ブロイラー鶏の免疫機能、腸内細菌叢および代謝産物に及ぼす飼育システムおよび抗生物質処理の影響
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公開日：2022年12月16日
ブロイラー鶏の免疫機能、腸内細菌叢および代謝産物に及ぼす飼育システムおよび抗生物質処理の影響
https://jasbsci.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40104-022-00788-y
Bochen Song, Peng Li, ...Yuming Guo 著者紹介
Journal of Animal Science and Biotechnology 13巻 記事番号：144 (2022) Cite this article
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指標詳細
概要
背景
中国では、スペース利用率の高いケージシステムが徐々にグランドリターシステムに取って代わってきているが、ケージ内の鶏の疾病発生率は高くなっている。地中貯蔵庫のブロイラーは、成長過程でより多くの環境微生物の刺激を受け、強い免疫機能と状態を示すと考えられるが、どの微生物とその代謝物が免疫調節の役割を果たしているかについての知識はまだ限られている。本研究では、ケージ飼育とグランドリターペンで飼育されたブロイラーの免疫機能、腸内細菌叢、代謝産物の違いや相関、腸内細菌叢の重要性について検討することを目的とした。
実験方法
実験は、飼育システム（ケージまたはグランドリターペン）および抗生物質処理（飲料水への広域抗生物質の添加または無添加）を因子とする2×2の要因配置で行った。
結果
その結果、ケージ群に比べ、グランドリターブロイラーでは、非特異的免疫機能（血中マクロファージ％、NO）、液性免疫機能（血中IgG、回腸のLPS刺激指数）、細胞性免疫機能（血中T％、Tc％、ConA刺激指数、サイトカイン）が強くなることが明らかとなった。抗生物質（ABX）投与は、非特異的免疫機能（血中マクロファージ率およびNO、回腸のiNOSおよびMucin2 mRNA発現）、液性免疫機能（血中IgGおよび回腸のsIgA）および細胞性免疫機能（血中T％およびサイトカイン、ThおよびTc比、回腸のTLRおよびサイトカイン mRNA発現）を有意に減少させた。さらに、グランドリターブロイラーでは、回腸の微生物相のα多様性が高いことがわかった。また，地上飼育ブロイラーでは，Staphylococcus，Jeotgalicoccus，JeotgalibacaおよびPediococcusの相対存在量が高かった．ABX処理により回腸内細菌叢のα多様性は有意に減少し、ChloroplastとMitochondriaが減少した。また，ブロイラー腸管内の酢酸，イソ酪酸，キヌレン酸およびアロリトコール酸の濃度は高かった．Spearman相関分析により、Jeotgalibaca、Pediococcus、酢酸、kynurenic acid、allolithocholic acidは免疫機能に関連していることが示された。
結論
グランドリターペンのブロイラーの回腸では、潜在的な病原体、リター繁殖細菌、短鎖脂肪酸、キヌレニン、アロリトコール酸、トリプトファン代謝物が多く、これが免疫機能や状態が強くなる理由かもしれない。
はじめに
現代のブロイラーは、急速な成長を目的とした品種改良の産物である。選抜の過程で、ブロイラーの免疫機能は成長性能に譲歩し、一般にブロイラーの耐病性は低下している[1]。従来、ブロイラーは地鶏舎やフリーレイジ方式で飼育されてきた。現在、中国では、多層ケージ方式が徐々にトレンドになっている。ケージシステムは鶏と糞尿を分離するため、鶏がリターや糞尿の微生物に接触する機会を減らすことができる。適切な微生物刺激がない場合、鶏の免疫系の発達が遅くなり、免疫機能が低下する可能性がある[2]。ケージで飼育した鶏の脚部異常、足部異常、盲腸内サルモネラ菌の定着率、死亡率が、グランドリターペンで飼育した鶏より有意に高いことが、生産・科学研究においてしばしば発見された[3,4,5]。その内部機構はまだ明らかになっておらず、今後の研究・検討に値するが。
多くの研究では、異なる飼育システムで育てられた動物の免疫機能には一定の違いがあると考えられています。ケージ飼いの産卵鶏と比較して、グランドリター群の産卵鶏の血清中のSRBC抗体価は高いことが報告されている[6]。ケージ飼育の鶏と比較して、グランドリター飼育のブロイラーは回腸のIL-1βおよびIFN-γ mRNAのレベルが高い[7]。室内飼育の鶏と比較して、放し飼い及び半放し飼いの鶏は、末梢血中のニューカッスル病ウイルス及び感染性気管支炎ウイルスに対する力価が高い[8]。しかし、いくつかの研究では、ケージ飼いと地鶏の産卵鶏の間で末梢血白血球数に有意な差はないことも分かっています[9]。ケージの鶏と比較すると、グランドリター群のブロイラーの末梢血中の好酸球、リンパ球、好塩基球、単球の数は少なく、貪食指数や貪食活性も低いことが分かっています[10]。一般に、より多くの微生物が存在する屋外環境で育った動物は、免疫機能が強くなる[11,12,13]。アレルギーのような過剰な炎症を起こすことなく、生育環境に適した微生物が多いほど、動物の免疫系が早く発達し、免疫機能や病気への抵抗力が強くなり、病気にかかりにくくなると考えられます[14, 15]。
腸内には多くの微生物が生息しています。これらの微生物を総称して腸内細菌叢と呼びますが、ほとんどの微生物は宿主と関係があります[16]。近年、腸内細菌叢が注目されており、腸の構造や機能に影響を与えたり、宿主の腸内の難消化性食物残渣を発酵させたり、免疫系の発達を促したりすることが明らかになっています[17]。適切な微生物コロニー形成は、免疫系が十分に機能するために重要です。研究により、微生物のコロニー形成は、腸におけるT細胞のホメオスタシスの誘導に非常に重要であることが報告されています[18, 19]。さらに、腸内細菌叢は腸管粘膜抗体の産生に影響を与える可能性があります[20]。微生物叢と免疫系の相互作用は、免疫の発達と免疫反応における微生物への曝露の重要性をある程度説明できる。腸内に有益な微生物が早期に存在することで、腸の健康状態や健全性が向上し、免疫系の発達を助けることで病原体に対する抵抗力が促進されることが報告されています[21]。
ABXを投与したマウスでは、腸内細菌叢が徐々に枯渇し、免疫系に悪影響を及ぼすことも研究により明らかになっています。マウスのMLNとPPでは、広域抗生物質による治療で腸内細菌叢が枯渇すると、Treg細胞の割合が減少することが分かっています[22]。ABX投与マウスの腸内細菌数が著しく減少すると、腸内細菌の刺激がないため、腸、大腸、腸間膜リンパ節、脾臓のTc（細胞障害性T）細胞、Treg細胞、DC細胞の割合が減少し、Th（ヘルパーT）細胞17、IL-22、IL-10の生産するサイトカインIFN-γとILも減少する[23]。しかし、抗生物質の免疫系への影響が主に微生物叢や代謝産物の変化によるものか、またその関連メカニズムは未だ不明である。
生育環境が動物の腸内細菌叢の組成を形成する可能性がある。親世代が同じマウスでも、腸内細菌叢が異なる場合がある。これは、生活環境や食餌療法が異なるためと考えられ、環境と食餌処理が腸内細菌叢を決定する主な要因である可能性が示唆された[24]。これまでの報告では、マウスなどの動物の飼育環境が腸内細菌叢に大きな変化をもたらすことが示されており、腸内細菌叢の形成における生活環境の重要性がさらに確認された[25,26,27]。
いくつかの研究では、飼育システムが鶏やアヒルなどの家禽の健康状態や肉質に大きな影響を与えることが分かっている[28,29]。しかし、飼育システムがブロイラーの免疫機能や腸内細菌叢に及ぼす影響については、まだ研究が不十分である。家禽の腸内細菌叢に及ぼす飼育システムの影響に関する研究もわずかしかない。より多くの微生物が存在する環境で生育する家禽の腸内細菌叢は、α多様性が高く、その多くが草や土壌に由来する可能性があることが分かっている[30,31,32]。
一方、現在行われている飼育方式の比較研究では、屋外と屋内の飼育方式を比較するものがほとんどである。しかし、屋内と屋外の飼育システムは温度、湿度、光量が異なり、動物の免疫機能や腸内細菌叢に影響を与える要因はより複雑である。このことも、この種の研究の結果に一貫性がない理由かもしれない。同じ家畜舎での研究であれば、環境微生物以外のこれらの干渉要因をほとんど排除することができる。そこで、本研究では、二重ケージおよびグランドリター飼育方式の同一鶏舎内で、広域抗生物質の飲料水への添加がブロイラーの免疫機能と腸内細菌叢に及ぼす影響について検討した。ブロイラーの免疫機能に関連する腸内細菌叢とその代謝物を調べ、グランドリター飼育方式のブロイラーの免疫機能の内部機構がケージ飼育のブロイラーより強いかどうかを判断した。本研究は、腸内細菌叢をターゲットとした栄養学的手段による家禽の免疫機能調節の理論的根拠を提供するものである。
材料および方法
実験動物および飼料
合計444羽のArbor Acresブロイラー（生後1日目）を、2×2因子配置を用いて4群に無作為に割り付けた。各処理群には6つの複製があり、各複製ケージには10羽の鶏、そして地上の砂の上には27羽の鶏が繰り返された。4つのグループは、ケージコントロールグループ（CC）、ケージ抗生物質グループ（CK）、グラウンドリターコントロールグループ（GC）およびグラウンドリター抗生物質グループ（GK）であった。飼料処方を表S1（Additional file 1）に示す。全米研究会議（NRC 1994）[33]の勧告に従って、薬剤を含まないトウモロコシ-大豆粕飼料をブロイラーの栄養要求量を満たすかそれ以上になるように配合した。実験期間中、標準的な管理手順を用いた。鶏は清潔な水と飼料に自由にアクセスできる。
飼育システム
実験期間中、標準的な管理手順を用いた。鶏ケージは長さ 100 cm、幅 70 cm、高さ 40 cm で、飼養密度は 14.3 羽/m2 であった。地鶏用鶏舎は長さ310cm×幅60cm×高さ75cmで、飼養密度は14.4羽/m2であった。産業界における地鶏飼育の実態に合わせ、敷料としてもみ殻を使用し、実験終了までもみ殻を8cmの高さに積み重ねた。二重ケージとグランドリターペンは同じ鶏舎内に設置し、光、温度、湿度も同じレベルにした。指標を決定するために、d10とd28にサンプルを採取し、試験期間は28日とした。
腸内細菌叢の減少モデルの確立
マウスの腸内細菌叢減少モデルの確立経験[23]を参考に、飲料水を用いて複合広域抗生物質（ネオマイシン、1g/L；アンピシリン、1g/L；バンコマイシン、0.5g/L；メトロニダゾール、1g/L）を添加したものを使用する。腸内細菌叢減少のモデルを確立するために、飼料摂取量の2倍で水消費量を計算し、毎日の水消費量に応じて、同じ濃度の化合物広域抗生物質飲料水をバケツに変調させる。ブランクコントロール群には、同量の通常飲料水を添加。
サンプル採取および指標測定
生育成績
d10およびd28に各ケージおよびグラウンドリターペンで鳥の飼料消費量および体重を測定した。飼料摂取量と体重のデータから、日平均増体量（ADG）、日平均飼料摂取量（ADFI）および飼料転換率（FCR）を算出した。飼料の無駄と鳥の死亡を毎日記録し、飼料消費量とFCRは、飼料の無駄と残羽を調整した。
末梢血単核細胞の分離
末梢血単核細胞（PBMC）の単離は、製造者のガイドラインに従ってFicoll-Paque Plusを用いた密度勾配遠心分離を用いて、以前に記載したように行った[34]。簡単に言えば、6羽の健康な鶏（複製あたり1羽）を、d10および28に各処理群から無作為に選択した。ヘパリン処理した血液サンプルを翼状静脈から採取し、次に滅菌カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス平衡塩溶液（CMF-HBSS；H6648、Sigma-Aldrich、Saint Louis, MO, USA）で1：1まで希釈した。希釈したサンプルを氷上に置き、等量のFicollリンパ球分離培地（LDS1088C, Tianjin HaoYang Biological Manufacture Co, Ltd., Tianjin, China）を含むチューブに慎重に重ねて、Ficollの上に明確な層を形成させた。400×g、室温で30分間遠心分離した後、血漿とリンパ球分離培地の界面にある白い凝集体を、滅菌済みトランスファーピペットを用いて清浄なチューブに移した。リンパ球懸濁液を3回、RPMI1640（C11875500BT、Invitrogen Corp, Grand Island, NY, USA）不完全培養液で3回洗浄し、5％（vol/vol）子牛胎児血清、0.5％ペニシリン（最終濃度、100 U/mL）、0.5％ストレプトマイシン（最終濃度）を補充した2 mLのRPMI1640完全培養液に再懸濁した。 5％ストレプトマイシン（最終濃度、100μg/mL）、および1％N-（2-ヒドロキシエチル）-ピペラジン-N-2-エタンスルホン酸（HEPES、最終濃度、24mmol/L；Amresco 0511、Amresco Inc．Cleveland, OH, USA）。トリパンブルー色素排除法と顕微鏡（DM6000B, Leica Microsystems, Wetzla, Germany）を用いて、生細胞を検出した。細胞懸濁液は、その後の解析のために、RPMI1640培地で最終濃度1×107cells/mLに希釈された。
回腸前葉リンパ球（LPL）の分離
カルシウムマグネシウムフェノールレッド（H6648, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA）を含まないD-Hanks溶液に5％FBS（10099141C, Gibco, Grand Island, NY, USA）、1 mmol/L DTT（ BL552A, Biosharp, Hefei, Anhui, China）および10 mmol/L HEPES（15630080, Gibco, Grand Island, NY, USA）を添加し分離液を作製した。消化液は、5% FBS (10099141C, Gibco, Grand Island, NY, USA), 0.25% pancreatin (15090046, Gibco, Grand Island, NY, USA), 0.1% collagenase I (17100, Gibco, Grand Island, NY, USA) and 100 U/mL DNAse I (EN0521, Thermo Scientific, NY, USA) を添加して37℃で5分間インキュベーションしたものを調製した。
洗浄のため、回腸前部（卵巣の1cm後）を1g切り出した。すべてのサンプルは同じ重量であった。腸管を腸間膜側に沿って縦に切断した。小腸は粘膜が外側に向くように回転させ、その後、ハンクスでチャイムが完全に洗い流されるまで軽く洗い、横方向に約0.5 cmの腸管組織片に切断した。分離は、50mL遠心管に分離液5mLを加え、恒温振とう箱に入れ、37℃（250r/min）で15分間振とうし、30秒間ボルテックスした後、200メッシュのセルシーブでろ過し、腸組織片を50mL遠心管に採取した。腸管組織片を刻むために、シャーレに移し、眼科用ハサミで100回泥状に切断した。次に、50mL遠心管に消化液5mLを加え、恒温式振とう箱に入れ、37℃で30〜45分間振とう（250r/min）した。その後、30秒間ボルテックスし、腸管組織片を300メッシュ（48μm）のセルシーブでろ過し、ろ液を滅菌7mL遠心管に集め、4℃（400×gまたは3000r/min）10分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを2 mLのRPMI 1640（またはD-Hank's、洗浄）に再懸濁した。その後、サンプルを4℃で10分間遠心分離（400×gまたは3000r/min）し、上清を廃棄し、ペレットを2mLのRPMI1640に再懸濁した。臓器組織リンパ球分離液を示差遠心分離（2500 r/min）で抽出し、繰り返し洗浄し、再懸濁し、最後に完全なRPMI 1640で培養した。臓器リンパ球抽出キットの方法に従い、密度勾配遠心にFicoll-Paque Plus (LDS1088C, Tianjin HaoYang Biological Manufacture Co., Ltd., Tianjin, China) を使用し、その後の方法は末梢血リンパ球分離と同じであった。
末梢血及び回腸単核球の増殖性
3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) assayを用いて、末梢血と回腸リンパ球の増殖反応性を調べた。簡単に述べると、96ウェルマイクロタイタープレート（Costar 3599, Corning Inc, NY, USA）に、90μg／mLのコンカナバリンA（Con A; C2613, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA）または50μg／mLのリポポリサッカライド（L3129, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA）の非存在下でPBMC懸濁液100μLおよびRPMI1640 100μLを添加した。培養は3連で行った。5％CO2インキュベーター（MCO-18AIC CO2インキュベーター，三洋電機バイオメディカル株式会社，東京，日本）内で39℃，68時間培養後，MTTを最終濃度5 mg/mLで各ウェルに添加した．さらに4時間培養した後、0.04 mol/L HCl溶液に溶解した10%ドデシル硫酸ナトリウム100 μLを各ウェルに加え、細胞を溶解してMTT結晶を可溶化させた。最後に、自動ELISAリーダー（model 550 Microplate Reader, Bio-Rad Pacific Ltd., Hongkong, China）を用いて、570nmにおける各サンプルの吸光度を測定した。各サンプルの刺激指数（SI）は、以下の式に基づいて算出した。
SI=(ミトジェン刺激細胞の吸光度)/(ミトジェン無添加試薬の吸光度)
末梢血中および回腸中の単核リンパ球の貪食能の測定
末梢血および回腸単核リンパ球の貪食活性レベルは、neutral red assay法により測定した。すなわち、末梢血PBMCを採取し、RPMI1640培地で2×106／mLになるように細胞数を調整した。その後、100μLのサンプルを96ウェル細胞培養プレートで2時間培養し（3ウェル複製）、上清を捨て、0.1％ニュートラルレッド溶液（N299163、上海アラジン生化学技術有限公司、中国・上海）を200μL/ウェル加え、さらに2時間培養し、上清を捨て、残ったニュートラルレッドはPBSで洗浄した（3回）。細胞溶解液を200μL/well（エタノール：酢酸＝1：1）で添加し、4 ℃、暗所で12時間保持し、550 nmでOD値を測定した。
フローサイトメトリーによる末梢血及び回腸PBMC中のリンパ球サブセットの決定
先に述べたように[35, 36]、フローサイトメトリーを用いて、CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 、KUL01+細胞のパーセンテージを分析した。すなわち、マウス抗鶏CD45-FITC（8270-02、Southern Biotech、Birmingham、AL、USA）、マウス抗鶏CD3-Alexa Fluor® 700（8200-27、Southern Biotech、Birmingham、AL、USA）、マウス抗鶏CD4-APC（8210-11, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA）、Mouse anti-chicken CD8α-Pacific Blue™ （8220-26, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA）、Mouse anti-chicken monocyte/macrophage-PE（8420-09, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA）が使用された。1.0mLエッペンドルフチューブに100μLのPBMC（2×106個）を加え、25μLの希釈一次モノクローナル抗体（1：100希釈）と陰性アイソタイプコントロールIgG（マウスIgG1κ）-SPRD、マウスIgG1κ-FITC、マウスIgG1κ-R-PE）で染色を試みた。室温で45分間インキュベートした後、細胞を冷PBSで2回洗浄し、1800×gで30分間遠心分離して未結合の一次抗体を除去した。PBSで希釈したヘモリシン溶液（1：25）を各チューブに合計300μL添加した。最後に、細胞を2回洗浄し、最終容量は500μLとした。中国中医薬科学院西院病院において、コールターXL（Beckman Coulter, Inc.、Pasadena, California, USA）を用いて5色フローサイトメトリー分析を実施した。そして、PBMCとLPLにおけるCD3+ T、CD4+ T、CD8+ T、単球／マクロファージ細胞の割合を算出した。
血清NO、リゾチーム活性、サイトカイン、免疫グロブリンおよび粘膜sIgA含量
市販のELISAキット(Genorise Scientific Inc., Glen Mills, PA, USA)を用いて、IL-1β、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γの血清レベルを測定した。説明書に従って、鶏IgG ELISAキット（E30-104、Bethyl Laboratories Inc.、Montgomery、TX、USA）を、血清中のIgGのレベルを決定するために使用した。血清中のNOおよびリゾチーム活性は、市販のELISAキット（A013-2-1；A050-1-1、Nanjing Jiancheng Institute of Bioengineering、Nanjing、China）を用いて測定した。回腸粘膜のsIgAは市販のELISAキット（YM-SQ2632，上海遠夢生物工学有限公司，上海，中国）を用いて測定した．
脾臓および回腸の遺伝子発現
d10および28に、脾臓および回腸の分子試料を液体窒素で急速凍結し、-80 ℃の低温フリーザーに移して、脾臓および回腸の免疫機能関連遺伝子の発現レベルを測定した。回腸の総RNAの抽出にはTRIzol試薬を用い、RNAの品質と濃度の測定にはNanoDrop超微量計算タンパク質分析装置を使用した。逆転写の段階で使用した試薬キットは、タカラのPrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)であった。逆転写後に得られたcDNAは、ABI7500リアルタイム蛍光定量PCR装置で、表S2に示すプライマーを用いてリアルタイム蛍光定量PCRを行った（Additional file 2）。蛍光定量キットはタカラのSYBR® Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus）を用い、GAPDHを内部参照とし、結果は2（-ΔΔCT）で表した。
糞便微生物数
無菌条件下で、10日目および28日目のブロイラー鶏から盲腸検体を採取し、液体窒素で急速凍結後、-20℃で保存し、糞便細菌数を測定した。具体的な方法は、盲腸を氷上（約4℃）に置いて解凍し、クリーンベンチ上の天秤で内容物0.3 gを計量し、5 mL滅菌遠沈管に入れた。次に、10倍希釈のため2.7mLの滅菌生理食塩水を加え、マイクロシェーカーで振とう混合し、10分間静置した。その後、上清0.3 mLを滅菌遠沈管に移し、滅菌生理食塩水を用いて102, 103, 104, 105, 106, 107, 108の勾配希釈を実施した。各希釈管の溶液100μLを対応する選択培地上に接種し、培地上で溶液が乾くまでプレートを広げた。対応する条件下で培養した後、30〜300コロニーを選択して菌数を測定した。このうち、好気性菌は栄養寒天培地（CM107、北京陸橋科技有限公司、中国北京市）で培養し、37℃の嫌気条件下で培養を行った。嫌気性菌は嫌気性寒天培地（CM1514, Beijing Luqiao Technology Co., Ltd., Beijing, China）を用い、培養条件は5% CO2、37℃、24時間後にプレートをカウントし、結果は糞便内容物1グラムあたりの菌数の対数（log10 CFU/g）で表わされた。
DNA抽出とハイスループットシークエンス
回腸消化物から、QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) を用いて、メーカーのプロトコルにしたがって細菌DNAを抽出した。DNA抽出液の濃度はNanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Scientific, MA, USA)で測定した。細菌16S rRNA遺伝子のV3およびV4領域は、以前に記載された方法に従って、バーコード付きプライマー対515F／806R（515F： 5′-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3′, 806R： 5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′ ）で増幅させた。増幅後、2％アガロースゲル上で実行したPCR産物は、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen、ドイツ）を用いて精製した。精製したアンプリコンを等モル量でプールし、そのペアエンドリードをIllumina HiSeq2500 PE250 platform (Illumina, San Diego, USA) で配列決定し、Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. Ltd. (中国、北京)で行った。
配列処理とバイオインフォマティクス解析
FLASHソフトウェア（v1.2.7）[38]を用いてペアエンドリードを結合し、Rawタグを生成した。QIIME (v1.7.0) 解析により高品質なクリーンタグを取得し[39]、UCHIMEアルゴリズムによりキメラ配列を除去し、有効なタグを取得した[40]。配列は UPARSE ソフトウェア (v7.0.1001) で解析し、類似度 97% で運用型分類単位 (OTU) にクラスタリングした[41]。各OTUはGreengenesデータベース[42]を用いてアノテーションを行った。希釈曲線とベン図は、R ソフトウェア（v2.15.3）を用いて作成した。微生物のα多様性の解析は、Pythonスクリプトを用いたQIIMEソフトウェアで行った[39]。β多様性は、主成分分析（PCA）により細菌群集構造の違いを評価し、R（v2.15.3）を用いてANOSIMにより分離の有意性を検定した。PICRUSt解析は、細菌群集の機能的ポテンシャルを予測するために使用した[43]。OTUはコピー数で正規化し、メタゲノム予測はさらにKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) にレベル2および3で分類した[44]。
回腸内容物短鎖脂肪酸
回腸チャイム（0.5 g）を10 mLプラスチック遠心管に秤量し、8 mLの脱イオン水を加え、超音波で30分間振とうした後、8000 r/min、4℃で10分間遠心分離を行った。上清を10倍に希釈し、0.22μmフィルターで濾過した。濾液25μlを採取し、ICS-3000高速イオンクロマトグラフ（Dionex, USA）を用いて、SCFAと乳酸を導電率で検出した。有機酸はAS11分析カラム（250 mm×4 mm）とAG11ガードカラムを用いてグラジエント条件で分離した。グラジエントは水酸化カリウムをキャリアとして、0〜5分、0.8〜1.5 mmol/L、5〜10分、1.5〜2.5 mmol/L、10〜15分、2.5 mmol/L、流量1.0 mL/min であった。
ノンターゲットメタボロームにおける回腸内容物
サンプルの検出およびデータ解析は、すべて天津羅和志源科技有限公司（中国・天津市）で行いました。回腸内容物中の代謝物の抽出工程は以下の通りである。(1) 回腸内容物100μLを採取し、抽出液（メタノール：アセトニトリル：水の容量比＝2：2：1、メタノールおよびアセトニトリルはともにクロマトグラフィーグレード、メルク社から購入）350μLを加え、内部標準物質のL-2-chlorophenylalanine（CAS#：103，616-89-3、≥98％；上海恒貝生物技術有限公司から購入）を20μL、ヴォルテックスで添加した後、攪拌した。Ltd.）を加え、ボルテックスで30秒間混合し、氷水浴条件下で10分間超音波処理を行った。(2) -20 ºC で 1 時間インキュベートした後、4 ºC で 13,000 r/min, 15 分間遠心分離を行った。(3) 上清 400 μL を 1.5 mL の遠沈管に注意深く取り出した後、真空濃縮機で抽出液を乾燥させた。(4) 乾燥した抽出液に再構成用の抽出液（アセトニトリルと水の等量）100 μLを加え、氷水浴中で30秒間のボルテックスと10分間の超音波処理を行った。(5) その後、12,000 r/min、4 ºCで15分間遠心分離した。 (6) 最後に上清60 μLを慎重に取り出して2 mL注入瓶に入れ、各試料10 μLを品質管理試料に混合し、60 μLは検査用に採った。
回腸内容物のメタボローム成分の分析には、Agilent 1290超高速液体クロマトグラフを使用し、ABSciexTripleTOF6600高分解能質量分析計シリーズを使用したシステムを使用しました。カラムはWaters（米国マサチューセッツ州ミルフォード）から購入したAcquity UPLC BEH Amideカラム（2.1mm×100mm、粒径1.7μm）を使用した。移動相条件は、25mmol/L酢酸アンモニウム・25mmol/Lアンモニア溶液（A）および100%アセトニトリル（B）とした。回腸内容物サンプルの分析におけるグラジエント項目は以下の通り。0-0.5 min, 5% A, 95% B; 0.5-7 min, 5%-35% A, 95%-65% B; 7-8 min, 35%-60% A, 65%-40% B; 8-9 min, 60% A, 40% B; 9-9.1 min, 60%-5% A, 40%-95% B; 9.1-12 min, 5% A, 95% B; 流速 0.5 mL/min, injection volume 2 μL であった。質量分析条件は以下の通りである。AB6600TripleTOF質量分析計は，ソフトウェア（AnalystTF1.7，ABSciex）の制御の下，IDA機能に基づいて一次および二次質量分析データを実行することができる。各データ取得サイクルにおいて、100分子以上の強いシグナルはスクリーンアウトされる。二次マススペクトルデータに対応するイオンを収集した。ボンバードエネルギー：35eV、50msごとに15回の二次スペクトルを取得。ESIイオン源のパラメータは以下のように設定した：霧化圧（GS1）。霧化圧力（GS1）：60Pa、補助圧力：60Pa、エアカーテン圧力：30Pa、温度：550℃、噴霧電圧：5mV。温度：550℃、スプレー電圧：5500 V（ポジティブイオンモード）または-4500 V（ネガティブイオンモード）。RSD < 30%のQCサンプルをスクリーニングし、良好なシステム安定性を確保するために、80%以上の特徴的な収率であることが要求されました。
データはまずMSconventerを用いてmzXML形式に変換し、XCMS（XCMS1.41.0）を用いてピークサーチ、ピークアライメント等のデータ処理を行った。その後，データ処理と物質同定のマッチングを行ったが，XCMSをベースにNuovo Zhiyuan社が開発したxcms4ddaとxcms4lipidを使用した。プログラムと自作ライブラリで処理し，minfrac を 0.5，カットオフを 0.8 に設定した．まず、二次データのスクリーニングを行った。スクリーニングの原理は、フォワードシグナルとリバースシグナルが1つずつ確認されれば、そのピークを保持することである。次に、1次データと2次データのピークをマッチングする。つまり、2次データに対応する1次データのピークを見つけ出し、mztolerance ± 25 ppmに従ってマッチングを行う。データ解析には、基本データ解析と個別データ解析の3つのパートがある。基本データ解析の目的は、メタボロームの定性・定量結果に対して一変量解析（UVA）および多変量解析（MVA）を行い、有意差のある代謝物をスクリーニングすることである。一変量統計解析では、データの前処理（まず元データの欠損値をシミュレートする；数値シミュレーション法は最小2分の1法で埋める、次に各サンプルの総イオン電流を用いて正規化する）、スチューデントのt検定、分散分析が行われます。多変量統計解析は、主成分分析（PCA）、部分最小二乗回帰分析（Partial Least Squares Discrimination Analysis, PLS-DA）、差分化合物スクリーニングと同定を行う。パーソナライズドデータ解析は、基礎データ解析に基づいて有意差のある代謝物に関する一連のバイオインフォマティクス解析で、異なる代謝物のKEGGアノテーション解析や代謝パスウェイ解析が含まれます。
統計解析
各データ群の統計解析には、SPSS 20.0 ソフトウェアを使用した。統計解析には GLM プロセスを使用した。相互作用が有意な場合は一元配置分散分析、処理間の差はダンカンの多重比較分析を用いた。P < 0.05 を有意とし，0.05 から 0.10 の P 値をトレンドとした．ブロイラー鶏の変数と微生物の相関分析の評価には、スピアマン順位相関係数を使用した。
結果
成長成績および免疫器官指数
図1および表S3（Additional file 3）に示すように、ケージ群と比較して、グランドリターブロイラーは、d 10における平均体重が高く、d 0-10における飼料摂取量および体重増加量が高く（P < 0.05）、d 0-10におけるFCRが低かった（P < 0.05）。しかし、d28ではその差は有意ではなかった。ABX処理は，対照群と比較して，ブロイラーのd 10の平均体重およびd 0～10の体重増加率を有意に増加させた（P＜0.05）．ケージ群と比較して，地上子ブロイラーはd 10の脾臓指数が高かった（P < 0.05）．ABX投与は対照群と比較して，d 10胸腺指数，d 10およびd 28滑液包指数を有意に低下させ（P＜0.05），d 10の脾臓指数を低下させる傾向があった（0.05 ＜ P＜0.1 ）．
図1
図1
ケージ飼いおよび地上砂床飼いのブロイラー鶏の成長成績，死亡率および免疫器官指数に及ぼすABX処理の影響。体重（A）、体重増加（B）、飼料摂取量（C）および飼料要求率（D）を加重平均して分析した。脾臓指数（E）、胸腺指数（F）、腓骨包指数（G）は、重み付けによって分析した。すべてのグラフは平均値で示され、標準偏差（SD）はひげで示される。主効果および交互作用効果は、一般線形モデル（GLM）手順を用いて分析し、主効果のP値は、各プロットの下に書き出した。相互作用効果が有意に異なる場合は、一元配置分散分析および多重比較を行った。Cage: ケージ対照群；Cage + ABX: ABX付きケージ群；Litter: グランドリター対照群；Litter + ABX: ABX付きグランドリター群
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末梢性非特異的免疫機能および体液性免疫機能
Fig.2に示すように、ケージブロイラーと比較して、d28で単核/マクロファージの割合が高くなった（P < 0.05）。対照群と比較して、ABX投与後のブロイラーでは、10日目の末梢血単核球／マクロファージの割合が低かった（P < 0.05）。対照群と比較して，d28のブロイラーにおける末梢血単核球の貪食機能は，ABX投与後に低下する傾向が認められた（0.05＜P＜0.1）．ケージ群と比較して、d10およびd28のグラウンドリターブロイラーの血清NOおよびリゾチーム濃度は高かった（P＜0.05）。通常群と比較して、ABX投与後のブロイラーのd 10およびd 28の血清リゾチーム濃度は低く（P < 0.05）、d 28のNO濃度は低かった（P < 0.05）。
Fig.
図2
ケージ飼いおよび地床飼いのブロイラー鶏の末梢性非特異的免疫機能および体液性免疫機能に対するABX処理の影響。末梢血リンパ球の単核球／マクロファージ（A）の頻度をフローサイトメトリーにより解析した。単球の貪食活性(B)はneutral red法により解析した。NO（C）、リゾチーム活性（D）、IgG（G）の濃度はELISAキットで分析した。末梢血リンパ球をリポポリサッカライド（LPS）で刺激し（F）、材料と方法の項に記載したように、刺激指数（SI）を算出した。脾臓におけるiNOS（E）、IgA（H）およびpIgR（I）のmRNAレベルは、RT-PCRにより解析した。すべてのグラフは平均値で示され、標準偏差（SD）はひげを経由して示される。主効果および交互作用効果は、一般線形モデル（GLM）手順を用いて分析し、主効果のP値は、各プロットの下に書き出した。相互作用効果が有意に異なる場合は、一元配置分散分析および多重比較を行った。棒グラフの小文字は有意差(P < 0.05)を示す。Cage: ケージ対照群; Cage + ABX: ABX付きケージ群; Litter: グランドリター対照群; Litter + ABX: ABX付きグランドリター群
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ケージ飼育ブロイラーに比べ，グランドリター飼育ブロイラーの末梢血B細胞増殖活性は，d28で増加する傾向があった（0.05＜P＜0.1）．ケージ群に比べ、地上飼育ブロイラーでは28日目の血清IgG濃度が高かった（P < 0.05）。通常群に比べ，ブロイラーではABX投与後28日目の血清IgG値が低下した（P < 0.05）．飼育システムと抗生物質投与は，ブロイラーの28日目の血清IgG値に相互作用を及ぼした（P＜0.05）．抗生物質投与はケージ飼育のブロイラーでIgGを低下させたが、地上飼育のブロイラーには有意な影響を与えなかった。
末梢性細胞性免疫機能
Fig. 3に示すように、ケージブロイラーと比較して、d10地上飼育ブロイラーでは末梢血T細胞およびTc細胞の割合が高かった（P < 0.05）。対照群と比較して、ABX処理後のd28のブロイラーでは、末梢血T細胞の割合が低かった（P < 0.05）。ケージブロイラーに比べ、28日目のグランドリターブロイラーは末梢血T細胞増殖活性が高かった（P < 0.05）。
図3
図3
ケージ飼いおよびグランドリター床飼いのブロイラー鶏の末梢細胞免疫機能に対するABX処理の影響。末梢血リンパ球のT（A）、Th（B）およびTc（C）の頻度をフローサイトメトリーにより解析した。末梢血リンパ球をコンカナバリンA（ConA）で刺激し（D）、材料と方法の項に記載したように刺激指数（SI）を計算した。血清中のIL-1β（E）、IL-4（F）、IL-10（G）、IL-17（H）、IFN-γ（I）のレベルをELISAキットで分析した。脾臓におけるTLR2 (J), TLR4 (K), NF-κB (L), IL-1β (M), IL-4 (N), IL-6 (O), IL-10 (P), IFN-γ (Q), TGF-β1(R) and TNF-α(S) mRNA levelをRT-PCRにより分析した。すべてのグラフは平均値で示され、標準偏差（SD）はひげを経由して示される。主効果および交互作用効果は、一般線形モデル（GLM）手順を用いて分析し、主効果のP値は、各プロットの下に書き出した。相互作用効果が有意に異なる場合は、一元配置分散分析および多重比較を行った。棒グラフの小文字は有意差(P < 0.05)を示す。Cage: ケージ対照群；Cage + ABX: ABX付きケージ群；Litter: グランドリター対照群；Litter + ABX: ABX付きグランドリター群
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ケージ群と比較して、グラウンドリター群のブロイラーのd10およびd28の血清IL-1β、IL-4およびIFN-γレベルは高く（P < 0.05）、d10の血清IL-17レベルは高かった（P < 0.05）。通常群と比較して，ABX投与後のd10およびd28のブロイラーの血清IL-4，IL-10，IL-17およびIFN-γレベルは低く（P＜0.05），d28のブロイラーの血清IL-1β，IL-10，IL-17およびIFN-γレベルは低く（P＜0.05）なっていた．
ケージブロイラーと比較して、d28地鶏ブロイラーは脾臓のIFN-γおよびIL-10のmRNAレベルが高く（P < 0.05）、IL-1βは増加する傾向があった（0.05 < P < 0.1）．対照群に比べ，ABX投与後28日目のブロイラーの脾臓におけるIFN-γおよびIL-10のmRNAレベルは低下し（P < 0.05），TGF-β1およびIgAは減少する傾向にあった（0.05 < P < 0.1）．
腸管非特異的免疫機能および体液性免疫機能
Fig.4に示すように、対照群に比べ、ABX投与後の28日目のブロイラーでは回腸単球の貪食能が低下した（P＜0.05）。ABX投与により、正常群と比較して、回腸のiNOSおよびMucin2 mRNAレベルが有意に低下した（P < 0.05）。
図4
図4
ケージ飼いおよび地上砂床飼いのブロイラー鶏の腸管非特異的免疫機能および体液性免疫機能に対するABX処理の影響。回腸リンパ球の単核球／マクロファージ（A）の頻度をフローサイトメトリーにより解析した。単球の貪食活性（B）は、neutral red法で分析した。空腸と回腸のiNOS (C), Mucin-2 (D), IgA (G), pIgR (H) のmRNAレベルは、RT-PCRによって解析された。回腸リンパ球をリポポリサッカライド（LPS）で刺激し（E）、材料と方法の項に記載したように、刺激指数（SI）を算出した。回腸粘膜のsIgAレベル（F）は、ELISAキットで分析した。すべてのグラフは平均値で示され、標準偏差（SD）はひげを経由して示される。主効果および交互作用効果は、一般線形モデル（GLM）手順を用いて分析し、主効果のP値は、各プロットの下に書き出した。相互作用効果が有意に異なる場合は、一元配置分散分析および多重比較を行った。Cage: ケージ対照群；Cage + ABX: ABX付きケージ群；Litter: グランドリター対照群；Litter + ABX: ABX付きグランドリター群
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ケージ飼育ブロイラーに比べ、d10地上リッターブロイラーの回腸B細胞増殖活性は高かった（P < 0.05）。ケージブロイラーとグランドリターブロイラーの回腸粘膜におけるsIgA量に有意差はなかった。対照群に比べ，ブロイラーの回腸粘膜のsIgA値はABX投与後に有意に減少した（P＜0.05）．ABX投与により，正常群と比較して回腸のIgAおよびpIgR mRNAレベルが有意に低下した（P < 0.05）。
腸管細胞性免疫機能
図5に示すように、ケージブロイラーと比較して、d 10グラウンドリターブロイラーは、回腸のTh細胞の割合が高く（P < 0.05）、d 28 Th細胞の割合は低く（P < 0.05）、d 28 T細胞の割合は高く（0.05 < P < 0.1） なっていることが示された。対照群と比較して、ABX処理後のブロイラーの回腸では、d 10のTc細胞の割合が低く（P < 0.05）、d 28のT細胞およびTh細胞の割合が低かった（P < 0.05）。
図5
図5
ケージ飼いおよび地上砂床飼いのブロイラー鶏の腸管細胞免疫機能に及ぼすABX処理の影響。回腸リンパ球のT（A）、Th（B）およびTc（C）の頻度は、フローサイトメトリーによって分析された。回腸リンパ球をコンカナバリンA（ConA）で刺激し（D）、刺激指数（SI）を材料と方法のセクションに記載されているように算出した。回腸のTLR2 (E), TLR4 (F), NF-κB (G), IL-1β (H), IL-4 (l), IL-6 (J), IL-10 (K), IFN-γ (L), TNF-α (M), TGF-β1 (N) のmRNAレベルをRT-PCRにより分析した。すべてのグラフは平均値で示され、標準偏差（SD）はひげを経由して示される。主効果および交互作用効果は、一般線形モデル（GLM）手順を用いて分析し、主効果のP値は、各プロットの下に書き出した。相互作用効果が有意に異なる場合は、一元配置分散分析および多重比較を行った。棒グラフの小文字は有意差(P < 0.05)を示す。Cage: ケージ対照群；Cage + ABX: ABX付きケージ群；Litter: グランドリター対照群；Litter + ABX: ABX付きグランドリター群
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ケージ群と比較して、グランドリター群のブロイラーは、28日目に回腸のIL-1β mRNAレベルが有意に上昇した（P < 0.05）。ABX投与により、通常群と比較して、回腸のTLR2、TLR4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-αおよびTGF-β1 mRNAレベルが有意に減少した（P＜0.05）。
回腸内細菌叢
βの多様性
図6AおよびBは、d10およびd28のCC、CK、GCおよびGKの4つのグループがよく分離できることを示しており、これは、d10およびd28のケージおよびグラウンドリターブロイラーの回腸微生物組成が有意に異なることを証明している。ABX処理は、回腸の微生物組成に大きな影響を与え、微生物組成のばらつきを増加させることができる。
図6
図6
ケージとグランドリターフロアペンを用いたブロイラー鶏の腸内細菌叢に及ぼすABX処理の影響。ブロイラー鶏の回腸内細菌叢のβ多様性（A, B）を非計量多次元尺度法（NMDS）により解析した。ブロイラーの回腸微生物相のα多様性はChao1 index (C)とShannon index (D)により解析した。T-testによるブロイラー鶏の回腸における微生物の差異(E-J)。盲腸の好気性菌（K）、嫌気性菌（L）の数を培養計数法で検出した。グラフはすべて平均値で示し、標準偏差（SD）はひげを経由して示した。主効果と交互作用は、一般線形モデル（GLM）手順を用いて分析し、主効果のP値は各プロットの下に書き出した。相互作用効果が有意に異なる場合は、一元配置分散分析および多重比較を行った。棒グラフの小文字は有意差(P < 0.05)を示す。CC/Cage：ケージコントロール群；CK/Cage + ABX：ケージ＋ABX群；GC/Litter：グランドリターコントロール群；GK/Litter + ABX：グランドリター＋ABX群
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アルファ多様性
Fig.6CおよびDに示すように、ケージブロイラーと比較して、グランドリターブロイラーは、回腸内微生物のα多様性が高く（P < 0.05）、d 28 Shannon, Simpson, Chao1指数は高く（P < 0.05）、d 10観察された種、Shannon、Chao1は増加傾向を示した（0.05 < P < 0.1）。対照群に比べ、ABX投与後のブロイラーの回腸微生物α多様性は減少し、d 10 observed_species, Shannon and Chao1 indexは有意に減少し（P < 0.05）、Simpson indexは減少傾向を示した（0.05 < P < 0.1）.
回腸に生息する微生物トップ10
Fig. S1 (Additional file 7) によると、ケージブロイラーと比較して、グランドリターブロイラーは、回腸におけるd 10 Escherichia-Shigella、d 10 Enterococcus、d 28 Staphylococcusの相対存在度が有意に増加し (P < 0.05) 、d 28 Escherichia-Shigellaの相対存在度が有意に減少していた。ABX処理により，回腸のEscherichia-Shigella，Chloroplast，Halomonas，Clostridium_sensu_stricto_1およびDietziaの相対量がd10およびd28に有意に増加し（P < 0.05），Lactobacillusの相対量がd10およびd28に有意に減少した（P < 0.05 ）．
異なる微生物についてのT-テスト
図6EおよびFから分かるように、ケージ群と比較して、グラウンドリターブロイラー回腸は、d 10 Escherichia-Shigella、d 10 Enterococcus、d 10 Halomonas、d 28 Staphylococcus、d 28 Enterococcus、d 28 Jeotgalibaca、d 28 Pediococcusおよびd 28 Jeotgalicoccusが有意に増加し（P＜0. 05）、d 10 Candidatus_Arthromitus、d 28 Halomonas、d 28 Clostridium_sensu_stricto_1およびd 28 Dietziaを有意に減少させた（P＜0.05）。
図6GおよびHに示すように、ケージブランク群と比較して、ABX処理はd10およびd28のLactobacillusを有意に減少させ（P＜0. 05）、d 10 Methylobacterium-Methylorubrum、d 10 Enterobacter、d 10 Romboutsia、d 10 Bifidobacterium、d 10 Bacillus、d 10 Turicibacter、d 10 Lachnoclostridium、d 10 unidentified_Chloroplast、d 28 Mitochondria、d 28 Halomonas、d 28 Dietzia、d 28 Aliidiomarinaおよびd 28 Nesterenkoniaを有意に増加した（P＜0.05）。
図6IおよびJは、グラウンドリター対照群と比較して、ABX処理によりd 10およびd 28 Lactobaclillusが有意に減少し（P < 0.05）、d 10 Streptococcus、d 10 Proteus、d 28 Halomonas、d 28 Dietzia、d 28 Brachybacteriumおよびd 28 Jeotgalibacaが有意に増加している（P < 0.05）ことを示した。
糞便微生物叢
図6KおよびLに示すように、ケージ群と比較して、d 28グラウンドリター群のブロイラーの盲腸内の総好気性菌および総嫌気性菌は高かった（P＜0.05）。通常群と比較して，d 10およびd 28のブロイラーの盲腸内の総好気性菌数および総嫌気性菌数は，ABX処理後に有意に減少した（P < 0.05）．
回腸内容物のノンターゲットメタボローム解析
データの品質評価と群間差の比較
データの信頼性を確保するためには、サンプル調製プロセスや機器の不安定性などの要因の影響を最小限に抑える必要があります。検出と解析の過程では、3つのQCサンプルを用いて、装置の安定性を監視し、確保した。元データの欠損値をシミュレートし，データを標準化した。並べ替えられたデータを得た後、主成分分析（PCA）と部分最小二乗法による識別分析（PLS-DA）を行い、グランドリターのブランクGCグループペアケージを得ました。空白のCC群のPLS-DAには散布図がある。図7A、7Bおよび図S2（追加ファイル8）は、ケージブランク群（CC）と比較して、グランドリターブランク群（GC）のブロイラー回腸代謝物組成が大きく変化し、二つの処理群の間に有意差があることを示している。PLS-DAモデルの並べ替え検定結果を図7Cに示すが、切片R2＝0.81、Q2＝-0.92であった。PLS-DAモデルにはオーバーフィット現象がなく、モデルの頑健性が高いことがわかる。
図7
図7
ケージ飼いとグランドリターフロアペンのブロイラー鶏の回腸メタボロームと短鎖脂肪酸の違い。d 31 における GC 群と CC 群の PLS-DA 散布図 (A, B)。GC群対CC群のPLS-DAモデルの並べ替え検定（C）（ネガティブイオンモード）。GC群対CC群のボルケーノプロット（D, E）。山グラフの各点は代謝物を表し、横軸は各物質の群における倍率変化（log2対数をとる）、縦軸はt検定のP値（log10対数をとる）を表しています。散布点の大きさは、PLS-DA モデルの VIP 値を表し、散布点が大きいほど VIP 値が大きいことを意味する。散らばった色は最終的なスクリーニング結果を表しています。有意に発現量が増加した代謝物を赤、有意に発現量が減少した代謝物を緑、有意差のない代謝物を灰色で示した。GC群とCC群のKEGGパスウェイ濃縮解析バブルチャート（F、G）。KEGG エンリッチメントの結果に従って、P 値が小さいものから大きいものへとソートされた上位 20 のパスウェイを選択し、バブルチャートを描画します。横軸は x/y (対応する代謝パスウェイの差分代謝物数/パスウェイで同定された代謝物総数)、値が大きいほどパスウェイの差分代謝物の濃縮度が高い、縦軸は KEGG パスウェイ名です。縦軸とバブルの色は、濃縮解析の P 値（負の常用対数をとったもの、つまり -log10 P 値）を示しています。色が赤いほどP値が小さく、濃縮の度合いが大きく、検定の信頼性が高く、統計量の差が大きいことを示している。ドットの大きさは、対応するパスウェイに含まれる異なる代謝物の数を表しています。ドットが大きいほど、その経路の差分代謝物が多いことを意味する。ブロイラー鶏の回腸内容物中の短鎖脂肪酸（H-J）濃度は、高速液体クロマトグラフィー（Dionex社、米国）で分析しました。グラフはすべて平均値で示し、標準偏差（SD）はひげを経由して示した。統計的差異は一元配置分散分析により決定し、主効果のP値は各プロットの下に書き出した。P値は、飼育システムの効果を表す。GC/Litter: グランドリター対照群, CC/Cage: ケージ対照群
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群間差分代謝物スクリーニング
相対分子量と二次質量分析データをHMDB、PubChem、KEGGデータベースと組み合わせて、比較検索を行い、代謝物の潜在的差異を解析した。PLS-DA モデルの第一主成分の投影における変数重要度（VIP）が 1 より大きく、P < 0.05 という条件に従って、240 種類の代謝物がポジティブイオンモードで同定され（表 S4, Additional file 4）、62 種類がネガティブイオンモードで同定された（表 S5, Additional file 5）。ケージ群に比べ、グランドリターブロイラーの回腸内容物の代謝物は濃度が上昇し、主にキヌレン酸、L-キヌレニン、アロリトコール酸が含まれていた。タウルソデオキシコール酸ナトリウム塩、クレアチニン、ネオプテリン、アフラトキシンG2、アントラニル酸、キサンチュレン酸、オクトピン、アグマチン、ピリドキシン、クエン酸、オレアノール酸、アジアチコシド、フェルラ酸、ラクチトール、グルタコン酸、ペリル酸など。グルタミン酸、ペリルアルチン、D-エリスロース4-リン酸など264種類の代謝物が減少し、choice、インドール、ジャコール、7-ケトデオキシビニン酸、タウロデオキシコール酸など38種類の代謝物が減少していました。デヒドロコール酸、デヒドロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸二水和物、タウロデオキシコール酸ナトリウム塩、デオキシコール酸、アントラニル酸、L-フェニルアラニン、グリココール酸、チミンの38代謝物が減少した。差分代謝物のスクリーニングは、ボルケーノマップの形で可視化されました (Fig. 7D and E)。
代謝物の差分 KEGG 解析
Table S6 (Additional file 6) によると、グループ間の差分代謝産物は、KEGGデータベースの不飽和脂肪酸の生合成、トリプトファン代謝、アルギニン生合成、タウリンおよびヒポタウリン代謝、第一胆汁酸生合成、アミノ糖およびヌクレオチド糖代謝、レチノールにマッピングされた。代謝経路は、代謝、ビタミンB6代謝、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸代謝、グリシン、セリン、スレオニン代謝、チロシン代謝、酸化的リン酸化、ペントースリン酸経路、クエン酸サイクル（TCAサイクル）、カフェイン代謝など34本であった。
差分代謝産物の代謝経路のエンリッチメント解析
代謝経路のエンリッチメント解析を行うために使用したチキンに対応するデータベースである MetaboAnalyst に各群の代謝物を入力し、対応する P 値を算出した。差分代謝産物が存在する代謝パスウェイのトポロジー解析とエンリッチメント解析により、代謝パスウェイを深くスクリーニングし、実験処理との関連性が高い代謝パスウェイを特定した。スクリーニング条件は、エンリッチメント解析P＜0.05、トポロジー解析。影響値0.1以上であった。Fig. 7FおよびGに示すように、トポロジー解析と組み合わせた差分代謝物のエンリッチメント解析により、ケージ群と比較して、グランドリターブロイラーの回腸内容で有意に高められた代謝経路は、主にトリプトファン代謝を含んでいた。アルギニンおよびプロリン代謝、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン生合成、ピリミジン代謝、2-オキソカルボン酸代謝、アミノ酸生合成、グリセロリン脂質代謝、ビタミンB6代謝、不飽和脂肪酸生合成、などであった。
回腸内容物短鎖脂肪酸
図7H-Jに示すように、ケージ群に比べ、28日目のグランドリター群のブロイラーの回腸酢酸およびイソ酪酸濃度は高かった（P < 0.05）。
免疫パラメータの差異、回腸微生物および代謝産物の相関ヒートマップ
次に、ブロイラーの腸内細菌叢、代謝物、免疫パラメータの関係を探るため、上述の回腸マイクロバイオームおよびメタボロミクスデータに基づき、スペアマン相関分析（図8AおよびB）を行い、グラウンドリターブロイラーの免疫機能の強化に関連する微生物および代謝物を同定した。Fig.8Aに示すように、平均体重、飼料摂取量、脾臓指数は、Escherichia-Shlgella、Staphylococcus、Jeotgalibaca、Pediococcusと正の相関、Methylobacterium-Methylorubrum、Turicibacter、Lachnoclostridiumと負の相関があった。胸腺指数、滑液包指数、末梢血Tc細胞比、単核マクロファージ比、Tリンパ球形質転換率は、Lactobacillus、Methylobacterium-Methylorubrumと正の相関、Escherichia-Shlgella、Staphylococcus、Jeotgalibaca、PediococcusおよびCandidatus-Arthromitusとは負の相関がみられた。血清NO、リゾチーム活性、IL-1β、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ量はMethylobacterium-Methylorubrumと正の相関、Lactobacillusと負の相関があった。血清IL-1β、血清IL-4、血清IFN-γ値、脾臓IL-10、脾臓IFN-γ mRNA発現量はL-kynurenine、kynurenic acid、allolithocholic acid、taurolithocholic acid sodium salt、creatinine、Neoopterinおよびaflatoxin G2に対して正の、コリン、インドール、jervine、7-ketodeoxycholic acidおよびその他のcholic acidsに対して負の相関がみられた。脾臓の免疫パラメータは、キヌレン酸と正の相関があった。末梢血マクロファージの比率は酢酸およびアフラトキシンG2と正の相関があった。末梢血Tリンパ球の転換率は、キヌレン酸と正の相関、インドールと負の相関があった。血清NOはデオキシコール酸と負の相関を示した。血清IL-10はコリン、ジャービン、タウロデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸ナトリウム塩と正相関があった。
Fig.8
図8
ブロイラー鶏の回腸差菌と免疫機能差の相関ヒートマップ。末梢（A）および腸（B）の免疫パラメータと、属レベルで異なる回腸微生物について、すべて有意に異なるスピアマンの相関を算出した。四角の色は、スピアマンの相関係のr値を表す。*P < 0.05
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図8Bから、回腸のTh細胞とTc細胞の比率は、Clostridium_sensu_stricto_1、Methylobacterium-Methylorubrum、Turicibacter、Lachnoclostridiumと正相関し、Staphylococcus、Jeotgalicoccus、Jeotgalibaca、Pediococcus、Candidatus_Arthromitusと負相関したことが示された。回腸粘膜のsIgAレベル、IL-1β、Mucin2、TLR2、IL-10、IFN-γ、TNF-α、TGF-β1、IgA、pIgR mRNA発現はLactobacillusと正相関していた。回腸IL-1β mRNA発現は、乳酸菌、アロリトコール酸、クレアチニン、ネオプテリン、アフラトキシンG2と正の相関があり、コリン、ジャービン、7-ケトデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロスデオキシコール酸二水塩、タウロリトコール酸ナトリウム塩とは負の相関が見られた。回腸のiNOS mRNAの発現は、酢酸と正の相関、Clostridium_sensu_stricto_1、7-ketodeoxycholic acidおよびデヒドロコール酸ナトリウムと負の相関があった。回腸Mucin2、TGF-β1およびIgAのmRNA発現は、Lactobacillusと正の相関、Peoteusと負の相関があった。回腸のIL-10 mRNA発現は、Lactobacillusと正の相関、kynurenic acidと負の相関があった。回腸のTNF-α mRNA発現は、代謝物および乳酸菌と正の相関を示し、イソ酪酸と負の相関を示した。Enterococcus、Staphylococcus、Jeotgalicoccus、Jeotgalibaca、PediococcusはL-kynurenine、kynurenic acid、allolithocholic acid、taurolithocholic acid sodium salt、creatinine、nepterin、aflatoxin G2とは正相関、dehydrcholine、Indolecholate acid、tauroocholic acid、nodiumourcholateとは正相関がみられた。二水和物とタウルソデオキシコール酸ナトリウム塩との間には負の相関があった。Proteusは酢酸と正の相関があり、コリン、7-ケトデオキシコール酸、デヒドロコール酸、デヒドロコール酸ナトリウム、タウロウルソデオキシコール酸二水和物と負の相関があった。Clostridium-sensu-strictoは、コリン、インドール、ジェルビン、7-ケトデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、デヒドロコール酸、デヒドロコール酸ナトリウムと正の相関があった。タウロデオキシコール酸二水和物、タウロデオキシコール酸ナトリウム塩、酢酸、L-kynurenine、kynurenic acid、allolitholic acid、taurolithocholic acid sodium salt、クレアチニン、ネオプチン、アフラトキシンG2 は負の相関を示した。Escherichia-Shlgellaはインドールおよびデヒドロコール酸と正の相関、アロリトコール酸と負の相関があった。
考察
私たちの以前の研究では、二重ケージと比較して、グランドリター飼育のブロイラー鶏は免疫機能が強く、腸内細菌叢が豊富であることが判明した[45]。より豊富な腸内細菌が腸管免疫シグナル伝達経路や腸管粘膜免疫機能を活性化し、産生された炎症性サイトカインが腸管バリアを介して末梢血に入るためではないかと推測される。サイトカインは末梢の免疫器官を刺激し、全身の免疫機能が強い状態になる。この過程で、腸内細菌が宿主の免疫機能を調節する役割を探るため、今回の実験では、飲料水に広域抗生物質を添加して腸内細菌を減少させた。そして、ブロイラーの免疫機能や状態の変化を評価し、免疫機能に関連すると思われる感受性の高い微生物やその代謝物を探した。
今回の研究の結果、ケージ群に比べ、グランドリター群で飼育したブロイラーは、d10における体重および飼料摂取量が多いことが明らかになった。これは、グランドリターペンで飼育されたブロイラーは、新鮮な籾殻から生成されるビタミンB12を摂取することができ、その結果、飼料摂取量が増加し、体重増加率が高くなったためであると考えられる。この結果は、Li ら[46]によっても支持されている。彼らは、7 日目から 28 日目にかけて、Ross 308 ブロイラーの体重増加は、FRS（フロアリター）＞NRS（プラスチックネット）＞CRS（ケージ）の順で現れることを明らかにした。我々の研究でも、ケージ群と比較して、d 10 から 28 においてグランドリター群の成長成績に差がないことがわかった。このことから，グランドリターペンで飼育されたブロイラーは，糞便と直接接触する時間が長く，足裏の炎症発生率が高いため，d10～28の体重増加率が低下している可能性がある[47]．ブロイラーの成長成績に対する飼育システムの影響の違いは、腸内細菌叢とエネルギー配分の変化に起因している可能性がある。
本研究では，広域抗生物質の飲料水への添加により，ブロイラーの体重増加率が1～10日にかけて有意に増加することを見出した．これは、飼料や環境由来の微生物が雛の腸内で急速にコロニー形成して増殖し、腸内の栄養素の一部を宿主と競合する可能性があるためと考えられる[48]。ヒヨコが飲料水を通じて広域抗生物質を摂取した後、これにより腸内の微生物数が大幅に減少し、その結果、腸内腔の栄養素をめぐる微生物と宿主との競合が減少した[49]。しかし、ブロイラーの成長成績に対する抗生物質処理のこの差は、d28で消失した。これは、抗生物質の長期摂取がブロイラーの腸絨毛や陰窩の形態構造に悪影響を及ぼし[50]、その結果、腸管の消化吸収能力が低下し、d10〜28の間の体重増加が減少する可能性があるためであると考えられる。いくつかの研究では、微生物は炭水化物を短鎖脂肪酸に発酵させ、飼料および内因性窒素含有化合物をアンモニアと微生物タンパク質に変換し、ビタミンB群を合成することが判明している。成熟した健康で安定した腸内細菌叢も、動物の腸の健康に重要な役割を果たす [51]。また、正常なマウス腸管内容物を移植した無菌マウスと比較して、ABX処理したマウス腸管内容物を移植した無菌マウスは、体重が少なく、回腸の長さも短いことがわかった。絨毛は著しく萎縮し、Paneth細胞は抗菌ペプチドα defensin 5の産生量が少なく、ABX処理後の腸内細菌はマウスの栄養吸収に寄与していないことが示された[52]。彼らの知見も我々の知見と一致しており、我々の知見の良い裏付けとなりうる。
病原体や炎症反応は、動物の成長性能に有害であり、食欲、消化吸収などの動物の正常な生理機能を乱し、動物の栄養摂取量を減少させることになる[53]。免疫系の維持・展開により、エネルギーコストや栄養コストが発生する可能性もあるが [54]。さらに、正常な腸内細菌叢は、一部の栄養素をめぐって宿主と競合することもある [48]。しかし、正常な免疫反応と健康で安定した腸内細菌叢の構造は、動物の成長性能に有益である。これは、宿主の正常な免疫機能が、病原性細菌を排除またはその数を減らし、病原性細菌が分泌する毒素や過剰な炎症による炎症性障害を軽減し、それによって動物の栄養摂取および消化吸収機能を正常に保つことができるからであろう[55]。さらに、安定した腸内細菌叢は、病原性細菌のコロニー化を撃退することができる[56]。さらに、腸内細菌叢は、宿主にとって消化しにくい残りの食餌を酵素の生産などによって分解し、短鎖脂肪酸、アロリトコール酸、トリプトファン代謝物など、宿主細胞にとって有益な代謝物を生産する[57]。最終的には、腸内細菌叢と免疫応答が動物の成長成績に寄与している。
免疫系は、動物の生命を守る「軍隊」である。防衛、監視、自己安定などの機能を持ち、病気の脅威に対応することができます。まず、ブロイラーの全身免疫機能を評価したところ、地上産のブロイラーは脾臓指数が高く、末梢血T細胞、Tc細胞、単核マクロファージの割合が高く、末梢血T細胞の増殖活性が強く、血清NO濃度およびリゾチーム活性が高く、血清IL-β、IL-4およびIgGレベルが高く、脾臓IL-1β、IL-10およびIFN-γ mRNAレベルが高くなることが判明した。その結果、ケージ飼いのブロイラーと比較して、地上子ブロイラーは全身免疫機能が強く、全身炎症が軽度な状態である可能性が示された。他の研究によると、屋外の鶏の脾臓指数は屋内の鶏より高い[58]。屋内集中飼育モードと比較して、屋外の放し飼いアヒルの滑液包、肺、十二指腸、回腸、盲腸におけるTLR7 mRNAの発現は有意に高い[59]。これらの結果は、基本的に本研究の結果と一致する。他の種類の動物を対象とした研究でも、飼育下で生活する動物に比べ、より自然な環境で育った動物は末梢免疫機能が強くなることが示されている[60]。ブロイラーにABXを投与すると、脾臓、胸腺、布袋の指数、末梢血T細胞と単核マクロファージの比率、末梢血単核細胞の食作用、血清NOおよびリゾチーム活性、血清IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ値、血清IgG値、脾臓IL-10、IFN-γ、TGF-β1およびIgA mRNAレベルが著しく低下することが確認されました。本研究により、ABX投与がブロイラーの全身免疫機能を抑制することが明らかとなった。報告によると、マウスのABX処理後、腸内微生物の数は著しく減少した。腸内微生物の刺激がないため、脾臓のTc細胞、Treg細胞およびDC細胞の割合が減少すると考えられる。同時に、Th細胞が産生するサイトカインIFN-γやIL-17、IL-22やIL-10のレベルもそれに応じて低下しており[23]、これは我々の研究結果と一致するものであった。この点から、ABX投与は腸内細菌叢の刺激を低下させ、全身の免疫機能にも一定の悪影響を及ぼすと考えられる。
腸粘膜は、栄養素の消化・吸収のための重要な部位であるだけでなく、免疫機能を発揮し、病原細菌の感染を防ぐための天然のバリアーでもある。腸は、腸内細菌叢によって刺激される最初の標的臓器である。グランドリターで飼育されたブロイラーの腸内にはより多くの微生物が存在し、細菌成分や代謝産物を直接刺激することでブロイラーの粘膜免疫反応を刺激し、産生されたサイトカインが血液に入ると推測している。末梢免疫器官の脾臓を刺激することで、わずかながら全身性の免疫反応が起こります。ABX投与は腸内細菌数を大幅に減少させることができ、微生物刺激の減少が全身免疫機能の状態を抑制する可能性がある。そこで、ブロイラーの粘膜免疫機能についても評価した。その結果、グランドリターブロイラーの回腸では、T細胞の割合、B細胞増殖活性、IL-1β mRNAレベルが高いことがわかった。その結果、グランドリターブロイラーの回腸粘膜免疫細胞の活性は高く、粘膜免疫機能状態はより強固であることが明らかとなった。アイソレータで飼育した子豚と比較して、農場の屋外で飼育した子豚は、炎症性サイトカインIL-2が高く、抗炎症性サイトカインIL-4が低いことが報告されている[12]。研究により、放し飼いアヒルの十二指腸、回腸、盲腸における TLR7 mRNA の発現が、屋内集中飼育のアヒルに比べて有意に高いことが報告されています [59]。ケージ飼育のブロイラーと比較して、地上飼育のブロイラーの回腸におけるIL-1βおよびIFN-γのmRNAのレベルは高く、これは本研究の結果と一致する[7]。その結果、ABX投与により、ブロイラーの回腸におけるT細胞、Th細胞およびTc細胞の割合が低下し、単球貪食能が低下し、回腸粘膜sIgAレベルが低下し、iNOS、Mucin2、TLR2、TLR4、IL-6およびIL-10のmRNAレベルが低下し、IFN-γ、TNF-α、TGF-β1、IgA、pIgRおよびオクルジンもmRNAレベルが低下することが明らかにされた。この結果から、広域抗生物質投与は、ブロイラーの粘膜免疫機能および免疫細胞のホメオスタシスに大きな悪影響を及ぼすことが明らかとなった。バンコマイシンやコリスチンを投与したマウスの小腸や大腸のリンパ濾胞の数が有意に減少したことが報告されている[61]。ネオマイシン、バンコマイシン、メトロニダゾールからなる広域抗生物質で処理すると、マウス腸内のG+菌特異的抗菌ペプチド再生膵島由来タンパク質3γは有意に減少した[62]。しかし、マウスのバンコマイシン処理により、大腸のTreg細胞数は減少した[63]。マウスのMLNとPPでは、広域抗生物質による治療で腸内細菌叢が枯渇すると、Treg細胞の割合が減少する[22]。マウスのABX処理により、腸内細菌数が有意に減少した。腸内細菌の刺激がなくなると、小腸、大腸、腸間膜リンパ節、脾臓のTc細胞、Treg細胞、DC細胞の割合が減少し、Th細胞-17、IL-22、IL-10の産生するサイトカインIFN-γ、ILも減少すると考えられ［23］、この結果は我々の研究結果と一致している。以上の結果から、地上子ブロイラーの腸管粘膜免疫機能状態はより強く、ABX投与後の腸管粘膜免疫機能状態はより弱くなっていることがわかった。これは、グランドリターブロイラーの腸内細菌叢による免疫系への刺激が強いことと、ABX処理における微生物刺激の低減が関係していると思われる。
動物の免疫機能と腸内細菌叢の間には、切っても切れない関係がある。ブロイラーの免疫機能と微生物叢の相互作用は、様々な生理活性低分子代謝産物の産生に依存している可能性がある。腸内細菌叢は、リポ多糖（LPS）およびペプチドグリカン（PGN）のデノボ合成により低分子活性代謝物（SCFAs、二次胆汁酸およびインドール）を産生し [64] 、宿主の食餌を用いて低分子活性代謝物（SCFAs, 二次胆汁酸、インドール）[65]や活性化した腸管粘膜免疫細胞が産生する炎症性サイトカインが血液循環を介して標的臓器や標的細胞を刺激し、免疫系の恒常性を調節していることが明らかになった。そこで、腸内細菌叢を評価した。
ブロイラーの各腸管セグメントでは、糞便微生物の総数および種類は多く、比較的安定している。炎症性飼育システムやABX処理を調整し、腸内細菌の数を上下に調節して免疫系の刺激を調節できるかどうかを調べるため、まず盲腸内の総需要、好気性菌数、総嫌気性菌数を検出しました。その結果、敷き床鶏では盲腸内好気性菌と総嫌気性菌の合計数が多くなっていました。ABX処理後、セカール総好気性菌数および総嫌気性菌数は有意に減少した。さらに観察したところ、通常の条件下では2つの飼育方式が存在することが明らかになった。ケージの場合、糞便微生物数はあまり変わらないが、ABX処理により敷料床の場合よりも高い程度に減少した。他の研究では、ブロイラー鶏はケージ、地床、放し飼いよりも環境微生物が多く、多様性が高いことが示されており［31、66、67］、今回の研究結果と一致する。ABX治療にはネオマイシン、アンピシリン、バンコマイシン、メトロニダゾールが含まれ、阻害範囲はグラム陽性菌、グラム陰性菌、嫌気性菌、原虫、トリコモナスであり、腸内細菌叢に対する古典的な広域抗生物質プロトコルを減らすために使用される。このABX処理を用いた研究により、ABX処理後のマウスの腸内細菌叢は、糞便中の総好気性菌、通性嫌気性菌、厳密嫌気性菌など大きく変化していることが示された。また、16S rRNA遺伝子数も有意に減少していた[23, 68, 69]。グラウンドリターモードでは、リターと地面に多くの微生物が含まれていると推測される。鶏は地面に直接触れ、リターをついばむことで、多くの微生物を摂取し、その結果、盲腸内の総好気性菌と総嫌気性菌の数が増加した。複数の微生物刺激によりブロイラー鶏の粘膜免疫および全身免疫機能状態が増強され、ABX処理により微生物刺激が弱まり、免疫機能状態がダウンレギュレートされることが明らかになった。
回腸の微生物相を16S rRNAシークエンスで検出した。その結果、グランドリターブロイラーの回腸の微生物α多様性は高く、2つの飼育システムのβ多様性は有意に異なることがわかった。また、Escherichia-Shigella、Enterococcus、Jeotgalicoccus、Pediococcus、Jeotgalibacaの相対量がグラウンドリターブロイラーの回腸で高く、Candidatus_ArthromitusとClostridium_sensu_stricto_1は低いことが示された。Escherichia-ShigellaおよびEnterococcusは、腸の炎症を引き起こす可能性のある日和見病原体で、炎症性腸疾患（IBD）患者の腸に多く見られるとの報告がある[70, 71]。Jeotgalicoccusはグラム陽性の球菌で、鶏舎内の砂や空気中に多く存在します[72]。私の以前の研究では、Jeotgalicoccusはブロイラーの免疫機能と有意な正の相関があることを発見した[45]。ペディオコッカスは、家禽の直腸や糞便から分離された優れたプロバイオティクス候補です。この菌は、増殖に適した幅広いpH値、温度、浸透圧を有しています。家禽飼料に含まれるプロバイオティクス菌株としてしばしば選択される[73, 74]。ブロイラー用飼料にペディオコッカス・ペントサセウスを添加すると、盲腸内の SCFA 含有量が有意に増加することが研究で報告されている [75]。Candidatus_Arthromitus は、自然免疫反応を誘導し [76]、上皮内リンパ球集団の Tc 細胞を活性化し [77]、Th17 細胞を特異的に誘導する [78, 79] ことが知られている。Clostridium_sensu_stricto_1がIgEを介した食物アレルギー症状を持つ乳児の腸内で増加し、IgE値と相関があることが報告されている[80]。Atarashiらは、Clostridium_sensu_stricto_1が大腸粘膜のTregの増殖を促進することを見出した[63]。本研究の結果から、リターフロアブロイラーの回腸では微生物の種類が多く、腸炎を誘発する可能性のある条件付き病原体である Escherichia-Shigella や Enterococcus が増加していることが明らかになった。また、免疫機能に正の関係を持つリター飼育菌Jeotgalicoccusが増加し、抗炎症細胞Tregの増殖を促進するClostridium_sensu_stricto_1が減少していた。ひき肉ブロイラーの回腸微生物は、粘膜免疫機能により強い刺激を与え、ブロイラーの免疫機能状態を改善する可能性があり、本研究の免疫機能状態の評価結果と一致する。他の研究では、ケージ飼いのブロイラーと比較して、回腸の微生物多様性と放線菌の相対存在度がグラウンドリターブロイラーで高いことが判明している[7]。ケージのアヒルと比較して、敷料床のアヒルの盲腸の微生物多様性と日和見病原体Erysipelato clostridiumは高い[81]。これらの研究は、本研究の結果と一致する。家禽は、より多くの環境微生物が存在する飼育系でより多くの腸内細菌を増殖させ、より多くの微生物刺激によりブロイラーの粘膜免疫機能および全身免疫機能の亢進を引き起こすと考えられる。また、本研究では、ブロイラーの回腸内微生物のα多様性がABX処理後に有意に減少し、β多様性が群間で有意に異なることを見いだした。ABX処理はケージブロイラーの回腸でLactobaclillusを減少させ、unidentified_Chloroplast、unidentified_Mitochondria、Enterobacter、Romboutsia、Bifidobacterium、Bacillusを増加させることが明らかになった。ABX処理により、挽き肉の回腸でLactobaclillusが減少し、Streptococcus、Proteus、Halomonas、Brachybacterium、Jeotgalibacaが増加した。報告によると、ABX処理によりマウス糞便中の16S rRNA遺伝子数が有意に減少した[23, 68, 69]。Lactobaclillus はブロイラーの回腸における主要な微生物であり、正常なブロイラーの回腸におけるその存在量は一般に 90% 以上である [82]．ケージ鶏では約30％しか占めないが、ABX処理後は約60％を占める。相対存在量の減少は、回腸内微生物の16S rRNA遺伝子の総数が減少したことを示すと推測される。また、細菌にはミトコンドリアや葉緑体が存在しないため、unidentified_Mitochondriaやunidentified_Chloroplastは回腸内容物を餌とする植物細胞由来である可能性がある。異なるグループの回腸内容物からDNAを抽出する操作は同じなので、抽出された飼料に含まれる植物細胞のミトコンドリアとクロロプラストのDNA量は同じであるはずです。ABX投与群で両者の相対量が増加したのは、16S rRNA遺伝子の数が減少したことを示していると思われる。したがって，ABX処理によりブロイラー回腸微生物の16S rRNA遺伝子数が減少し，回腸微生物がブロイラーの粘膜や全身の免疫機能に与える刺激が減少することが推測され，本研究における免疫面の結果と一致する。
微生物叢の変化は、微生物と宿主の代謝に変化をもたらす可能性がある。グランドリターブロイラーの回腸では酪酸およびイソ酪酸の濃度が高く、回腸のPediococcusの増加と関連している可能性が示唆された。SCFAs、特に酪酸は、大腸上皮細胞のエネルギー源として利用されることが報告されている[83]。また、マウスの腸の後半分の共生微生物が、腸内容物のレジスタントスターチを発酵させて生成したSCFA酪酸を胸腺のTreg細胞産生に利用し、生成したプロピオン酸がヒストンの脱アセチル化を阻害することができるという研究結果もある。HDACは末梢血中の新しいTreg細胞の産生を高めるが[84]、これはこの実験の結果と一致する。このことから、ひき肉ブロイラーの強い免疫機能状態には、微生物による直接的な刺激に加えて、その代謝物であるSCFAsが関係している可能性があることがわかった。
SCFAs に加えて、ノンターゲットメタボロームを用いて回腸内容物の代謝産物の差分を測定したところ、ケージ群に比べ、グラウンドリター群のブロイラーの回腸における代謝産物組成が大きく変化していることがわかりました。増加したものは、キヌレニン酸、L-キヌレニン、アロリトコール酸、タウルソデオキシコール酸ナトリウム塩、クレアチニン、アントラニル酸、キサンチュレン酸、ネオプチン、アフラトキシンG2、オクトピン、アグマチン、ピリドキシン、クエン酸、ウリックアシドなど、減少したものはチョイル、インドール、デオキシコール酸およびその塩の38代謝物であることが分かりました。代謝パスウェイ解析の結果、ケージコントロール群（CC）と比較して、グランドリターコントロール群（GC）の差分代謝物は、不飽和脂肪酸の生合成、一次胆汁酸生合成、トリプトファン代謝、レチノール代謝、アルギニン生合成、タウリンとヒポタウリン代謝、クエン酸サイクル（TCAサイクル）、ビタミンB6代謝など34代謝パスがKEGGデータベースで顕著に強化されていることが判明した。本研究の相関分析の結果、ほとんどの末梢免疫機能は、Lactobaclillus, Jeotgalibaca, Methylobacterium-Methylorubrum, Pediococcus, kynurenic acid, L-kynurenine, allolithocholic acid, taurolithocholic acid, creatinine, neopterin, aflatoxin G2 と正相関し、 Candidatus-Arthromitus, indole 及び deoxycholic acid は負の相関があることが明らかにされました。腸管粘膜免疫機能の多くは、Lactobacillus, allolithocholic acid, creatinine, neopterin, aflatoxin G2と正の相関があり、Clostridium_sensu_stricto_1, 7-ketodeoxycholic acid, taurodeoxycholic acid, sodium dehydrocholate, choline および jervineと負の相関がある。酢酸および末梢血マクロファージの割合は、回腸におけるiNOS mRNAの発現と正の相関があった。Jeotgalicoccus, Jeotgalibaca, Pediococcusはkynurenic acid, allolithocholic acid, creatinine, neopterin, aflatoxin G2と正の相関、indole, choline, taurodeoxycholic acid, dehydrocholic acidと負の相関がみられた。これまでの研究で、Clostridium reuteri、Lactobaclillus reuteri、Bacteroidesなどの腸内細菌がトリプトファンを代謝してインドールプロピオン酸やトリプタミンを生成し、それがインドール、インドール乳酸、インドール3-酢酸に変化することが分かっています[85,86,87]。研究により、トリプトファン代謝物（キヌレニン、セロトニン、メラトニン）および細菌のTrp代謝物（インドール、インドール酢酸、スカトール、トリプタミン）が腸内細菌叢の構成および微生物代謝に影響を与えることが判明しています。宿主免疫系、宿主-マイクロバイオーム界面、宿主免疫系-腸内細菌叢の相互作用が大きな影響を及ぼしている[88]。トリプトファンの内因性代謝物であるキヌレニンは，腸のNLRP3インフラマソームの発現を調節することによって，内因的に大腸炎を悪化させることができる[89]．報告によると、インドールおよびその誘導体であるインドール酢酸は、細菌がトリプトファンを代謝した生成物であり、炎症を抑制し腸の恒常性を維持することができる[87]。インドールはAhR受容体を活性化し、局所的なIL-22の産生を促進し、腸管細胞の上皮バリア機能を促進し、NF-κBの活性化および炎症性ケモカインの産生を抑制し、抗炎症サイトカインの産生を増加させて、炎症を抑制できる［88］．インドール誘導体のIAA、IPA、ILAは、プレグナンX受容体（PXR）またはAhR受容体を活性化することにより、腸管免疫細胞やバリアー性を高めることができる[87]。胆汁酸は肝臓で合成され，加工・修飾されて十二指腸に分泌され，腸内細菌叢の働きで二次胆汁酸に変換されるとの報告がある．二次胆汁酸には、リトコール酸とデオキシコール酸の2種類がある。これらは、免疫細胞を調整し、炎症性因子を減少させ、全身の炎症を抑え、IBDの発生を緩和することができます。本研究では、マウス腸内共生細菌（Bacteroides polymorpha, Bacteroides fragilis）が腸内胆汁酸プールの組成に影響を与え、大腸Treg細胞の数を調節していることを発見しました。食事と栄養が不十分なSPFマウスに、一次胆汁酸または二次胆汁酸の特定の組み合わせを補充すると、胆汁酸-VDR軸を介して大腸Treg細胞の割合が増加し、大腸炎に対する感受性を低下させることができる[90]。また、百寿者は、リトコール酸の様々なアイソフォームを含む固有の二次胆汁酸を産生できる微生物を豊富に含む固有の腸内細菌叢を有することが研究で明らかにされている。これらの特異的な胆汁酸の代謝は、病原体の感染リスクの低減に関与し、腸のホメオスタシスの維持に役立つと考えられる[91]。その結果、グラウンドリターブロイラーの回腸内容物の代謝物の組成が大きく変化することがわかった。酢酸、酪酸、キヌレニン、アロリトコール酸、内因性トリプトファン、微生物代謝物（インドール酢酸、キヌリア酸、インドール）等が腸管細胞AhR、NLRP3、GRP41、TLR-NF-κB等を制御することにより腸管粘膜免疫機能を活性化して軽度の腸管炎症を引き起こし、これにより腸管透過性が高まり全身性の炎症が起こる可能性があると考えられる。
我々は、グランドリターで飼育されたブロイラーの腸内により多くの微生物が、細菌成分や代謝産物を介してブロイラーの粘膜免疫反応を直接刺激していると推測している。産生されたサイトカインや免疫調節代謝産物は血液に入り、末梢免疫臓器の脾臓を刺激し、わずかながら全身性の免疫反応が起こる。広域抗生物質処理は、腸内微生物の数を著しく減少させ、微生物や代謝産物による免疫系の刺激を減少させるので、ブロイラーの免疫反応を低下させ、免疫機能状態を弱めることができる。ケージブロイラーの免疫機能が低下しているのは、環境微生物や代謝産物の刺激が不足しているためと考えられ、食事療法によって免疫機能や腸内細菌叢を調整し、病気への抵抗力を高める必要がある。
まとめ
以上より、グランドリターブロイラーは免疫機能が強く、回腸では免疫機能と正の相関を示す潜在的病原体、リター飼育細菌、短鎖脂肪酸、キヌレニン、アロリトコール酸、トリプトファン代謝産物が多く存在した。これが免疫機能を強くしている理由かもしれない。広域抗生物質治療により、末梢粘膜や回腸粘膜の免疫細胞の割合やサイトカインレベルが低下し、これらはLactobaclillusなどの微生物が少ないことと関係していると考えられる。
データおよび資料の入手方法
本研究で作成・解析した16S rRNA遺伝子配列データは、NCBI primary data archive (PDA) でアクセッション番号PRJNA 775,677で公開されています。本データはこちらでご覧いただけます：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/775677
略語
ABX:
抗生物質
BW:
体重
BWG:
体重増加
コンA
コンカナバリンA
DTT
1,4-DL-ジチオスレイトール
ELISA
酵素結合免疫吸着法
FBS:
ウシ胎児血清
FCR:
飼料要求率
FI:
飼料摂取量
GAPDH。
グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ
IFN-γ:
インターフェロン-γ
IgA
免疫グロブリンA
IL-1β：インターロイキン-1β
インターロイキン-1β
iNOS：アイノス
誘導性一酸化窒素合成酵素
LPS
リポポリサッカライド
MTT
3-（4，5-ジメチルチアゾル）-2，5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド
NE:
壊死性腸炎
NF-κB:
核因子-κB
NO:
窒素酸化物
PBMC:
末梢血単核細胞
pIgR:
高分子免疫グロブリン受容体
PLS-DA:
部分最小二乗法による識別分析
RT-PCR:
逆転写-ライマーゼ連鎖反応
sIgA:
分泌型免疫グロブリンA
Tc細胞
細胞傷害性T細胞
TGF-β:
トランスフォーミング増殖因子-β
Th細胞。
ヘルパーT細胞
TLR2:
Toll様受容体
TNF-α:
腫瘍壊死因子（Tumor necrosis factor）α
Treg細胞。
制御細胞
ZO-1
ゾヌラオクルーデンス-1
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参考文献のダウンロード
資金提供
本研究は、中国農業研究システムプログラム（CARS-41-G11）、山東省革新的人材博士研究プログラム（SDBX2021013）、山東農業大学創意研究基金（76616）の支援により行われた。
著者情報
著者名および所属
中国農業大学動物科学技術学院動物栄養学国家重点実験室、北京、100193、中国
宋伯晨、李鵬、徐慧平、王忠、元建民、張炳憲、呂增鵬、郭玉銘
山東農業大学畜産学部, Taian, 271018, China
宋伯晨・宋志剛
貢献
BSとYGが研究をデザインした。BSは動物実験の実施、試料の分析、原稿の執筆を行った。PLとHXは動物への給餌と試料分析に貢献した。ZWとJYは原稿作成に協力した。BZとZLはサンプル収集とデータ分析に協力した。ZW、JY、BZ、ZL、ZS、YGは原稿の修正に貢献した。最終原稿は全著者が読み、承認した。
共著者
Yuming Guoに連絡すること。
倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
実験動物の処置は、中国農業大学動物管理使用委員会（中国、北京）の承認を得た。この研究では、すべての実験方法は、実験動物の世話と使用のための中国農業大学保健ガイドに従って行われた。
論文発表の同意
該当なし。
競合する利益
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言する。
補足情報
追加ファイル 1: 表S1.
実験飼料1 の成分および組成（計算値および分析値）（%、特に断りのない限り、as-fed 基準）。
追加ファイル2: 表S2.
定量的リアルタイムPCRに使用したオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列。
追加ファイル3: 表S3.
ABX処理がケージおよびグランドリターペンのブロイラー鶏の成長成績に及ぼす影響。
追加ファイル4: 表S4.
GC群 vs. CC群の回腸内容物における発現上昇および発現低下代謝物（正イオン）。
追加ファイル5: 表S5.
GC群とCC群の回腸内容物における発現量のアップレギュレーションとダウンレギュレーション（負イオン）。
追加ファイル6: 表S6.
GC群とCC群の回腸内容物の代謝産物差のKEGGパスウェイのアノテーション。
追加ファイル7：Fig.S1.
ブロイラー鶏の回腸に生息する微生物上位10種（属レベル）。
追加ファイル8: 図S2.
GC群とCC群の回腸内容物中の代謝物のPCA散布図。
権利と許可
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この記事の引用
Song, B., Li, P., Xu, H. et al. 飼育システムと抗生物質処理がブロイラー鶏の免疫機能、腸内細菌叢および代謝産物に及ぼす影響. J Animal Sci Biotechnol 13, 144 (2022). https://doi.org/10.1186/s40104-022-00788-y
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受領日
2022年5月12日
受理済
2022年10月03日
公開日
2022年12月16日
DOI
https://doi.org/10.1186/s40104-022-00788-y
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キーワード
広域抗生物質
ブロイラー
腸内細菌叢
免疫機能
代謝産物
飼育システム
動物科学とバイオテクノロジー
ISSN: 2049-1891
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