala、n = 4772; Malmö、n = 3811）の最終研究サンプルを得ました。

すべての研究参加者は、最初の施設訪問時に、署名入りのインフォームド・コンセントを提供した。本研究はヘルシンキ宣言を遵守し、スウェーデン倫理審査局（Etikprövningsmyndigheten Dnr 2010-228-31M, Dnr 2018-315）の承認を得ている。参加者は、参加に対する報酬を受け取っていない。

腸内マイクロバイオームサンプルの採取と前処理
参加者は、自宅でのサンプル採取方法の説明を含む、あらかじめパッケージ化された糞便サンプル採取キット（バーコード付きチューブ、手袋、ジップロックバッグ、紙製採取ボウル）を受け取った。参加者は、試験会場を訪れるまで、自宅の冷凍庫でサンプルを-20℃に保存するよう求められた。研究室でサンプルを受け取ると、中央バイオバンクに輸送して-80℃で保管するまでの0-7日間、-20℃で保管した。最後に、サンプルはメタゲノム解析のため、ドライアイスで Clinical Microbiomics A/S (Copenhagen, Denmark) に輸送された。サンプルはランダムな順序で分析され、158サンプルが繰り返し分析された。

糞便DNAは、NucleoSpin® 96 Soil kit (740787; Macherey-Nagel; Germany)を用いて抽出した。ネガティブコントロールとポジティブコントロールを含む。サンプルは2200rpmで5分間ビーズビートを行い、1サンプルあたり平均1.2μgのDNAを得た。メタゲノムの配列決定は、Illumina Novaseq 6000 system (Illumina, USA)の2×150 bpペアエンドシーケンスを用いて行った。平均して、マルメサンプルでは1サンプルあたり2630万リードペア（7.9 Gb）、ウプサラサンプルでは1サンプルあたり2530万リードペア（7.6 Gbp）が生成された。アダプターを含むリード、10%以上のあいまい塩基を含むリード、50%以上の塩基でPhred quality score <5のリード、ヒト参照ゲノムGRCh38にマッピングされたリードは、Bowtie 2 v02.3.250を用いて、デフォルト設定で削除しました。残りのリード（中央値：24.8×106、最小値：8.2×106リードペア/サンプル）はMEGAHIT v1.1.151を用いてアセンブルし、BWA mem v0.7.16a52を用いて、本研究およびマルメ子孫研究からのデータ53、Pasolliらによるデータ54、ヒト腸内細菌に関連する分離微生物株の一般公開ゲノム3488個55〜57という主要ソースから新たに作成した1400万の非冗長微生物遺伝子カタログに対応させました。メタゲノム生物種は、遺伝子カタログから、以前に確立された品質基準58を満たす共分散遺伝子群として定義された。各生物種において、高度に相関し、かつ異なる100のシグネチャー遺伝子が同定され、アバンダンスプロファイリングに使用された。全体として、1985種が遺伝子カタログで同定された。ある種のシグネチャー遺伝子にマッピングされたすべてのサンプルの遺伝子カウント数が、その種のカウント数を決定した。ただし、シグネチャー遺伝子のうち<3にリードがマッピングされている種についてはカウント数を0とした。種の相対的な存在量は、各種のカウント数をそのシグネチャー遺伝子の有効長で割り、各サンプルの合計が100％になるように正規化することで計算された。種の相対的な存在量は（自然）log+1変換され、少なくとも100の非ゼロの測定値を持つ種がさらなる分析に含まれた。品質管理後、1528種が含まれ、サンプルあたりの平均は325種であった。Shannon diversityは、vegan59 v2.5-7 Rパッケージを使って、リードの深さによる交絡を避けるためにダウンサイジングしたデータで計算された。各サンプルのリードは、シグネチャー遺伝子に対応する遺伝子数テーブルから置換なしのランダムサンプリングにより210,430リードにダウンサイジングされた。シグネチャー遺伝子に1473リードしかマッピングされていないサンプルは破棄された。分類学的アノテーションのため、カタログ遺伝子をNCBI RefSeq60データベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/、2021年5月2日ダウンロード）の遺伝子と比較した。種レベルの分類学は、単一の種に対して95%以上の配列類似度を持つ遺伝子が75%以上あるメタゲノム種に割り当てた。属、科、目、クラス、門のアノテーションには、異なる閾値を用いた（遺伝子の≧60、50、40、30、25％；配列類似度がそれぞれ≧85、75、65、55、50％のもの）。

機能アノテーションのために、カタログ遺伝子をEggNOG-mapper62 v2.0.1を使ってgut metabolic modules v1.0761 (https://github.com/raeslab/GMMs, GMM) データベースにアノテーションした。特定のGMMモジュールの機能に必要な酵素/タンパク質遺伝子の2/3以上を含む種について、潜在的な機能プロファイルを決定した。モジュール内に代替反応経路が存在する場合は、そのような反応経路は1つだけ必要とされた。ステップ数が 4 つ以下のモジュールについては、すべての反応経路が必要であった。

血漿メタボロームサンプルの採取と前処理
被験者の静脈血サンプルは、一晩絶食した後、試験会場を訪れた際に採取されました。このサンプルは、血漿メタボローム解析のためにMetabolon Inc. サンプルは、純水、代謝物抽出に使用した溶媒、Metabolon Inc.が管理するヒト血漿サンプルプール、試験参加者のサンプルプールという異なる品質管理基準とともに、無作為な順序で取り扱われ、分析された。タンパク質は、Glen Mills社のGenoGrinder 2000を用いた激しい振とうによるメタノール沈殿と遠心分離によって除去しました。代謝物を最大限に同定するために、ネガティブイオンモードのエレクトロスプレーイオン化（ESI）を用いた逆相（RP）/超高速液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法（UPLC-MS/MS）、親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）/UPLC-MS/MS、ポジティブイオンモードESIでの2つの別々のRP/UPLC-MS/MS分離の4プロセスを並行して使用した。ピークの同定と定量、および品質管理は、Metabolon社のハードウェアとソフトウェアを使用して実施しました。各代謝物について、各装置プレート（144サンプル）ごとに、ピーク測定面積をそのバッチのサンプルのピーク面積の中央値で割りました。検出閾値に達しなかった代謝物の測定値は、その代謝物の最小の観測値からインプットされました。代謝物のアノテーションは、RI、m/z、クロマトグラフィーデータに基づいて、3300以上の精製標準物質と未知化合物からなるMetabolonのライブラリと照合して行いました。アノテーションの過程で、各代謝物に2種類の代謝経路を割り当てました。（1）広い代謝経路の用語を含む「代謝物クラス」、（2）狭い代謝経路の用語を含む「代謝物サブクラス」です。本研究では、検出閾値以上の測定値が100件以上ある代謝物を対象とした。薬物代謝物以外の代謝物は（自然）log+1変換を行った。Metabolonでxenobioticsクラスの薬物に分類された代謝物は、2値化（存在または不在）した。品質管理に合格した1321代謝物が解析に含まれました。そのうち、269代謝物がアノテーションされていない、238代謝物が内部標準物質で確認されていない、142代謝物がメタボロミクス配信3バッチのうち少なくとも1つで測定されていない、76代謝物が8583人中8582人分しか測定されていない、これは親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）/UPLC-MS/MS測定処理中に1サンプル紛失したためです。

表現型の処理
自己申告のコーヒー摂取量は、合計8カテゴリーから4カテゴリー（1日あたり1杯未満、1-2杯、3-4杯、4杯以上）に折りたたまれた。出生地は、自己申告の出生国をスカンジナビア、非スカンジナビア・ヨーロッパ、アジア、その他のカテゴリーに折りたたんで決定した。メトホルミン（ATCコード A10BA02、A10BD20、A10BD07、A10BD05、A10BD03）、オメプラゾール（ATCコード A02BC01）、全身用抗菌薬（ATCコード J01）の処方箋は、SCAPISにおける1日目の訪問から12カ月前の期間を用いてSwedish Prescribed Drug Registerから取得された。推定糸球体濾過量は、CKD-EPI Studyの式21を用いて算出した。総エネルギー摂取量を調整するために、食物繊維の摂取量を総エネルギー摂取量で割った。

統計解析
R v4.1.1 (https://cran.r-project.org/)を用いて解析を行い、プロットを作成した。部分スピアマンの順位相関は、ppcor64 v1.1 R パッケージを使用して、シャノン多様性指数と各代謝物について計算された。相関推定値は、年齢、性別、出生地（北欧、非北欧ヨーロッパ、アジア、その他）、研究場所（ウプサラまたはマルメ）、微生物DNA抽出プレート、メタボロミクス配信バッチ（これは、別々にプロファイルされ、後で共同で正規化されたサンプルの3バッチ（ウプサラの2つとマルメの1つ）を表す）で調整されました。微生物抽出プレートとメタボロミクス配信バッチは、研究サイトにネストされていたため、研究サイト、微生物抽出プレート、メタボロミクス配信バッチのラベルを組み合わせて、1つのカテゴリバッチ変数に統合されました。2段階以上のカテゴリ変数（出生地とバッチ）はダミー変数に変換し、最後のカテゴリのダミー変数を削除してから解析した。関連性の p 値は Benjamini-Hochberg 法を用いて、偽発見率 5%で多重検定用に調整した。同様に、各生物種について、部分スピアマンの順位相関を各代謝物について計算し、年齢、性別、出生地、研究場所（ウプサラまたはマルメ）、微生物DNA抽出プレート、メタボロミクス配信バッチで調整し、メインモデルとして、さらに感度分析としてShannon多様性指数で調整した。さらに感度分析として、肥満度、収縮期血圧、推定糸球体濾過量、食物繊維摂取量の3等分による参加者の層別化、喫煙者、訪問1年以内に抗生物質を処方された参加者、健康・ライフスタイルアンケートに従って過去2週間に高血圧、脂質異常症、糖尿病の薬を服用した参加者を除外してメインモデルで実施されました。

リッジ回帰モデルを用いて、glmnet65 v4.1-3 Rパッケージを用いたネステッド10回クロスバリデーション法により、各代謝物の分散のうち腸内細菌叢で説明される割合を推定した。各反復において、データは10フォールドに分割された。9つのフォールドはトレーニングフォールドとして使用され、1つはホールドアウトフォールドとして使用された。9つの訓練フォルドはさらに10フォルドに分割され、クロスバリデーションされた平均二乗誤差が最も小さくなるλを見つけるためにグリッドサーチが行われた。そして、このλを持つモデルの性能をホールドアウトフォルドでテストした。この手順を 10 回行い、その都度ホールドアウトのフォールドを変えて、平均学習平均二乗誤差、平均テスト平均二乗誤差、平均テスト r2 を報告した。

マイクロバイオームによって説明される分散が最も大きいことが判明した 50 種類の未特定代謝物について、METLIN66 における m/z の差の許容誤差を 5 パーセントとして、最も一般的な 2 つのイオン付加体 (ポジティブモードでは M + H および M + Na、ネガティブモードでは M-H および M-Cl) の追加検索が行われました。この検索では、各m/z値に対して複数の異なるマッチングが存在したため、追加の決定的なアノテーションは得られなかった。

ランク付けされた関連性のp値（絶対t統計量によって分割されたタイ）の濃縮分析は、片側検定として別々に正と負のスピアマンのρのfgsea67 v1.19.2パッケージを使用して実行された。正と負の係数のエンリッチメントp値を組み合わせ、Benjamini-Hochberg法を用いて、偽発見率5%で多重検定を調整した。エンリッチメント解析は、GMMモジュールと代謝物サブクラスを用い、それぞれ1グループあたり5代謝物以上または1種以上とした。

報告書の概要
研究デザインの詳細については、本記事とリンクしているNature Research Reporting Summaryをご覧ください。

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謝辞
欧州研究評議会[ERC-2018-STG801965 (T.F.); ERC-CoG-2014-649021 (M.O-M.); ERC-STG-2015-679242 (J.G.S.)], スウェーデン研究会議 [VR 2019-01471 (T.F.); 2018-02784 (M.F.)] から資金援助を受けています。 O-M.); 2018-02837 (M.O-M.); 2021-03291 (M.O-M.); EXODIAB 2009-1039 (M.O-M.); 2019-01015 (J.Ä.); 2020-00243 (J.Ä.); 2019-01236 (G.E.); and 2021-02273 (J.G.S.)], The Swedish Heart-Lung Foundation [Hjärt-Lungfonden, 20190505 (T.)], 2020205 (J. L.)、2021 (J.)S. (M)、2023 (M)、2024 (M)］、スウェーデン心臓肺財団 (Hjärt-Lungfonden.... F.); 20200711 (M.O-M.); 20180343 (J.Ä.); 20200173 (G.E.); and 20190526 (J.G.S.)], Göran Gustafsson foundation [2016 (T.F.)], Axel and Signe Lagerman's foundation (T.F.), the A.L.F. government grant [2018-0148(M.O-M.). )］、ノボ ノルディスク財団［NNF20OC0063886（M.O-M.）］、スウェーデン糖尿病財団［DIA 2018-375（M.O-M.）］ 、スウェーデン戦略研究財団 ［LUDC-IRC 15-0067（M.O-M.）］ 、フォーマス ［2020-00989（S.A.）］ が含まれます。Swedish CArdioPulmonary bioImage Study（SCAPIS）の主な資金提供団体は、スウェーデン心肺財団です。また、Knut and Alice Wallenberg Foundation、Swedish Research Council、VINNOVA（スウェーデンのイノベーション機関）、Gothenburg大学およびSahlgrenska大学病院、Karolinska Institutetおよびストックホルム縣、Linköping大学および大学病院、Lund大学およびスコーネ大学病院、Umeå大学および大学病院、Uppsala大学および大学病院から研究費が提供されました。計算とデータの取り扱いは、スウェーデン研究評議会から助成金契約番号2018-05973を通じて一部資金援助を受けているウプサラ先端計算科学学際センター（UPPMAX）のスウェーデン国立計算基盤（SNIC）が提供するプロジェクトsens2019512のリソースによって実現されたものです。我々は、Knut and Alice Wallenberg財団の資金提供による国家データ駆動型生命科学（DDLS）プログラムの一部として提供された、ホスティング、計算およびストレージサービスのSciLifeLab Data Centreに感謝したい。

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著者による寄稿
G.E.、J.G.S.、J.A.、M.O.M. J.S.、T.F.は資金を獲得した。K.F.D., S.S-B., U.H., J.Ä., M.O-M., and T.F.は研究の設計とコンセプトの立案を行った。L.B., L.L., G.E., J.G.S., J.S., J.Ä., M.O-M., T.F. はデータを収集した。N.N.、A.C.E.、J.B.H.、および H.B.N. はメタゲノム解析とバイオインフォマティクスを、K.F.D., F.O., Y-T.L., S.A., L.B. および S.S-B は品質管理とデータ管理を、 K.F.D. はすべての関連解析を行い Web atlasを作成、 K.F.D. と G.V. は結果の視覚化を、 M.O-M と T.F. は研究の調整をしています。K.F.D.、G.B.、C.N.、D.N.、J.Ä.、M.O-M.、T.F.は原稿の第1稿を執筆した。すべての著者は、結果の解釈と原稿に対する批判的なフィードバックを行った。

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Nature Communicationsは、この論文の査読に貢献された匿名査読者の方々に感謝します。

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資金提供
ウプサラ大学よりオープンアクセスの資金提供を受けています。

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データの利用
本研究で得られた匿名化メタゲノム解析データは、European Nucleotide Archiveにアクセッション番号PRJEB51353 (https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/prjeb51353) として寄託されています。メタボローム解析はMetabolon, TX, USAで行われ、SCAPIS-Uppsalaの匿名化された125サンプルの最初の分析段階（MS1）のスペクトルデータがMetaboLightsにアクセッション番号MTBLS407で寄託されました。ただし、MS/MSスペクトルデータはMetabolonから研究者コミュニティには公開されていません。個人レベルの追加データは、プライバシー法で保護されている機微な個人情報を含むため、制限付きアクセスで利用できます。アクセスは、Swedish Ethical Review Board（https://etikprovningsmyndigheten.se/；申請手順と条件はリンク先に記載）の倫理承認とSCAPIS Data access board（https://www.scapis.org/data-access/；申請手順と条件はリンク先に記載）のデータアクセス承認を受けて取得することになります。これらのデータは研究目的にのみ使用することができ、商用利用はできません。すべての図の基礎となるデータは、Source Data ファイルで提供され、https://github.com/MolEpicUU/GUTSY_Atlas68 で入手できます。本研究の全結果とさらなる研究関連の検索可能な資料を含む論文のコンパニオンウェブサイトは、https://gutsyatlas.serve.scilifelab.se/ からアクセス可能です。

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コードの入手方法
本研究の解析に関連するコードは、https://github.com/MolEpicUU/GUTSY_Atlas で入手可能である。

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競合する利益
N.N.、A.C.E.、J.B.H.、H.B.N.はClinical Microbiomics社の従業員である。J.Ä.は、アストラゼネカおよびベーリンガーインゲルハイムの諮問委員会の委員を務め、アストラゼネカおよびノバルティスから講演料を受け取っているが、いずれも本プロジェクトとは無関係である。残りの著者は、競合する利害関係を宣言していない。

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脚注
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図および所属機関に関する管轄権の主張に関して中立的な立場を維持しています。

これらの著者は等しく貢献した。Koen F. Dekkers, Sergi Sayols-Baixeras, Marju Orho-Melander, Tove Fall.

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補足情報
オンライン版には、10.1038/s41467-022-33050-0に掲載されている補足資料が含まれています。

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    Nature Communicationsの記事は、Nature Publishing Groupの提供でここに提供されます。

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