ヒト常在菌Segatella copriのRNAランドスケープから、腸内コロニー形成に不可欠な低分子RNAが明らかになった

哉百名

2024年10月6日 14:27

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論文オンライン公開2024年10月04日オープンアクセス

ヒト常在菌Segatella copriのRNAランドスケープから、腸内コロニー形成に不可欠な低分子RNAが明らかになった

https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128%2824%2900352-4

Youssef El Mouali∙Caroline Tawk∙Kun D. Huang∙ ... ∙Falk Ponath∙Jörg Vogel∙Till Strowig... Show more

ハイライト

ヒト腸内常在菌Segatella copriのRNAランドスケープの同定

エタトランススクリプトミクスにより、腸内で高発現しているS. copriの低分子RNAが同定された

小分子RNA SrcFがS. copriの腸内定着に必須であることを同定した。

同居する腸内常在菌によるルクタン分解がSrcFの発現を制御する

概要

セガテラ・コプリ（Segatella copri）細菌は、ヒトの腸内細菌叢に広く存在する細菌であり、健康状態および疾患状態に関連している。しかし、Segatella copriが腸内を効率的にコロニー形成する能力を決定する内在性因子は、ほとんど解明されていない。我々は、S. copriの広範なトランスクリプトームマッピングを行い、ヒト由来のサンプルを調べた結果、SegatellaRNA colonization factor（SrcF）と名付けた低分子RNAを発見し、SrcFが同胞性マウスにおけるS. copriの腸内コロニー形成に必須であることを明らかにした。rcFは栄養獲得に関与する遺伝子を制御しており、複合糖質、特にフルクタンがその発現を制御している。さらに、SrcFの発現は、ヒトのマイクロバイオーム構成や同居常在菌によるフルクタンの分解に強く影響されることから、複合糖質の分解は、エネルギー生成という確立された機能を超えて、常在菌間の種間シグナル伝達を媒介することが示唆された。この研究により、腸内コロニー形成における重要な制御因子としての低分子RNAの寄与が明らかになった。

抄録

キーワード

はじめに

ヒトのマイクロバイオームは、何千もの種からなる複雑な微生物生態系を形成しており、その多くは臓器部位、あるいはヒト宿主に特化している。これらの生態系の中で、微生物は必須栄養素、特に炭水化物を獲得するために競争したり協力したりしている。モデル腸内細菌バクテロイデス・テタイオタミクロンの研究から、炭素の利用可能性に応じて細菌の遺伝子発現を調節する高度な転写および転写後制御ネットワークが発見されている。特にSegatella copri（旧名Prevotella copri）4は、ヒト腸内細菌叢に広く存在する豊富なメンバー（個体の34％で最も豊富）5,6であり、ヒト腸内細菌型として提唱されている3つのうちの1つを支配する主要な種を構成している7。

. コプリは、13の異なる種を含むS.コプリ複合体の一部であり、食物繊維の豊富な食事を摂取する伝統的な農耕社会、非西洋化社会ではどこにでも生息している。前者では、S.コプリの存在はヒトの関節リウマチの発症と相関しており12,15、特定のS.コプリ分離株はマウスモデルで関節炎を悪化させる16。後者では、セガテラ属菌の存在は、複雑な多糖類を豊富に含むベジタリアンまたはビーガン食と正の相関がある18,19。このように、S.copri単離株は植物由来の豊富な多糖類を容易に利用することができる5,20,21。この栄養学的多様性は、多糖類およびその分解産物の分解および輸送のための調節因子および酵素をコードする、多糖類利用遺伝子座（PULs）と名付けられた複数の遺伝子クラスターに起因する2,22。

一方、S. copriが腸内コロニー形成を成功させるために、どのように栄養素を感知し、優先順位をつけているのかは不明である。メタゲノミクスに基づく研究では、S. コプリの複雑なゲノム内容が明らかにされているが5 、19 、20、どのプロモーター配列が遺伝子発現を促進するのか、あるいはmRNAの翻訳がどのように制御されるのかなど、S. コプリの転写および翻訳メカニズムに関する知見は不足している。さらに、S. copriに低分子非コードRNAが存在するのかどうか、またそれらが腸内の環境的手がかりを統合し、遺伝子発現やコロニー形成にどのような影響を与えるのかについては、転写後のRNAランドスケープは未解明のままである。

我々は、S. copriがどのように遺伝子発現を制御して腸内コロニー形成を成功させているのかを理解するために、S. copriのin vitroおよびin vivoにおける包括的なRNAマップを作成し、潜在的な制御機能を持つ低分子RNA（sRNA）の存在など、遺伝子制御の基本的な側面を明らかにした。そこで、S. copriの腸内コロニー形成に関連する遺伝子発現制御因子を同定することを目的とした。その結果、S. copri株で保存されているヒトマイクロバイオームで高発現しているsRNAを同定し、このsRNAが同胞性マウスの腸内コロニー形成に必須であることを明らかにした。SrcFはSegatellaRNA colonization factor（セガテラRNAコロニー形成因子）と名付けられ、その欠失がいくつかのPULを含むS. copri遺伝子の発現に強く影響することを明らかにした。さらに、SrcFの発現を規定する環境的な手がかりとして、フルクタンなどの食餌成分を突き止めた。この発現調節は、S. copriがアクセス可能なフルクタンや、S. copriはアクセスできないが同居する微生物叢のメンバーによって分解されたフルクタンから単糖が放出されることによって起こる。この結果は、複合糖質の細胞外分解が、エネルギー源としての機能だけでなく、種間シグナル伝達にも関与している可能性を示している。また、ヒトの腸内細菌叢における常在菌の相互作用を完全に把握するためには、細菌をコードするゲノムを超える拡張が必要であることを強調している。

結果

S. copriHDD04およびDSM18205Tの一次トランスクリプトーム

S. copriのゲノムワイドなRNAランドスケープは、特異的ヌクレアーゼ処理によって一次（5′-PPP）転写産物末端と加工（5′-P、5′-OH）転写産物を区別することで、転写産物の5′末端をグローバルに同定することを目的としたdifferential RNA sequencing（dRNA-seq）を適用することによって決定された23。RNA-seqは転写開始点（TSS）を注釈付きコード配列（CDS）に割り当て（STAR Methods参照）、潜在的な制御機能を持つ注釈なしの非コード遺伝要素を同定する。ここでは、S. copriHDD04株とDSM18205T株（それぞれ遺伝的に扱いやすい分離株とタイプ株21,24）を、3つの増殖期条件、すなわち初期指数関数期（EEP; OD600nm0.2 5；約4時間）、指数関数期中期（MEP；OD600nm0.8；約6時間）、定常期（Stat；OD600nm4.0；約11時間）の3つの増殖相条件でdRNA-seqを行った（図1A）。

図1セガテラ・コプリHDD04とDSM18205Tの一次トランスクリプトーム

キャプション

ANNOgesic25を用いてゲノムワイドにTSSを同定した結果、S. copriHDD04とDSM18205Tの両方で2,000以上のTSSが同定され、関連するCDS23に対するゲノム上の位置に基づいて、両株で同様の分布を持つ5つのカテゴリーに分類された（図1B;STAR Methods参照）。まず、一次TSSは、あるCDSの上流300 nt以内で最もカバー率が高いTSSと定義され、残りのTSSは二次TSSと定義される（図1B）。次に、内部TSSは所定のCDS内に位置し、アンチセンスTSSはCDS内またはCDSを100 nt挟んでアンチセンス方向に位置する（図1B）。最後に、300 ntのウィンドウ内でどのCDSとも関連しない予測されたTSSは、オーファンとして分類され、遺伝子間未注釈遺伝要素23（下記参照）を示している可能性がある（表S1 ）。

HDD04株とDSM18205T株は、TSSとターミネーターの予測から得られた転写産物の長さはほぼ同じであった（図1C;STAR Methods参照）。さらに、一次TSSとCDSからmRNAの5′非翻訳領域（5′UTR）を同定したところ、S. copriHDD04とDSM18205Tの5′UTRの平均長さは、それぞれ69 ntと76 ntと同程度であった（図1D）。さらに、リーダーレス転写産物（開始コドンにTSSを持つ）は、両株でそれぞれ36と35と同程度の数が同定された（図1D）。Bacteroides thetaiotaomicronのように、S. copriには明確なコンセンサスリボソーム結合部位がない。

プロモーター配列を同定するために、注釈付き一次TSSの上流50 ntの配列領域をコンセンサス配列について解析した27。注目すべきことに、HDD04の一次TSSの70％以上に高度に保存された-7ボックスTAnnTTTCAが同定され、S. copriHDD04の一次TSSの15％にのみ保存された-33ボックスAAAnnTTTGGが同定された（図1E）。また、-7ボックスはアンチセンスTSSの70％、オーファンTSSの65％に存在するが、内部TSSには5％しか存在しない。S. copriDSM18205Tでは、同様の頻度で歯状のプロモーターモチーフが見つかった（図1E）。ここで同定されたプロモーターモチーフは、B. thetaiotaomicronや Bacteroides fragilis、Flavobacterium johnsoniaeで最近同定された標準的なプロモーターモチーフに似ている。

S.コプリにおけるオンコーディングRNAレパートリーとSegatella種複合体全体の保存性

S.コプリの一次転写産物のTSSをdRNA-seqでアノテーションすることにより、非コードsRNAを含む非アノテーション制御RNAエレメントをマッピングすることができた（STAR Methods参照）。まず、S. copriHDD04とDSM18205Tにおいて、Infernal31でアノテーションされたハウスキーピングRNAの発現を検証した。いずれの株も、転移メッセンジャーRNA（tmRNA）とRNase PのRNA成分（M1 RNA）をコードしている（図2AおよびS1A）。さらに、Bacteroidales-1 RNA (RFAM, RF01693)32をコードしており、B. thetaiotaomicronの6SRNAのホモログであることが最近同定された26。S. copriHDD04株とDSM18205T株の一次トランスクリプトームは類似性が高く、ゲノムの平均ヌクレオチド同一性が95%以上であることから34、遺伝学的に扱いやすいS. copriHDD04株を用いて、一次トランスクリプトームのさらなる特性解析を行った。

図2セガテラ・コプリにおけるノンコーディングRNAレパートリーとセガテラ種複合体全体における保存性

キャプション

非コードsRNAレパートリーは、ANNOgesic25による予測とdRNA-seqデータの手作業によるキュレーションを組み合わせて、包括的にアノテーションした（STAR Methods参照）。S. copriHDD04では、63のノンコーディングRNAが同定され、その平均長は244 nt（範囲は75-477 nt）であった（図S1B）。そのうち27個は遺伝子間領域にコードされ、7個は他の遺伝子に対してアンチセンス方向にコードされ、残りの30個はS. copriHDD04のmRNAの3′または5′由来のものであった（表S1F）。注目すべきは、6つの遺伝子間sRNAと8つのmRNA由来sRNAが小さなオープンリーディングフレーム（<50アミノ酸）を含んでいることである。遺伝子間sRNAの保存性解析（塩基配列同一性70%のBLASTN解析36,37）により、S. copriHDD04で同定されたsRNAのほとんどは、S. copri（旧P. copriclade A）株間で保存されていることがわかった（図2B）。一方、S. copri種複合体以外ではほとんど保存されておらず、プレボテラ科の他のメンバーやB. thetaiotaomicronでは保存されていない（図2B）。さらに、S. copriHDD04における推定sRNAのサブセットの発現を、ノーザンブロット検出によって実験的に検証した。その結果、EEP、MEP、STATにおいて90～300 ntの6種類の遺伝子間sRNAが検出された（図2C）。遺伝子間sRNAのうち5つ（ScnR282、ScnR276 [SrcF]、ScnR86、ScnR101、ScnR247）はStatに集積した。同時に、ScnR157は成長期を通じて構成的に発現していた（図2C）。興味深いことに、ScnR157はセガテラ属で強く保存されている（図2B）。ScnR157の発現は、セガテラ属の追加3種、すなわちSegatella brunsvicensis 、Segatella sinensis 、Segatella hominisで実験的に検証された（図S1C）。ゲノムのシンテニーは部分的にしか維持されていないが（図S1D）、sRNA配列とプロモーター領域は高度に保存されており、S. copri（図1E）で同定されたプロモーター領域が他のセガテラ属でも遺伝子発現を駆動しているようであることを示している（図S1E）。驚くべきことに、ScnR125（3′由来）とScnR139（アンチセンス）という異なるクラスのsRNAの発現も検出され（図2D）、mRNA由来のsRNAとアンチセンスsRNAもS. copriにおける潜在的な制御要素である可能性が示された。

マウス腸内におけるS. copriのリマリートランスクリプトームマップ

大腸はS. copriの主な生息地であり、in vitroで得られたTSSの大規模な解析にもかかわらず、in vivoで特異的なTSSを同定できるかどうかを検討した。例えば、S. copriのHDD04は29個のPULをコードしているが21、17個はin vitroでは発現が低いか、あるいは発現しなかったため、PULのTSSの大部分（約60％）をマッピングすることができなかった。S.copriは通常の餌を与えられた無菌マウスには単コロニー化できないが、合成されたミニマムコミュニティー内ではマウスに安定的にコロニー形成する38。OMM12マウスにS. copriHDD04株をコロニー形成させたところ（図3A）、7日目には糞便中の相対量が10％を超え、14日目には消化管腔内の相対量が13％～22％に達した（図3B）。インビボでTSSを同定するための全RNAを得るために、遠位結腸（DC）内容物、すなわちS. copriが最も高存在に達した場所をRNA抽出とその後のdRNA-seqに用いた。定義されたコミュニティーのおかげで、目的のS. copri株を深くカバーすることができ、マウス腸内の他のコミュニティーメンバーとクロスマッピングしたリードを容易にフィルターすることができた（図3C;STAR Methods参照）。

図3 マウス腸内におけるSegatella copriの一次トランスクリプトームマップ

キャプション

マウス腸内におけるS. copriのTSSを同定するために、S. copriに特異的にアライメントされたリードをdRNA-seq解析に組み込み、TSSを前述のように同定した25（表S1B）。検出されたTSSは、Statサンプルではなく、EEPおよびMEPサンプルで検出されたTSSとかなり重複していた（図3D）。興味深いことに、OMM12腸管コロニーに特有のTSSがさらに302個（全TSSの12%）検出された（図3Dおよび3E）。そのうち76個は一次TSS（一次TSS全体の7％）であり、試験管内では検出されなかったS. copriの17個のPULのうち11個と関連していた。例えば、PUL15のP4D_02382がコードするhelix-turn-helix（HTH）転写制御因子は、糖/プロトンシンポーター（P4D_02381）と共転写していることが確認された。一方、in vitroではどちらの発現も検出されなかった（図3F）。PULのTSSに加えて、β-/α-アミラーゼをコードするP4D_631-633のような追加遺伝子のTSSも捕捉され（表S1B）、S. copriがマウス腸内で活発にデンプンを分解していることが示唆された。同様に、デンプンを分解すると予測されているが21、機能的な確認が得られていないPUL15内の遺伝子も腸内で発現している。また、29個のPULのうち6個は、マウスの餌に含まれない成分の分解に関与する遺伝子のクラスターであると推定されるもの、あるいは我々の実験環境では誘導刺激が存在しないものの発現は検出されなかった。

全体として、我々はin vitroと in vivoの両方でS. copriの転写ランドスケープの包括的なマップを作成し、S. copriの1,000以上の一次TSSを同定することができた（図3E）。興味深いことに、同定されたTSSの中で、さらなるsRNAのアノテーションはなく、マウスの腸でのみ発現する潜在的なsRNA制御因子は存在しないことが示された。

エガテラ-保存型sRNA SrcFはヒト腸内細菌叢に高濃度に存在する

アノテーションされたエレメントの中から、細菌における重要な転写後制御因子であり、遺伝子発現の微調整に関与する遺伝子間非コードRNAを同定した。それにもかかわらず、我々はS. copriの腸内コロニー形成に対するsRNAの寄与を明らかにすることを目的とした。我々は、S. copriHDA03、HDB01、HDC01、およびHDD04株のメタゲノムとメタトランスクリプトームを、それぞれのドナー（ドナーA、B、C、およびD）から入手した。その結果、S. copri分離株をin vitroで増殖させた場合と比較して、ヒトの便サンプルにおける保存sRNAの発現を定量することができた（図4 C；Table S2 ）。興味深いことに、ScnR282とScnR157は、全ドナーにおいて最も発現低下したsRNAのひとつであった（図4C）。同様に、全ドナーにおいて、ScnR276のアップレギュレーションが観察されたが、ScnR247はドナーA、B、Dではアップレギュレーションされたが、Cではアップレギュレーションされなかった（図4C）。ScnR276の塩基配列（SegatellaRNA colonization factorの頭文字をとってSrcFと命名（後述））を解析したところ、4つのドナー系統すべてにおいて、塩基レベルでの高い保存性とゲノムの共時性が示された（図4Dおよび4E）。S. copriHDD04をコロニー形成したOMM12マウスでは、マウスの結腸および盲腸におけるScnR276（SrcF）、ScnR247、およびScnR282の発現は、ヒトのドナー便で観察された発現と類似していた（図S1F）。

図4セガテラ必須RNAコロニー形成因子SrcFはヒト腸内細菌叢に高濃度に存在する。

キャプション

未同定のS. copri分離株を含むヒトマイクロバイオームを調査するため、同定されたS. coprisRNAの保存解析を、上記の選択された分離株以外にも拡張し、ヒト腸内9種34に属する、配列決定されたすべてのSegatella株において系統的な保存解析を行った（図S2A）。同定されたsRNAのほとんどは、S. copri（旧P. copriclade A、n= 186）において高度に保存されており、60％以上が少なくとも2つの追加Segatella種に存在した（図S2A）。SrcFの場合、分析したS. copri全株の97%に存在する（図4F）。さらに、S. brasiliensis株の35％が、SrcFS. copri遺伝子座と相同な遺伝子座内にSrcF様配列を持つ。S. brunsvicensis株の80％、S. sinensis株の70％、S. sinica株の63％では、それぞれフランキング遺伝子が共起しているが、これらの株ではSrcFはほとんど存在しない（図S2B）。さらに、Segatella属以外のSrcFの存在は、Unified Human Gastrointestinal Genome（UHGG）43コレクション（n= 4,744種、200,000ゲノム）内で決定された。その結果、SrcFはPrevotellasp900557255（S. copriclade Aの代表）とPrevotellasp900556795（SGB1635,S. copriclade D =S. brasiliensis）でのみ見つかった。ScnR282やScnR247などのS. coprisRNAは、Prevotellasp900557255（S.copriクレードA代表）にのみ存在した。

S.コプリ株におけるSrcFの高い保存性と、UHGGコレクションに代表される種におけるSrcF配列の欠如により、未特性のS.コプリ分離株を保有するヒトサンプルにおけるこのsRNAの発現をより深く調べることができる。S. copriがコードするsRNAの発現を、S. copri42株（S. copriの5%以上、n= 93、STAR Methods参照）を保有するヒトのメタトランスクリプトームで解析した（図4G）。これらのヒトサンプルにおけるSrcFの発現中央値は、最も高発現のsRNAの一つであった（1,000 transcripts per kilobase million [TPM]、図4G;表S2E）。このことから、SrcFはS. copri株の間で強く保存されているsRNAであり、ヒトのマイクロバイオームでも高発現していることから、このS. coprisRNAが腸内で重要な役割を果たしていることが示唆された。

rcFはS. copriの腸内コロニー形成に必須である

272ntのSrcF sRNAの構造予測では、5′末端が高度に構造化され、3′末端がステムループになっており、細菌における標準的な非コード制御RNAの特徴に似ていることが示された（図5A）。SrcFが腸内コロニー形成の重要な非コードRNA制御因子であるかどうかを調べるため、HDD04株でSrcFを遺伝的に欠失させ（ΔSrcF ）、ノーザンブロット検出によって発現の欠如を検証した（図5B）。.コプリ野生型（WT）株とΔSrcF株は同様の増殖プロフィールを示し、in vitroでのSrcF欠失による強い増殖不良は否定された（図5C）。さらに、OMM12マウスをHDD04 WT株とΔSrcF株（比率1：1）で共コロニー化し、糞便サンプル（n= 6）中のS. copriの存在量を経時的にモニターした（図5D）。S. copriHDD04（WT +ΔSrcF ）によるOMM12マウスのテーブルコロニー形成は、糞便からの16S rRNAアンプリコンシークエンシングによって検証された（図5 D；Table S3B）。S.コプリWTとΔSrcFの相対量を、コロニー形成後3、5、7、14日目に株特異的プライマーを用いたqPCRで測定したところ、14日目にはS.コプリWTがΔSrcFに1,000倍以上の差をつけていた（図5E）。ヒトマイクロバイオームにおけるSrcFの高発現（図4）と一致することから、SrcFはS. copriの腸内コロニー形成に不可欠な因子であることが裏付けられた。

図5 SrcFはS. copriの腸内コロニー形成に必須である。

キャプション

rcFは特定の複合多糖類に応答してS. copriの遺伝子発現に影響を与える。

SrcFの欠失は、おそらく遺伝子発現の調節を介して、S. copriの腸内コロニー形成における顕著な適性欠損を引き起こす。SrcFの制御下にある遺伝的ネットワークを知るために、SrcFの発現が最も高くなるStatまで成長させたS. copriWT株とΔSrcF株の遺伝子発現解析を行った（図2Cおよび5F参照）。rcF欠失により、42の遺伝子がアップレギュレーションされ、69の遺伝子がダウンレギュレーションされた（-2 >log2fold > 2,p-adj < 0.05）（図5F;表S3D）。SrcFが存在しない場合、S. copriHDD04のPUL11、PUL22、およびPUL23は発現が上昇し、PUL16は発現が低下したことから、PULの発現制御におけるSrcFの役割が示唆された（図5FおよびS4A）。さらに、推定輸送系（例えば、外膜および内膜トランスポーターをコードするP4D_01551-1555）や代謝酵素（例えば、β-ガラクトシダーゼおよびα_L-フコシダーゼをコードするP4D_02317-2319）をコードする遺伝子の発現もΔSrcFで低下しており、基質の取り込みおよび代謝の制御に関与している可能性が示唆された（図5F；表S3D）。NA結合タンパク質もまた、SrcF非存在下で、機能未知遺伝子のサブセットと同様に発現低下している（図5F）。全体として、SrcFの欠損は、S. copriのトランスクリプトーム、特に代謝と栄養獲得の制御に関与する経路の大幅な調節阻害をもたらした。このことは、SrcFが遺伝子発現レベルで炭素利用を制御している可能性を示唆している。

SrcF 欠失により、複数の PUL と栄養獲得遺伝子の発現が変化したことから（図 S4A）、炭素源の利用可能性が SrcF の発現に影響する可能性があると考えられた。S.copriは、イヌリン、アラビナン、アラビノキシラン、ペクチン、ペクチン性ガラクタン、キシラン、グリコーゲンといった、S.copriが唯一の炭素源として利用することが知られている複合糖質21を含む最小培地で培養した。ルコースを対照とし、SrcFの発現を測定した。S.コプリをイヌリン、キシラン、アラビノキシラン、グリコーゲンのみを炭素源として生育させた場合、rcFの発現は乏しかった（図5G）。同様に、イヌリン、キシラン、グリコーゲンをリッチ培地に添加しても、SrcF の発現は低下した（図 5H）。このことから、SrcFレベルはS. copriが利用する複合糖質の代謝によって調節され、その結果、SrcFの制御下にある代謝遺伝子の発現に影響を与えると考えられる。

rcFはイヌリンの代謝によって抑制される

複合多糖の利用可能性によるSrcF発現の特異的制御をより良く理解するために、S.copriによるイヌリン利用がSrcF発現にどのように影響するかを調べた。.copriのHDD04には29個のPULがコードされているが、そのうち特定の複合多糖を利用することが実験的に検証されているのは4個だけである21。どのPULがキシランとグリコーゲンを利用するのに必要なのかはまだ不明であるが、我々は以前にPUL26とそのハイブリッド2成分系（HTCS）制御因子（HTCSInu ）がイヌリンの利用に必須であることを同定している21（図S2C）。

イヌリンβ-(2-1)-フルクトースポリマー、あるいはそこから誘導されるオリゴ糖や単糖がSrcFのダウンレギュレーションにつながるかどうかを調べるため、S. copriをイヌリン、フラクトオリゴ糖（FOSs）、あるいはフルクトースを添加した脳心筋注入液（BHI）で培養した。SrcFの発現はノーザンブロットで測定した（図6A）。興味深いことに、単糖フルクトースを含む3つのイヌリン成分はすべてSrcFのダウンレギュレーションをもたらした（図6A）。SrcFの発現をWTとΔhtcsInuの間で比較すると、イヌリンとFOSによるsRNAのダウンレギュレーションはHTCSInuに依存していた（図6B）。興味深いことに、フルクトースによるSrcF発現抑制もHTCSInuに依存していた（図6B）。しかしながら、グルコース、ガラクトース、キシロースのような他の単糖の存在下では、いずれの株でもsRNAは抑制されない（図S2D）。特にアラビノースはSrcFを抑制したことから、SrcF発現に影響を与える新たなシグナルである可能性がある（図S2D）。興味深いことに、S. copriのPUL26Inuの HTCS は、Bacteroides 由来のHTCSInuと高い保存性を示し、フルクトースと相互作用する残基が同定されていることから44、S. copri由来のHTCSInuは、イヌリン分解由来のフルクトースと直接相互作用する可能性が示唆された（図 S3 ）。

図6 SrcFはS. copriによるイヌリン代謝によって抑制され、マウス腸内ではHTCSInuによって制御される。

キャプション

SrcFはコロニー形成に必須であり、その発現はPUL26HTCSInuによって抑制されることから、PUL26HTCSInuは S. copriの腸内コロニー形成に影響を与える可能性があると考えられた。.copriのWT株とΔhtcsInu株をOMM12マウスで競合させ（1：1の比率）、糞便からの16S rRNAアンプリコンシークエンシングによってコロニー形成を確認した（図6C;表S3C）。その結果、S. copriΔhtcsInuはWT株と競合し、イヌリンの利用はS. copriのコロニー形成に必須ではないことが示された（図6D）。逆に、ΔhtcsInuを欠失させると、ΔhtcsInuがWT株を強く（1,000倍以上）駆逐するため、腸内でのコロニー形成に有利となる（図6D）。ΔhtcsInuのコロニー形成の優位性は、フルクトースを介したSrcF抑制に対するこの株の鈍感さに起因する可能性がある（図6D）。このことを検証するために、ΔSrcFΔhtcsInu二重欠失株を作製し、OMM12マウスをΔhtcsInu株と共コロニー化した。驚くべきことに、ΔhtcsInu株はΔSrcFΔhtcsInu株を凌駕し、腸内コロニー形成におけるSrcFの役割をさらに支持した（図6E）。また、ΔSrcFΔhtcsInu株とS. copriWT株をOMM12に共存させたところ、ΔSrcFΔhtcsInu株はS. copriWT株を上回ったことから、HTCSInuはSrcF非依存的にS. copriのコロニー形成にも影響を与えていることが示された（図S4C）。

TCSInuはマウス腸内のSrcFレベルを制御する

SrcFとHTCSInuの関連性を明らかにするため、我々はOMM12マウスにS. copriWT株、ΔSrcF株、ΔhtcsInu株を別々にコロニー形成させ、マウスの腸内で異なる制御を受ける遺伝子を同定することを目的とした。その結果、S. copri ΔSrcF株はマウスをコロニー形成することができず、これは腸内コロニー形成の強い欠損と一致していた（図6F）。対照的に、S. copriWT株とΔhtcsInu株はOMM12マウスにコロニー形成し、後者の方が14日目の糞便中の存在量が高かった（図6F）。S. copriWT株とΔhtcsInu株のマウス腸管からのランスクリプトーム解析から、ΔhtcsInuの欠失は71遺伝子のダウンレギュレーションと94遺伝子のアップレギュレーション（-2 >log2fold > 2,p-adj < 0.05）を引き起こし（図6のG;表S3のG）、PUL26制御以外の役割を示唆している。さらに、ΔhtcsInuの欠失は腸におけるSrcF発現のアップレギュレーションを引き起こし、ヒトドナーの便サンプルで観察される範囲の存在量レベルに達した（図6H）。また、ΔhtcsInu株では、in vitroにおけるSrcF制御遺伝子のうち、さらに21遺伝子がin vivoで発現低下している（図6G;表S3H）。これらの結果から、S. copriによるフルクタン利用は、必須のコロニー形成因子SrcFをダウンレギュレートし、イヌリン利用を停止すると、gnotobioticマウスの腸内でS. copriがコロニー形成に有利になることが示された。これと一致して、マウス腸内におけるS. copriのトランスクリプトーム解析から、PUL26はOMM12-S.copriをコロニー形成したマウスの結腸および盲腸でダウンレギュレートされる一方、アラビナン、ペクチン性ガラクタン、アラビノキシランの利用に必要なPUL14、PUL21、PUL24などの他のPUL21は、in vitroで増殖させたときと比較してマウス腸内で誘導されることが示された（図S4B；表S3EおよびS3F）。

同居常在菌によるオリサッカライド分解はS. copri腸内コロニー形成因子の発現に影響する

rcFの発現はイヌリンの利用によって抑制され、S. copriを保有する多くのヒト腸内細菌叢で高発現している。そこで、ヒトのマイクロバイオームにおける多糖類の分解能力、特にフルクタン類の分解能力が、in vitroで観察された制御を再現するかどうかを検討した。その結果、40検体（43％）がSrcFの高発現（＞1,000 TPM、高発現）を示し、28検体（30％）がSrcFの低発現（＜1,000 TPM、低発現）を示した（図7A）。25検体（27%）のサブセットはSrcF発現を示さず（TPM = 0）、これらの検体ではカバレッジが不十分であるか、この遺伝子座が存在しない可能性がある（表S2E）。ヒトドナーにおけるrcF発現は、S. copriの存在量と相関していない（R = -0.018,p= 0.88, Spearmanの相関、図S5A）ことから、微生物叢の違いなどの外因的シグナルがSrcF発現プロファイルに寄与している可能性が示唆される。微生物叢組成のaxonomic解析では、SrcF発現の高いサンプルと低いサンプルの間でα多様性に有意差は見られなかったが、β多様性にはわずかな差が観察された（p= 0.011、PERMANOVA）（図S5BおよびS5C）。炭水化物活性酵素（CAZymes）に基づく機能解析では、SrcF発現量の高いマイクロバイオームと低いマイクロバイオームでは、機能性が異なることが示唆された（p= 0.001, PERMANOVA;Figure S5D;Table S4 ）。特に、フルクタン切断を担うGHであるグリコシルヒドロラーゼ32（GH32）の遺伝子含量は、SrcF高発現サンプルではSrcF低発現サンプルと比較して有意に低かった（図7B）。この観察結果から、群集内の他の常在菌によるフルクタン代謝がSrcFの発現に寄与し、結果としてS. copriのコロニー形成に影響を及ぼしている可能性が考えられた。具体的には、Bacteroides caccae、Bacteroides ovatus、Bacteroides fragilisはイヌリン（β2-1フルクタン）を利用するが、レバン（β2-6フルクタン）は利用せず、B. thetaiotaomicronはレバンを利用するが、イヌリンは利用しない。S. copri の場合、イヌリンを利用することはできるが、レバンを唯一の炭素源として生育することはできない（図 7C）ので、レバンの存在は SrcF 発現に影響しないはずである。レバンを補充しても、S. copri のWT またはΔhtcsInuにおいて SrcF 発現をダウンレギュレートすることはできなかった（図 7D）。S. copriWT をB. thetaiotaomicron と共培養すると、SrcF はレバン依存的にダウンレギュレートされ、B. thetaiotaomicronによるレバン分解がS. copriの SrcF のダウンレギュレーションにつながることが示された（図 7E）。一方、ΔhtcsInuでは、B. thetaiotaomicronとlevanの存在はSrcFのダウンレギュレーションを引き起こさず、フルクトースを介したSrcFのダウンレギュレーションがHTCSInuを介してシグナル伝達されるというモデルを支持した（図7EおよびS6）。以上のことから、複合多糖類の分解は、交差摂食メカニズム45に寄与するだけでなく、同居常在菌の遺伝子発現にも影響を与える可能性があることが示された。

図7 SrcFは同居常在菌によるフルクタン分解によって抑制される。

キャプション

考察

腸内細菌の体力は、生存するために変化する環境を察知し、それに迅速に対応する能力に依存している。腸内では、常在細菌は宿主からのシグナルや食餌中の栄養素を効果的に解釈し、それに応答しなければならない。また、安定したコロニー形成を成功させるためには、腸内の他の住人と協力的・拮抗的な相互作用を行わなければならない。このような制御機構を理解することは、基礎研究にとっても、微生物に基づく治療法の開発にとっても非常に重要であるが、ヒトの常在菌のうち、モデル動物以外の多くの常在菌について、複雑なコロニー形成戦略に関与する常在遺伝子の制御に関する研究はほとんど行われていない。

最近、S. copri複合体のメンバーの菌株コレクションが拡大し、遺伝学的ツールが開発されたことで、S. copriの機能研究を開始することが可能となった。本研究では、S. copriのHDD04株とDSM18205T株について、ほぼ同様のグローバルRNA構造を明らかにし、S. copri（旧Prevotella copriclade A）に保存されている豊富なノンコーディングsRNA制御因子を明らかにした（図2およびS1 ）。S.コプリの遺伝的扱いやすさに株ごとの違いが観察されたことから、S.コプリHDD04は、タイプ株であるS.コプリDSM18205Tよりも遺伝的に扱いやすいことから、今後の機能研究のモデルとして提案することにした21。同定されたsRNAの保存性が高く、S.コプリを保有する個体における存在量が一般的に高いことから、ヒトマイクロバイオームにおけるこれらの制御RNAの発現解析を直接行うことができる。NA抽出法やライブラリー調製プロトコールでは、小さな転写産物は捕捉できない可能性があるため、すべての公開データセットがsRNAの発現決定に適しているとは限らない。それにもかかわらず、我々はこの方法を用いて、ヒトマイクロバイオームにおいて一般的に高発現している必須RNAコロニー形成因子SrcFを同定した。

SrcFの欠失は、S.copriの腸内コロニー形成能力に強く影響し、PULを含む栄養素の取り込みと利用の両方に関与すると推定される遺伝子の発現を調節しない（図5）。コプリは複雑な炭水化物を代謝するのに適した腸内細菌である5,10,20。腸内で様々な炭素源を奪い合うためには、効率的なエネルギー採取とコロニー形成の成功のために、遺伝子発現を多目的に微調整する必要がある2,22。大腸菌のようなモデル生物では、エネルギー源の階層性が深く理解されており、 sRNAが炭素源の利用可能性に応じて細菌の遺伝子発現を再構築する役割を果たすことが示されている。rcFは複合糖質によって制御され、特定のPUL遺伝子座の発現を制御する。このことから、SrcFはS. copriが腸内で生存するために不可欠な栄養素を統合する制御ハブの役割を果たしている可能性が示唆された。B . テタイオータオミクロン（B. thetaiotaomicron）では、フルクタンレバンを分解するPULのHTCS制御因子が、フルクトース単糖を直接感知することが示されている。HTCSInuがフルクトースに直接結合する可能性は、保存性解析から示唆されている（図S3 ）。HTCSInuがSrcFの発現をどのように制御しているのかは、まだ解明されていない。

また、B. ovatusによるイヌリンの表面分解は、Phocaeicola vulgatusとの交雑摂食を引き起こす45。同様に、B. thetaiotaomicronによるレバンの細胞外分解は、他のバクテロイデス属菌の増殖をサポートする46。我々は、B. thetaiotaomicronによるレバンの分解が、S. copriのSrcF抑制につながることを示した（図7）。同時に、ヒトの微生物群では、フルクタンに特異的なGH32がSrcFの低発現と相関していることから、これらの微生物群がフルクタンを分解してフルクトースを放出する能力が高いことが示唆された。これらを総合すると、複合多糖類の分解は、腸内常在細菌のエネルギー資源として貢献するだけでなく、遺伝子発現やコロニー形成能力に影響を与える重要な細菌間シグナルとして機能する可能性がある。腸内細菌の代謝活性が同居細菌のコロニー形成にどのような影響を及ぼすのかについては、さらなる研究が必要である。興味深いことに、食事から摂取される単量体のフルクトースとグルコースが、B. thetaiotaomicronのコロニー形成制御因子であるRocの発現に影響を与えることが示されている50 、51。注目すべきことに、rocの5′mRNAリーダーはフルクトースとグルコースに応答するために必要であり、B. thetaiotaomicronにおけるコロニー形成の転写後制御を示唆している50。B.テタイオータオミクロンにはSrcFは存在しないが、この例は、腸内常在菌のコロニー形成制御、特に食餌性成分に反応したコロニー形成制御における転写後制御の可能性を浮き彫りにしている。

SrcF sRNAの欠失は、S. copriの遺伝子発現に強く影響する。SrcFがRBPとともに機能し、標的遺伝子を直接制御するのか間接的に制御するのかは、まだ明らかにされていない。相同性から、S. copriは既知のsRNA結合タンパク質をすべて欠いている。特に、細菌52で報告されているHfq、ProQ、CsrAという3つの主要なRBPや、最近B . thetaiotaomicronで報告されたRBPファミリーを欠いている53 、54。注目すべきは、S. copriの遺伝学的解析は依然として困難であることである、しかしながら、S. copriにおけるTSSと制御エレメントの同定は、異所性遺伝子発現のためのコンストラクトを含む遺伝学的ツールの開発への極めて重要な足がかりとなる。このような進歩は、遺伝子の過剰発現を容易にする29 、57、あるいは遺伝子機能解析を合理化するためのCRISPRiベースのスクリーニング60 、61 、62などに有望である。

OMM12マウスにS. copriをコロニー形成させることで、1回の実験で腸内常在菌のdRNA-seqを行い、in vivoで発現している遺伝子のTSSを同定することができた。S.コプリを異なる食餌成分やより複雑な微生物叢に暴露することで、S.コプリのRNAランドスケープに新たな要素が発見されるかもしれないが、今回のアプローチにより、S.コプリのコロニー形成因子を同定し、検証することができた。今後、S. copriにおけるゲノムワイドなスクリーニングの確立を目指した研究が進めば、S. copriの腸内コロニー形成に必要な因子のさらなる発見が期待される。

最後に、マイクロバイオームの構成はヒトの健康に重要な役割を果たしており、長年の目標は、問題のあるマイクロバイオータメンバーを特定し、それを改変することであった。今回我々は、腸内コロニー形成に必須なS. copri特異的遺伝子間sRNAとしてSrcFを同定した。このような遺伝的要素は、マイクロバイオームの精密編集のターゲットとして有望である。S.コプリの存在は、ヒトにおける関節リウマチの発症と関連しており12 、15、特定のS.コプリ分離株は、マウスモデルにおいて関節リウマチを悪化させることが示されている16。さらに、ある種のプレボテラ・コプリ株（現在はS.コプリ）の存在は、バングラデシュの子どもたちの栄養失調と闘うためのマイクロバイオーム指向の補完食治療の成功に大きく寄与している64,65。このことは、セガテラ属のコロニー形成を成功に導く要因を理解することが、将来および現在のマイクロバイオーム介入療法に多大な影響を与える可能性があることを示している。

リソースの利用可能性

連絡先

詳細については、リードコンタクトであるTill Strowig教授（till.strowig@helmholtz-hzi.de ）にお問い合わせください。

試薬の入手可能性

本研究で作製されたプラスミドおよび細菌株を含む、ユニークで安定した試薬は、要望に応じて主任連絡先から入手可能である。

ATAおよびコードの入手可能性

RNA-seq、dRNA-seq、16S rRNAアンプリコンシーケンスの生データはNCBI-SRA Bioprojectに寄託されており、発表日現在一般に入手可能である。配列番号は主要リソース表に記載されている。ノーザンブロットの画像はMendeleyに寄託されており、公開日現在で入手可能。DOIは主要リソース表に記載されている。

本論文はオリジナルコードを報告していない。

本論文で報告されたデータを再解析するために必要な追加情報は、要求があれば主担当者から入手可能である。

謝辞

Vertis Biotechnologie AG社には、dRNA-seq用ライブラリーの作製に多大な技術協力をいただいた。また、RNA-seqと16S rRNAシーケンシングのライブラリー調製をそれぞれ担当してくれたAgata BieleckaとAchim Gronowに感謝する。Haiyi Wangには技術的な支援をいただいた。また、Mikrodiversヒトドナーサンプルの処理にご協力いただいたEric Galvez氏に感謝する。RNA-seqデータ作成については、ヴュルツブルク大学のCore Unit SysMedおよびHelmholtz Centre for Infection Research（HZI）のゲノム解析コア施設に感謝する。.E.M.はDeutsche ForschungsgemeinschaftのWalter Benjamin positionの支援を受けた（助成金DFG EL 1232/1-1）。J.V.はGottfried Wilhelm Leibniz Prizeの助成を受けた（DFG Vo875-18）。.S.はドイツ研究財団（DFG）の個人助成金（STR 1343/15-1）およびドイツの卓越戦略-EXC 2155 "RESIST"-プロジェクトID 390874280の助成を受けた。

著者貢献

概念化、Y.E.M.およびT.S.、方法論、Y.E.M.、C.T.およびT.S.、調査、Y.E.M.、C.T.、K.D.H.、L.A.、T.R.L、執筆-原案、Y.E.M.およびT.S.、執筆-総説および編集、Y.E.M.、C.T.、K.D.H.、L.A.、F.P.、J.V.およびT.S.、資金獲得、T.S.およびJ.V.、リソース、T.S.およびJ.V.、監督、T.S.

利益申告

著者らは、競合する利益はないと宣言している。

TAR★方法

EYリソース表

EAGENTまたはRESOURCE SOURCE IDENTIFIER

細菌およびウイルス株

本研究で使用した細菌株本研究表S5

生物学的試料

ヒト便サンプル（ドナーA～D）本研究 N/A

化学物質、ペプチド、組換えタンパク質

evan Sigma-Aldrich Cat#L8647

ラビナン Megazyme Cat#P-ARAB

ラビノキシラン Megazyme Cat#P-WAXYRS

ヌリンカーボシンス Cat#YI01274

北極ガラクタンメガザイム Cat#P-PGAPT

イランカルボシンス Cat#YC05381

ウシン Sigma-Aldrich Cat# M2378

リコゲン Sigma-Aldrich Cat#G0885

エクチン Fluka Cat#76282

ラクトオリゴ糖 Biosynth Cat# OF05207

ルクトース Sigma-Aldrich Cat# F0127

ynaMarker, Prestain Marker for Small RNA Plus Biotrend DM253S

erminatorエキソヌクレアーゼ Vertis Biotechnologie AG N/A

4 ポリヌクレオチドキナーゼ New England Biolabs Cat#M0201

市販アッセイ

EGAscript T7 転写キット Thermo Fisher Scientific Cat# AMB13345

ig 発光検出キット Sigma-Aldrich Cat#11363514910

IG RNA標識ミックス Sigma-Aldrich Cat#11277073910

CR DIG ラベリングミックス Sigma-Aldrich Cat#11585550910

APA SYBR® FAST Merck Cat#KK4602

EBNext® Ultra™ DNA Library Prep Kit for Illumina® New England Biolabs Cat#E7370S

gencourt® AMPure® XP ビーズ Beckman Coulter, Inc. at#A63880

an-prokaryoteリボPOOLキット siTOOLs Biotech Cat#dp-K096-3

ibo-Zero PlusマイクロバイオームrRNA欠失キットイルミナ Cat# 20072062

llumina Stranded Total RNA Prep イルミナ Cat# 20040534

イルミナ用 EBNext® Ultra™ Directional RNA ライブラリー調製キット New England Biolabs Cat#E7420S

エポスデータ

リジナルブロット画像本研究 Mendeley Data:https://doi.org/10.17632/skr3snz3ry.1

シーケンスデータ PRJNA1082502

実験モデル 生物／株

egatella copriHDD04 ヒト分離株 Li et al.21

Egatella copriHDA03 ヒト分離株 Li et al.21

Segatella copriHDB01 ヒト由来分離株 Li et al.21

エガテラ・コプリHDC01 ヒト由来 Li et al.21

エガテラ・コプリDSM18205 ヒト由来林ら24

エガテラ・ブルンスビエンシスNi025 ヒト由来 Blanco-Miguez et al.34

エガテラ・シネンシスHDE04 ヒト分離株 Li et al.21

エガテラ・ブラジリエンシスHDD05 ヒト由来 Li et al.21

egatella hominisHDD12 ヒト分離株 Li et al.21

LIGO-MM12 WT C57BL/6NTac マウス 8-12 週、ドイツ、ヘルムホルツ感染研究センターの無菌施設で gnotobiotic isolaters で飼育されたマウス Brugiroux et al.

リゴヌクレオチド

本研究で使用したNAオリゴヌクレオチド本研究表S5

組換えDNA

本研究で作製したプラスミド本研究表S5

ソフトウェアとアルゴリズム

NNOgesic Yu et al.25 https://annogesic.readthedocs.io/en/latest/

EADemption Förstner et al.66 https://reademption.readthedocs.io/en/latest/

etaPhlAn 4 (v 4.0.0) Blanco-Miguez et al.67 https://github.com/biobakery/MetaPhlAn

lastn (v2.5.0) Altschul et al.68 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

raphPad Prism v8.4.3 GraphPad Software, Inc. /A

amtools (v1.3.1) Danecek et al.69 N/A

owtie2 (version 2.4.2) Langmead andSalzberg70 https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml

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実験およびモデル被験者の詳細

倫理声明

動物実験は、ドイツ・ブラウンシュヴァイクのヘルムホルツ感染研究センター（Helmholtz Centre for Infection Research）のガイドライン、国内動物保護法（Tierschutzgesetz (TierSchG)）および動物実験規則（Tierschutz-Versuchstierverordnung (TierSchVersV)）、および欧州実験動物科学連合（FELASA）の勧告に準拠して実施した。本研究は、ニーダーザクセン州自然・環境・消費者保護局（LAVES）（ドイツ、ニーダーザクセン州、オルデンブルク）の承認を得た。

ヒトデータ収集

ハノーファー医科大学の倫理委員会（MikroDivers: 8628_BO_K_2019）の審査および承認を得た。llの患者/参加者は、本研究への参加について書面によるインフォームド・コンセントを提供した。MikroDiversコホートは、18歳以上の健康なボランティアを募集する進行中の研究である。参加基準は、インフォームド・コンセントに署名する意思と能力があり、糞便サンプルを提供し、地理的由来、食事の嗜好、年齢、性別に関するアンケートに回答することである。除外基準は、最近の抗生物質摂取（4週間未満）、化学療法薬および免疫抑制薬の摂取（過去に摂取したことがある）、急性および慢性の炎症性腸疾患、大腸がん、糞便微生物叢移植のレシピエント、直接患者のケアに携わっていること（病院など）である。2024年7月までに30人以上が組み入れられた。S. copriを保有する4人のドナーは以下の通りである：ドナーA（地理的起源：ドイツ、年齢：39歳、食事：雑食、性別：男性）、ドナーB（地理的起源：バングラデシュ、年齢：31歳、食事：雑食、性別：女性）、ドナーC（地理的起源：コロンビア、年齢：33歳、食事：雑食、性別：男性）、ドナーD（地理的起源：ブラジル、年齢：26歳、食事：雑食、性別：男性）である。ヒトの便サンプルからのメタトランスクリプトミクスとメタゲノミクスの結果に、性別が影響することは報告されていない。

氷

ligo-M12 C57BL/6NTac39マウスは、Helmhotz Centre for Infection Researchの無菌施設内のアイソレーター（Getinge社製）で飼育した。8～16週齢の雌雄マウスを使用した。殺菌した餌と水を自由摂取させた。氷は12時間の厳密な光サイクル下で飼育され、1ケージあたり3匹までの群に分けられた。マウスはCO2による窒息と頚椎脱臼により安楽死させた。

菌株

egatella copri株および派生株（表S5）は、Brain Heart infusion (BHI) broth (Oxoid, #CM1135B ) (37g/l) に10% FBS ( Sigma Aldrich, #F7524 )とビタミンK3を1μg/ml添加したBHI-S液体培地で培養した。または固形で増殖させた株を、5%のウマ血液（Thermo Scientific, #SR0050C ）と1 μg/mlのビタミンK3を添加したBHI寒天平板（37 g/l BHI, 18 g/l 寒天）上で増殖させた。培養は、10％CO2、4％H2、86％N2の雰囲気の嫌気チャンバー（Coy Laboratory Products社製）内で37℃で行った。コロニーからS. copriを接種し、37℃のBHI-S静置培養で一晩培養した後、一晩培養した培養液を1:100に分培し、S. copriを目的のOD600nmまで増殖させた。必要に応じて、BHI-Sに5μg/mlのエリスロマイシンを添加した。scherichia coli株はLysogeny broth（LB）（トリプトン10g/l、酵母エキス5g/l、塩化ナトリウム10g/l）で培養した。菌体培養は37℃、200rpmで好気的に培養した。必要に応じて、LBにアンピシリン（200 μg/ml）と0.3 mM 2, 6-ジアミノピメリン酸（DAP）を添加した。

エガテラ・コプリは、唯一の炭素源として複合多糖類の存在下でも増殖した。tは、前述21のように調製した最小培地に10g/lの複合多糖類溶液を1:1で添加した培地で増殖させた。あるいは、多糖類溶液をBHI-Sに1：1で添加した。アラビナン（Megazyme）、アラビノキシラン（Megazyme）、ペクチン性ガラクタン（Megazyme）、キシラン（Carbosynth）、ムチン（Sigma）、グリコーゲン（Sigma Aldrich）、ペクチン（Fluka）、レバン（Sigma aldrich）、イヌリン（Carbosynth）の溶液を水中で調製し、オートクレーブ滅菌した。また、可能であれば、水溶液を調製し、ろ過滅菌した。HI-Sはまた、オリゴ糖と単糖の溶液を1:1で添加した。ラクトオリゴ糖（Carbosynth）、フルクトース（Sigma）、グルコース（Sigma）、ガラクトース（Sigma）、キシロース（Sigma）およびアラビノース（Sigma-Aldrich）溶液（10 g/l）を水に溶解し、ろ過滅菌した。

方法の詳細

遺伝子操作

遺伝子操作に用いたリゴヌクレオチドおよびプラスミドを表S5に示す。egatella copri欠失は、マイナーな変更を加えて、以前に記載された21のように作製した。SrcFの上流および下流の2kb断片をQ5 High Fidelity DNA Polymerase（New England Biolabs）でPCR増幅し、DNA Gibson assembly（HiFi DNA Assembly Master Mix, New England biolabs）を介してPCR増幅したpEx-deletion-ermGにクローニングした。クローンはPCRで遺伝子型判定され、陽性クローンはMicrosynth Seqlab（ドイツ）でサンガー配列決定により検証された。S. copriHDD04におけるSrcFの遺伝子欠失のオンジュゲーションおよび選択は、既述のように実施した。pEx-deletion-ermG-SrcFを導入した大腸菌β2155を、アンピシリン添加LB中、好気的条件下でOD600nm 0.5-0.7まで増殖させ、細胞1mlをペレット化し、抗生物質無添加LBで洗浄し、ペレット化した細胞を嫌気チャンバー（Coy lab）に移した。copriHDD04 レシピエント株をBHI-SでOD600nm 0.5-0.7まで増殖させた。ドナー株のペレットを100μlのS. copri培養液に再懸濁し、DAP（大腸菌β2155がDAPに対してオーソトロフ）を含むBHI-blood寒天培地プレートにスポットし、嫌気下でコンジュゲーションのために37℃で18時間培養した。増殖した菌体を1mlのBHI-Sに再懸濁し、5μg/mlのエリスロマイシンと200μg/mlのゲンタマイシンを添加したBHI-血液寒天培地に100μlをプレーティングし、37℃で2〜4日間嫌気培養した後、トランスコンジュガントを選択した。正しいトランスコンジュガントをPCRで確認し、対立遺伝子交換のためにBHI-Sで再培養し、プラスミド統合維持のネガティブセレクションとして5％スクロースを添加したYT（酵母エキス5g/l、トリプトン10g/l）寒天プレートにプレーティングした。37℃で2～4日間培養して生育した株は、エリスロマイシンを添加したBHI-blood plateと無添加のBHI-blood plateにストリークし、抗生物質感受性株はPCRで遺伝子欠失の遺伝子型を決定し、Microsynth Seqlab（ドイツ）でサンガー配列決定により検証した。

全RNA単離

目的の菌株を所望の細胞密度まで嫌気的に増殖させ、OD600nmの4単位のバイオマスを停止液（95％エタノール、5％フェノール）で5：1（v/v）に回収し、液体窒素でスナップ凍結した。活性全RNAをホットフェノール法で抽出した後、DNase処理した。またはマウスの腸内容物からのRNA抽出は、マウスを犠牲にした後、盲腸および結腸内容物を直ちにRNAシールド溶液（#R2001）に懸濁し、-80℃で保存した。ZymoBIOMICS RNA Mini Kit (#R2001)を用いて、メーカーの指示に従い、全RNAを抽出した。RNAの品質は、HZI（Helmholtz Centre for Infection Research）のゲノム解析コア施設のバイオアナライザーで測定した。

オーサーンブロットとDIGリボプローブ

sRNAの直接検出はノーザンブロットで行った。短時間で10μgの全RNAを、8.3M尿素を含むTris-Borate-EDTA（TBE）6％アクリルアミドゲルで電気泳動分離した（300V、30mA）。300V、30mA)。NAをナイロンメンブレン（Sigma Aldrich、#15356-1EA）に移し、UV架橋によってメンブレンに架橋した。またはプローブとして、標的sRNAに相補的な全長アンチセンスDIG標識RNAプローブ（リボプローブ）を用いた。またはリボプローブの作製は、各プローブ用のPCRテンプレートを入手し、MAXIscript T7in vitrotranscription kit (Thermo Scientific, AM1312)を用いて、メーカーの指示に従い若干の修正を加えながらRNAプローブを作製し、ヌクレオチドミックスとしてDIG RNA labeling mix (Sigma Aldrich, #11277073910 )を添加した。標識リボプローブは、Microspin G-50カラム（Cytiva, #27 -5330-01）でさらに精製した。エンブランをRoti-HYBRIクイックバッファー（CarlRoth、#A981.1）中、68℃でリボプローブとハイブリダイズさせ、2xSSCと0.5xSSCで洗浄した。イグナル検出はDIG luminescence detection kit (Sigma Aldrich, #11363514910 )を用い、メーカーの指示に従い、ChemiDoc (Biorad)でシグナルを捕捉した。または5S rRNAローディングコントロールの検出には、5' DIG標識オリゴヌクレオチドをプローブとして用いた（Eurofins）。メンブレンを5S rRNAプローブとともに42℃でインキュベートし、5xSSC 1xSSCおよび0.5xSSCで洗浄した。シグナルはリボプローブと同様に検出した。リボプローブ用の PCR テンプレートの作製に使用したリゴヌクレオチドを表 S5 に示す。

配列決定のためのNA処理およびcDNAライブラリー調製

またはdifferential RNA sequencing (dRNA-seq)のためのライブラリーは、Vertis Biotechnologie AGで、以前に記載されたように調製した36。まず、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs）で処理した後、超音波（4℃、30秒×4パルス）を用いて全RNAサンプルを断片化した。その後、RNAサンプルを2つに分け、一方をターミネーターエキソヌクレアーゼ処理（+TEX）し、もう一方は未処理（-TEX）とした。RNAサンプルはポリ(A)ポリメラーゼを用いてポリ(A)テール化した。その後、RNA 5'ポリホスファターゼ（Epicentre）を用いて5′PPP構造を除去した。その後、RNAアダプターをRNAの5'-一リン酸にライゲーションした。オリゴ(dT)アダプタープライマーとM-MLV逆転写酵素を用いて第一鎖cDNA合成を行った。得られたcDNAを高忠実度DNAポリメラーゼを用いて約10-20ng/μlまでPCR増幅し、Agencourt AMPure XP kit（Beckman Coulter Genomics）を用いて精製した。分離したライブラリーは、細菌in vitroサンプルについてはヴュルツブルク大学のCore Unit SysMedのIllumina NextSeq 500プラットフォームで、マウス由来サンプルについてはHelmholtz Centre for Infection Research（HZI）のゲノム解析コア施設のIllumina Novaseqでシーケンスした。

または従来のRNAシーケンスでは、条件ごとに3つの生物学的複製を処理した。S. copri株の全RNAは、Pan-prokaryote riboPOOL Kit（siTOOLs Biotech）を用いて、製造元の指示に従って細菌のリボソームRNA（rRNA）を除去した。イルミナシーケンス用のライブラリーは、NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina（New England Biolabs）を用いて、メーカーの指示に従って調製した。またはメタトランスクリプトームシークエンシングでは、マウス腸またはヒトドナーの全RNAをRibo-Zero Plus Microbiome rRNA Depletion Kit（Illumina）によりリボソームRNA枯渇させ、Illumina Stranded Total RNA Prep（Illumina）を用いてメーカーの指示に従ってcDNAライブラリーを作製した。

ディファレンシャルRNAシーケンス（dRNA-seq）データ解析

ディファレンシャルRNAシーケンス（+/- TEX）用のライブラリーは、1,500万リード/ライブラリーの深度でシーケンスした。初期指数関数期（EEP）、中期指数関数期（MEP）、定常期（Stat）のサンプルを、S. copriHDD04株およびDSM18205T株のそれぞれのdifferential RNA-seq解析に統合した（各条件につき3反復）。また、ANNOgesicでは、転写開始点（TSS）、ターミネーター、転写産物の長さ、非翻訳領域、低分子RNA、プロモーターモチーフの同定が可能である。TSSpredator71は、アノテーションされたCDSに対する相対的な位置に基づいてTSSを5つのカテゴリーに分類する。第一に、一次TSSは与えられたCDSの上流300 ntのウィンドウ内で最もカバレッジの高いTSSと定義され、残りのTSSは二次TSSと定義される。次に、内部TSSは与えられたCDS内に位置し、アンチセンスTSSはCDSまたはCDSをアンチセンス方向に挟む100 ntのウィンドウ内に位置する。最後に、予測されたTSSのうち、どのCDSとも関連しないものは、オーファンとして分類され、遺伝子間に存在する注釈のない遺伝的要素を示している可能性がある。TranstermHP72とRNAfold73の組み合わせにより、ANNOgesicパイプラインはターミネーターを予測することができるため、転写産物の境界を予測することができる。プロモーター推定モチーフの同定では、同定された全ての一次TSSの上流50 ntを抽出し、保存モチーフを同定するためにMEME27の入力として使用した。

S.copriをcolonizeしたOMM12マウスからTSSをマッピングするために、4億リードのペアエンド2x50bpのライブラリーを作成した。S.copriのマップリードを得るために、READemption (2.0.0)と-crossalign_cleaningコマンドを使用して、S.copriHDD04ゲノムとOligo-Mouse-Microbiota (OMM12)members74,75の12メンバーにリードをアライメントし、複数の生物種にマップされたリードを除去した66。S.copriのみのリードのために生成されたカバレッジファイルは、デフォルト設定でTSSをマップするためにANNOgesicパイプラインとTSSpredatorに統合された。(+/-TEX)ライブラリーのoverageファイルをIntegrative GenomicsViewer76(IGV)にロードし、転写開始点(TSS)を可視化した。

全RNAシーケンスデータ解析

ooled ライブラリーは、Helmholtz Centre for Infection Research (HZI)のゲノム解析コア施設で、イルミナNovaseqを用いてペアエンド（2x50bp）シーケンスを行った。遺伝子ごとのリード数は、シーケンス深度（マップされたリード数）と転写産物長を考慮したTPM（transcripts per kilobase million）に正規化した。S. copriWt、S. copri、ΔSrcF、およびS. copriΔhtcsInuライブラリー間の差次的発現遺伝子は、P値を決定するためにWald検定を、多重検定（P-adj）のためにP値を補正するためにBenjamini-Hochbergを利用するDESeq277を用いて計算した77。

エタトランスクリプトームデータ解析

成人男性コホートから得られたヒト糞便微生物群集のメタトランスクリプトームデータ（372メタトランスクリプトーム）42を再解析し、S. copriにおける同定された低分子RNAの存在量を決定した。awリードを低品質でトリミングし、bbdukを用いてphix174およびヒトhg19ゲノムに対してフィルターをかけた。さらに、ribodetector v0.3.78を用いてリボソームリードを除去し、近縁種の偽陽性マッピングを避けるため、分類学的な種プロファイリングを行った：すべてのライブラリーをbwa-mem2を用いてUnified Human Gastrointestinal Genome Collection version243（n= 4,744）のゲノムに対してマッピングした。Clade-A代表ゲノム "Prevotellasp900557255 "にマップされたeadsは、samtoolsを介して新しいリードライブラリにフィルタリングされた。これらのメタトランスクリプトームのうち3つは、Unified Human Gastrointestinal Genome (UHGG)コレクションからS. copriに5%以上のリードをマッピングした43。S. copriにフィルターされたリードは、READemptionパイプライン66を使用して私たちのS. copriHDD04に再マッピングされ、注釈付けされた遺伝子間sRNAの相対発現は、リードをTPM(transcripts per kilobase million)に正規化して決定された。

S. copriHDA03、S. copriHDB01、S. copriHDC01およびS. copriHDD04。21 S. copriゲノムのアノテーションは、S. copriHDA03、S. copriHDB01およびS. copriHDC01の保存されたアノテーションsRNAの座標で修正した（図2）。注釈付き遺伝子間sRNAの相対発現レベルは、リードカバレッジをTPM（transcripts per million）に正規化することで決定した。ヒトドナーの sRNA 発現の倍数変化は、BHI でin vitro培養したそれぞれのS. copri分離株をリファレンスとして決定した。

ゲノムDNA抽出およびアンプリコン16S rRNA配列決定

マウスの糞便からZymoBIOMICS™ DNA Miniprep kitを用いて、製造者の指示に従ってゲノムDNAを抽出した。または16S rRNAアンプリコンシークエンシングを行い、V4領域を既述のように増幅した79,80プールライブラリーをIllumina MiSeqプラットフォームでペアエンド250 bpシークエンシングした。リードはopen-reference OTU pickingによって97 % IDのOTUにクラスタリングされ、代表配列はOligo-Mouse-Microbiota (OMM12)ゲノム75と S. copriHDD04の16S rRNA遺伝子を用いてUPARSEアルゴリズム82を用いて決定された。

ヒトドナーメタゲノムライブラリーの調製

ZymoBIOMICS™ DNA Miniprep kitを使用し、製造者の指示に従ってドナーA-D便サンプルからゲノムDNAを抽出した。イルミナDNA PCR-Free Library KitおよびIDT for Illumina DNA/RNA UD Indexesを用いて、以前に単離したDNAのエノームライブラリーを調製した。ライブラリーはメーカーの指示に従って調製した。ライブラリー濃度の定量はQubit ssDNA Assay Kitを用いて行い、その後KAPA Library Quantification Kit for Illuminaを用いて定量した。シーケンシングは、NovaSeq S4 PE150プラットフォームで、サンプルあたり4Gbpの深さをターゲットとして行った。

エタゲノムデータ解析

4人のヒトドナーA～Dの腸内細菌叢におけるSegatella種の相対量を決定した。セガテラ属に属する種の相対量を推定するために、リファレンスベースのアプローチMetaPhlAn 4（v 4.0.0）67を、ドナーA、B、C、D由来の4つのショットガンメタゲノムサンプルにデフォルト設定で適用した。

または公開されているデータのマイクロバイオームについて、S. copriSrcF発現レベルと各ドナーのヒト腸内細菌叢との関連を調べた。上記のように、対応するショットガンメタゲノムサンプルにおいてSrcF発現が検出された（すなわち、TPM > 0）68のショットガンメタゲノムサンプル（表S6B）をダウンロードした。ダウンロードしたサンプル中のS. copriの相対量を評価するために、まず各サンプルのメタゲノムリードをBowtie2（v2.3.5.1; --end-to-end --no-unal -U -S）を用いてClade-A代表ゲノム「Prevotellasp900557255」にアライメントした70。得られたBAMファイルはsamtools（v1.3.1; view -Sb）を用いて作成し、さらにpythonパッケージCMSeq（https://github.com/SegataLab/cmseq）を用いて以下の基準でクリーニングした： 1）リードのアライメント品質≥30、（2）リードのカバレッジ深度≥5X、（3）リードの最小同一性≥96％、（4）アライメントされたリード長≥90 nt、（5）最小優性対立遺伝子頻度≥50％。そして、各サンプルにおけるClade-A代表ゲノムの存在量は、クリーニングしたアラインメントリードをメタゲノムサンプルの総リード数で割って算出した。このアプローチは、菌株特異的リードを抽出するために、他の研究でも広く用いられている。

また、各サンプルの微生物群集組成全体の定量化には、上記のようにMetaPhlAn 4を用いた。α多様性はRパッケージmia(https://github.com/microbiome/mia)によって推定されたShannon indexを用いて計算し、β多様性は種レベルの相対存在量に基づくBray-Curtis非類似度を用いて計算し、その後、可視化のために主座標分析(PCoA)を行った(Pythonパッケージscikit-bio v0.5.7;http://scikit-bio.org/)。Rパッケージvegan v2.6.2(https://github.com/vegandevs/vegan) を用いて、ベータ多様性の並べ替え多変量分散分析 (PERMANOVA) を行った。

さらに、各サンプルについて、カスタムパイプラインを使用して、CAZymes機能キャリッジのプロファイリングも行った。簡単に説明すると、まずCAZymeデータベース（バージョン09242021、https://bcb.unl.edu/dbCAN2/download/CAZyDB.09242021.fa ）をダウンロードした。PALADINからの出力は、samtools（v1.3.1）を用いて、view -Sbの設定でBAMファイルに変換した。CAZymesに対するリードのアラインメントのカバレッジは、BBMap（https://jgi.doe.gov/data-and-tools/software-tools/bbtools/bb-tools-user-guide/bbmap-guide/）のpileup.shユーティリティスクリプトを用いて推定した。CAZymeは、カバレッジ深度が10倍以上、カバレッジ幅が100%以上の場合にのみ、メタゲノムサンプル中に存在するとみなされた。CAZymesの存在と非存在に基づくaccard距離を計算し、主座標分析（PCoA）（Python package scikit-bio v0.5.7;http://scikit-bio.org/ ）によって可視化した。CAZyme配列量における低SrcF発現群と高SrcF発現群の差の統計学的有意性は、Benjamini-Hochberg法による多重仮説検定で補正したWilcoxon Rank Sum検定で評価した。

セガテラ属におけるsmall RNAの保存性解析

セガテラ属における27のsRNAの保存性は、ヒトのセガテラ属9種に分類された、これまでに報告された1,135の高品質なメタゲノム集合ゲノム（MAG）を利用して評価した（表S6A）。簡単に説明すると、Blastn (v2.5.0)を用いて、-word_size 11 -qcov_hsp_perc 60 -perc_identity 70のカスタム設定で、27個のsRNAをMAGのそれぞれに対してアライメントした。Segatella属における各sRNAの保存性は、少なくとも1つのブラストヒットが観察されたその種のMAGのパーセンテージとして定量化した。

オリゴマウス-微生物叢（OMM12）マウスの S. copriコロニー形成

またはS. copriのコロニー形成のために、S. copriWTをOD600nmが0.5-0.8になるまで嫌気的に増殖させた。培養液をエアロックしたバイアルに移し、その後のコロニー形成に使用した。マウスに200μlのS. copriを経口投与し、50μlの培養液を経口投与した。S. copriWT、S. copriΔSrcFおよびS. copriΔhtcsInuをBHI-S中でOD600nmが0.5-0.8になるまで嫌気的に増殖させた。を混合し（1:1）、その後のコロニー形成のために混合液（投入液）をエアロックしたバイアルに移した。マウスは上記と同様に経口投与した。

反復アッセイ定量PCR法

株特異的プライマーを用いた定量的PCR（qPCR）により、競合アッセイにおけるS. copriのWT株と変異株の相対量を指示された時点でモニターした。使用したリゴヌクレオチドは表 S5 に示す。KAPA Sybr Fast Universal qPCRマスターミックス（Kapa biosystems (#KK4602)）を用い、CFX96装置（BioRad）で定量的PCRを行った。それぞれの競合実験におけるS. copriWT、S. copriΔSrcF、S. copri ΔhtcsInuの相対量を決定するため、標準曲線を用いて ean 株 DNA 量を算出した。

統計解析

統計解析は、GraphPad Prism 10とRSoftware（www.r-project.org ）を使用して行った。使用した統計検定の詳細、「n」で示されたサンプルサイズ、平均値の定義、および有意性は、それぞれの図の説明、図、および方法の説明に記載されている。

補足情報 (8)

DF (6.12 MB)

S1. 図S1-S6

プレシート (484.77 KB)

S1. 図1に関連するS. copriのifferential RNA-seq

. egatella copriHDD04転写開始点。試験管内での増殖によるTSSを含む。.OMM12コロニー化マウス由来、C. 予測されるターミネーター。Segatella copriDSM18205転写開始点。試験管内での増殖から得られたTSSとE. 予測されるターミネーターを含む。Segatella copriHDD04 small RNAアノテーション。

プレシート (44.38 KB)

S2. 図4に関連する、ヒトドナーマイクロダイバーにおけるS. coprisRNAの発現

. S. copriHDD04ドナー。S. copriHDA03ドナー。S. copriHDB01ドナー。S. copriHDC01ドナー。NCBI-SRA BioProjectのヒトメタトランスクリプトームにおけるS. coprisRNAの発現： RJNA354235。

プレシート (2.39 MB)

S3. 図3、4、5、6に関連するランスクリプトーム解析と16S相対存在量解析

. S.コプリがコロニー形成したOMM12マウスのdRNA-seq用6S rRNAアンプリコンシークエンス。C.ΔSrcFおよびΔhtcsInu競合のS.copri-colonization OMM12マウスの16S rRNAアンプリコンシークエンス。定常期におけるS. copriHDD04ΔSrcFvs. WtのTotal RNA-seq。S. copriHDD04 Wt in vitroとS. copri-OMM12コロニー化マウスの結腸のTotal RNA-seq。S. copriHDD04 Wtのin vitroとS. copri-OMM12コロニー化マウスの盲腸のTotal RNA-seq。H. マウス盲腸および結腸におけるS.copriWtおよびS. copri ΔhtcsInuのTPMにおけるS. copriScnRの発現。

プレシート（36.24 KB）

S4. 図7およびS5に関連する、SrcFの発現量が高いメタゲノムおよび低いメタゲノムにおけるAZymesの存在量

プレシート（12.72 KB）

S5. STARメソッドに関連するトレイン、プラスミド、オリゴヌクレオチド

プレシート（38.03 KB）

表S6. 図4、7、S2、S5に関連するエタゲノム、メタトランスクリプトーム、メタゲノム集合ゲノムの識別子

. A.sRNA保存解析に使用したAG識別子とそれぞれの分類されたセガテラ属種。NCBI-SRAバイオプロジェクトからダウンロードしたメタトランスクリプトームおよびメタゲノミックサンプル： RJNA354235。メタトランスクリプトームとメタゲノムが対になっていない場合、またはSrcF (TPM)がゼロの場合は除外した。

DF (10.04 MB)

S2. 論文＋補足情報

参考文献

グッドマン、A.L.

内部者の視点： 微生物叢を覗く窓としてのアクテロイデス

At. icrobiol. 017;2, 17026

ヒト常在菌Segatella copriのRNAランドスケープから、腸内コロニー形成に不可欠な低分子RNAが明らかになった

ヒト常在菌Segatella copriのRNAランドスケープから、腸内コロニー形成に不可欠な低分子RNAが明らかになった

ハイライト

概要

抄録

キーワード

はじめに

結果

S. copriHDD04およびDSM18205Tの一次トランスクリプトーム

S.コプリにおけるオンコーディングRNAレパートリーとSegatella種複合体全体の保存性

マウス腸内におけるS. copriのリマリートランスクリプトームマップ

エガテラ-保存型sRNA SrcFはヒト腸内細菌叢に高濃度に存在する

rcFはS. copriの腸内コロニー形成に必須である

rcFは特定の複合多糖類に応答してS. copriの遺伝子発現に影響を与える。

rcFはイヌリンの代謝によって抑制される

TCSInuはマウス腸内のSrcFレベルを制御する

同居常在菌によるオリサッカライド分解はS. copri腸内コロニー形成因子の発現に影響する

考察

リソースの利用可能性

連絡先

試薬の入手可能性

ATAおよびコードの入手可能性

謝辞

著者貢献

利益申告

TAR★方法

EYリソース表

実験およびモデル被験者の詳細

方法の詳細

統計解析

補足情報 (8)

参考文献

記事メトリクス

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