ディーゼル排気粒子がマルハナバチBombus terrestrisの腸内細菌叢と遺伝子発現を変化させる

第13巻 第6号 e10180
研究論文
オープンアクセス
ディーゼル排気粒子がマルハナバチBombus terrestrisの腸内細菌叢と遺伝子発現を変化させる

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ece3.10180

ディミトリ・ザイデナート、アルフォンス・R・ヴァイグ、アンドレアス・ミッテレーダー、トーマス・ヒレンブランド、ディーター・ブリュッゲマン、トーステン・オペル、ニコ・ラングホフ、マルセル・リードル、ハイケ・フェルドハール、オリバー・オッティ
初版発行：2023年6月21日
https://doi.org/10.1002/ece3.10180
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概要
昆虫は受粉や害虫駆除など多くの重要な機能を提供しているため、昆虫の減少は世界中の生態系にとって大きな脅威となっている。土地利用の変化、地球温暖化、外来種と並んで、汚染が減少の主な原因のひとつである。農薬の悪影響についてはよく研究されているが、空気中の粒子状物質など、他の人為的汚染物質が昆虫に及ぼす影響についてはまだ知識が不足している。この問題を解決するため、我々はマルハナバチBombus terrestrisの働き蜂を亜致死量のディーゼル排気粒子（DEP）とブレーキダストに経口または空気感染させた。7日後、腸内細菌叢の組成を調べ、遺伝子発現の変化を追跡した。他の治療法では変化は見られなかったが、DEPの経口暴露は腸内細菌叢の構造を有意に変化させた。特に、中心的細菌であるスノドラセラ（Snodgrassella）はDEP処理で存在量が減少した。同様に、トランスクリプトーム解析により、DEP経口曝露後の遺伝子発現に変化が見られたが、他の処理では見られなかった。この変化は代謝とシグナル伝達に関連しており、一般的なストレス反応を示している。腸内細菌異常症はマルハナバチの病原体に対する感受性を高め、一般的なストレス反応は利用可能なエネルギー資源を低下させる可能性がある。これらの影響は、昆虫が複数のストレス環境に直面する自然条件下で悪化する可能性がある。
1 はじめに
世界的な生物多様性の損失は、人類が現在直面している大きな課題のひとつである（Díaz et al.） 特に昆虫は、受粉、栄養循環、害虫駆除、栄養段階をつなぐなど、多くの重要な生態系機能を提供または貢献しているため、昆虫の急速な減少は懸念される。土地利用の激化、気候変動、外来種と並んで、汚染が減少の主な原因のひとつとなっている（Miličić et al., 2021; Sánchez-Bayo & Wyckhuys, 2019）。
農薬は、行動変化以上の腸内マイクロバイオームの微妙な変化から死亡率の増加まで、様々なレベルで昆虫に害を与える（Desneux et al., 2007; Motta et al.） 他の人為的汚染物質も昆虫の観察された減少に寄与している可能性があるが、その影響はあまり研究されていないことが多い（Cameron & Sadd, 2020; Feldhaar & Otti, 2020; Sánchez-Bayo & Wyckhuys, 2019）。交通や工業プロセスに由来する空気中の粒子状物質は、環境のいたるところに存在するようになった（Gieré & Querol, 2010; Zereini & Wiseman, 2010）。哺乳類、特に人間への有害な影響は集中的に研究されているが、昆虫への影響を調査する研究はまだ少ない（Kim et al.） 昆虫は様々な方法でこれらの汚染物質に遭遇する可能性がある。例えば、汚染地域で採餌する、汚染された食物を摂取する、昆虫のクチクラに直接沈着する、などである（Feldhaar & Otti, 2020; Łukowski et al.） 空気中の粒子状物質は、経口摂取や気管系を介して昆虫の体内に入る可能性がある（Feldhaar & Otti, 2020; Negri et al.） 社会性昆虫の場合、汚染物質が巣に移動したり巣に蓄積されたりするため、リスクが高まる可能性がある。
自動車のブレーキダストとディーゼル排気粒子（DEP）は、環境中に放出される交通に由来する大気中微粒子の主要なクラスである（Hamilton & Hartnett, 2013; Harrison et al.） ブレーキダスト粒子は、使用されているブレーキライニングによって、様々な金属やフェノール化合物を含んでいる（飯島ら、2007；Thorpe & Harrison、2008）。様々な無脊椎動物種をこのような粒子に暴露すると、様々な影響が見られた。土壌中の粒子状物質汚染は、アリLasius nigerのコロニー形成に影響を与えなかった（Seidenath他、2021年）。しかし、土壌を食するミミズ（Eisenia fetida）は、ブレーキダスト粒子を混ぜた土壌に曝されると、死亡率が強く増加した（Holzinger他、2022）。DEPはブレーキダストとは組成が異なる。DEPは、多環芳香族炭化水素（PAHs）などの有機化合物が吸着した元素炭素と、微量の金属やその他の元素から構成されている（Greim, 2019; Wichmann, 2007）。高用量のディーゼル排気微粒子（1および2 g/L）を7日間にわたって食物中に暴露すると、ツチマルハナバチ作業員の生存率が対照群に比べて50％近く低下した（Hüftleinら、2023年）。
古典的な生態毒性学のアプローチの多くは、死亡率、成長、繁殖に対する物質の影響に焦点を当てている。しかし、汚染物質は昆虫に対してより微妙な亜致死影響を及ぼすこともあり、長期的には深刻な結果をもたらす可能性がある（Straub et al.） 直接的な亜致死影響には、ストレス反応や解毒プロセスといった生理機能の変化が含まれる。昆虫の体内の微生物と相互作用することで、汚染物質の経口曝露は間接的に昆虫の健康に影響を及ぼす可能性がある。
ほとんどの真核生物とそれに関連する微生物は、いわゆるホロビオントという実体を形成している（Theis et al.） 昆虫では、微生物は消化管、外骨格、血球、または細胞内に存在する（Douglas, 2015）。昆虫の腸内マイクロバイオームには、病原体からの保護、解毒、消化、必須栄養素の生産など、さまざまな機能がある（Engel & Moran, 2013）。社会性マルハナバチ（Bombus spp.）とミツバチ（Apis mellifera）は、腸内マイクロバイオームがかなり単純で高度に保存されているため、腸内細菌叢を研究するモデル生物である（Engel et al.） マルハナバチの腸内マイクロバイオームを支配しているのは、少数のコア細菌分類群である： Snodgrassella、Gilliamella、Schmidhempelia、Bifidobacteriaceae（BifidobacteriumとBombiscardovia）、Lactobacillaceae内の2つのクラスターである（Hammerら、2021; Koch & Schmid-Hempel, 2011a; Martinsonら、2011）。マルハナバチにおける共生細菌の機能は数多く提唱されているが、実験で実証されたものはごくわずかである (Hammer et al., 2021; Zhang & Zheng, 2022)。マルハナバチの腸内細菌叢は解毒に重要である可能性がある。微生物叢を持たない個体は、毒性濃度のセレン酸にさらされたときの生存率が低かったからである（Rothman et al.） さらに、一般的なトリパノソーマ寄生虫Crithidia bombiに対する抵抗性は、微生物叢を持たない個体と比較して、微生物叢が無傷のマルハナバチで高い（Koch & Schmid-Hempel, 2011b）。C.bombiに感染した場合の結果は、遺伝子型よりもむしろ宿主の微生物叢の構成によって異なる（Koch & Schmid-Hempel, 2012）。
空気中の粒子状物質などの人為的汚染物質が腸内細菌叢に及ぼす影響を調べることは、昆虫の健康に対するリスクを評価する上で重要な手段である（Duperron et al.） 保存された腸内マイクロバイオームであっても、中核となる細菌の相対的な存在量やその他の微生物の存在は、年齢、食餌、環境パラメータの変化によって変化する（Koch et al.） 様々な汚染物質がミツバチの腸内微生物組成に影響を与える。ミツバチの働き蜂では、農薬や抗生物質が中核的な腸内微生物種の相対的・絶対的存在量を変化させる（DeGrandi-Hoffmanら、2017年；Mottaら、2018年；Raymannら、2017年）。カドミウム、銅、セレン酸、過酸化水素などの環境毒性物質の数々は、現場で現実的な濃度でツチマルハナバチBombus impatiensの腸内細菌叢を変化させる（Rothman et al.） このような微生物群集の変化はマルハナバチの健康に影響を及ぼす可能性がある。腸内細菌叢の組成的・機能的変化である腸内細菌叢異常症は、ヒトや脊椎動物における様々な疾患や健康問題と関連している（DeGruttolaら、2016；Levyら、2017；Shreinerら、2015）。昆虫では、ディスバイオシスは生殖適性、免疫、病原体に対する抵抗性に悪影響を及ぼす（Amiら、2010；Daisleyら、2020；Raymannら、2017）。
トランスクリプトーム解析は、潜在的に有害な物質の亜致死影響を分子・細胞レベルで特徴付ける高感度なツールである（Prat & Degli-Esposti, 2019; Schirmer et al.） 遺伝子発現の変化は、ストレス応答や解毒プロセスなどの生物学的プロセスを早期に特定するのに役立つ。さまざまな汚染物質への曝露は、いくつかの昆虫種において遺伝子発現の変化を誘導することが示されている。人為的汚染物質（殺虫剤、PAHs）に暴露された蚊（Aedes aegypti）は、解毒、呼吸、クチクラタンパク質に関する遺伝子の発現を増加させた（David et al.） ホタル (Luciola leii) も、広範な PAH であるベンゾ(a)ピレンに曝露された際に同様の反応を示した (Zhang 他、2019 年 )。異なる種のハチでは、ネオニコチノイドであるイミダクロプリド、チアメトキサン、クロチアニジンは、代謝、免疫、ストレス応答遺伝子のアップレギュレーションを誘導する (Aufauvre 他, 2014; Bebane 他, 2019; Christen 他, 2018; Colgan 他, 2019; Gao 他, 2020; Shi 他, 2017)。重金属に曝露されたミツバチ（A. mellifera）では、解毒に関連する遺伝子の発現が対照群よりも高かった（Al Naggarら、2020；Gizawら、2020；Zhangら、2018）。
農薬とは対照的に、粒子状物質のような他の環境汚染物質がハチの遺伝子発現や腸内細菌叢に及ぼす影響についてはほとんど不明である。この知識のギャップを解決するために、我々はバフテイルマルハナバチBombus terrestrisの働き蜂を交通から派生する空気中の粒子状物質に曝露し、腸内細菌叢と遺伝子発現の変化を調査した。マルハナバチには亜致死濃度のブレーキダストまたはディーゼル排気粒子（DEPs）を添加した砂糖水を与えた。この経口曝露に加え、マルハナバチの1グループは気管系に取り込まれる可能性があるため、空気経由でもDEPsに曝露した。以前の研究で、近縁種のツチマルハナバチで異なる金属による変化が見られたように（Rothman et al.） さらに、粒子状物質に含まれる有毒化合物がマルハナバチの生理機能を阻害する可能性があるため、解毒・代謝遺伝子の発現に変化が生じ、ストレスレベルが上昇することが予想される。
2 方法
マルハナバチ飼育
2021年3月にBiobest社（ベルギー、Westerlo）から女王蜂のコロニー4頭を注文した。コロニーは26℃、湿度70％の恒温室内で、12：12時間の明暗サイクルで飼育した。コロニーには砂糖水（50%Apiinvert, Südzucker AG, Mannheim, Germany）と花粉（Imkerpur, Osnabrück, Germany）を自由に与えた。
投与量の選択
陸上環境における空気中の粒子状物質に関するデータは、定量化および起源を特定することが困難であるため、まばらである。空気中の粒子状物質が高レベルで流入している証拠は、土壌サンプルを分析するなどして、それが沈殿した後に初めて明らかになることが多い。不自然に多量の特定金属は、ブレーキダストなどの外部資源に起因する可能性がある（Alsbou & Al-Khashman, 2018; Peikertova & Filip, 2016）。アリゾナ州の都市土壌の同位体分析では、化石燃料の燃焼によって生成されたと推定される煤カーボンブラックが最大 0.54% (w/w) 含まれていた (Hamilton & Hartnett, 2013)。ミツバチは自然界で空気中の粒子状物質に汚染されているが、これらの粒子の取り込みに関 するデータやモデルはない (Negri et al., 2015)。以前の実験では、7 日間にわたる慢性的な DEP 経口曝露により、1 g/L 以上の濃度に曝露したマルハナバチの生存率が低下した (Hüftlein 他、2023 年 )。ブレーキダスト粒子を経口曝露すると、濃度8 g/Lで7日後の生存率が低下した（F. Hüftlein, D. Seidenath, A. Mittereder, T. Hillenbrand, D. Brüggemann, O. Otti, H. Feldhaar, C. Laforsch, M. Schott, 未発表データ）。マイクロバイオームとトランスクリプトームの実験では、以前の実験で死亡率や脂肪体重に影響を与えなかった0.4 g/Lの亜致死量を選択した（F. Hüftlein, D. Seidenath, A. Mittereder, T. Hillenbrand, D. Brüggemann, O. Otti, H. Feldhaar, C. Laforsch, M. Schott, 未発表データ）。飛翔処理のために箱は1.5mgのDEPで汚染され、その後1頭のワーカーが箱の中に放たれた。DEPは働き蜂の飛翔運動によって分散され、この濃度ではこのセットアップでマルハナバチのクチクラにかなりの汚染が見られた（下記参照）。
実験手順
実験開始時に、4つのコロニーから成虫ワーカーを無作為に6つの処置のいずれかに割り付けた。コントロール：砂糖水のみ（アピインバート50%）を給餌（n = 56）； 溶剤コントロール：乳化剤Tween20を0.02%（v/v）添加した砂糖水を給餌（n = 56）； ブレーキダスト：乳化剤Tween20を0.02%（v/v）添加した砂糖水と0.4 g/Lのブレーキダスト粒子を給餌（n = 56）； DEP：乳化剤Tween20を0.02%（v/v）添加した砂糖水と0. 4 g/L ディーゼル排気粒子（n = 56）；飛行コントロール：砂糖水（50% アピインバート）を与え、プラスチックボックス（7 × 7 × 5 cm、EMSA、ドイツ・エムスデッテン）内で1日1回3分間飛行させた（n = 24）；DEP飛行：砂糖水（50% アピインバート）を与え、プラスチックボックス（7 × 7 × 5 cm、EMSA、ドイツ・エムスデッテン）内で1日1回3分間飛行させた。 5(±0.1)mgのディーゼル排気粒子を入れたプラスチック・ボックス（7×7×5cm、EMSA、エムスデッテン、ドイツ）内で3分間飛行させた（n = 24）。
実験は温度 26℃、湿度 70%の恒温室内で、12:12 時間の明暗サイクルで行った。マルハナバチはニコットケージ (Nicotplast SAS, Maisod, France) で飼育し、先端をカットした 12 mL シリンジ (B. Braun SE, Melsungen, Germany) に 2 mL の給餌液 (ad libitum) を入れた。餌にカビが生えたり細菌が繁殖したりするのを防ぐため、シリンジは毎日新しいものと交換した。実験期間は7日間であった。実験終了後、動物は-20℃で冷凍保存した。
実験終了後 1 週間以内に、トランスクリプトーム解析のため、各処置ごとに 12 匹（コロニーあたり 3 匹）のマルハナバチを無作為に選んだ（N = 72）。さらに、コントロール、溶媒コントロール、ブレーキダスト、DEP 処理について、それぞれ 20 匹のマルハナバチ（コロニーあたり働き蜂 5 匹）を無作為に選び、マイクロバイオーム解析を行った（N = 80）。
ディーゼル排気粒子（DEP）の生成と収集
ディーゼル排気粒子は、4気筒ディーゼルエンジン（OM 651, Daimler AG, Stuttgart, Germany）から収集した。エンジンは，Zöllner (2019)に記載されているように，水冷渦電流ブレーキを備えたテストベンチ上で運転した．DEPサンプルは，電気集塵装置（OekoTube Inside, Mels-Plons, Switzerland）で収集した。生排気サンプルのサブミクロン粒度分布を測定するために，高速応答微分移動度微粒子分光計DMS500（Combustion，Cambridge，England）を適用した。市街地走行中のエンジン負荷と速度によって、固体粒子の直径の中央値は52.1±1.8 nmから101.9±1.7 nmであった。DEP組成は、熱重量分析（TGA、STA 449 F5 Jupiter、Netzsch-Gerätebau GmbH、Selb、ドイツ）によって特徴付けられた。DEP質量の72.2%±1.1%が元素状炭素、23.2%±0.9%w/wが有機物、4.6%±0.7%w/wが無機物であった。PAHsの定量では、ピレンが444 ppm、フェナントレンが220 ppm、フルオランテンが107 ppmであった。
DEP試料の元素組成を誘導結合プラズマ発光分光分析法（ICP-OES、Optima 7300 DV、PerkinElmer Inc. カルシウム（1.63% w/w）、亜鉛（0.53% w/w）、リン（0.50% w/w）の画分を示し、ディーゼル燃料と潤滑油にさかのぼることができた。銅(1.03% w/w)、アルミニウム(0.02% w/w)、鉄(0.02% w/w)は、それぞれピストンリング、シリンダーヘッド、エンジンブロック材料の摩耗に起因する。さらに、少量のホウ素（0.13% w/w）、マグネシウム（0.10% w/w）、モリブデン（0.03% w/w）、ナトリュウム（0.02% w/w）、硫黄（0.17% w/w）が検出された。
ブレーキダスト粒子の生成
バイロイト大学セラミック材料工学講座から提供されたブレーキダスト粒子は、タングステンカーバイド粉砕セット（Pulverisette 9、Fritsch GmbH、Idar-Oberstein、ドイツ）を用いて振動カップミルで3分間粉砕したLowMetブレーキパッド（TMD Friction Holdings GmbH、Leverkusen、ドイツ）から得られたものである。LowMetブレーキパッドは，欧州の乗用車を代表する一般的なブレーキパッドで，非鉄金属（25%(w/w)），スチールウール（15%(w/w)），ガソリンコークス（12%(w/w)），硫化物（10%(w/w)）から構成されている、 酸化アルミニウム(5%(w/w))、樹脂(5%(w/w))、黒鉛(4%(w/w))、雲母(4%(w/w))、炭化ケイ素(3%(w/w))、バライト(2%(w/w))、繊維(2%(w/w))、ゴム(1%(w/w)) (Wiaterek, 2012)。粉砕された細粒粉末の粒度分布は、レーザー回折式粒度分布測定装置（PSA 1190 LD, Anton Paar GmbH, Ostfildern-Scharnhausen, Germany）を用いて測定した。平均粒子径は10.19±4.37μm（D10＝0.68μm（全粒子の10％がこの粒子径より小さい）、D50＝5.76μm（粒子径の中央値）、D90＝25.87μm（粒子径の90％がこの粒子径より小さい））であった。
マルハナバチ腸内マイクロバイオーム分析
解剖前にマルハナバチを解凍し、70% エタノール、90% エタノール、超純水で 2 回洗浄した。各マルハナバチをオートクレーブ滅菌した正方形のアルミホイル（5 × 5 cm）の上に置き、滅菌したピンセットとハサミで腹部を開いた。作物から中腸と後腸を注意深く分離し、エッペンドルフチューブに移した後、液体窒素中で腸をスナップ凍結した。すべてのサンプルはさらに処理するまで-80℃で保存した。
16S rDNA断片のPCR増幅と配列決定
マルハナバチ腸サンプルのメタゲノム DNA は、NucleoMag DNA Bacteria kit（Macherey-Nagel, no. 744310, Düren, Germany）を用いて、FastPrep-24 ビーズビート装置（MPbio, Irvine, USA）で直径 1.4 mm のセラミックビーズ（No. P000912-LYSK0A, Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, France）を用いてサンプルを破砕した後、製造元の指示に従って精製した。メタゲノムDNAを5ng/μLの濃度に希釈し、2.5μLのDNAを用いて、16Sメタゲノミックシークエンシングライブラリー調製プロトコル（Part # 15044223 Rev. B, www.illumina.com）に記載されているように、プライマー515F-Y（Turner et al., 1999）および806RB（Apprill et al., 2015）を用いて16S rDNA断片を増幅した。サンプルライブラリーをNextera XT index kit（v2 set A、www.illumina.com）を用いてバーコード化し、等モル量で組み合わせ、293サイクルシングルエンドR1モードを使用してイルミナのiSeq-100プラットフォームでシーケンスした。リードのデマルチプレックスはiSeq-100ローカルランマネージャーで行い、サンプル固有のリードはFastQフォーマットで保存した。
マイクロバイオーム解析
微生物データの統計解析は、QIIME2（Bolyen et al.、2019）およびR 4.2.1（R Core Team、2022）を用いて行った。16S rDNA断片のフォワードリード（R1リード）は、QIIME2マイクロバイオーム解析パッケージ（ver.2021.11; Bolyen et al.、2019）を用いて解析した。特に指示がない限り、すべての解析ツールはQIIME2パッケージのプラグインとして使用した。解析ステップに沿って使用された各パラメーターは、QIIME2データファイル（付録S1として入手可能）の出所情報から容易にアクセスできる。簡単に説明すると、以下の解析ステップが実行された： 非多重リードは、16Sプライマー配列のトリミング（plugin cutadapt; Martin, 2011）、ノイズ除去、重複除去、キメラチェック（plugin DADA2; Callahan et al. 希少なASVは、全サンプルにわたるASVの頻度の中央値（=6）を用いてフィルターにかけた。ASVの分類学的分類は、SILVA参照データベース（ver.138.1; Quast et al., 2013; Yilmaz et al., 2014）に基づくprefitted sklearn-based taxonomy classifiersを用いて行った（plugin feature-classifier; Bokulich et al.） どの分類学レベルでも分類学的に割り当てられなかったASV（「未割り当て」）、および合計3900リード未満のサンプルは、以降の解析ステップの前に削除された。Shannon多様性指標、Faithの系統的多様性、Pielouの均等性、および観察されたASVなどのアルファ多様性指標は、QIIME2の'core-metrics-phylogenetic'ワークフロー（プラグインの多様性）を使用して、サンプルあたり3900リードに希釈して得られた。微生物組成に対する処理とコロニー起源の全体的な影響を評価するために、Qiime2でRパッケージvegan（Oksanen et al., 2022）のADONISによる並べ替え多変量分散分析を行った。α多様性の有意差を見つけるために、パッケージglmmTMB（Brooks et al., 2017）の関数glmmTMBを用いて、処理を固定因子、コロニーをランダム因子とする一般化線形混合モデル（GLMM）を当てはめた。DHARMaパッケージ（Hartig, 2022）のqqplotおよび残差対予測プロットであるモデル診断検定プロットを用いてモデル仮定をチェックした。次に，パッケージcar (Fox & Weisberg, 2019)の関数Anova()を用いて統計量を作成し，処理間の差のp値を計算した．有意な処理効果については、multcompパッケージ（Hothorn et al., 2008）のTukey HSDポストホック検定とBenjamini-Hochberg補正を用いて一対比較を行った。希薄化したデータの存在量の差は、負の二項分布、有意水準カットオフFDR < 0.01、外れ値の置換オフ、cooksCutoffオフのDESeq2パッケージを用いて解析した（Love et al.） Aldex2（プラグインaldex2; Fernandes et al., 2013）を用いて組成差分存在量解析を行った。ロバストなAitchison PCAを実行するQIIME2のプラグインDEICODE（Martino et al.） 有意性は、999の並べ替えによるPERMANOVAで検定し、続いて多重検定のためのBenjamini-Hochberg（BH）補正を用いたペアワイズPERMANOVAで検定した（Anderson, 2008）。qiime2Rパッケージ（Bisanz, 2018）およびmiaパッケージ（Ernst, Shetty, et al., 2022）を使用して、Rでマイクロバイオームデータをインポートおよび処理した。tidyrパッケージ（Wickham & Girlich, 2022）を使用してデータを配置し、ggplot2パッケージ（Wickham, 2016）、ggpubrパッケージ（Kassambara, 2020）、およびmiaVizパッケージ（Ernst, Borman, & Lahti, 2022）を使用してプロットした。
マルハナバチ全腹部のトランスクリプトーム解析
マルハナバチは解凍し、解剖前に70%エタノール、90%エタノール、超純水で2回洗浄した。腹部を滅菌ハサミで切断し、エッペンドルフチューブに入れ、液体窒素中でスナップ凍結した。すべてのサンプルはさらに処理するまで-80℃で保存した。
RNA配列決定
RNeasy Lipid Tissue kit（Qiagen、番号74804、Hilden、ドイツ）を用いて腹部サンプルから全RNAを調製した。NEBNext Ultra II Directional Library Prep Kit for Illumina（New England Biolabs、番号E7760、米国イプスウィッチ）とNEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module（New England Biolabs、番号E7490、米国イプスウィッチ）を併用し、100 ng RNAからRNA-Seqライブラリを構築した。サンプルは等モル量で結合され、150bpペアエンドモードでIllumina装置（Genewiz, Leipzig, Germany）でのシーケンスに送られた。サンプルあたり平均1,950万リードに相当する合計14億7,000万リードが得られた。
差次的発現解析
RNA-Seqリードはさらに、OmicsBoxバイオインフォマティクスプラットフォーム（v. 2.0.36, www.biobam.com）を用いて解析した。特に断りのない限り、差次 発現解析に使用したツールはすべてOmicsBoxプラットフォームからアクセスできる。RNA-Seqリードは、Trimomatic（詳細はAppendix S1: RNAseq_1_trimmomatic_report）（Bolger et al.、2014）を用いて前処理し、データセットからシーケンシングアダプター、低品質配列、短いリードを除去した。クオリティトリミングしたリードを、STAR（Dobin et al., 2013）を用いてB. terrestrisゲノムアセンブリ（Bter_1.0, GCA_000214255.1、metazoa.ensembl.orgからダウンロード）にマッピングした。HTseq (Anders et al., 2015)を用いてマッピングファイルから遺伝子特異的カウントテーブルを作成し、edgeR (Robinson et al., 2010)を用いて差次的発現遺伝子をそれぞれ同定した。B. terrestrisゲノムの機能アノテーションは、annotation release v. 102 (metazoa.ensembl.orgからgff3フォーマットで入手可能)に基づいた。12,008遺伝子のうち4975遺伝子に機能アノテーションがなかったため、OmicsBoxプラットフォームの機能アノテーションワークフローを用いて、公開されているアノテーションを追加情報で更新した。簡単に説明すると、アノテーションされていない遺伝子のコード配列を使用して、refseq_proteinデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov）とInterProScan（www.ebi.ac.uk）から機能アノテーションを抽出した。これらをパイプラインのGOマッピングとアノテーションツールに入力し、最終的に既存の機能アノテーションに統合した。遺伝子発現に対する処理とコロニー起源の全体的な影響を評価するため、Qiime2でRパッケージvegan (Oksanen et al., 2022)の分散ADONISの並べ替え多変量解析を行った。遺伝子セット濃縮解析（GSEA; Subramanian et al., 2005）は、ランク付けされた遺伝子リスト（ランク = sign(logFC) * -log10(p-value); FC: fold change）とGene Ontologyの機能アノテーションで定義された遺伝子セットを用いて行った。濃縮されたGO用語の機能ネットワーク解析には、Cytoscape（v. 3.9.1; Shannon et al., 2003）のClueGo（v. 2.5.9; Bindea et al., 2009）とCluePedia（v. 1.5.9; Bindea et al., 2013）プラグインを使用した。R 4.2.1（R Core Team, 2022）でトランスクリプトームデータをプロットするために、ggplot2（Wickham, 2016）、ggpubr（Kassambara, 2020）、pheatmap（Kolde, 2019）パッケージを使用した。
3 結果
マルハナバチの腸内マイクロバイオームに対する汚染物質の影響
細菌の16S rDNA断片のアンプリコンシークエンシングにより、合計2,425,928の生リードが得られた。品質フィルタリングと未同定配列の除去を行った後、適切なサンプリング深度を確保するために、サンプリング深度が3900リード以下のサンプル（n = 7）（すべてDEP処理による）も除去した（13個のDEP複製サンプルが解析に残った）。残りのサンプルでは、1,856,025個の16S rDNA遺伝子配列が得られ、サンプルあたりの平均リード数は25,425個（n = 73）、468個のアンプリコン配列変異（ASV）に対応した。サンプルベースの希薄化曲線は、ほとんどのサンプルがプラトーに達していることから、マイクロバイオームを代表的にカバーするのに十分なシーケンス深度を示唆している（図A1）。ADONIS解析により、マイクロバイオーム組成に対する処理の有意な影響が明らかになった（R2 = 0.423、p < 0.001）。マイクロバイオーム組成に対するコロニー由来の有意な影響（R2 = 0.001, p = 0.946）は見られなかった。
分類群数
属レベルで、最も一般的な細菌分類群（少なくとも1つの処理で1%以上）は以下の通りであった： Gilliamella、Snodgrassella、Lactobacillus、Asaia、Bombiscardovia、Methylorubrum、およびBombilactobacillusであった。各サンプルの最も一般的な属の相対的な存在量は、他の処理グループと比較して、DEP処理で異なる微生物組成を示している（図1）。
図1
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各試料の最も一般的な細菌属の相対存在量。サンプルは処理に従って配置されている。
ASVの相対存在量は、コントロール、溶媒コントロール、ブレーキダストの間で差はなかったが、DESeq2によると、DEP処理では、コントロールと比較して16種類のASVが異なって存在した（図2、表A1）。11のASVはDEP処理でコントロールより存在量が多かった。5つのASVはコントロールと比較して存在量が減少していた。差分存在量を同定するためのより保守的なアプローチとしてALDEx2があり、DEP処理では対照と比較して有意に存在量が変化したASVが5つ明らかになった： Snodgrassella 1 + 2、Neisseriacae、Lactobacillus bombicola、およびBombiscardoviaであった（表 A2）。
図2
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コントロールと比較したDEP処理におけるASVの相対存在量の対数2倍変化。このプロットにASVを含めるためのカットオフはFDR (=padj) < .01であった。色は最も特異的な分類学的標識を示す。
腸内細菌叢のα多様性
観察されたASVの数は処理間で差がなかった（ガウス分布によるGLMM：χ2 = 0.918, df = 3, p = 0.821；図3a）。Pielouの均等性は処理間で差があった（ガウス分布によるGLMM：χ2 = 42.697, df = 3, p < 0.001；図3b）。DEP処理は他の処理より有意に均等性が低かった（Benjamini-Hochberg (BH)調整p値を用いたTukey比較： DEP対コントロール p < 0.001、DEP対溶剤コントロール p < 0.001、DEP対ブレーキダスト p < 0.001；図3b）。シャノン多様性は処理間で差があった（ガウス分布によるGLMM：χ2 = 24.035, df = 3, p < 0.001; 図3c）。DEP処理区の多様性は他の処理区より有意に低かった（BH調整p値を用いたTukey比較： DEP対コントロール p < 0.001、DEP対溶剤コントロール p < 0.001、DEP対ブレーキダスト p < 0.001；図3c）。フェイスのPDは処置間で差があった（ガウス分布によるGLMM：χ2 = 19.062, df = 3, p < 0.001; 図3d）。DEP処理におけるフェイスのPDは、他の処理よりも有意に高かった（BH調整p値を用いたTukey比較： DEP対コントロール p < 0.001、DEP対溶剤コントロール p < 0.001、DEP対ブレーキダスト p < 0.001；図3d）。
図3
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異なる処理におけるマルハナバチ腸内細菌叢のα多様性。(a) 観察されたASV、(b) Pielouの均等性、(c) シャノン多様性、(d) FaithのPD。アスタリスクは他の処理と比較した有意差を示す（p < 0.05）。箱ひげ図は中央値、第1四分位値、第3四分位値を示す。ドットは個々のデータ点を示す。
腸内細菌叢のβ多様性
マルハナバチ腸内細菌叢の群集組成は、ロバストAitchison距離間の有意差によって示されるように、処理群間で異なっていた（Overall PERMANOVA pseudo-F4, 73 = 16.844, p = 0.001）。DEP処理の微生物群集組成は、他のすべての処理と異なっていた（BH調整p値を用いたペアワイズPERMANOVA；DEP対コントロール：擬似F = 32.247、p = 0.002；DEP対溶剤コントロール：擬似F = 30.651、p = 0.002；DEP対ブレーキダスト：擬似F = 25.699、p = 0.002）。その他の処置の間に差は見られなかった（BH調整p値を用いたペアワイズPERMANOVA：p > .05）（図4）。
図4
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ロバストAitchison主成分分析に基づくDEICODE距離。点は、治療に従って色分けされた単一サンプルを表す。矢印は原点からのユークリッド距離を表し、主成分軸に強い影響を及ぼすASVを示す。楕円は各処置の多変量t分布の95%信頼区間を示す。真核生物Bombus rupestrisのASVは、使用したプライマーの非特異性が残っていることで説明できる（TestPrimeで解析、www.arb-silva.de）。
マルハナバチの遺伝子発現に対する汚染物質の影響
トランスクリプトーム解析では、報告された結果が不必要に膨れ上がるのを防ぐため、生物学的に適切な処理 の比較のみに焦点を当てた。コントロール vs. 溶媒コントロール、コントロール vs. DEP、コントロール vs. ブレーキダスト、フライトコントロール vs. DEP フライトを比較した。発現の異なる遺伝子（DEGs）を解析した結果、処理間の違いが明らかになった。合計324個の遺伝子が、コントロールと比較してDEP処理で差次的に発現した（低カウント遺伝子フィルター設定： CPM Filter = 1、CPM Filter = 2に達したサンプル）。165遺伝子が発現上昇（LogFC > 1）し、159遺伝子が発現低下（LogFC < -1）した（表A3、図A2）。ブレーキダスト処理では、1つの遺伝子（リパーゼ3）のみがコントロールと比較して差次的に発現（上昇）した。溶媒対照では、対照と比較して差次的に発現した遺伝子はなかった。DEPフライト処理では、フライトコントロールと比較して差次的発現遺伝子は見られなかった。ADONIS解析により、遺伝子発現に対する処理の有意な影響が明らかになった（R2 = 0.279, p = 0.002）。遺伝子発現に対するコロニー起源の有意な影響（R2 = 0.031, p = 0.054）は見られなかった。
マルハナバチの働き蜂の遺伝子発現の変動は、コントロールとDEP処理の間で明瞭に分かれている（図5）。全サンプルで処理間の明瞭な分離は、DEP 経口曝露時のマルハナバチの遺伝子発現に実質的な違いがあることを示している。この遺伝子発現の違いの信頼性はクラスター分析によって確認され、コロニーごとというよりむしろ処理ごとに明確なクラスタリングが見られた（図6）。その他の処理については、nMDSプロットでは明確な区別がつかず、遺伝子発現に差がないことを示している（図 A3-A5）。
図5
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コントロールとDEP処理間のlog2倍変化（FC）に基づく非計量多次元尺度プロット。nMDSプロットの軸は、遺伝子発現の次元縮小を表し、各処置の転写変化のばらつきを視覚化している。各ポイントは1サンプルを表し、処理によって色分けされている。
図6
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コントロールとDEP処理で差次的に発現した遺伝子のサンプル（x軸）の階層的クラスタリングを示すヒートマップ。ヒートマップは、ユークリッド距離を用いたWardのクラスタリングを用いて得られた。値はlog2変換したCPM（Counts per million reads）発現値のzスコアを表す。
DEP処理で差次的に発現した324の遺伝子は、遺伝子の特性を記述し、それぞれを3つのカテゴリーのいずれかにグループ化する遺伝子オントロジー（GO）用語にアノテーションされた： 細胞構成要素、分子機能、生物学的プロセスである。GO濃縮分析を用いて、最も過大に発現している用語と過小に発現している用語を見つけた。DEP処理で最も有意にアップレギュレートされた30のGO用語は、タンパク質結合機能、酵素複合体、代謝（特に異化）プロセスなどであった（図7a）。DEP処理で最も有意にダウンレギュレートされた30のGOタームには、転移酵素活性、ミトコンドリアおよびオルガネラ膜、代謝、特に生合成プロセスが含まれる（図7b）。
図7
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(a)DEP処理で最も有意に発現が増加した30個の遺伝子と(b)発現が減少した遺伝子の遺伝子オントロジー用語をカテゴリー別に色分けし、-log10FDRでソートしたもの。
DEP処理においてFDR≦0.05で差次的に発現したGO用語のᜅ-スコア≧0.4に基づく機能ネットワーク解析は、特定の機能グループへのクラスタリングを示した（図A6a）。アップレギュレートされた機能は、リン酸化、代謝プロセスの制御、グアニルヌクレオチド結合、シグナル伝達に関連している（図A6b）。ダウンレギュレートされた機能は、ミトコンドリア、脂質代謝プロセス、小胞体、リン脂質生合成プロセスに関連している（図A6c）。
4 結論
本研究では、ディーゼル排気粒子（DEPs）の経口暴露はマルハナバチ労働者の腸内細菌叢と遺伝子発現を変化させるが、空気経由のDEPs暴露は変化させないことを発見した。経口曝露でテストした2つ目の汚染物質であるブレーキダストは、マルハナバチワーカー の腸内細菌叢や遺伝子発現に変化を引き起こさなかった。
コントロール、溶媒コントロール、ブレーキダスト暴露処理における腸内微生物群集の組成は類似していたが、DEP処理では大きな変化が検出された。これはいくつかの興味深い問題を提起している。(1) DEPはどのように細菌に影響を与え、腸内細菌叢組成の変化を誘発するのか？(2)ディーゼル排気ガス中のどの成分が、観察された変化の原因なのか？我々の仮説では、PAHsがバクテリアに直接影響を与えるDEPの成分である可能性がある。DEPにはさまざまな有機化合物の一種であるPAHが含まれており、さまざまな生命体に対して毒性、変異原性、遺伝毒性があることがよく知られている（Patelら、2020；Sunら、2021）。また、PAH曝露による腸内微生物群集のシフトは、魚類、ナマコ、ポットワーム（Enchytraeidae）など、さまざまな動物で報告されている（DeBofskyら、2020、2021；Dingら、2020；Quintanilla-Menaら、2021；Zhaoら、2019）。したがって、本研究ではPAHsがマルハナバチの腸内細菌叢の変化の主な原因であると推測している。しかし、DEPsに含まれる大量の元素状炭素は、それ自体が別の説明を提供する可能性がある。DEPは表面積対体積比が大きいため、活性炭のように機能し、微生物を吸着して排泄によって排出するのかもしれない（Naka et al.） 活性炭に直接的な悪影響がないとしても、一定の吸着と排出によって細菌群集が乱れ、本研究で観察されたような組成的・量的変化が生じる可能性がある。
スノッドグラッセラ（Snodgrassella）という細菌は、汚染されていないマルハナバチの腸内細菌叢（Hammer et al. スノッドグラッセラはギリアメラとともに回腸内壁を覆うバイオフィルムを形成している（Hammer et al., 2021; Martinson et al.） 宿主と共生生物の双方がこのバイオフィルム形成から利益を得る可能性がある。なぜなら、バイオフィルムは細菌の流出を防ぎ、共栄的ネットワークの形成を可能にするからである（Kwong et al.） さらに、バイオフィルムは、C. bombiのような、腸壁に付着しなければ持続できない腸内寄生虫から宿主を守る可能性がある（Koch et al.） しかし、スノッドグラッセラの生息数が極端に減少していることから、微生物間の相互依存関係はDEP曝露によって破壊されるようだ。対照的に、ギリアメラはDEP曝露後に相対的に存在量が増加する。このことは、ギリアメラがスノッドグラッセラとは独立してバイオフィルムを形成できる可能性を示している。ギリアメラの相対存在量が高いことの比較的単純な説明としては、スノッドグラッセラが減少したため、腸内ではギリアメラだけが優勢な細菌となり、そのためギリアメラがよりよく増殖するか、その空白を埋めることができる、ということが考えられる。Rothmanら（2020）はすでに、ハチを銅、セレン酸、グリホサートに曝露すると相対量が減少することを報告している。さらに、スノグラッセラも属するナイセリア科の未知の細菌が、DEP曝露後に相対存在量が低下することを発見した。これが一貫した結果であれば、この科のDEPに対する一般的な感受性を示しているのかもしれない。
DEP処理でAsaiaの相対存在量が高くなったのは、Asaiaが細菌群集を支配している2つのサンプルによるもので、相対存在量はそれぞれ99%と67%であった。Asaiaは花に共生する酢酸菌で、半翅目、双翅目、ヒメカゲロウ目など、さまざまな昆虫目の腸内によく見られる（Bassene et al.） アノフェレス蚊の腸内細菌叢を支配することができるため、マラリア防除のツールになりうると考えられている（Caponeら、2013；Faviaら、2008）。マルハナバチにおけるAsaiaの報告はあるが、DEPサンプルの一部でAsaiaが優勢なのはかなり珍しい（Bosmansら、2018年）。DEPは自然のマイクロバイオームコミュニティを崩壊させ、Asaiaのような日和見菌への扉を開く可能性がある（Favia et al.） この実験ではマルハナバチを終生室内で飼育したが、アサイア属細菌は実験開始前にマルハナバチに与えた花粉に由来する可能性がある。
マルハナバチの中心的な腸内細菌のひとつであるラクトバチルス属（Hammer et al.） マルハナバチ関連菌であるL.bombicola種はDEP曝露後に存在量が低下する一方、ミツバチ関連菌であるL.apis種の存在量は増加した。ここでもまた、DEPによって本来のマイクロバイオームが破壊されることで、外来細菌がマイクロバイオームに定着することが説明できるかもしれない。実験前にマルハナバチに与えた花粉はミツバチが集めたものであるため、L. apisの供給源になる可能性がある。
DEPによる腸内細菌叢の変化はマルハナバチの健康に影響を与える可能性があり、コアバクテリアは寄生虫による感染を防ぐ可能性がある。Gilliamella、Lactobacillus、Snodgrassellaの存在量は寄生虫であるCrithidiaやNosemaと負の相関関係があり、非中核細菌は感染したマルハナバチでより多く存在する（Cariveauら、2014；Kochら、2012；Koch & Schmid-Hempel、2012；Mocklerら、2018）。スノッドグラッセラとギリアメラのバイオフィルム形成は、回腸壁に付着して持続する必要のあるトリパノソーマC. bombiに対する物理的バリアを形成している可能性がある（Koch et al.） このバイオフィルムが破壊され、Asaiaのような非中核細菌がより多く存在するようになると、DEPに曝露されたマルハナバチの寄生感受性が高まる可能性がある。
トランスクリプトーム解析により、亜致死量のDEPsにマルハナバチを経口曝露した後の遺伝子発現に有意な変化が見られた。合計で 165 遺伝子が発現上昇し、159 遺伝子が発現低下した。GO濃縮解析とネットワーク解析から、これらの変化は汚染物質に対する一般的なストレス反応に関連している可能性が示された。アップレギュレートされたGO用語が多くの代謝・異化過程に関与しているのに対し、ダウンレギュレートされたGO用語は代謝・生合成過程を含んでいた。DEPへの暴露は、エネルギーコストが高くなった結果、貯蔵していた蓄えを枯渇させ、観察された変化を引き起こしたのかもしれない。代謝の変化は昆虫の汚染物質に対する典型的な反応のようで、生化学的プロセスを阻害することが多いことから、合理的であると思われる。亜致死量のネオニコチノイドに曝露されたマルハナバチとミツバチにおける転写 変化は、主に代謝プロセスに関連している (Bebane 他, 2019; Colgan 他, 2019; Gao 他, 2020; Shi 他, 2017)。重金属やPAHsへの曝露は、クモ、蚊、蛾、ホタルに同様の変化を引き起こす（Chenら、2021；Davidら、2010；Liら、2016；Zhangら、2019、2021）。変化の細部は異なっていても、汚染物質に対する反応には特定のプロセスが共通して関与しているようだ。我々の知見と一致して、殺虫剤やPAHsへの曝露は、昆虫のエネルギー代謝の重要な部分であるミトコンドリア機能に影響を及ぼす（Colgan et al.） このことは、汚染物質によるエネルギー需要の増加という考え方を支持するものである（Beyersら、1999；Calow、1991）。また、イミダクロプリドやPAHベンゾ(a)ピレンに暴露されたミツバチやホタルの観察結果と同様に、シグナル伝達のアップレギュレーションも観察された (Gao et al., 2020; Zhang et al., 2019, 2021)。通常、PAHs、殺虫剤、重金属などの化学的ストレス因子は、解毒プロセスや薬物代謝に関連する遺伝子に影響を与える（Chen et al., 2021; David et al., 2010; Gizaw et al.） しかし、我々の研究では、解毒関連遺伝子で発現の差は見られなかった。おそらく、DEPに付着したPAHsの数は、解毒の測定可能な増加につながる反応を引き起こすには十分ではなかったのだろう。全体として、マルハナバチのDEP経口曝露後に観察された遺伝子発現の変化は、汚染物質に対する一般的なストレス反応に似ている。
DEP経口投与後にマルハナバチのマイクロバイオームと遺伝子発現が有意に変化したことから、これらのシステムが互いに影響し合う可能性があるのか、またどのように影響し合うのかという疑問が生じる。代謝の変化はDEPによる腸内細菌叢の変化によって引き起こされる可能性があり、それによって宿主に供給される代謝産物の種類と量が変化する可能性がある（Douglas, 2018）。さらに、昆虫免疫は腸内細菌叢に依存しているかもしれない。ミツバチでは、本来の腸内マイクロバイオームが免疫遺伝子の発現を刺激し、抗菌ペプチドの産生を誘導する（Kwongら、2017年）。この相互作用の機能とそのメカニズムは完全には解明されていないが、宿主はこのようにして微生物叢を制御しているのかもしれない。しかし、宿主の健康は、将来の感染に対する免疫系をプライミングすることで、この相互作用からも恩恵を受けるかもしれない。汚染物質が腸内細菌叢を変化させることで、昆虫の健康が脅かされるかもしれない。このことは、抗生物質曝露によって腸内マイクロバイオームが変化したミツバチの死亡率上昇を説明できるかもしれない（Raymann et al.）
経口暴露とは対照的に、我々はマルハナバチを空気経由でDEPsに暴露した後、遺伝子発現に影響を与え ることは発見できなかった。変化を引き起こすには、DEPが気管系に入るか、触角などの感覚器官に付着する必要がある。マルハナバチの1日3分間の暴露では、影響を与えるには十分ではなかったかもしれない。触角に付着した微粒子は清掃行動によってすぐに取り除かれたかもしれないし、気門は気管への微粒子の取り込みを防ぐ効果的な防護壁になっているようだ（Harrison, 2009; Schönitzer, 1986）。したがって、マルハナバチの気管系に入り込んだ粒子はごくわずかであったと思われるため、今回の結果には注意が必要である。
DEPとは異なり、ブレーキダスト粒子の経口曝露はマルハナバチの腸内微生物群集や遺伝子発現に影響を与えなかった。しかし、実験手順にはいくつかの懸念が残る。ひとつは、実際のブレーキングシーンで発生したブレーキダストを使用したのではなく、人工的に粉砕したブレーキパッドを使用したことである。人工的に粉砕されたブレーキパッドに由来するダストは、物理化学的性質が異なる可能性がある。粉砕されたブレーキダスト粒子の平均粒径は、DEPよりもはるかに大きい（10μm対0.01μm）。重量あたりの処理濃度を定義すると、このような物理的特性の違いにより、処理溶液の粒子数に大きな差が生じる。さらに、大きなブレーキダスト粒子はフィーディングシリンジの底に沈む傾向があり、これが粒子の取り込みを減少させた可能性がある。ブレーキダストはマルハナバチに影響を与えないと思われるが、本研究で指摘された限界に対処するため、さらなる研究が必要である。
対処すべきもう一つの問題は、本研究で使用した用量が、マルハナバチが遭遇する現場での現実的な濃度とどのように関連するのかということである。陸上生息域に存在する空気中の微小粒子状物質の起源と量に関する知識はまだ曖昧なことが多いが、昆虫による取り込みの可能性についてはさらにわからない。ハチ生産物の汚染は記録されているが、昆虫と空気中微粒子物質との遭遇率の現実的なモデリングが必要である (Conti & Botrè, 2001)。この研究で用いた用量は、おそらく自然界で遭遇する用量よりも高い。しかし、我々の実験セットアップには、寄生虫、限られた餌の入手可能性、干ばつや熱ストレスのような生物学的要因など、ハチが野生で直面しなければならない他のストレス要因は含まれていない。マルハナバチは1つのストレス要因に直面すればそれを補うことができるかもしれないが、最終的には複数のストレス要因によって過度の負担を受けることになる。
これらを総合すると、我々のマイクロバイオームとトランスクリプトーム解析の結果は、マルハナバチで示した経口DEP曝露後の昆虫の健康に対する潜在的影響を示している。腸内細菌異常症はマルハナバチの病原体に対する感受性を高める可能性があり、一方、一般的なストレス反応は利用可能なエネルギー資源を低下させる可能性がある。このことは、昆虫減少の原動力としてDEPのような空気中の粒子状物質が果たす役割の可能性を浮き彫りにしている。
著者の貢献
Dimitri Seidenath：概念化（同等）、データキュレーション（同等）、形式的分析（同等）、調査（同等）、方法論（同等）、視覚化（リード）、執筆-原案（リード）。Alfons R. Weig: 概念化(支援)、データキュレーション(同等)、正式分析(同等)、方法論(同等)、ソフトウェア(同等)、可視化(支援)、執筆-原案(支援)、執筆-校閲・編集(同等)。アンドレアス・ミッテレーダー 方法論（同等）、リソース（同等）、執筆-レビューと編集（支援）。トーマス・ヒレンブランド 方法論（支援）、リソース（支援）、監督（支援）、執筆-校閲・編集（支援）。ディーター・ブリュッゲマン 資金獲得（支援）、プロジェクト管理（支援）、リソース（支援）、監督（支援）、執筆-校閲・編集（支援）。Thorsten Opel： 方法論（支援）、リソース（支援）、執筆-校閲・編集（支援）。ニコ・ラングホフ： 資金獲得（支援）、方法論（支援）、プロジェクト管理（支援）、リソース（支援）、監督（支援）、執筆-校閲・編集（支援）。Marcel Riedl：調査（同等）。ハイケ・フェルトハール： 概念化（同等）、資金獲得（同等）、プロジェクト管理（同等）、監督（同等）、執筆-原案（支持）、執筆-査読・編集（主導）。オリバー・オッティ：概念化（同等）、正式分析（支援）、資金獲得（同等）、プロジェクト管理（同等）、監督（同等）、可視化（同等）、執筆-原案（支援）、執筆-レビューおよび編集（主導）。
謝辞
ラボ作業を手伝ってくれたSara Pölloth、Simon Bitz、Frederic Hüftlein、Helena Hartmann、NGSライブラリーを準備してくれたMichaela HochholzerとAndrea Kirpal（Keylab Genomics and Bioinformatics）に感謝する。Projekt DEALによるオープンアクセス資金提供。
資金提供情報
このプロジェクトは、バイエルン州環境・消費者保護省から、プロジェクトネットワークBayOekotoxの一部として資金提供を受けた。オープンアクセス出版は、ドイツ研究振興財団（DFG、ドイツ研究財団）-491183248の助成を受けた。バイロイト大学オープンアクセス出版基金の助成を受けた。
付録A
図A1
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各サンプルの希釈曲線。X軸は10,000リードで切断。縦破線はシーケンス深度3900を示す。
図A2
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コントロールと比較したDEP処理における遺伝子の発現差。青い点は有意に発現低下した遺伝子、赤い点は有意に発現上昇した遺伝子を示す。横の赤線は-log10(FDR = 0.05)を示す。2本の縦の赤線はそれぞれ-1と1のlog2FCを示す。
図A3
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コントロールと溶媒コントロールの間のlog2倍変化（FC）に基づく非計量的多次元尺度プロット。nMDSプロットの軸は、各処置の転写変化のばらつきを可視化する遺伝子発現の次元縮小を表す。各ポイントは1サンプルを表し、それぞれの処理に従って色分けされている。
図A4
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コントロールとブレーキダスト処理間のlog2倍変化（FC）に基づく非計量多次元尺度プロット。nMDSプロットの軸は、各処置の転写変化のばらつきを視覚化する遺伝子発現の次元縮小を表す。各ポイントは1サンプルを表し、それぞれの処理に応じて色分けされている。
図A5
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フライトコントロールとDEPフライト処理間のlog2倍変化（FC）に基づく非計量多次元尺度プロット。nMDSプロットの軸は、各処置の転写変化のばらつきを可視化する遺伝子発現の次元縮小を表す。各ポイントは1サンプルを表し、それぞれの処理に従って色分けされている。
図A6
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CytoscapeのClueGoおよびCluePediaプラグインを使用し、FDR≤0.05のGOについてKappa-Score≥0.4に基づいて、DEP治療で濃縮された遺伝子用語および機能グループのネットワーク解析。(a)機能的にグループ化されたアップレギュレート（赤）とダウンレギュレート（青）の遺伝子オントロジーのネットワーク。(b)DEP処理でアップレギュレートされた特定の用語を含む機能グループの円グラフ。(c)DEP処理で発現低下した特定の用語を含む機能グループの円グラフ。各グループの面積は、各グループ内のGO用語の相対数を表す。各グループで最も重要な用語にはラベルが付けられている。
表A1. DESeq2（カットオフ：FDR < 0.01）によると、DEP処理と対照処理を比較した差次的に豊富なASV。
ASVLog2 fold changepadj (=FDR)特徴IDLactobacillus bomicola-5.372<.001ac3366c90455cdc1a4ad414f21215a91Snodgrassella 1-4. 848<.001f9dff838e1ab76a58a54df65a2457d5aSnodgrassella 2−4.256<.0018f7166172175c35bbfc8fa4dc5ef58b8Neisseriaceae−3. 108<.001f1ae3848b7e710b5da56f2a447ae0234Bombiscardovia−1.251.010bf7591505d4138d52e3a9c537c958fa1Gilliamella 12. 146<.00136aed5b1dc9b5c1a2844e58f2d34b1f5Gilliamella 22.473<.0011e232cdf347e2b62b3b1d7347e891797Bacteria unspec. 13.162.0016445d5095ad81f1b73aa974a171ebce6Bombus rupestris3.645<.0016d53feb4ee4fac60aba11969e1e5fc01Bacteria unspec. 23.768.004101de948d3a66ac329a31fd5f92c00d5Bacteria unspec. 34.008<.0017ebb40e08aa315a3ab9ae5fb0b47ae34Methylorubrum4.025<.00192f1720367db58c68a96eceb9feb416aBacteria unspec. 44.030<.0015c70c440562c05d292daf0c5b4694ef4Bacteria unspec. 54.201<.001a6ddcd6498df4ed3d6c3e05663f658fbAsaia sp.10.960<.00149d46d00a93443b060707ab2db8ba82dLactobacillus apis14.158<.00196d14363f547715b65bf7d8ad1d31d17
注：正のLog2倍変化は、DEP処理でより高い存在量を示す。
表A2. ALDEx2による、DEP処理と対照処理を比較した有意に豊富なASV。
ASVEffectp adjFeature IDSnodgrassella 2−5.516<.0018f7166172175c35bbfc8fa4dc5ef58b8Neisseriaceae−2.659<.001f1ae3848b7e710b5da56f2a447ae0234Lactobacillus bombicola−2. 393<.001ac3366c90455cdc1a4ad414f21215a91Snodgrassella 1−2.356<.001f9dff838e1ab76a58a54df65a2457d5aBombiscardovia−2.092<.001bf7591505d4138d52e3a9c537c958fa1
注：負の効果はコントロールでより高い存在量を示す。 padj = ウィルコクソン検定のBenjamini-Hochberg補正p値の期待値。効果 = 効果の大きさの中央値 (diff.btw/max(diff.win)).
表A3. コントロールと比較したDEP処理における差次的発現遺伝子（低カウント遺伝子フィルター設定： CPM Filter = 1、CPM Filter = 2に達したサンプル）。
FeatureDescriptionLogFCLogCPMFDRLOC105666082Protein IWS1 homolog4.778−0.174<0.001LOC100651567Protein yellow-like4.2685.560<0.001LOC1006448464.2595.525<0.001LOC1006441584.2390.4640.009LOC1006430934.1012.086<0. 001LOC105666427Titin homolog4.054−0.636<0.001LOC1006469404.045−2.0330.002LOC110119163Protein fantom-like3.865−1.153<0.001LOC1101195073.774−0.774<0.001LOC1101202403.763−1.264<0.001LOC1006489953.0342.508<0. 001LOC100646947Proline-rich protein 42.981-0.210<0.001LOC100648170Salivary glue protein Sgs-3-like2.8824.684<0.001LOC110120085MATH and LRR domain-containing protein PFE0570w-like2.8650.639<0. 001LOC100646909Leucine-rich repeat protein SHOC-2-like isoform X12.8152.525<0.001LOC1006479742.7899.078<0.001LOC100647281Spore wall protein 2-like2.7840.248<0.001LOC100644232MATH and LRR domain-containing protein PFE0570w-like2. 7754.245<0.001LOC1006471782.7547.912<0.001LOC1006455002.7525.742<0.001LOC1006471762.642−1.240<0.001LOC100652307Mucin-5AC-like isoform X32.5903.066<0.001LOC100647203Glycine-rich cell wall structural protein2. 579-0.377<0.001LOC105666061繊維鞘CABYR結合タンパク質様2.5511.1060.008LOC100649104電子伝達フラボタンパク質βサブユニットリジンメチルトランスフェラーゼ様2.489-0.274<0. 001LOC100650993ハイブリッドシグナル伝達ヒスチジンキナーゼL様2.367-0.563<0.001LOC100642564プロトン共役アミノ酸トランスポーター様タンパク質哀れ2.3401.911<0.001LOC1006470412.2814.208<0. 001LOC100645710セントロソームタンパク質290kDa様2.1984.105<0.001LOC1006514332.1878.265<0.001LOC100644285ジンクフィンガータンパク質100様2.1860.703<0.001LOC1006472652.1635.745<0.001LOC105666426タイチンホモログ2.151-0.425<0. 001LOC100644468Spore coat protein SP96-like2.129-0.2940.027LOC100649167Coiled-coil domain-containing protein 170 isoform X12.1214.034<0.001LOC100645585Ununcharacterized protein LOC100645585 isoform X12.0370. 733<0.001LOC1006435612.0016.567<0.001LOC1006459961.9880.963<0.001LOC1006520191.9676.469<0.001LOC105666709Uncharacterized protein LOC1056667091.8904.064<0.001LOC110119744Uncharacterized protein LOC1101197441. 8702.413<0.001LOC100647550Cyclin-dependent kinase inhibitor 1C1.832−1.1750.029LOC1006503401.829−0.412<0.001LOC1006479291.794−0.292<0.001LOC105665898Uncharacterized protein LOC1056658981.790−1.1260. 002LOC105665941Uncharacterized protein LOC1056659411.7811.785<0.001LOC1006466771.7749.275<0.001LOC110120139Uncharacterized protein LOC1101201391.7590.166<0.001LOC1006458401.7390.876<0.001LOC1006478831.7389.769<0. 001LOC100651423シスチノシンホモログアイソフォームX11.7267.389<0.001LOC110119585オドラント受容体49b様1.7181.471<0.001LOC1006461531.7092.931<0.001LOC105666013プロテインフックホモログ3様1.687-0.0560. 013LOC100645923Uncharacterized protein LOC100645923 isoform X11.6570.413<0.001LOC100649809Microtubule-associated protein 10-like1.655−0.3590.006LOC1006512311.6453.3390.006LOC1006486881.6314.1920. 046LOC110119618Uncharacterized protein LOC1101196181.6300.8230.002LOC1101193381.6200.068<0.001LOC1006462021.6174.879<0.001LOC105666927Uncharacterized protein LOC1056669271.576−0.6310.041LOC1006515301.5740.2990.002LOC1006467471. 5625.823<0.001LOC1006486461.5346.323<0.001LOC1006483001.5317.334<0.001LOC110120263Uncharacterized protein LOC110120263 isoform X21.4964.036<0.001LOC1006469221.4738.312<0.001LOC1006482831.4720.806<0.001LOC1006460091. 4719.026<0.001LOC1006468961.4494.249<0.001LOC100649615アタキシン-7様タンパク質11.4405.277<0.001LOC105666227低品質タンパク質：未特性タンパク質LOC1056662271.439-0.4430.001LOC1006517321.4392.514<0. 001LOC1006428841.4365.710<0.001LOC100642438推定されるWRKY転写因子タンパク質11.4203.795<0.001VSP1.4099.742<0.001LOC105666604未特性タンパク質LOC1056666041.4040.1970.003LOC1056658821.3992.459<0. 001LOC1006455631.3991.182<0.001LOC1006460941.3996.502<0.001LOC1006459791.397−0.8030.021LOC105665708LOW QUALITY PROTEIN: uncharacterized protein LOC1056657081.3940.8550.008LOC100648236Uncharacterized protein LOC1006482361. 3863.095<0.001LOC1006445991.3704.767<0.001LOC100646656Myb-like protein X1.3641.395<0.001LOC1006457021.3619.861<0.001LOC1006521831.3579.345<0.001LOC1006522581.3519.815<0.001LOC1006447341.3446.064<0. 001LOC1006427701.3398.595<0.001LOC1006481021.3369.620<0.001LOC1006432151.3351.7660.012LOC100643695小胞抑制性アミノ酸トランスポーター1.3320.1570.001LOC1056667992孔カリウムチャネルタンパク質sup-91.3310. 8060.033LOC1006483041.3276.114<0.001LOC1101198151.3253.311<0.001LOC100648321Uncharacterized protein LOC1006483211.3002.319<0.001LOC100646208Protein PIH1D31.2920.892<0.001LOC1006427151.288−0.4270.009LOC1006479861. 2776.942<0.001LOC100646384Pupal cuticle protein G1A-like1.2751.415<0.001LOC100645727Prohormone-2-like1.2751.824<0.001LOC1006502761.2682.753<0.001LOC1006505661.2648.947<0.001LOC1006493871.2595.304<0.001LOC1006498361. 2573.552<0.001LOC1006451371.2523.719<0.001LOC1006489701.251−0.6110.006LOC1006499381.2476.943<0.001LOC1006519011.2428.224<0.001LOC1006466241.2294.2940.044LOC100647259Uncharacterized protein LOC1006472591. 2285.697<0.001LOC1006474971.213−0.2250.008LOC1006495791.2099.855<0.001LOC1006456761.2027.801<0.001LOC1006463761.195−0.5950.033LOC1006494071.1889.355<0.001LOC100647950Alpha-tocopherol transfer protein-like1. 1841.0300.046LOC1006514911.1772.702<0.001LOC100642208DNAリガーゼ1様アイソフォームX61.1752.630<0.001LOC100649496未特性タンパク質LOC1006494961.1740.9850.006LOC100645061タンパク質odd-skipped1.1713. 722<0.001LOC1006429571.1626.871<0.001LOC1056663691.1621.6890.004LOC1006497391.1607.421<0.001LOC1006432431.1532.973<0.001LOC1006484761.1505.734<0.001LOC1006486531.1462.896<0.001LOC1006485581.1433.700<0. 001F2未特定のアブドロラーゼドメイン含有タンパク質DDB_G0269086-like1.134-0.5290.011LOC100648973タンパク質GDAP2ホモログ1.1299.913<0.001LOC105666926未特定のタンパク質LOC105666926アイソフォームX21.1202. 0810.0369LOC1006471471.1153.715<0.001LOC110119847Protein lethal(2)essential for life-like1.1144.4260.039LOC100645059SIFamide-related peptide1.109−0.6950.036LOC1006437821.1020.0970.003LOC1006449561.1014. 921<0.001LOC1006511771.0952.141<0.001LOC1006473291.0919.649<0.001LOC1006463201.0890.9160.017LOC1006428831.0815.822<0.001LOC1006516561.0757.739<0.001LOC1006424841.074−0.0790.030LOC1006488791.072−0.5880. 043LOC110119508未特性タンパク質LOC1101195081.0720.436<0.001LOC100642826タンパク質FAM151BアイソフォームX21.0699.561<0.001LOC100651405エステラーゼB1様1.0670.3210.003LOC110119866未特性タンパク質LOC1101198661. 0650.8790.013LOC105666040Uncharacterized protein LOC1056660401.0640.8600.002LOC1006448621.0527.371<0.001LOC1056668341.0450.9930.010LOC100649218Uncharacterized protein LOC100649218 isoform X21. 0441.947<0.001LOC1006450361.0402.696<0.001LOC100649225Basic proline-rich protein isoform X11.029−0.6350.034LOC1006480731.0261.1760.007LOC1006443971.0231.5070.015LOC100644350Uncharacterized protein LOC1006443501. 0181.2950.021LOC100643873Prion-like-(Q/N-rich) domain-bearing protein 25 isoform X21.0178.273<0.001LOC1006453851.0162.750<0.001LOC1006473231.0156.130<0.001LOC1006450621.012−0.6280.008LOC1006467771. 0093.1790.001LOC100645806成長因子受容体結合タンパク質14アイソフォームX21.0046.502<0.001LOC100644243推定唾液分泌ペプチド1.00212.695<0.001LOC100649384-1.0085.405<0.001LOC100650561-1. 0177.586<0.001LOC100643490−1.0188.027<0.001LOC100649785−1.0194.479<0.001LOC100647616−1.0205.5330.021LOC100646229−1.0235.296<0.001LOC100649475−1.02410.228<0.001LOC105666138−1.0356.859<0. 001LOC100642963Histidine-rich glycoprotein-like−1.0455.1540.002LOC100651034−1.0456.727<0.001LOC100642358−1.0453.873<0.001LOC100648843−1.0498.843<0.001LOC100642272−1.0548.7410.021LOC100631070Melittin−1. 0593.7660.008LOC100642297Lysozyme-like−1.06110.6820.002LOC100649166−1.0614.248<0.001LOC100644014−1.0726.401<0.001LOC100651129Protein G12−1.07810.2830.043LOC100645024−1.0918.467<0.001LOC100644917−1. 0914.886<0.001LOC100647588長鎖脂肪酸輸送タンパク質4様体-1.0966.759<0.001LOC100644715ポリペプチドN-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ2-1.1004.682<0.001LOC100651969未同定タンパク質LOC100651969アイソフォームX2-1. 1000.8900.002LOC100646207−1.1015.6820.002LOC105666529Aquaporin-11−1.1022.117<0.001LOC100644235Uncharacterized protein LOC100644235−1.1071.968<0.001LOC100646060−1.1147.402<0. 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注：log-fold change (logFC)が正の場合は、DEP処理で発現が高いことを示す。
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