最小肝性脳症治療におけるプロバイオティクス、リファキシミン、ラクチュロースの効果と腸内細菌叢の比較検討

2023年4月5日 10:46

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ORIGINAL RESEARCHの記事
Front. Microbiol.、2023年3月24日
第2回脊椎動物の消化器官における微生物について
第14巻～2023年｜https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1091167
最小肝性脳症治療におけるプロバイオティクス、リファキシミン、ラクチュロースの効果と腸内細菌叢の比較検討

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1091167/full?utm_source=S-TWT&utm_medium=SNET&utm_campaign=ECO_FCIMB_XXXXXXXX_auto-dlvrit

Ming-Wei Wang1†‡, Wei-Juan Ma1†‡, Yan Wang1‡, Xiao-Han Ma1‡, Yu-Feng Xue1‡, Jing Guan2*‡ and Xi Chen1*‡.
1安徽医科大学第一附属病院消化器科、中国安徽省合肥市
2中国安徽省合肥市安徽医科大学第一附属病院消化器病重点実験室
背景最小肝性脳症（MHE）は、肝性脳症の病態の初期段階である。腸内細菌叢は肝性脳症の病態に関与しており、重要な治療標的となっている。MHEに対する統一的な治療方針はないため、本研究では、MHE治療における様々な腸内微小生態系調節剤の安全性と有効性を明らかにし、腸内細菌叢の解析を通じて潜在的なメカニズムを探ることを目的として実施した。
方法肝硬変患者を対象に、心理測定による肝性脳症スコアテストを用いてMHEをスクリーニングした。MHEと診断された患者を登録し、プロバイオティクス、リファキシミン、またはラクチュロースを4週間投与した。有害事象は記録した。治療後、心理測定肝性脳症スコアテストを実施した。入室時と4週目に血液と便のサンプルを採取した。血液サンプルは、血中アンモニア、肝臓、腎臓、および止血機能を評価するために分析された。便の微生物組成は、微生物組成の変化を確認するために塩基配列を決定した。
結果肝硬変患者323名のうち、74名がMHEと診断された。全体で54名の患者が登録され、フォローアップに同意した52名が解析に含まれた。プロバイオティクス、リファキシミン、ラクチュロースを投与されたMHE患者の回復率は、それぞれ58.8％（20/34）、45.5％（5/11）、57.1％（4/7）であった。プロバイオティクスとリファキシミンは、MHE患者の肝機能を一定程度改善した。MHE患者の腸内細菌叢の分類学的組成は、治療前は健常者と異なっていたが、治療後はその差が有意に減少し、腸内細菌叢は次第に健常者の構造に似てきた。また、抗炎症作用や良好な認知機能に関連する特定の分類群の相対量が、治療後のMHE患者において増加することを見出した。それに伴い、MHE患者の代謝経路は治療前と治療後で変化していました。プロバイオティクス治療後に低下した経路は、糖代謝と芳香族化合物の分解であった。ラクチュロース投与後、アルギニンとオルニチンの分解経路は減少傾向を示した。
結論プロバイオティクス、リファキシミン、ラクチュロースは、MHEの治療に安全かつ有効であり、腸内細菌叢の組成をある程度改善することができる。
はじめに
肝性脳症（HE）は、慢性肝疾患と急性肝不全の両方に共通する重大な合併症である。HEは、不顕性変化（軽度の認知障害）から深刻な見当識障害、錯乱、昏睡に至るまで、幅広い神経精神異常のスペクトルとして現れる（Rose et al.、2020）。最小肝性脳症（MHE）は、明らかな精神神経症状を伴わないHEの経過におけるinsidious stageである。それは一連の神経心理学的検査によってのみ診断することができます。肝硬変患者の20-80%に軽微な、あるいは隠蔽されたHEが発生し、MHEはより悪い健康関連QOLと自動車運転事故と関連している（Bajajら、2009、2020）。
HEの病因はまだ不完全に理解されています。現在、アンモニア中毒が中核的な理論として残っており、炎症性メディエーターや他の有害物質の役割も注目されている。血中アンモニアの増加は、アストロサイトの腫脹と細胞毒性脳浮腫を誘発し、精神神経症状を引き起こす可能性がある。全身的な炎症状態は、HEを誘発し悪化させる重要な要因であると考えられるようになってきています。血漿中の炎症マーカーの上昇がHEの発生と重症度に関連し、血漿中の炎症マーカーの上昇と高血中アンモニアの間に相乗効果が存在することが直接的な証拠から明らかになっています（Aldridge et al.、2015）。腸内細菌は、宿主の多くの生理的プロセスに関与し、多くの消化器疾患の発生や発症に重要な役割を果たすことから、近年、研究のホットスポットとなっています（Tilg et al., 2016）。以前の研究では、減圧性肝硬変患者における腸内細菌叢の変化は、潜在的に有益な自生分類群、特にLachnospiraceae、Ruminococcaceae、Clostridiales XIVが相対的に減少し、潜在的に病原性の分類群、例えばStaphylococcaceae、Enterobacteriaceae、Enterococcaceaeが相対的に過剰増殖するという特徴があると報告しています（Bajaj et al., 2014b）。また、便および唾液の微生物叢における乳酸菌の相対的な存在量は、MHEを有する肝硬変患者ではMHEを有しない患者よりも高く、一方、便および唾液のLachnospiraceae属（RuminococcusおよびClostridium XIVb）は、優れた認知力と関連していた（Bajaj et al., 2019）. MHEの主な原因として特定の病原体は特定されていませんが、いくつかの研究により、肝硬変およびその合併症における腸内細菌叢の重要な役割が明らかになっています。また、腸-肝-脳軸の概念についても言及されることが多くなってきています。現在、腸内細菌叢を調整することによるMHE治療の薬物介入法には、主にラクツロース、プロバイオティクス、リファキシミンがある（Patidar and Bajaj, 2015; Mancini et al., 2018）。例えば、ラクツロース治療はMHEの回復率を有意に改善し、MHE患者の腸内細菌叢の変化はこの治療の効果を変調させる（Wang et al.、2019）。プロバイオティクスの介入は、肝硬変におけるアンモニア濃度、小腸細菌過剰増殖、オロセカル通過時間を有意に減少させ、心理測定肝性脳症スコア（PHES）を改善しました（Lunia et al.、2014）。プロバイオティクスは肝硬変において安全で忍容性が高く、内毒素血症やディスバイオシスを軽減します（Bajaj et al., 2014a）。リファキシミンは、MHEにおける認知機能および内毒素血症の改善と関連し、腸内細菌と代謝産物の関連性の変化を伴っていた（Bajaj et al.、2013）。さらに、単剤よりも併用薬の方が効果的な場合があることが研究で示されています（Sharma et al.、2013）。25の研究を含むメタアナリシスでは、リファキシミンに続いてラクツロース、プロバイオティクスとL-オルニチンL-アスパラギン酸（LOLA）、LOLAがMHEの回復に最も有効であることが示唆されている（Dhiman et al., 2020）。しかし、これらの薬剤の間で有効性に大きな差がないことを明らかにした研究もあります（Agrawal et al., 2012; Sidhu et al., 2016）。MHE療法の選択は、介入の時間や量、患者の包括基準の一貫性のなさ、異なる薬剤間の直接的な有効性の比較の欠如などにより、依然として議論の余地があります。さらに、MHE患者における腸内細菌に関する関連研究も不足しています。
本研究の目的は、MHEの治療における異なる介入薬の安全性と有効性を比較することである。治療前後のMHE患者における腸内細菌叢の解析と合わせて、MHEの潜在的な発症メカニズムや薬剤の治療効果について検討する。
材料と方法
患者様
本試験は単施設試験であり、2020年12月から2022年3月まで安徽医科大学第一病院にて実施された。インクルージョン基準は以下の通り： (1）30～70歳、（2）肝硬変の存在を示す画像診断、（3）3カ月以内に状態が安定した、（4）PHESを用いてMHEを診断した。以下の場合、患者は除外された： (1) 過去2週間以内に吐血や下血などの消化管出血の症状、または肝硬変の他の重篤な合併症がある場合 (2) 経頸管的肝内ポートシステムシャントまたはシャント手術の経験がある場合； (3）最近のアルコール摂取、最近の感染症、抗生物質の使用歴（過去2週間）のある患者、（4）ラクツロース、LOLA、プロバイオティクス療法中の患者、（5）糖尿病、心不全、呼吸不全、末期腎疾患、新生物など他の重篤な疾患、（6）長期の高タンパク食の患者。患者の病歴と臨床特性は、ベースライン時に記録した。
倫理
本研究は、安徽医科大学病院倫理委員会の承認を得て、中国臨床試験登録部（ChiCTR2000040960）に登録された。すべての患者は、書面によるインフォームドコンセントを提供した。URL：http://www.chictr.org.cn/index.aspx.
MHEの診断
すべての被験者は、デジタル接続テスト5つのテスト、すなわち、数字接続テストAおよびB/C、数字記号テスト、ライントレーステスト、およびシリアルドッティングテストを含むPHESシステムでテストを受けた。年齢と教育水準で層別化し、ゼロ点はMHE患者と対照者の差の値が1標準偏差（SD）未満であることを意味した。最終的な合計得点は-15から+5までの範囲であった。現在の国際的に認知されているPHESシステムの診断基準では、総スコアが-4以下の患者をMHEと診断し、審査の総スコアが-4を超えている間はMHE患者は回復したとみなされました。
治療内容
患者は、プロバイオティクス（Pro）群、リファキシミン（Rif）群、ラクツロース（Lac）群に割り付けられ、4週間の治療を受けた。Pro群には、プロバイオティクスカプセル（Bifidobacterium, Lactobacillus, and Enterococcus Capsules, Oralの生菌複合体）を420mg、1日2回投与した。Bifidobacterium longum、Lactobacillus acidophilus、Enterococcus faecalisを含むプロバイオティクスカプセルは、上海信義医薬有限公司で製造されたものである。各カプセル（210mg）には、1.0×107CFU以上の生菌が含まれていた。Rif群には、リファキシミンを200mgで1日2回投与した。Lac群には、1日2〜3回の排便を維持するためにラクツロース処理を行った。入室時と4週目に血液と便を採取し、PHES検査も実施した。
臨床検査
血中アンモニア、肝機能、腎機能、抗凝固機能の評価のための血液サンプルは、採取後30分以内に安徽医科大学第一附属病院の研究室に送られ測定された。Child-Turcotte-Pugh（CTP）および末期肝疾患モデル（MELD）スコアは、標準的な臨床および検査指標を用いて算出した。
16S rDNA遺伝子の塩基配列決定
すべての便サンプルは、滅菌綿棒を使って採取し、2mlの滅菌サンプリングチューブに入れました。サンプルはその後、DNA抽出と配列決定のために中国天津のNovogene配列決定センターに送られた。QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（Qiagen、Hilden、ドイツ）を用いてゲノムDNAを抽出し、16S rDNA PCRプライマー（341F、CCTAYGGRBGCASCAG；806R、GGACTACNNGGTATCTAAT）を用いて、各試料の総 DNAをPCRテンプレートとして16S rDNAのV3-V4超変量領域の増幅を行いました。ライブラリーはTruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kitで構築し、シーケンスは2 × 250-base pair protocolに基づきNovaSeqシステム（Illumina）を使用しました。
16S rDNA遺伝子シーケンスのバイオインフォマティクス解析
まず、16S rDNA遺伝子配列の生データのプライマー領域をCutadapt（バージョン1.18）で削除した。ペアとなった配列は、Vsearch（バージョン2.14.1）を用いてデフォルトのパラメータでマージした（Rognes et al.、2016）。次に、マージされたリードをQIIME2（バージョン2019.10）で解析した（Bolyen et al.、2019）。低品質のマージリードをフィルタリングし、フィーチャーテーブル（100%同一性）を構築するためにDeblurを利用した（Amir et al.、2017）。総存在量（サンプルから得られた配列の総数）＞16,000、総存在量＞10の特徴を持ち、少なくとも5つのサンプルで観察されたサンプルは、その後の解析に予約した。配列データセットの分類学的割り当てにはGreengenes 16Sデータベース（バージョン13.8）を使用し、QIIME2プラグインの特徴sklearn分類器（McDonaldら、2012；Bokulichら、2018）により実行した。アルファおよびベータ多様性は、QIIME2を用いた希薄特徴表で評価した；細菌のmetaCyc代謝経路は、PICRUSt2（バージョン2.3.0）（Douglas et al., 2020）で予測された。ランダムフォレストモデルは、RパッケージRandomForestを用いて、相対存在量>0.1%の属レベルに基づいて実施した。すべての図はRソフトウェア（v4.1.0）を用いて可視化した。
統計解析
正規分布のデータは、paired t test、ANOVA、またはχ-square testで比較し、平均値（SD）として表現した。正規分布でないデータは、Kruskal-Wallis順位和検定で比較した。異なる薬剤の有効性を比較するためにカイ二乗検定を用いた。α多様性の差は、複数群に対するANOVA検定で評価した。複数グループ間の非類似度の比較は、順列多変量分散分析検定（PERMANOVA）を用いて行った。LEfSeおよびDESeq2（Segata et al., 2011; Love et al., 2014）を用いて、分類群の存在量の差分レベルを比較した。そして、2つのグループ間の代謝の特徴の差分はt検定で比較した。偽発見率法による多重比較補正後のp値＜0.05はすべて有意差ありとした。
結果
PHESの基準範囲
男性109名、女性91名、年齢47.7±10.5歳、学歴10.7±4.2年の計200名の健康なボランティアを評価対象とした。年齢と教育レベルに応じてグループ分けした後、各グループにおける5つの小項目の実験基準範囲を補足表1に示した。
臨床的アウトカム
肝硬変患者323名を対象に、PHESのスクリーニングを実施した。このうち74名がMHEと診断され、MHE発症率は22.9％でした。合計52名の患者が治療を完了し、血液と便のサンプルを提供しました（図1）。彼らのベースライン臨床特性を表1に示します。Pro群、Rif群、Lac群の回復率はそれぞれ58.8％（20/34）、45.5％（5/11）、57.1％（4/7）であった。プロバイオティクス、リファキシミン、ラクチュロースの間でMHE回復率に統計的有意差はなかった（p = 0.843）。治療を拒否した20人のMHE患者は、PHESによる再検査を受けなかった。残念ながら、そのうちの2名には、6ヶ月の追跡調査中にHEの増悪が認められた。治療を受けたMHE患者には、並存は見られなかった。血液学的指標を治療前と治療後で比較し、その結果を表2に示した。血清アルブミンの増加、血清総ビリルビン（TBIL）の減少、国際標準化比（INR）がプロバイオティクス治療後に検出され、血清アルブミン値の増加がリファキシミン治療後に検出された（図2）。その他の指標では、統計的に有意な差は認められませんでした。全体の患者さんは、MHEが回復したかどうかによって、奏効と非奏効に診断されました。その結果、非反応例では、反応例と比較してベースラインのINR（1.16 ± 0.11 vs. 1.08 ± 0.13, p = 0.026）およびMELD（5.11 ± 3.11 vs. 2.77 ± 2.73, p = 0.007) が高いことがわかりました。特に、プロバイオティクス治療に反応しなかった患者は、反応した患者と比較して、ベースラインのTBIL、INR、MELDの性能が高いことが示された（表3）。
図1
図1. MHEに対する治療患者の流れ。
表1
表1. MHE患者のベースラインデータ。
表2
表2. 治療前後の血中アンモニアおよび肝機能の変化。
図2
図2. ベースラインと4週目の血液学的指標は、有意な改善を示した。プロバイオティクス群におけるベースライン時および4週間後のTBIL（A）、INR（B）、ALB（C）の成績、リファキシミン群におけるベースライン時および4週間後のALB（D）の成績。TBILは総ビリルビン、INRは国際標準化比、ALBは血清アルブミン。
表3
表3. 3群における治療に対する非反応の予測因子。
重篤な有害事象はなかったが、3人の患者に軽度の有害反応が見られた。1例目はラクチュロースを1週間服用した後に腹痛が、2例目はリファキシミンを1週間服用した後に便秘が発生した。両患者の前述の徴候は中止後に治まったため、これらの症例は試験から離脱した。また、別の患者はラクツロース服用後に下痢を起こしたが、指示通りに用量を調整したところ消失した。
MHE患者における腸内細菌叢の特徴
治療前後の健常対照者およびMHE患者の便サンプルにおいて、最も豊富な細菌門と上位7属を図3Aに示した。門レベルの相対量では、治療前の対照者と比較して、MHE患者では、プロテオバクテリアが濃く、バクテロイデーテスが少ないことが示され、属レベルの相対量では、腸内細菌科が濃く、バクテロイデーテスが少ないことが示されました。腸内細菌叢のα-diversityを対照者とMHE患者で比較したところ、Chao1 index、観察OTUs、Shannon index、Faith_PDに有意差は見られなかった（補足図1A）。細菌分類学の重み付けされていないUniFrac行列に基づく主座標分析では、MHE患者の分類学的組成は、治療前の健常者のものとは異なることが示された（図3B）。しかし、重み付けUniFrac行列およびBray-Curtis行列に基づく主座標分析では、有意差は認められなかった（補足図1B）。MHEと対照例の差分分類群を比較するためにDESeq2解析を実施した。その結果、MHE患者ではPediococcus、Selenomonas、Anaerosinus、Lactobacillus、Pseudomonas、Bifidobacteriumが濃縮され、Barnesiellaが欠如していることが示された（図4A）。LEfSe解析でも同様の結果が得られた（補足図2A）。
図3
図3. MHE患者およびコントロールの腸内細菌叢。(A）異なるグループにおける腸内細菌叢の組成。(B）全患者と対照者における細菌分類の重み付けされていないUniFracマトリックスに基づくPCoA。
図4
図4. DESeq2解析に基づく分類学的特徴の違い。MHE患者とコントロールの間の腸内細菌叢の相対存在量の変化（A）、プロバイオティクス治療前後のMHE患者（B）、リファキシミン治療前後のMHE患者（C）、ラクチュロース治療前後のMHE患者（D）。Log2(baseMean): base meanのlog base 2、base meanは全サンプルのカウントを正規化した平均値で、シーケンスの深さで正規化する。-loge(P)：p値のlog base eのマイナス値。
処理に伴う分類学的および代謝学的組成の変化
動物門レベルの相対存在量上位5位は、処理方法にかかわらず、処理後のMHEでBacteroidetesが増加する傾向を示した。また、属レベルでも同様の結果が得られた（図3A）。治療前のMHE患者における治療後の細菌多様性を解析した。興味深いことに、α-ダイバーシティは治療後に有意な変化は見られなかったが、重み付けされていないUniFrac行列に基づく主座標分析により、MHE患者の分類学的組成は治療後に大きく変化し、徐々に健常者のものに近づいていることが示唆された（図3Bおよび補足図1A）。そこで、治療前と治療後のMHE患者における差分分類群を決定した。Pediococcus、Lactobacillus、Akkermansia、およびMacellibacteroidesの相対存在量は減少し、Barnesiella、Dorea、およびRoseburiaの存在量はプロバイオティクス治療後に増加しました（図4B）。Rifaximin処理により、Clostridium、Pediococcus、Ruminococcus、Streptococcus、Selenomonas、Biophila、Desulfovibrio、Pseudomonasの存在量が減少し、Barnesiellaの存在量が増加した（図4C）。Lacグループは、Pediococcus、Clostridium、Pseudomonasの存在量が減少し、AnaerosinusとAkkermansiaの存在量が増加しました（図4D）。LEfSe解析でも同様の結果が得られた（補足図2B-D）。
PICRUSt2 を用いて、16S rDNA 遺伝子配列から腸内細菌叢の持つ代謝経路を予測した。代謝経路を比較したところ、MHEと対照群の間に明らかな変化は見られなかった（図5A）。しかし、MHE患者のプロバイオティクス治療前後の代謝経路には違いが見られた。プロバイオティクス治療後にダウンレギュレートされた経路は、糖代謝（LACTOSECAT-PWY、PWY-6470、PWY-5265）、芳香族化合物の分解（3-HYDROXYPHENYLACETATE-DEGRADATION-PWY、 PWY-6071，PWY0-321，METHYLGALLATE-DEGRADATION-PWY，GALLATE-DEGRADATION-I-PWY，PWY-5431，PWY-5417，GALLATE-DEGRADATION-II-PWY，CATECHOL-OTHO-CLEAVAGE-PWY）およびPWY-6876は発現が上昇していた．リファキシミン処理前後で有意なパスウェイの変化は見られなかった。ラクチュロース処理後、アルギニンとオルニチンの分解経路（ORNDEG-PWY、ARGDEG-PWY、ORNARGDEG-PWY、AST-PWY）は低下傾向を示した（図5B-D）。予測されたすべての代謝経路の説明は、補足表2に記載されていた。
図5
図5. 治療前後の患者における代謝の差異の特徴。MHE患者と健常対照者の代謝上の特徴の差異比較（A）、プロバイオティクス治療前後のMHE患者（B）、リファキシミン治療前後のMHE患者（C）、ラクツロース治療前後のMHE患者（D）。 q値、ベンジャミン・ホックバーグ法による調整p値。q-valueが有意でない場合はp-valueを使用する。
主要な分類群およびバイオマーカーとの相関関係
MHEに関与する主要な分類群を特定するため、MHE患者とコントロール個体との間で、属レベルでの相対存在量を比較した。その結果、Selenomonas、Anaerosinus、Lactobacillus、Pediococcus、Prevotellaが豊富で、Ruminococcus、Barnesiella、Gemmigerが不足していることがわかりました。異なる分類群の組み合わせでMHEを予測すると、曲線下面積は0.867となった（図6）。
図6
図6. MHEに関連する主要な分類群。Receiver Operating Curve（ROC）-解析により、MHEとコントロールグループの区別におけるランダムフォレストモデルの性能が示された（A）。ランダムフォレストモデルによって選択された上位9つの重要な分類群（B）。
その後、特定の属と肝硬変のバイオマーカーとの間のスピアマン相関係数を算出した。Pediococcus、Rothia、Allobaculumはアラニンアミノトランスフェラーゼと正の相関、Bilophilaは血清アルブミンと負の相関、Odoribacterはアンモニアと正の相関、SuccinispiraはTBIL、プロトロンビン時間（PT）、CTPと正の相関、血清アルブミンと負の相関があった； Subdoligranulumはアラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼと負の相関、AkkermansiaはMELDと負の相関、Clostridiumはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼと正の相関、DoreaとRoseburiaは血清アルブミンと正の相関、LactobacillusはPTと負の相関（図7A）。特に、Barnesiellaは補正後のPT（p＝0.0092）、MELD（p＝0.035）、INR（p＝0.018）の成績と負の相関があり、Bacteroidesは補正後のCTPスコア（p＝0.0046）と負の相関が、血清アルブミン値（p＝0.046）と正の相関が、Bifidobacteriumは血清クレアチニン値（p＝0.044）と正の相関が見られた（図7B）。特定の属と代謝経路の間のスピアマン相関係数は、図7Cに示した。
図7
図7. 相関関係の解析。(A）バイオマーカーと腸内細菌叢の相関係数を属レベルで示した。(B) 異なるバイオマーカーと有意に相関する主要な属。(C）バイオマーカーと代謝の特徴との間の相関係数。スピアマン相関係数を算出し、図中にラベルを付けた。AST、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ALT、アラニンアミノトランスフェラーゼ、ALB、血清アルブミン、TBIL、総ビリルビン、PT、プロトロンビン時間、INR、国際標準化比、CRE、クレアチニン、CTP、Child-Turcotte-Pugh、MELD、末期肝疾患モデル．スピアマン相関係数を算出し、図中にラベル表示した。統計的に有意なものを示した： *p < 0.05, **p < 0.01.
考察
本研究により、MHEの治療において、プロバイオティクス、リファキシミン、ラクツロースが安全かつ有効であり、リバース率はそれぞれ58.8％（20/34）、45.5％（5/11）、57.1％（4/7）であることが明らかになった。また、カイ二乗検定により、3剤間で有効性に有意差はないことが示された。これまでの研究で、肝硬変患者のHEの二次予防にはラクツロースとプロバイオティクスが有効であり、プロバイオティクスはラクツロースに対して非劣性である可能性があることが示されている（Agrawalら、2012；Pratap Mouliら、2015）。また、別の研究では、リファキシミンとラクチュロースがMHEを逆転させる上で同等の効果を持つことが示されました（Sidhu et al.、2016）。これらの研究により、プロバイオティクス、リファキシミン、ラクチュロースは、MHEの治療において安全かつ有効であることが明らかになりました。
また、プロバイオティクスとリファキシミンが血清TBIL、血清アルブミン、INRなどの肝機能をある程度改善することがわかり、これまでの知見と裏付けされました。Dhimanら（2014）は、CTPとMELDがプロバイオティクス群でベースラインから6ヶ月まで有意に改善されたことを明らかにしました。また、リファキシミン療法後に血清ビリルビンの有意な改善がみられました（Bajaj et al.、2013）。しかし、ラクチュロースの肝機能に対する有意な効果は認められませんでした。その理由として考えられるのは、主な役割が腸内pHを調節して酸性環境を維持し、大腸蠕動運動を刺激してカタルシス作用を発揮することです。一方、グルタミン酸分解酵素の活性を阻害し、アンモニア代謝を阻害してMHEの逆転を実現する（Dhiman, 2012）。興味深いことに、治療後の血中アンモニアに有意な差は見られませんでした。プロバイオティクスが血中アンモニアを減少させるという研究結果もありましたが（Lunia et al., 2014; Pratap Mouli et al., 2015）、他の報告では、治療後に血中アンモニア濃度に変化がない、あるいは量が増加していることもありました（Mittal et al., 2011; Bajaj et al., 2014a）。これらの結果から、アンモニア値はHE患者の治療の直接的な指針とはならないことが示された（Haj and Rockey, 2020）。
肝硬変患者は一般的に、Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Clostridiales XIVなどの有益な自生分類群の割合が減少した腸内細菌叢に変化が見られる。腸内細菌科、ブドウ球菌科、腸球菌科などの潜在的な病原性細菌の相対的な過剰増殖が見られ、その存在レベルは疾患の進行や内毒素血症と相関しています（Chenら、2011；Bajajら、2012；Bhatら、2016）。一方、ディスバイオシスは、特にHE患者において、肝機能の悪化とともに徐々に悪化する（Bajaj et al., 2014b）。このことは本研究でも確認され、PCoAの結果、α多様性に有意な変化はないものの、腸内細菌異常症の存在が示唆されました。また、本研究では、腸内細菌叢におけるBacteroidesとBarnesiellaの相対存在レベルがMHEでは低く、Lactobacillusは高いレベルであることが示されました。これらの知見は、腸内細菌叢に関する先行研究において、診断方法にかかわらず、便および唾液サンプル中の乳酸菌の相対存在レベルがMHEで高かったことを裏付けるものでした（Bajaj et al., 2019）。MHEの発症率は、バクテロイデス優勢群が非優勢群より有意に低く（Haraguchi et al., 2019）、その後の1年間の追跡調査におけるHE再発および全生存とそれぞれ関連していた（Sung et al., 2019）。本研究では、MHE患者におけるBacteroidesの相対存在量が、治療後に上昇傾向を示すことも明らかにした。このことから、バクテロイデスはMHEの発症や転帰に関係している可能性が示唆されました。別の研究では、Barnesiellaは良好な認知機能と正の相関があり、炭水化物発酵、病原性細菌の競合的阻害、免疫調節に関与することが報告されています（Meyer et al.、2022）。これらのパラメータは、MHEにおける潜在的な促進因子である可能性がある。
腸内細菌叢は、治療後に異なる変化を示した。プロバイオティクス、リファキシミン、ラクチュロースによる治療後の腸内細菌叢のα多様性に有意差はなく、α多様性はMHEの病因と治療における重要な因子ではない可能性が示唆された。しかし、重み付けされていないUniFracマトリックスに基づくPCoAでは、すべての治療法がdysbiosisを改善し、微生物相を健康な人のそれに近づけることが示された。プロバイオティクスは、MHE患者において、Barnesiella、Roseburia、Bacteroidesの存在量を改善し、Lactobacillusの存在量を減少させることができる。前述のように、Barnesiellaは良好な認知力と正の相関があった。Songら（2022）は、Roseburia hominisがプロピオン酸や酪酸を産生することにより、神経炎症を緩和することを発見した。また、バクテロイデス科は肝硬変マウスの全身および神経炎症と負の相関があり、バクテロイデス種は胆管結紮誘発胆汁性肝疾患関連の認知機能障害に重要な役割を果たすことが報告されています（Kang et al., 2016; Yang et al., 2022）。このことは、プロバイオティクスによる認知機能の改善を一部説明できるかもしれません。Rif群は全体的に低下傾向を示しました。腸内細菌叢の変化は、MHEにおけるリファキシミン治療を評価した過去の3つの研究で分析されました。最初の2つの研究では、リファキシミンは細菌の豊かさを減少させたが、特定の種への影響は観察されなかった；さらに、炎症の循環マーカーはリファキシミン治療によって変化しなかった（Kimerら、2018； Schulzら、2019）。これは、リファキシミンの広範囲な殺菌効果によるものと考えられる。しかし、第3の研究では、Veillonellaceaeが緩やかに減少し、Eubacteriaceaeが増加した以外に、有意な微生物変化は見られなかった。リファキシミン投与により、相関ネットワーク上のネットワーク接続性とクラスタリングが有意に減少した（Bajaj et al.、2013）。Rifaximin治療は、全生存期間の延長と、自然細菌性腹膜炎、静脈瘤出血、再発HEのリスク低減と有意に関連していた（Kang et al.、2017）。これは、介入サイクル、投与量、および／または統計・分析方法が異なるためと考えられる。AkkermansiaとAnaerosinusの量はLac群で高く、PediococcusとPseudomonasの量は低くなっていました。Akkermansiaは、腸管バリア保護、抗炎症、免疫調節の機能を有する（Zhang et al.、2019）。Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteriaにおいて、ラクチュロース反応者と非反応者の間に有意差が認められ（Wang et al., 2019）、ラクチュロースの有効性に関連している可能性がある。
PICRUSt2を用いて腸内細菌叢が有する代謝経路を予測したところ、プロバイオティクス処理後に糖代謝と芳香族化合物の分解が減少した。芳香族アミノ酸と分岐鎖アミノ酸は、同じトランスポーターを介して血液脳関門を通過するために競合し、HEで観察される神経抑圧につながります（Gluudら、2017）。プロバイオティクスがMHEを回復させる別の潜在的なメカニズムは、芳香族アミノ酸の蓄積を変化させることによって達成されるかもしれない。ラクチュロース処理後、アルギニンおよびオルニチンの分解に関連するいくつかの代謝経路がダウンレギュレートされた。これは、オルニチンのレベルがラクチュロース群で高い可能性があることを意味し、一方、オルニチンはアンモニア代謝を高め、HEの治療に使用された（Goh et al., 2018）。
MHEに関与する主要な分類群を特定するため、MHE患者と対照個体の間で属レベルでの相対的な存在量を比較しました。その結果、Selenomonas、Anaerosinus、Lactobacillus、Pediococcus、Prevotella、Ruminococcus、Barnesiella、GemmigerがMHEかどうかを区別するための重要な分類群であることがわかりました。異なる分類群の組み合わせでMHEを予測し（曲線下面積0.867）、MHEの補助診断に活用することが期待される。
反応性患者と非反応性患者の比較では、反応性患者ではMELDとINRが低く、特にPro群では低いことがわかった。偶然にも、BarnesiellaはMELDおよびINRと負の相関があることがわかった。このことは、MHEにおけるBarnesiellaの役割を研究するための新しいアイデアを提供する可能性がある。
本研究にはいくつかの限界があった。まず、サンプルサイズは、特にRifとLacのグループにおいては、大きくない。これは、結論の信頼性に影響を与える可能性がある。我々は統計的手法を用いて、サンプルサイズが小さいことの影響を最小限に抑えた。可能であれば、次回の研究では登録患者数を増やす予定です。また、患者さんの追跡調査は短期間であり、長期間の追跡調査は行っておらず、プラセボ群も含まれていません。さらに、検体は便のみで、粘膜やその他の検体は採取していない。最後に、メタボローム解析は実施されておらず、根本的なメカニズムをさらに追求することはできなかった。
結論として、プロバイオティクス、リファキシミン、ラクツロースは、MHEの治療において安全かつ有効であった。肝機能および腸内細菌異常症は、今回の患者においてある程度改善された。治療後、分類学的および代謝学的パラメータに有意な変化がみられた。これらの知見は、病態研究の貴重な参考となるだけでなく、MHEの治療戦略の改善に役立つ可能性がある。
データの利用可能性に関する声明
本研究で紹介したデータセットは、オンラインリポジトリで見ることができます。リポジトリ名とアクセッション番号は以下の通りです：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA898090.
倫理に関する声明
ヒトが参加する研究は、安徽医科大学第一附属病院倫理委員会（No.PJP2020-15-24）の審査・承認を得た。患者/参加者は、この研究に参加するために書面によるインフォームドコンセントを提供した。
著者の貢献
XCとJGは、本試験を構想し設計した。M-WWとW-JMがデータを収集した。M-WWとJGは、バイオインフォマティクスと統計解析を行った。X-HMとYWは原稿を作成した。Y-FXとW-JMは原稿を編集した。すべての著者が最終原稿を読み、承認した。
資金提供
この研究は、中国国家自然科学基金（82073947）の支援を受けています。
利益相反
著者らは、本研究が、潜在的な利益相反と解釈されうる商業的または金銭的関係がない状態で行われたことを宣言する。
出版社からのコメント
本記事で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。
補足資料
本論文の補足資料は、オンラインにてご覧いただけます：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1091167/full#supplementary-material。
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キーワード：プロバイオティクス、リファキシミン、ラクチュロース、最小肝性脳症、腸内細菌叢
引用元：日本経済新聞 Wang M-W, Ma W-J, Wang Y, Ma X-H, Xue Y-F, Guan J and Chen X (2023) 最小肝性脳症の治療におけるプロバイオティクス、リファキシミン、ラクツロースの効果比較と腸内細菌叢. Front. Microbiol. 14:1091167. doi: 10.3389/fmicb.2023.1091167.
Received（受理）された： 06 November 2022; Accepted： 2023 年 3 月 13 日；
発行：2023年3月24日
編集者
ジョバンニ・タランティーノ（ナポリ・フェデリコ2世大学、イタリア
レビューした人
Liang Tao, Westlake University, 中国
ブカレスト大学（ルーマニア）Gratiela Gradisteanu Pircalabioru氏
Copyright © 2023 Wang, Ma, Wang, Ma, Xue, Guan and Chen. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを記載し、本誌の原著を引用することを条件に、学術的に認められた慣習に従って、他のフォーラムでの使用、配布、複製が許可されます。本規約を遵守しない使用、配布、複製は許可されません。
*Correspondence： Jing Guan, guanjing@mail.ustc.edu.cn; Xi Chen, ayfychenxi@163.com
(注) †これらの著者は、本作品に等しく貢献している。
‡ORCID：Ming-WeiWang、orcid.org/0000-0002-0128-9294; Wei-Juan Ma、orcid.org/0000-0002-0334-8489; Yan Wang, orcid.org/0000-0002-3517-6554; Xiao-Han Ma, orcid. org/0000-0002-0240-8523; Yu-Feng Xue, orcid.org/0000-0003-3110-8172; Jing Guan, orcid.org/0000-0002-9124-702X; Xi Chen, orcid.org/0000-0002-2720-8843
免責事項：本記事で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または支持されるものではありません。
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