カンピロバクター・ジェジュニ由来の細胞致死性膨張毒素が大腸がん転移を促進する
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論文オンライン公開中2024年12月02日
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カンピロバクター・ジェジュニ由来の細胞致死性膨張毒素が大腸がん転移を促進する
https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(24)00437-2?dgcid=raven_jbs_aip_email
Zhen He1,2,3,4,14 ∙ Jing Yu1,2,3,4,14 ∙ Junli Gong1,2,3,4,14∙ ... ∙Jinlin Huang10 jinlin@yzu.edu.cn ∙ Christian Jobin11,13 christian.jobin@medicine.ufl.edu ∙ Ping Lan1,2,3,15 lanping@mail.sysu.edu.cn... Show more
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Highlights
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Campylobacter jejuni is enriched in primary tumors of metastatic CRC patients
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C. c.jejuniは、細胞致死性膨張毒素（CDT）依存的にCRCの転移を促進する
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CDTは、JAK2/STAT3/MMP9シグナル伝達経路を活性化し、CRCの転移を促進する
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C.jejuniは、腸から腸管外腫瘍に移行し、転移を促進する
要約
さまざまな形態の固形がんには細胞内細菌が生息しているが、これらの微生物がもたらす生理学的影響については十分に理解されていない。我々は、転移を有する患者の原発性大腸癌（CRC）病変においてカンピロバクターが有意に濃縮されていることを示す。カンピロバクター・ジェジュニ（C. jejuni）由来の細胞致死性膨張毒素（CDT）は、肝転移モデルマウスや肺転移モデルマウスにおいて、JAK2-STAT3-MMP9シグナルを介してCRCの転移を促進することが、C. jejuniに感染したヒト大腸組織やCDT処理した患者の大腸腫瘍細胞で確認された。cdtBの遺伝的欠失（ΔcdtB）または精製CdtBタンパク質は、この遺伝毒素がC. jejuniの転移促進特性に必須であることを示している。C.jejuniにコロニー形成されたマウスでは、CDTを産生するC.jejuniの腸管外移植腫瘍へのトランスロケーションが増加し、これらの腫瘍の転移が促進される可能性がある。全体として、これらの知見は、腫瘍内細菌由来の遺伝毒素が腫瘍の転移を促進することを示しており、がん管理のための新たな診断・治療の道を開く可能性がある。
Graphical abstract
Graphical abstract undfig1
Keywords
colorectal cancer
metastasis
Campylobacter jejuni
cytolethal distending toxin
Introduction
大腸がん（CRC）患者は、通常、原発巣の診断から5年以内に遠隔転移を起こす1,2,3,4。
腸内細菌叢がCRCを含む様々な癌の発生と進行に影響を及ぼすことが判明している6,7。細菌が癌の連続性に影響を及ぼすプロセスは多因子性であり、例えば、免疫、代謝、宿主DNAの完全性を変化させる遺伝毒素、短鎖脂肪酸、インドール、胆汁酸誘導体などの細菌由来分子が含まれる6,8,9。バクテリオームと宿主の相互作用は、（1）例えば糞便中の細菌が周囲の細胞（上皮細胞や粘膜免疫細胞）の活動に影響を与えるような細胞外的な方法、および（2）細胞内微生物が細胞の生理機能を直接変化させるような細胞内的な方法で作用する可能性がある。フソバクテリウム・ヌクレアタム（F. nucleatum）、遺伝毒性を持つ大腸菌（E. coli）、腸内毒素原性を持つバクテロイデス・フラジリス（B. fragilis）などのいくつかの腫瘍促進性細菌は、がん
転移の促進に関連している。さらに、B. fragilisはB. fragilis毒素（BFT）を分泌し、β-カテニン-Notch1経路の活性化を引き起こすことにより、乳癌転移を刺激する可能性がある15。しかしながら、遺伝毒素産生菌と癌転移の関係は十分に理解されていない。
細菌由来の遺伝毒素の一種であるCytolethal distending toxin（CDT）は、カンピロバクター、エシェリヒア、ヘリコバクター、サルモネラの様々な種によって産生される18,19,20。この毒素が宿主細胞に取り込まれると、DNA損傷と細胞周期停止が引き起こされる18,19。興味深いことに、カンピロバクターはCRC病変部において正常隣接組織と比較して濃縮されており21,22,23、CDTはCRCの前臨床モデルにおいて腫瘍形成特性を示している24。
ここで我々は、腫瘍内のカンピロバクター属菌が転移性CRCに濃縮され、サブユニットCdtBを介してがん転移を促進することを証明した。この酵素サブユニットは、がん細胞において、複数のマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の発現を増加させ、ヤヌスキナーゼ2（JAK2）-転写シグナル伝達活性化因子3（STAT3）シグナル伝達を活性化させる。重要なことは、腸内でCDTを産生するカンピロバクター・ジェジュニは、腸管外の腫瘍病巣に移行し、転移の進行を促進する可能性があることである。
結果
カンピロバクター属細菌は転移性CRCにおいて濃縮されている
転移における腫瘍内細菌の影響をより深く理解するために、3年以内に遠隔転移を起こした化学療法未治療患者（TNMステージIおよびIIA）34人（転移群）と、3年間の追跡期間中に転移のない状態を維持した患者37人（非転移群）から原発性CRC組織を採取し（表S1）、16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定した。主座標分析（PCoA）により、転移群と非転移群との間で細菌組成に有意差があることが明らかになった（図1A）。その後の線形判別分析効果量（LEfSe）分析により、転移群においてカンピロバクターが有意に濃縮されていることが明らかになった（図1Bおよび1C）。重要なことは、腫瘍内にカンピロバクターが存在する患者（カンピロバクター検出、n=33）は、検出可能なレベルのカンピロバクターが存在しない患者（カンピロバクター検出なし、n=38）よりも有意に予後が不良であり、CRC転移におけるカンピロバクターの潜在的な臨床的意義が示されたことである（図1D）。さらに、検証コホートと一般に公開されているデータベース（PRJNA531761）12を用いて確認したところ、腫瘍内カンピロバクターは術前転移患者において濃縮されていることが一貫して観察された（図1E-1H；表S2）。UC San Diego Cancer Microbiomeの1,123の原発性大腸腫瘍サンプルを含むThe Cancer Genome Atlas（TCGA）の微生物データセットと527のCRC転移サンプルを含むHartwig Medical Foundationのデータセットを用いて25、CRCと転移性CRCの両方にカンピロバクターが存在することを確認した。CDTは、カンピロバクターが介在する病原体の主要な病原因子である。次に、定量的リアルタイムPCR（qPCR）を用いて、発見コホートにおける生理活性CDTサブユニットであるcdtBの存在を測定した（図1Jおよび1K）。また、C. jejuniに特異的な病原性因子であるCampylobacter invasion antigen B（ciaB）の存在も測定した26,27,28。相関分析によると、cdtBの検出の増加は、発見コホートにおけるciaBの存在と平行しており（r = 0.7879、p < 0.0001）、C. jejuniの存在とcdtBの発現との関連が示唆された（図1L）。術後転移を起こした患者の組織で行われた蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）では、非転移の対照と比較して、腫瘍内のCDT産生C. jejuniの存在量が多いことが示された（図1Mおよび1N）。これらのデータを総合すると、CDT産生C. jejuniは転移性CRC患者の原発腫瘍に有意に濃縮されていることが示唆された。
図1 カンピロバクターは転移を有するCRC患者において濃縮されている
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C. jejuniはCRCの転移を促進する
カンピロバクターが腫瘍転移に及ぼす機能的影響を調べるため、CRC細胞株（CT26、MC38、DLD-1、HCT116、SW620、SW480）をヒト臨床分離株C. jejuni 81-176と共培養した。その結果、C. jejuniは、対照として大腸菌DH5αまたはPBSと共培養した細胞と比較して、CRC細胞の細胞遊走能と浸潤能を有意に促進することが観察された（図S1AおよびS1B）。これらのin vitroでの観察の意義に取り組むため、皮下移植した腫瘍（CT26およびMC38）にC. jejuniを注射し、細菌のコロニー形成とともに腫瘍の成長をモニターした。その後、これらのマウスから腫瘍細胞を採取し、遊走と浸潤をアッセイした（図2A）。C.-jejuniにコロニー形成された皮下腫瘍は、腫瘍増殖に影響を与えることなく、コントロールと比較して有意に遊走能と浸潤能の増加を示した（図2Bおよび2C）（図S1C-S1G）。重要なことは、単離されたC. jejuniに暴露された腫瘍細胞を脾臓に注入したり、尾静脈から投与したりすると、それぞれマウスの肝臓と肺への転移が増加したことである（図2D-2GおよびS1H-S1K）。この観察を別のモデルに拡張するため、CRC同所性肝転移モデルを用いた。HCT116-ルシフェラーゼ細胞（1×106個/マウス）をBABL/cヌードマウスの盲腸に移植した。その後、C. jejuni（1×109コロニー形成単位[CFU]/マウス）を3日ごとにマウスに経口投与し、42日目に転移性肝腫瘍の進行を評価した（図2H）。その結果、C. jejuniは、腫瘍の成長を促進することなく糞便腫瘍に浸潤することが観察されたが（図S1L-S1N）、重要なことに、肝転移を有意に増加させた（図2IおよびS1O）。これらの結果から、腸管C. jejuniはCRCの転移を促進することが示された。
図2 C. jejuniはCRC転移を促進する
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C. jejuni promote CRC metastasis in a CDT-dependent manner
CDTはC. jejuniによる大腸腫瘍形成に重要な役割を果たしていた24。このことから、C. jejuniの転移促進作用はCDTによるものであると推測された。これを解決するために、我々はcdtB遺伝子を欠損したC. jejuni（ΔcdtB）とcdtB遺伝子を発現する相補株（cdtB Comp）を作製した。C. jejuni ΔcdtBは、野生型（WT）株と比較して、CRC細胞の浸潤と遊走において有意な減少を示し、この表現型はcdtB Compで回復した（図S2AおよびS2B）。この観察を他のC. jejuni株にも広げるため、下痢患者から2つのC. jejuni株（C. jejuni_1およびC. jejuni_2）を分離し、cdtB遺伝子欠損株とそれに適合する相補株を作製した。C. jejuni 81-176と同様に、C. jejuni_1とC. jejuni_2はともに細胞の遊走と浸潤を促進することができたが、CdtB欠損株ではこの転移促進能は減弱していた（図S2C-S2E）。
CDTのin vivoでの役割を調べるため、マウスにCRC腫瘍細胞を皮下移植し、7日後にC. jejuni（WT, ΔcdtB, またはcdtB Comp; 81-176株）を腫瘍内に注射した（図3A）。C. jejuni ΔcdtBでコロニー形成された皮下腫瘍から抽出された細胞は、C. jejuni WTでコロニー形成された腫瘍から抽出された細胞と比較して、遊走能と浸潤能が有意に低下しており、この表現型はcdtB Compでコロニー形成された腫瘍では逆転していた（図3Bおよび3C）。C. jejuni WT、ΔcdtB、cdtB Compの各群間で、腫瘍の増殖率と重量に有意差は認められなかった（図S3A-S3D）。重要なことに、C. jejuniの腫瘍内コロニー形成特性はcdtB遺伝子欠損に影響されなかった（図S3E）。さらに、C. jejuniΔcdtBをコロニー形成した皮下腫瘍から得た細胞を静脈注射すると、肺への転移能が低下した（図3D、3E、S3F、S3G）。これらの結果は、CRCの同所性肝転移モデルでも確認された（図3F、3G、S3H-S3K）。したがって、これらのデータは、C. jejuniのCRC転移促進能がCDTサブユニットcdtBに依存していることを示している。
図3 C. jejuniのCRCに対する転移促進能はcdtBに依存している
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CRC転移におけるCdtBの役割を確認するために、CDTタンパク質の3つのサブユニットを異種発現させ、精製した： これらの3つのサブユニットを組み合わせると、個々のCDTサブユニットと比較して、腫瘍細胞の転移促進能が有意に増強されることが観察され（図S4AおよびS4B）、三重結合毒素の概念と一致した18,19,29。In vitroでCdtA+Cで処理した細胞は、CdtA+B+Cで処理したCRC細胞と比較して、転移促進能が有意に低下したことから、CdtBがCDTを介した腫瘍転移の重要な構成要素であることが示された（図S4CおよびS4D）。in vitroのデータに従って、CdtA+B+Cを皮下腫瘍に注入すると（図4A）、溶媒、CdtB、CdtA+Cと比較して、腫瘍細胞の遊走能と浸潤能が有意に増加した（図4Bと4C）。注目すべきは、腫瘍増殖は異なるCDTサブユニットの存在によって影響を受けなかったことである（図S4E-S4H）。さらに、採取した腫瘍細胞をマウスに尾静脈注射したところ、CdtA+B+Cは肺転移巣の形成を有意に促進した（図4D、4E、S4I、S4J）。これらの結果は、CDTのCdtBサブユニットがCdtAおよびCdtCとの相乗効果でCRCの転移を促進する上で重要な役割を果たしていることを示している。
図4 CDTはCRC細胞の転移を刺激する
CDTはJAK2/STAT3/MMP9シグナル伝達経路を活性化する
CDTを持つC. jejuniの転移促進作用のメカニズムを知るために、遺伝子セット濃縮解析（GSEA）を用いて3つの独立したRNAシーケンス（RNA-seq）データセットを解析した： すなわち、C. jejuniで処理したCT26細胞株（in vitro、C. jejuni WT vs. PBS）、C. jejuniで処理したCT26細胞株（in vitro、C. jejuni WT vs. C. jejuni ΔcdtB）、CDTで処理したCT26細胞株（in vitro、CDT刺激細胞株、CdtA+B+C vs. コントロール）である。これら3つのRNA-seqデータセットを組み合わせることで、がん転移に関連するJAK/STATを含む、4つのシグナル伝達経路のアップレギュレーションが観察された（図5A、5B、S5A-S5C）。重要なことは、JAK2-STAT3シグナル伝達経路がCDTによって活性化されたことで、CT26およびMC38細胞株ではリン酸化されたJAK2およびSTAT3の発現が増加した（図5C）。これまでの研究で、JAK-STATシグナル伝達経路の活性化がMMP遺伝子の発現と腫瘍転移につながることが示されている30,31,32,33,34。そこで、CDTによる腫瘍転移がJAK-STAT-MMPsシグナル伝達軸を介して作用するかどうかを検討した。CDTタンパク質またはC. jejuni共培養に曝露したCRC細胞株では、qPCRで測定したところ、いくつかのMmps遺伝子が発現上昇していた（図5D、5E、S5D、S5E）。特に、Mmp9遺伝子は異なるCRC細胞株で強固なmRNAのアップレギュレーションを示した（図5Dおよび5E）。同様の結果は、in situ腫瘍内共刺激マウスモデルから単離された腫瘍細胞でも観察された（図S5FおよびS5G）。驚くべきことに、C. jejuni感染患者からのヒト大腸粘膜の公開RNA-seqデータセットを再解析したところ、JAK/STATシグナル伝達経路の活性化と同様にMMP9遺伝子のアップレギュレーションが示された（図5Fと5G）35。CDTに曝露したヒト大腸腫瘍細胞では、PBSに曝露した腫瘍細胞と比較してMMP9発現の有意な増加が可視化された（図5H）。薬理学的阻害剤AG490によるJAK2リン酸化の阻害は、JAK-STATシグナル伝達経路の活性化を有意に阻止し、CRC細胞株におけるCDT誘導性のMMP9発現をダウンレギュレートし（図5I）、その結果、CDT誘導性の遊走および浸潤が同時に減弱した（図S5HおよびS5I）。腫瘍細胞におけるMmp9の阻害（図S5JおよびS5K）は、CDT誘発CRC細胞株の浸潤および遊走（図S5LおよびS5M）ならびに肺転移マウスモデルにおけるCDTの転移促進効果（図5Jおよび5K）を有意に阻害した。これらの結果から、CDTはJAK2/STAT3/MMP9シグナル経路を活性化し、CRCの転移を促進することが示された。
図5 CDTはJAK2/STAT3/MMP9シグナル伝達経路を活性化し、がん転移を促進する
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C. jejuniの腸内コロニー形成は腸管外がん転移を促進する
カンピロバクター属はCRC患者の組織から検出されたため、腸内コロニー形成後の転移に対するこの細菌の影響を評価した。皮下にCRC細胞株を移植したマウスに、図6Aに示すように、抗生物質カクテルを5日間投与した後、C. jejuni WT、ΔcdtB、cdtB Comp、またはPBSを経口投与した。cdtB遺伝子の欠損は腸内C. jejuniコロニー形成に影響を与えなかった（図S6A）。重要なことに、C. jejuni WT、ΔcdtB、およびcdtB Compを投与したマウスの腫瘍では、ciaBの存在によって測定されるC. jejuniの同程度の量が観察されたが、ΔcdtBを投与したマウスの腫瘍ではcdtB遺伝子は検出されなかった（図6B〜6E）。採取した腫瘍細胞のin vitroアッセイでは、ΔcdtBを投与したマウスの細胞は転移促進能が有意に低下していたのに対し、C. jejuni cdtB Comp株をコロニー形成したマウスではこの転移促進能が回復していた（図6Fおよび6G）。同様に、肺転移モデルでは、ΔcdtBを投与したマウスは、C. jejuniおよびcdtB Comp株を投与したマウスと比較して、転移病変が有意に減少した（図6H、6I、S6B、およびS6C）。特に、C. jejuniとcdtB Compを投与したマウスの腫瘍組織では、Mmp9遺伝子の有意なアップレギュレーションが観察された（図S6DおよびS6E）。これらの結果は、C. jejuniの腸内コロニー形成が、CdtBを介したJAK-STAT-MMP9経路を介して腫瘍転移を促進する可能性があることを示している。
図6 C. jejuniの腸内コロニー形成はCRCの転移進行を促進する
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考察
腸内細菌の中には、特異的な病原因子の作用により、腫瘍の微小環境や腫瘍細胞の内在性生物学的性質を改変することで、発がんプロセスに影響を及ぼすものがある。例えば、ホロ毒素CDTは結腸上皮細胞株とCRC細胞株の両方においてDNA損傷とゲノム不安定性を促進することが報告されている。この酵素サブユニットにより、がん細胞では複数のMMPの発現が増加し、JAK2-STAT3シグナルが活性化された。興味深いことに、CDTを産生するC. jejuniは腸内に定着し、腸管外の腫瘍病巣に移行して転移の進行を促進した。さらに、生きたカンピロバクターが腸管外腫瘍から回収できたことから、腫瘍が細菌の増殖に適した微好気性環境を提供していることが示唆された。C. jejuniが腫瘍部位に移動するメカニズムはまだ不明であるが、サルモネラ、エシェリヒア、およびクロストリジウム属のいくつかで報告されているように、リガンドを産生する腫瘍部位に細菌を誘導する走化性レセプターが関与している可能性が高い38。さらに、転移患者の原発性CRC組織では、カンピロバクターが有意に豊富であることが観察された。このように腫瘍内のカンピロバクター濃度が高いことは、カンピロバクター濃度が低い患者と比較して有意に予後が悪いことと関連している。したがって、腫瘍内C. jejuniはCRCの転移に影響を及ぼす可能性があり、予後不良と関連している。
JAK2/STAT3/MMP9シグナル伝達経路は腫瘍転移に関与しているが39、細菌由来の遺伝毒素とこの経路との関係は不明であった。我々の結果は、CRC細胞株においてJAK2リン酸化阻害剤を用いてJAK2/STAT3経路を遮断するか、あるいはMMP9遺伝子をノックアウトすると、CdtBを介したCRC転移が消失することを示している。これらの知見は、CdtBによるがん転移におけるJAK2/STAT3シグナル伝達経路の重要な役割を強調している。以前の研究では、ヘリコバクター・ヘパティカス由来のCdtBがマウスの大腸炎の誘発に必須であることが示された40。このプロセスはJAK/STAT3経路の誘導と関連している。したがって、この経路の活性化はCDTを保有する細菌間で共有されている可能性が高い。CdtBを介したJAK/STAT3活性化のメカニズムはまだ不明である。CDTホロトキシンは膜脂質ラフトを介して細胞に結合し、その後エンドソームに内在化され、ゴルジ複合体や小胞体を通って輸送され、そこでCdtBは核にアクセスしてDNAを損傷する41。興味深いことに、DNA損傷応答は、JAK/STAT3/MMP9経路の強力な誘導因子であるインターロイキン（IL）-6などの炎症性サイトカイン42の産生につながることが示されている。さらに、CdtBはホスファチジルイノシトール-3,4,5-トリホスフェート（PIP3）ホスファターゼとして働き、ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI-3K）シグナルを阻害して、プロテインキナーゼB（Akt）を不活性化するが、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β（GSK3β）は活性化する44。このように、C. jejuniと関連するCdtBは、異なるシグナル伝達経路を介してJAK/STAT経路を活性化する可能性があり、CRC転移におけるこれらの経路のそれぞれの寄与を明らかにするためには、さらなる調査が必要である。
本研究のいくつかの限界を強調しておきたい。カンピロバクター属菌が転移性CRC患者において濃縮されているという知見は、16S rDNA配列決定に基づいており、特に転移組織のような生物量の少ない臓器では解像度に欠ける。さらに、これらの組織における転移とC. jejuniとの関連は、qPCRによって測定されたCiaB遺伝子発現とCdtB遺伝子発現との相関に基づいている。2bRAD-M技術46のような、より感度の高いマイクロバイオーム解析アプローチを用いたさらなる研究が、転移組織における様々なカンピロバクター種の解明に役立つであろう。
要約すると、われわれはCDT産生カンピロバクターをがん転移を促進する腫瘍内細菌として同定した。これらの知見は、がん患者の予後バイオマーカーを設計する上で有用であろう。重要なことは、JAK2/STAT3/MMP9経路がCDTによるがん転移に寄与しているという知見は、治療への応用の可能性があるということであり、現在、この経路を阻害するいくつかの薬剤が臨床試験中である。
リソースの利用可能性
リードコンタクト
リソースおよび試薬のさらなる情報およびリクエストは、リードコンタクトであるPing Lan (lanping@mail.sysu.edu.cn)までお願いします。
資材の入手可能性
資材および試薬のすべての要請は、主任連絡先（lanping@mail.sysu.edu.cn）に直接連絡すること。
抗体、細菌、プラスミドを含むすべての試薬は、材料譲渡契約を締結した後、リクエストに応じて入手可能である。
16SアンプリコンシークエンスおよびRNA-seqデータは
Sequence Read Archive (SRA)に寄託されており、発表日現在一般に入手可能である。プロジェクト番号とアクセッションリンクは主要リソースの表に記載されている。本論文ではオリジナルコードは報告していない。
本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、要請があれば主担当者から入手可能である。
謝辞
本研究は、中国国家重点研究開発プログラム（P.L.へ、2022YFA1304000）、広東省消化器病臨床研究センタープログラム（P.L.へ、2020B1111170004）、中国国家重点臨床分野、中国国家自然科学基金（Z.H.へ、 82273346、J.G., 82100588）、中国広東省科学技術計画（Z.H., 2021B1212040017）、広東省基礎応用基礎研究基金会（J.G., 2019A1515110032）、広東省長江慈善基金会。研究スポンサーは、研究デザイン、サンプル収集、データ解析、データ解釈、in vitroおよびin vivo実験においていかなる役割も果たさなかった。
著者の貢献
Z.H.、C.J.、P.L.が本研究を監督し、実験をデザインした。Z.H.、J.Y.、J.G.、J.W.、Z.L.、W.M.C.、C.L.、Y.L.が実験を行った。Z.H.、J.Y.、J.G.、C.J.、J.W.は原稿を作成した。Z.H.、J.Y.、J.G.、Q.Z.、J.W.、R.Z.G.はデータ解析を手伝った。L.D.、J.H.、T.D.、B.G.は科学的洞察と原稿の批判的レビューを行った。X.H.はサンプル採取に協力した。
利害関係の宣言
著者らは、競合する利害関係はないことを宣言する。
STAR★Methods
Key resources table
REAGENT or RESOURCE SOURCE IDENTIFIER
Antibodies
anti- Phospho-Jak2 Cell Signaling Technology Cat#3776S; RRID: AB_2617123
anti-Phospho-Stat3 Cell Signaling Technology Cat#9145T; RRID: AB_2491009
anti-Stat3 Cell Signaling Technology Cat#4904T; RRID： AB_331269
抗GAPDH Cell Signaling Technology Cat#5174T; RRID: AB_10622025
抗jak2 Cell Signaling Technology Cat#3230T; RRID: AB_2128522
抗MMP9 ThermoFisher Cat#MA5-32705; RRID： MMP9 用 Alexa Fluor 488 Abcam Cat#ab150077; RRID:AB_2630356
YF®633-Phalloidin UElandy Cat#YP0053S
Cy3-conjugated C. jejuni probe Exon Biological Technology 社製。jejuni probe Exon Biological Technology N/A
FITC標識 cdtB mix Probe Exon Biological Technology N/A
FITC標識 EUB338 Universal bacterial probe Exon Biological Technology N/A
細菌およびウイルス株
C. jejuni 81-176 ATCC Cat#BAA-2151
C. jejuni_1 本紙 N/A
C. jejuni_2 本紙 N/A
大腸菌 DH5a ThermoFisher Cat#EC0112
E.coli
BL21(DE3) E.coli BL21(DE3) Tiangen Cat#CB105-02
生物試料
ヒト CRC 腫瘍組織 The Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University N/A
化学物質、ペプチド、 バンコマイシン アラジン Cat#V301569
アンピシリン Sangon Biotech Cat#A9393-5G
メトロニダゾール Sangon Biotech Cat#M3761-5G
ネオマイシン CHINOOK Cat#CND40121-10g
DMEM ギブコ Cat#11995073
FBS ギブコ Cat#10099-141
ペニシリン-ストレプトマイシン（P/S） ギブコ Cat#15140122
PBS Servicebio Cat#G4202-500ML
チプシン- EDTA EDTA Gibco Cat#25200072
ヒツジクエン酸血液 Hqbio Cat#HQ50071
カンピロバクター選択サプリメント Oxoid Cat#SR0098E
Tryptone Soya Agar (TSA) Oxoid Cat#CM0131B
ルシフェリン Promega Cat#P1043
Bouin's Fixative solution Phygene Cat#PH0976
コラゲナーゼ I BioFroxx Cat#1904MG100
70 μm cell strainer Corning Cat#08- 771-2
トランスウェルチャンバー Corning Cat#3422
Matrigel® Basement Membrane Matrix Corning Cat#356234
クリスタルバイオレットリーグ Cat#916087
PEI MAX 40K Polyscience Cat#24765- 1
Puromycin Solarbio Cat#P8230
polybrene Biosharp Cat#BL628A
protease/phosphatase inhibitor cocktail Beyotime Cat#P1045
EGF PeproTech Cat#AF-100-15
recombinant human noggin PeproTech Cat#120-10C
recombinant human r- スポンジン 1 PeproTech Cat#120-38
細胞回収液 Corning Cat#354253
重要な市販アッセイ
DNeasy Blood & Tissue Kit QIAGEN Cat#69504
shMMP9 レンチウイルスベクター Genechem N/A
SYBR Green Real- Time PCR master mix 東洋紡 Cat#QPK-201
Hiscript@ III RT Super Mix Vazyme Cat#R323-01
BCA Protein Assay Kit Thermofisher Cat#23227
Trizol® 試薬 Life Technologies Cat#15596-018
FastDNA Spin Kit MP Biomedicals Cat#116540600
寄託データ
16S rRNA sequencing (discovery cohort) BioProject： PRJNA846057 https://dataview. ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA846057
16S rRNA sequencing (validation cohort) BioProject:PRJNA1018594 https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA1018594
RNA-sequencing BioProject:PRJNA1144893 https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA1144893
実験モデル： 生物／株
MC38 ATCC Cat#AC337600
CT26 ATCC Cat#CRL-1670
HCT116 ATCC Cat#AC100596
MC38-Luciferase Gifts from Other Laboratory N/A
CT26-Luciferase Gifts from Other Laboratory N/A
HCT116- Luciferase Gifts from Other Laboratory N/A
SW620 ATCC Cat#AC100162
DLD1 ATCC Cat#AD0507
SW480 ATCC Cat# AC100953
Balb/C Gempharmatech-GD Cat#balb/c 002
C57BL/6 Gempharmatech-GD Cat#C57 C57BL/6J
Balb/c-nude Gempharmatech-GD Cat#D000521-13
オリゴヌクレオチド
一覧 本論文、 表S3およびS4 N/A
ソフトウェアおよびアルゴリズム
SnapGene v2. 3.2 N/A https://www.snapgene.com/
ImageJ N/A https://imagej.nih.gov/ij
Biorender N/A https://biorender.com/
GraphPad Prism N/A https://www.graphpad.com/
In vivo imaging system Perkin Elmer N/A
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実験モデルと被験者の詳細
マウス
C57BL/6、BALB/c、BALB/c-nude（6-8週齢）は、Gem Pharmatech Co. Ltd.（広州）から購入した。(広州)から購入し、特定病原体フリー(SPF)施設で12時間の明暗サイクル、周囲温度(20-22)C、湿度(60±10%)の条件下で飼育した。
マウス実験は、孫中山大学第六附属病院および広州瑞戈生物科技有限公司（承認番号20211121-001）の機関動物飼育使用委員会（IACUC）が承認したガイドラインに従って行われた。
ヒト検体収集
ヒトCRC腫瘍検体は、中山大学第六附属病院ヒト医療倫理委員会（2019ZSLYEC-096）の承認を得て、組織バンクから収集した。
発見コホートについては、3年以内の追跡期間内に術後遠隔転移（肺転移または肝転移）を有する（転移群）または有さない（非転移群）CRC患者（T1-3N0M0、ステージI-IIA）を本研究に募集した。除外基準は、腸閉塞、神経周囲浸潤、印環細胞癌、手術断端陽性、断端不定または陽性、粘液性腺癌、12個未満のリンパ節検査、限局性穿孔、リンパ管・脈管浸潤などの既知の危険因子を有することであった。最終的に、71人の患者を発見コホートに採用した（転移群、n=34；非転移群、n=37）。
検証コホートでは、術前に肝転移を有するCRC患者（転移群）と有さないCRC患者（非転移群）をリクルートした。除外基準は、1ヵ月以内の抗生物質の使用、腸閉塞、他の重篤な器質的疾患の併発などであった。最終的に、検証コホートには54人の患者を採用した（転移群：n=26、非転移群：n=28）。
CRCの病期は、米国癌合同委員会（AJCC）第8版TNM病期分類に従って分類された。ヒト試料使用のプロトコールおよびインフォームド・コンセントは、孫中山大学第六附属病院倫理審査委員会の承認を得た。
細胞株と細菌株
すべての細胞株は、10％ウシ胎児血清（FBS；Gibco, NY, USA）と1％ペニシリン-ストレプトマイシン（P/S, Gibco, CA, USA）を添加したDMEM培地（Gibco, NY, USA）で培養した。C. jejuni 81-176（ATCC）、C. jejuni_1、C. jejuni_2、ΔcdtBおよびΔcdtB補体染色物を、5％ヒツジクエン酸血液（TSA/blood）およびカンピロバクター選択サプリメント（Oxoid, MA, USA）を含むトリプトン寒天培地（TSA）プレート上で、微好気条件下、37℃で48時間培養した。大腸菌DH5α（Sinosoft、南京、中国）は、ルリア・ベルタニ（LB）プレート上で、好気的条件下、37℃で培養した。
方法詳細
マウス実験
腫瘍内注射では、CRC細胞（MC38-Luciferase細胞またはCT26-Luciferase細胞、1×106個/マウス）をBALB/CマウスまたはC57BL/6マウスの右腋窩に皮下移植し、7日目、10日目、13日目に細菌（C. jejuni、ΔcdtB、cdtB CompまたはDH5α、5×107 CFU/マウス）またはPBSを多点腫瘍内注射で投与した。異種発現CDTタンパク質については、50μl（10μmol/L）のタンパク質溶液を、上記のように皮下に移植した腫瘍内に注入した。マウスは16日目に犠牲にし、腫瘍細胞を無菌的に抽出した（詳細は皮下腫瘍細胞抽出を参照）。
腸内細菌のコロニー形成のため、マウスにはバンコマイシン（100mg/L）、メトロニダゾール（200mg/L）、アンピシリン（200mg/L）、ネオマイシン（200mg/L）を含む抗生物質カクテルを7日間飲水投与した。48時間の洗浄期間後、0日目と7日目に細菌（1×109 CFU/マウス）またはPBSをマウスに経口投与した。CRC細胞は0日目にマウスに皮下注射した。16日目に糞便および腫瘍中のC. jejuniの存在を測定した。糞便中のC. jejuniの定量は、連続希釈した糞便ホモジネートをCampylobacter選択寒天培地プレートにプレーティングすることにより行った。DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN, Germantown, MD）を用いて腫瘍組織から全DNAを抽出し、全サンプルの組織DNAを均一な濃度に調整した。C.jejuniの定量は、C.jejuni特異的遺伝子（ciaB）を用いたqPCRで行い、C.jejuniのDNAを陽性対照とし、滅菌酵素不含水を陰性対照とした。異なるサンプルから得られたCt値を比較した。すべてのプライマー配列を表S3に示す。
肝転移モデルマウスは、以前に記載されたとおりに実施した47。簡単に言うと、マウスをイソフルランで麻酔し、ルシフェラーゼを発現する腫瘍細胞1×106個をインスリン注射針で脾臓にゆっくりと注入し、その後腹部を縫合し、2日目と3日目にエントイオダインで消毒した。12日目に、in vivoイメージングシステム（Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts, USA）を用いてルシフェラーゼ活性を測定し、転移性肝腫瘍の進行を評価した。各マウスに200μlのルシフェリン（15mg/ml；Promega社、米国ウィスコンシン州フィッチバーグ）を腹腔内（i.p.）注射し、10分後にルシフェラーゼシグナルを捕捉した。その後マウスを犠牲にし、肝臓をBouin's Fixative solution（Phygene社、福州、中国）で固定した。
肺転移モデルマウスには、ルシフェラーゼを発現した腫瘍細胞1×106個を尾静脈から注射した。14日目に転移した肺腫瘍の進行を評価し、ルシフェラーゼ活性を測定し、上記のように定量した。
CRC同所肝転移モデルでは、HCT116-ルシフェラーゼ細胞（1×106個/マウス）をBABL/c-ヌードマウスの盲腸に移植し、C. jejuni（1×109CFU/マウス）を3日ごとに投与した。肝転移の進行は、上述のようにルシフェラーゼ活性を定量することにより、42日目に行った。糞便または腫瘍中のC.jejuniの定量は、上記のように、連続希釈した糞便または腫瘍ホモジネートをカンピロバクター選択寒天培地プレートにプレーティングすることにより行った。
皮下腫瘍細胞抽出
マウスの皮下腫瘍組織（細菌を腫瘍内に注入）を冷PBSで2回洗浄し、1〜2mm3の立方体に切断し、10mlのコラゲナーゼI（0.5mg/ml）（BioFroxx、ドイツ）を含む50mlチューブに移し、37˚Cシェーカーで1時間インキュベートした。70μmのセルストレーナー（Corning, NY, USA）で混合物を濾過した後、4℃、5分間の遠心分離（200g）により腫瘍細胞懸濁液を採取し、細胞ペレットを冷PBSで2回洗浄し、DMEM培地（10％FBS、1％P/S）を入れた10cmディッシュに48時間プレーティングした。これらの細胞は、その後C.jejuniを刺激することなく、その後の細胞実験および動物実験に使用された。精製CDTの腫瘍内注入実験にも同じ方法を用い、残留するCDTタンパク質をPBSで洗い流し、抽出した細胞を48時間培養した後、その後の刺激なしにその後の細胞および動物実験に用いた。
細胞共培養アッセイ
CT26、MC38、DLD-1、HCT116、SW620またはSW480細胞を6ウェルプレートにプレーティングし、12時間後、培地をペニシリン-ストレプトマイシン（P/S）フリーDMEM（10％FBS）に交換し、細菌（C. jejuni、ΔcdtB、cdtB CompまたはDH5α、）と感染多重度（MOI）10：1で12時間共培養した。細胞は1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含む滅菌PBSで洗浄し、DMEM（FBSフリー、1％P/S）で8時間インキュベートした後、細胞遊走または浸潤アッセイを行った。
CDT刺激については、細胞を上記のようにプレーティングし、CDTタンパク質（作業濃度：10 nmol/L）またはビヒクルコントロールを培地に72時間添加した。細胞を滅菌PBSで洗浄し、DMEM（FBSフリー、1％P/S）で8時間インキュベートした後、細胞遊走または浸潤アッセイを行った。JAK2のリン酸化を阻害するために、阻害剤AG490をDMSOに溶解し、50μmol/Lで細胞培養液に添加し、ビヒクル対照群には同量のDMSOを添加した。
遊走および浸潤アッセイ
腫瘍細胞の遊走および浸潤アッセイは、Matrigel® Basement Membrane Matrix（Corning, NY, USA）を添加または無添加のTranswellチャンバー（Corning, NY, USA）で行った。200μlの細胞（CT26とMC38：1×105 cells /well、DLD-1、HCT116、SW620とSW480：2×105 cells /well）をDMEM（FBSフリー、1％P/S）中で上側のチャンバーに播種し、下側のチャンバーは600μlのDMEM（10％FBS、1％P/S）で満たした。12時間（CT26およびMC38）または24時間（DLD-1、HCT116、SW620およびSW480）の細菌またはタンパク質刺激後、細胞を4％パラホルムアルデヒドで15分間固定し、0.2％クリスタルバイオレット（League、北京、中国）で30分間染色した。浸潤または遊走した細胞の画像は、顕微鏡で1条件につき無作為に5フィールドから撮影した。結合したクリスタルバイオレットは、各インサートに33％酢酸を加え、10分間振とうすることで溶出した。下部チャンバーからの溶出液を96ウェルの透明マイクロプレートに移し、Thermo Scientific Microplate Readerを用いて570 nmの吸光度（光学密度値、OD値）を測定した。
蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）
蛍光in situハイブリダイゼーションは、以前に記載されたように、5μmの組織切片で実施した48。簡単に言うと、パラフィン切片を脱パラフィンし、リゾチーム溶液（10mg/mL）中で37℃でインキュベートした。C. jejuniプローブは、Cy3標識特異的プローブ（5'-AGCTAACCACCTTATACCG-3'）49と、5'および3'でFITC標識したcdtBミックスプローブ（5'-CCTGTTGAGTGGCTGTTCTTGG-3'、5'-AATTGCTCCTACATCTGTTCCTCCATTAG-3'、5'-AAGCGGTGGAGTATAGGTTTGTTGTC-3'）； 5'-ATTGCTTTGCTGCTGCGGAT-3'）。全細菌の検出には、FITC標識EUB338ユニバーサル細菌プローブ（5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'）を用いた。すべてのプローブはExon Biological Technology社（広州、中国）製であった。スライドは、あらかじめ温めたハイブリダイゼーションバッファー（100 mM Tris-HCl、pH 7.4、0.9 M NaCl、0.1% SDS、35%ホルムアミド）で希釈した各プローブ5 ng/μlとともに、湿度の高い室内で48℃、一晩インキュベートした。その後、スライドをあらかじめ温めた（46℃）洗浄バッファー（20 mM Tris-HCl、pH 7.4、225 mM NaCl、5 mM EDTA）とTrisバッファー（20 mM Tris-HCl、pH 7.4）でそれぞれ3回洗浄した。組織はDAPIを含むアンチフェード・マウンティング・メディウムで染色し、共焦点顕微鏡（Leica DMI4000B、ハイデルベルク、ドイツ）を用いて蛍光シグナルを捕捉した。
MMP9遺伝子サイレンシング
shMMP9 no.1（74302-2）、shMMP9 no.2（74302-4）およびshNT（shGFP；CON077）レンチウイルスベクターはGenechem Co. レンチウイルスは、PEI MAX 40K（Polyscience, Illinois, USA）を用いて、HEK293T細胞にパッケージングプラスミド（psPAX2およびpMD2.G）を共導入することにより作製し、48時間後にウイルス上清を回収した。次いで、ウイルス含有培地上清を用いて、ポリブレン（1μg/ml）法を用いてCT26およびMC38腫瘍細胞に感染させた。ピューロマイシン耐性CT26細胞（ピューロマイシン、20μg/ml）およびMC38細胞（ピューロマイシン、6μg/ml）をその後の実験のために選択した。すべてのshRNA配列を表S3に示す。
ヒト腫瘍および糞便中のC.jejuniの定量化
腫瘍組織中に転移しているC.jejuniを同定するために、DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN、Germantown、MD）を用いて腫瘍組織から全DNAを抽出し、cdtBおよびC.jejuniの代理マーカーであるC.jejuni特異的遺伝子ciaBを用いたqPCRによってC.jejuniの存在を判定した26,27,28。内部参照遺伝子として18S rRNA遺伝子を用いた。すべてのプライマー配列は表S3に示した。
RNAおよび定量的リアルタイムPCR
Total RNA Kit（R323-01, Vazyme, China）を用いて、腫瘍細胞または腫瘍組織からTotal RNAを抽出した。RNAの品質と濃度は、NanoDrop ND-2000 spectrophotometer（Thermofisher, MA, USA）を用いて評価した。1μgのtotal RNAを、Hiscript@ III RT Super Mix with gDNA wiper (R323-01, Vazyme, China)を用いて、メーカーのプロトコールに従ってcDNAに逆転写した。qPCRは、SYBR Green Real-time PCR master mix (QPK-201, Toyobo, Japan)を用いて、Applied Biosystems 7500 Real-time PCR systemで行った。異なるサンプルから得られたCt値は、2-ΔΔCtを用いて比較した。GAPDH は内部参照遺伝子として使用した。本研究で使用したすべてのプライマー配列を表 S3 に示す。
ウェスタンブロット
プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤カクテル（Beyotime, Shanghai, China）を含むRIPAバッファーで細胞ペレットを溶解し、BCA Protein Assay Kit（Thermofisher, MA, USA）を用いてタンパク質濃度を定量した。等量の総タンパク質を12% SDS-PAGEにかけた後、TBST緩衝液（50 mmol/l Tris-HCl, 150 mmol/l NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.4）中5%スキムミルクで1時間ブロッキングし、一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。その後、膜をPBST（PBS、0.1% Tween-20）で洗浄し、二次抗体と室温で40分間、1時間インキュベートした。以下の抗体を使用した：抗ホスホ-Jak2（カタログ番号：3776S、1:1000希釈）、抗ホスホ-Stat3（カタログ番号：9145T、1:1000希釈）、抗jak2（カタログ番号：3230T、1:1000希釈）、抗Stat3（カタログ番号：4904T、1:1000希釈）および抗GAPDH（カタログ番号：5174T、1:2000希釈）は、Cell Signaling Technology社（CST、MA、US）から購入した。抗MMP9（カタログ番号：MA5-32705、1:1000希釈）はThermoFisher社から購入した。
cdtB knockout-C. jejuni (ΔcdtB)およびcdtB complement-C. jejuni (cdtB Comp)の構築
C. jejuniのプラスミドおよびプライマーを表S4に示す。C. jejuni 81-176の欠失変異体は、以前に記載されたように構築された。50,51 簡単に述べると、cdtB欠失変異体用のベクターを構築するために、759 bp-上側相同腕と744 bp-下側相同腕を持つcdtBコード配列（237 bp）をPCRで増幅した。この2つの増幅断片とプラスミドpG0385由来のカナマイシン耐性カセットを、既報のプロトコールに従ってpBluescript II SKにクローニングして連結した52。ΔcdtB変異体に用いたカナマイシン耐性カセット（プラスミドpG0385からPCRで得たもの）は、プラスミドpACH1をベースにした非極性デザインであり53、5'末端に3×ストップコドン、3'末端にRBS領域を含む。
cdtB遺伝子はプラスミドpG0125にクローニングされ、自然形質転換によってC. jejuni 81-176に形質転換された。相同組換えにより、cdtB遺伝子は染色体のhsdM遺伝子座に挿入された。
C
.jejuniのcdtA断片はXhoIとBamHI（Thermo Fisher, MA, US）を用いてpCold TF（Takara）に挿入し、cdtBまたはcdtC断片はNheIとXhoI（ThermoFisher, MA, US）を用いてpET21b（Takara, Japan）にクローニングした。cdt遺伝子プラスミドはそれぞれ、ヒートショック形質転換を用いて大腸菌BL21(DE3)(Tiangen, Beijing, China)にトランスフェクトした。1mMのIPTG（イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド）の添加により毒素CdtA、CdtBおよびCdtCの発現を誘導し、培養を30℃で一晩行い、組換えタンパク質を発現させた。遠心分離で菌体を回収し、PBSで2回洗浄し、20mlの溶解バッファー（20mMリン酸バッファーpH7.8、10mMイミダゾール、0.5M NaCl）に懸濁した。ウルトラソニケーションと遠心分離を行い、可溶性画分をNi-NTA樹脂（Smat-Life sciences, Changzhou, China）と4℃で回転させながら1時間インキュベートした。樹脂に結合したHisタグ組換えタンパク質を溶出バッファー（20mMリン酸バッファーpH7.8、250mMイミダゾール、0.5M NaCl）で洗浄した。溶出した精製タンパク質を脱塩し、限外ろ過（10K分子量カットオフ（MWCO）、ミリポア）で濃縮した。
オルガノイドの単離、培養、処理および画像化
ヒト腫瘍細胞をCRC患者から単離し、既述のようにマトリゲル（Corning, NY, USA）中で培養した。50ng/mL組換えヒトEGF（PeproTech #AF -100-15）、50ng/mL組換えヒトノギン（PeproTech #120 -10C）および250ng/mL組換えヒトr-スポンジン1（PeproTech #120 -38）を添加したBCM（基礎培地）からなる予め温めたオルガノイド培養液をプレートに加えた。成熟し、出芽したオルガノイドを前述のように継代し、CDTタンパク質（50μg/mL）で12時間処理した。その後、オルガノイドを細胞回収液（Corning #354253 , NY, USA）で回収し、4%ホルムアルデヒドで氷上30分間固定し、100%メタノールで氷上10分間透過処理し、5%ヤギ血清と1%BSAで1時間ブロックした。オルガノイドをMMP9の一次抗体（ThermoFisher、#MA5-32705、1:1000希釈）とともに4℃で一晩インキュベートした。翌日、オルガノイドをPBSTで洗浄し、二次抗体（MMP9用Alexa Fluor 488、Abcam、ab150077）とともに室温で40分間、1時間インキュベートした。オルガノイドは、DAPIとYF®633-Phalloidin（UElandy、#YP0053S 1:500、F-アクチンと結合）を添加した抗フェードマウンティングメディウムで染色し、共焦点顕微鏡（Leica DMI4000B、ハイデルベルク、ドイツ）を用いて蛍光シグナルを捕捉した。
RNA配列決定と解析
CT26およびMC38細胞株からTrizol®試薬（Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）を用いて全RNAを抽出した。NEBNext® UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina® (NEB, USA)を用いて、製造元の指示に従ってシーケンスライブラリー（非鎖特異的、ペアエンド）を作成し、インデックスコードを付加して各サンプルの配列を決定した。インデックスコードを付加したサンプルのクラスタリングは、cBot Cluster Generation SystemでTruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS（Illumia）を用い、メーカーの指示に従って行った。ライブラリー調製物をIllumina NovaSeq 6000プラットフォームでシーケンスし、150 bpペアエンドリードを作成した。DESeq2 Rパッケージ（1.16.1）を用いて、2群（条件ごとに3生物学的複製）の差次的発現解析を行った。すべてのRNA-seqデータはExtended Table S2に記載されており、NCBI GEOからaccession PRJNA1144893で入手可能である。
High throughput 16S rRNA amplicon sequencing and analysis
ゲノムDNAはFastDNA Spin Kit for Soil（MP Biomedicals）を用いて抽出した。簡単に説明すると、V3-V4領域からPCRを用いてバーコード付きアンプリコンを作成した。最初のステップでは、338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）および806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）プライマーにイルミナアダプター配列を付加したものを用い、総容量20μlで10ngのゲノムDNAを最初のPCRの鋳型として用いた。その後、PCR産物を精製し、フラグメントアナライザーでチェックし、定量した後、等モルのマルチプレキシングを行い、Illumina MiSeq PE300プラットフォームでシーケンスした（2x300 bp）。微生物解析にはQuantitative Insights into Microbial Ecology 2（QIIME2）ソフトウェアを使用した。リードをインポートし、q2-data2プラグインでクオリティフィルターおよびデマルチプレックスを行った。参照16S rRNA遺伝子データベースとしてGreengenes (version 13.8)を用いて配列を分類した。R(v4.1.1)を用いてPrincipal Coordinate Analysis (PCoA)、LEfSe、Significant Speciesを行った。16S rRNAデータはNCBI GEOのaccession PRJNA846057（発見コホート）およびPRJNA1018594（外部検証コホート）から入手可能。
The Cancer Genome Atlas（TCGA）および Hartwig Medical Foundation データセットの解析
TCGA サンプルについては UC San Diego Cancer Microbiome FTP サイト（https://ftp.microbio.me/pub/cancer_microbiome_analysis/TCGA）から、Hartwig サンプルについては Hartwig FTP サイト（https://ftp.microbio.me/pub/cancer_microbiome_analysis/TCGA）から、それぞれ処理したデータをダウンロードした。次に、両データセットを結合し、UC San Diego Cancer Microbiome のアプローチに従って正規化およびバッチ効果の除去を行い、TCGA の大腸原発腫瘍サンプル（非転移性）および Hartwig の転移性サンプル（大腸を原発腫瘍部位とするサンプル）におけるカンピロバクターの正規化存在量をプロットした。
定量化および統計解析
本研究で行った統計解析およびデータの可視化は、上記の特別な統計解析を除き、GraphPad Prism 8を用いて行った。データは平均値±SEMで示した。2群間の差は、対応のないスチューデントのt検定を用いて比較した。3群以上の比較は、Tukeyの多重比較検定と組み合わせた一元配置分散分析検定により行った。採用した患者の臨床的特徴の差は、Pearsonのカイ2乗検定またはFisherの正確検定を適宜用いて決定した。p値はすべて両側で、p値が0.05未満の差は有意差とみなし、nsは有意でない比較を示す。
補足情報(4)
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。図S1～S6および表S1～S4
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データS1。記事と補足情報
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