PCOSの病態とメトホルミン治療効果における腸内細菌叢とSCFAの影響

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PCOSの病態とメトホルミン治療効果における腸内細菌叢とSCFAの影響

Impact of Gut Microbiota and SCFAs in the Pathogenesis of PCOS and the Effect of Metformin Therapy

著

エフゲニイ・クカエフ

1,2,*,

エカテリーナ・キリロワ

1,

アリサ・トカレワ

1,

エレーナ・リムスカヤ

1,3,

ナタリア・スタロドゥブツェワ

1,4,

ガリーナ・チェルヌカ

1,

タチアナ・プリプトネヴィチ

1,

ウラジーミル・フランケビッチ

1,5および

ゲンナジー・スクヒク

1

1

V.I.クラコフ国立産科・婦人科・周産期医学研究センター、ロシア連邦保健省、117997モスクワ、ロシア

2

V.L.タルローズ化学エネルギー問題研究所、N.N.セメノフ連邦化学物理研究センター、ロシア科学アカデミー、119334モスクワ、ロシア

3

レベデフ物理研究所、119991モスクワ、ロシア

4

モスクワ高等研究センター、123592 モスクワ、ロシア

5

シベリア国立医科大学トランスレーショナル医学研究所、634050 トムスク、ロシア

*

著者

Int. J. Mol. Sci. 2024,25(19), 10636;https://doi.org/10.3390/ijms251910636

投稿受理：2024年8月29日 2024年8月29日／改訂：2024年9月28日／受理：2024年9月29日／発行：2024年10月2日

(この論文は特集号「多嚢胞性卵巣症候群の新たな挑戦と展望」に属しています )

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レビュー報告書 バージョンノート

要旨

多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）は、内分泌系と代謝系の両方に影響を及ぼす複雑な疾患であり、しばしば不妊、肥満、インスリン抵抗性、心血管合併症を引き起こす。本研究の目的は、PCOSの発症における腸内細菌叢とその代謝産物、特に短鎖脂肪酸（SCFA）の役割を調べ、メトホルミン治療がこれらの成分に及ぼす影響を評価することである。PCOS女性（）および健常対照者（）の糞便および血液サンプル中のSCFA濃度を、精密測定のためにガスクロマトグラフィー質量分析計（GC/MS）を用いて分析した。糞便微生物叢はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により定量的に検出した。6ヵ月間のメトホルミン治療の有効性を評価するため、PCOS群（）における微生物叢とSCFAの変化も評価した。その結果、PCOS女性では、日和見微生物（C. perfringens、C. difficile、Staphylococcusspp.、Streptococcusspp.）の顕著な過剰増殖とともに、有益菌（すなわち、C. leptumグループとPrevotellaspp.）の有意な減少が認められた。酢酸（AA, ）と吉草酸（VA, ）の過剰産生は、SCFAの上昇と肥満やPCOSの発症との関連を示唆している。興味深いことに、血流中のAAが、高体重指数（、）、インスリン抵抗性（、）、慢性炎症などの主要な症状を改善することにより、PCOSに対する保護効果をもたらす可能性がある。メトホルミン投与後、血清SCFA濃度は有意な変化を示さなかったが（）、腸管内のAAが正常化したことから、メトホルミンは消化管内で局所的により顕著な効果を発揮することが明らかとなった。さらに、この研究では、メトホルミン治療の成功を予測するための最も効果的なモデルが、血清中の酪酸（BA）とVAの濃度に基づいて同定され、その正確率は91％、感度は100％、特異度は80％であった。これらの有望な知見は、標的を絞った介入や個別化治療を開発し、最終的にPCOS女性の臨床転帰を改善する可能性を強調するものである。

キーワード

メタボロミクス；多嚢胞性卵巣症候群；短鎖脂肪酸；病因；腸内細菌叢；ガスクロマトグラフィー質量分析法

1. はじめに

多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）は、アンドロゲン過剰、排卵機能不全、多嚢胞性卵巣形態を特徴とする一般的な内分泌代謝疾患である [1,2,3,4]。PCOSの臨床像は多様であり、4つの異なる表現型に分類することができる [4,5]。PCOSの診断基準としては、ロッテルダム基準が推奨されている [5]。この病態は、インスリン抵抗性（IR）、性腺刺激ホルモンおよび神経ペプチド分泌の障害、肥満、2型糖尿病、アテローム性脂質異常症、脳血管合併症のリスク上昇など、幅広い異常を伴う [1,2,6,7]。PCOSは女性不妊症の主要な原因であり、その有病率は増加傾向にある [7,8]。PCOS患者の肥満率の増加は、代謝の問題をさらに激化させ、グルコースおよび脂質代謝の乱れをもたらす [8]。

近年、微生物叢とヒトの健康との関係に注目が集まっている [9]。生理的バランスの調整、代謝保護への影響、構造的完全性の維持、組織学的恒常性の確保における腸内細菌叢と膣内細菌叢の役割が、数多くの研究で強調されている [10,11,12]。PCOS患者における腸内細菌叢の組成は、健康な女性とは大きく異なっている [12]。腸内細菌叢の乱れは、PCOSに関連する様々な臨床症状、特に肥満やインスリン抵抗性と密接に関連している [6,13]。

その重要性が認識されているにもかかわらず、腸内細菌叢がPCOS患者に影響を及ぼす正確なメカニズムについての理解はまだ不完全である [6,12,14,15,16]。腸内細菌叢の重要な機能は、食物繊維を発酵させて、主に酢酸（AA）、プロピオン酸（PA）、酪酸（BA）、吉草酸（VA）を含む短鎖脂肪酸（SCFA）に変換することである [12,17,18]。中でもBAは、腸管上皮細胞にとって重要なエネルギー源となるだけでなく、強力な抗炎症作用を示すという二重の機能を持つことから、特に注目されている [19]。SCFAは総体的に、腸粘膜バリアの完全性の維持に重要な役割を果たし、腸内生態系における重要なシグナル伝達分子として作用する [20,21]。さらに、これらの脂肪酸は、グルコース刺激によるインスリン分泌を促進する代謝プロセスに不可欠であるため、インスリン感受性が向上する。インスリン感受性の向上は、食欲を制御し全体的な代謝の健康を調節するペプチドホルモンの調節に役立つため、この向上はPCOS患者にとって特に有益である [22]。これらの洞察は、PCOSにおける腸内細菌叢の役割に関する更なる研究の必要性を強調し、PCOSに関連する代謝および炎症症状を緩和するために微生物の不均衡を標的とした治療介入の可能性を示唆している。

メトホルミンは、その代謝作用でよく知られており [23,24]、腸内細菌叢とSCFA産生に対する潜在的な影響を探ることは、この研究の新しい側面を表している。メトホルミン治療後のSCFAプロファイルと微生物組成の変化を分析することで、PCOSにおけるメトホルミンの治療機序と潜在的有益性を明らかにしたい。

本研究の目的は、PCOSの発症における腸内細菌叢とその代謝産物、特にSCFAの役割を調査し、これらの成分に対するメトホルミン治療の効果を評価することである。本研究で得られた知見は、PCOSに罹患した女性に対する標的介入や個別化された治療戦略の開発に重要な示唆を与え、より効果的で個別化された治療法の選択肢につながる可能性がある。

2. 結果と考察

2.1. 研究対象者の臨床的プロフィール

69人のPCOS患者を対象とした研究では、平均体格指数（BMI）は24.8±5.2kg/で、60.9％が標準体重、20.3％が過体重、18.9％が肥満であった。臨床的アンドロゲン亢進症は患者の66.7%に認められ、78%は生化学的アンドロゲン亢進症を示し、総テストステロンの上昇は53.6%、遊離テストステロンの上昇は34.8%であった。PCOSの形態学的徴候は患者の87.0％に認められ、平均卵巣容積は12.7±3.2、卵胞数は26.8±18.8であった。耐糖能検査では11.6％に耐糖能障害が認められ、インスリン抵抗性は36.2％、高インスリン血症は39.1％であった。脂質異常症は29.0％に認められ、dual-energy X-ray absorptiometryでは、患者の79.7％（平均37.0±7.5％）に総脂肪過剰が認められ、うち67.3％に内臓脂肪過剰が認められ、平均540.7±482.9gであった。

PCOS患者では、インターロイキン-6（IL-6）、腫瘍壊死因子α（TNF-）、C反応性蛋白（CRP）の血清中平均値が対照群と比較して有意に上昇し、それぞれ1.3pg/mL、0.8pg/mL、4.8mg/Lであったのに対し、対照群では0.7pg/mL、0.4pg/mL、3.1mg/Lであった。CRPとIL-6の上昇はPCOS患者の37.7％にみられたが、TNF-レベルの上昇は両群ともみられなかった。

体脂肪の質量、総脂肪の相対的割合、内臓脂肪の質量は、甲状腺脂肪の質量やBMI（）と同様に、互いに非常に強い直接的な関連がある。さらに、これらのパラメータはすべて高密度リポ蛋白（HDL）レベルと逆相関があり、負の相関係数で示される（体脂肪量の場合 、）。総脂肪量を除くと、これらのパラメータは、性ホルモン結合グロブリン（SHBG）およびアンドロステンジオンのレベルとも負の相関を示す。さらに、体脂肪パラメータは、低比重リポ蛋白（LDL）、トリグリセリド、C反応性蛋白、空腹時インスリンと正の相関があり、体脂肪組成と様々な代謝および心血管危険因子との間に強い関連があることを示唆している（図1 、補足資料の表S1参照）。

図1. 治療前の対照群（）とPCOS群（）における体組成と臨床パラメータの相関プロット。十字記号は統計的に有意でない（）関係を示す。ドットの大きさは相関係数の絶対値を表す。

2.2. PCOSによる腸内細菌叢の乱れ

最近の科学的研究では、慢性的な低グレードの炎症と代謝機能障害との関係、特に腸内細菌叢組成の乱れとの関係にますます焦点が当てられてきている。微生物とヒトの免疫系との間の複雑な相互作用は、これらの微生物による生物学的活性物質の合成とともに、様々な代謝過程の調節において重要な役割を果たしている。腸内細菌叢は、消化、エネルギーバランス、腸管バリア機能の維持に不可欠であるだけでなく、脂肪蓄積、血管系形成、神経系や免疫系の調節、薬物代謝などにも影響を及ぼしている [25,26]。腸内細菌叢と宿主との間の安定した均衡は、恒常性の維持と様々な病態に対する抵抗力の維持に不可欠である。

ヒトの消化管には多様な細菌種が生息しており、その数は数百に上ることが多い。これらの細菌は多くの機能的役割を共有しており、機能的冗長性によってある程度の補償が可能である。しかし、この冗長性は、代謝機能障害を伴うPCOSのような疾患の発症や進行に関与する可能性のある特定の微生物を同定する際の課題となっている。微生物の多様性の低下と機能的冗長性は、肥満、メタボリックシンドローム、2型糖尿病などの疾患と強く関連している [27,28,29]。腸内細菌叢の多様性の低下とインスリン抵抗性、肥満との間には相関関係があることが、数多くの研究で示されている [30,31]。

腸内細菌組成の変化は、PCOSの病因に大きく関与しているようである [10,13]。PCOS患者では腸内細菌叢の多様性が低下しており、現在の研究によると、これらの患者で最も多くみられる属には、Clostridium属（Bacillota門）、Bacteroides属（Bacteriodota門）、Escherichia属（Pseudomonadota門）が含まれる。ラクトバチルス属とビフィドバクテリウム属の多くのメンバーは、宿主に健康上の利点をもたらす有益な共生細菌であるが、クロストリジウム属には、C. tetani、C. botulinum、C. difficile、C. perfringensなどの病原性種と、大腸で優勢な細菌種であるF. prausnitziiを含むSCFA産生グループC. leptumなどの有益な種の両方が含まれていることに注意することが重要である [19]。

腸内細菌叢組成の包括的定量分析により、主要微生物、特に酵素およびSCFA産生菌の消化管コロニー形成レベルに有意差があることが明らかになった（図2参照）。PCOS群では、共生細菌の有意な減少が観察され、特にC. leptum群とPrevotella属において顕著であった。 この減少は、体重が増加している個体で特に顕著であった。さらに、A. muciniphila、F. prausnitzii、Bifidobacteriumspp.、Lactobacillusspp.、Desulfovibriospp.、Bacteroidesspp.を含む他の有益な微生物のレベルは、健康な対照群と比較してPCOS群では全般的に低かった。

図2. 治療前のPCOSが腸内細菌叢に及ぼす影響を、コロニー形成単位数の中央値を用いたレーダーチャート（対数目盛）で示した： PCOS群（赤色）と対照群（青色）。データは、糞便1g中の糞便リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）標的遺伝子アンプリコンコピー数の平均推定値を表す。統計的に有意な変化（）はアスタリスク（*）で示した。

共生細菌の減少は、日和見微生物の過剰繁殖を伴った。日和見微生物は、タイトジャンクションタンパク質の発現を障害し、腸管透過性を増加させる可能性がある [13,32]。この透過性の亢進は、毒素、特にリポ多糖の全身循環への移行を促進し、免疫系を活性化させ、慢性的な低悪性度炎症を引き起こす。PCOS患者にみられる日和見病原体、特にC.ペルフリンゲンス（C. perfringens）グループとブドウ球菌属に関連する病原体の存在の高まりは、慢性炎症にさらに寄与している可能性がある。これらの日和見病原微生物と慢性炎症を示すマーカーとの間には弱い正の相関が認められたが、PCOSに伴う炎症は多因子性であり、炎症性サイトカインの合成を刺激する多くの中間体によって影響を受けることを考慮することが重要である。さらに、PCOS患者ではC. difficileと Streptococcus属の力価上昇が検出されたが、これらの所見は統計学的有意差には至らなかった（）。結論として、PCOS患者の腸内細菌叢は、日和見病原体が増加し、有益な共生細菌が減少することで、種の豊富さが減少し、微生物バランスが偏っていることが特徴である [13,32,34]。この微生物のアンバランスは、遺伝的およびエピジェネティックな因子によって複合化され、PCOSに伴う代謝異常および肥満の発症において、さらなる決定因子として機能する可能性がある。

2.3. 糞便および血漿中のSCFA（GC/MS）

SCFA、特にAA、PA、BA、VAの研究における最近の進歩により、細胞レベルおよび分子レベルの両方で、様々な生理学的システムに対する重要な作用が解明されてきた。新たな研究により、SCFAの存在や欠乏が、自己免疫疾患、代謝症候群、神経疾患など、さまざまな疾患の発症に影響を及ぼすことが明らかになっている [35]。

PCOS患者では、腸内細菌叢の異常が観察されており、SCFAなどの微生物代謝産物の組成異常が特徴である [11,13,14]。これらの細菌由来分子は、食物摂取、エネルギー消費の調節、腸管免疫恒常性の維持において重要な役割を果たしている。具体的には、BAは主に腸内の結腸細胞で利用され、AAとPAは門脈を介して肝臓に輸送される。肝臓では、プロピオン酸は肝細胞でさらに代謝され、酢酸はしばしば末梢循環に入る。研究により、BAはグルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）やペプチドYY（PYY）などの腸管ホルモンの分泌を刺激することが示されており、これらのホルモンは、インスリン分泌を促進し、満腹感を誘発することにより、血糖値の低下に重要な役割を果たしている［36,37］。さらに、BAは腸のバリア機能を支え [38]、ムチンの産生を促進し [39]、顕著な抗炎症作用を示す [40]。したがって、BAを産生する細菌の集団の減少は、慢性的な低悪性度炎症とインスリン抵抗性の発症に寄与する可能性がある。酢酸とPAもまた、代謝プロセスに大きな影響を与える。酢酸とプロピオン酸は膵臓細胞の機能に影響を与え、インスリン分泌を促進し、血糖値を下げると考えられている [41,42]。SCFAは、代謝プロセスにおいて重要な役割を担っていることから、PCOSにおいて重要な代謝バイオマーカーとして同定されている [17,19,22]。これらのSCFAsのレベルおよび利用における変化は、PCOSの根本的なメカニズムに光を当て、新たな診断および治療戦略への道を開く可能性がある。PCOSに関連する特異的なSCFAプロファイルが同定されれば、健康な腸内細菌叢とSCFA産生を回復させることを目的とした的を絞った介入が可能となり、その結果、PCOSに特徴的な代謝障害や炎症性障害を緩和できる可能性がある。これにより、最終的にはPCOSおよび関連する代謝機能不全に苦しむ患者の臨床転帰が改善される可能性がある。

PCOS患者における腸内細菌叢の代謝産物を調査した結果、この疾患の発症と進行における腸内細菌叢の重要な役割が明らかになった（図3に図示し、表S2およびS3に詳述）。特にPCOS群では、AAとVAの濃度が有意に上昇した（）。PAとBAも増加傾向を示したが、これらの変化は統計学的有意差には達しなかった（）。これらの所見は、Liら（2022）[43]が報告した結果と一致している。Zhangら（2019）は、PCOSの女性と比較して、対照群で有意に便中SCFAが多いことを報告している［44］。最近の研究では、エネルギー制限食がPCOSの肥満・過体重患者の糞便中のAAとBAのレベルを有意に低下させ、それによって血清脂質プロファイルが改善することが確認されている[45,46,47]。したがって、腸内でのAAの過剰産生または蓄積は、肥満やPCOSの発症に関与している可能性がある。血清中では、AA、PA、BA、VAの濃度が有意ではない（）減少傾向を示した。） 血清中のSCFA濃度は糞便中の濃度と相関しなかったことから（図S2）、血流中のSCFA濃度は相互に関連する様々な因子の影響を受けていることが示された。これらの因子には、大腸上皮層の透過性、大腸内の酸性度、SCFAの主要消費者である免疫細胞や大腸細胞の代謝活性の変動などが含まれる。さらに、大腸細胞によるSCFAトランスポーターであるMCT-1とSMCT-1の発現の個人差が血清中のSCFA濃度に大きな影響を与えることから、遺伝的素因も一役買っている [16,19]。これらの要素は複雑で非線形な方法で相互作用し、SCFA濃度に影響を及ぼす。これに加えて、血液中に存在する酢酸の一部は内因性であり、様々な組織や臓器から放出される [48]。

図3. SCFA濃度、相対量、および比率のバイオリンプロット（糞便）。青：対照群（）；赤：治療前のPCOS群（）；黄：治療後のPCOS群（）。AA：酢酸；VA：吉草酸；BA：酪酸；PA：プロピオン酸。* はMann-Whitney検定による、 **は 、 ***は 、を示す。

PCOSは生殖障害だけでなく、代謝異常とも関連しており、2型糖尿病やメタボリックシンドロームの危険因子として知られている[1,2,3]。PCOS患者のおよそ3分の1は、CRPおよび/またはIL-6の上昇など、低グレードの炎症を示す検査所見を示す。ほとんどのPCOS患者は脂肪組織が過剰であることから、血清中の炎症性マーカーとアディポサイトカインのレベルを評価し、体組成や血清SCFAとの関係を調べた（図4）。血清AAの絶対濃度は、BMI、内臓脂肪の質量、総脂肪の相対的割合、TNF-、トリグリセリド、グルコース負荷1時間後のインスリン値、IL-6と逆相関を示した。AAと最も強い相関が認められたのは、炎症性TNF-（、）とIL-6（、）であった。さらに、AA濃度はSHBG (,p= 0.03)およびHDL (, )と正の相関を示した（図4、表S4）。

図4. メトホルミン治療前のPCOS群における臨床関連パラメータ（）と血清SCFAsとの統計学的に有意な関連。十字記号は統計的に有意でない（）関係を示す。ドットの大きさは相関係数の絶対値を表す。

血中にAAが存在すると、PCOS予防効果がある可能性がある。AAは、高BMI、インスリン抵抗性、全身性炎症などのPCOSの主要な臨床症状と逆相関しており、AA濃度の上昇は、これらの病的特徴の重症度の低下と関連していることを示している。このことは、PCOSの管理におけるAAの治療的価値の可能性を強調するものである。さらに、主要な血清SCFAであるAA（、）、PA（、）、BA（、）およびVA（、）と、PCOSで観察される炎症および代謝異常の重要な担い手であるTNFとの間に強い負の相関があることから、PCOSの病因における血中SCFAの有益な効果が確認された。この関係は、SCFAがPCOSに関連する炎症プロセスをどのように緩和できるかを強調している。SCFAが抗炎症作用を発揮する主なメカニズムは、IL-6やTNF-などの炎症性メディエーターの合成を阻害することである。

SCFAがPCOSの発症と進行に影響を及ぼす正確なメカニズムを解明するためには、広範かつ詳細な研究が必要である。今後の研究では、PCOSとの関連におけるSCFAの特異的な生化学的相互作用、細胞応答、およびより広範な生理学的効果の探求に焦点を当てるべきである。これにより、より明確な洞察が得られ、この複雑な病態を管理するための新規治療標的が明らかになる可能性がある。

2.4. メトホルミン治療の成功予測

PCOSは不均一な疾患であり、最適な治療レジメンの開発を複雑にしている。治療は対症療法であり、処方される薬剤のほとんどが "適応外 "で使用されるため、最大限の有効性が制限され、有害事象のためにしばしば治療コンプライアンスが低下する。経口避妊薬の併用が一般的であるが、インスリン感作薬、特にメトホルミンも広く使用されている。メトホルミンのグルコース代謝に対する有益な作用は、十分に確立されている：肝臓での糖新生を減少させ、腸でのグルコース吸収を減少させ、末梢でのグルコース利用を促進し、GLP-1の分泌を増加させる。さらに、メトホルミンは、代謝パラメーターを改善することにより間接的に、また抗炎症作用により直接的に、慢性炎症の重症度を軽減することが証明されている [24]。腸内細菌叢の乱れが確認されていることを考慮すると、メトホルミンが腸内細菌組成に及ぼす影響と、プロバイオティクスによって細菌叢を是正することによって治療効果を高める可能性が特に注目される。

PCOS群におけるメトホルミン治療6ヵ月後（）、月経間隔が64.2±46.1日減少した（）。月経周期の完全な回復は69例中16例（23.2％）で達成された。月経回数の増加を特徴とする部分的な改善は、69人中23人（33.3％）で観察された。しかし、69人中30人（43.5％）では乏月経または無月経が持続し、治療による効果は認められなかった。

メトホルミン治療中に体組成の有意な変化が観察された：総脂肪組織の割合は治療後の37.0±7.3％から35.4±6.6％に減少し（）、内臓脂肪組織の質量は654.4±651.7gから382.5±416.2gに減少した（）。代謝パラメーターのうち、空腹時インスリン値は27.1％の統計学的に有意な減少を示し、これはHOMA指数の減少にも反映された（）。しかし、脂質プロファイル・パラメータには有意な変化はみられなかった（）。CRP値上昇の患者数は1.5倍減少し、IL-6値上昇の発生率は3.5倍減少した。これらの結果から、PCOSにおけるメトホルミンの有益な効果が確認された。

研究参加者において、メトホルミン治療は、インスリン抵抗性と慢性低悪性度炎症のマーカーの頻度を減少させただけでなく、A. muciniphilaのような腸内細菌叢の共生細菌の存在量を増加させ、C. perfringensや C. difficileのような日和見病原体を減少させた。メトホルミン投与は糞便中のSCFAレベルに選択的効果を示し、AAを正常レベルまで有意に減少させるが、他のSCFAには実質的な影響を与えない（図3）。血液中のSCFAレベルはメトホルミン治療後に持続的な減少を示したが（図S1 ）、この減少は対照群と比較した場合には統計学的有意差には達しなかった（）。したがって、メトホルミンがSCFAsに及ぼす影響は、血中よりも消化管においてより顕著である可能性がある。このような差のある作用の背後にあるメカニズムや、PCOSのような疾患の管理における臨床的意義の可能性をよりよく理解するためには、さらなる研究が必要である。患者の約半数（43.5％）でメトホルミン治療中に周期の調節が欠如していたことから、コホートはさらに、完全な効果のある群（）と効果のない群（）に分けられた。治療前の腸内細菌叢組成は、治療効果が十分に認められた群と認められなかった群で有意差が認められた（図5）。治療効果が十分に認められた患者では、C. leptumgr.、Butyricimonasspp.、Parabacteroidesspp.、Bacteroidesspp.、およびDialister、Alisonella、Megaspherae、Vellonellaの複合グループの存在量が、治療効果が認められなかった患者よりも有意に高かった（）。これらの細菌のほとんどは、腸と代謝の健康に有益であると考えられている。特にC. leptumgr.には、ヒトの腸内細菌叢において最も豊富で重要な種のひとつであるF. prausnitziiが含まれている。これらの共生細菌が減少すると、グルコース代謝、脂肪酸酸化、さらには食欲の調節に重要な役割を果たすSCFAの合成が減少する可能性がある。さらに、これらの細菌は脂肪の消化と乳化に不可欠な胆汁酸の産生にも関与している。したがって、これらの共生細菌の減少は、しばしばPCOSと関連する脂質異常症やインスリン抵抗性の発症に寄与する可能性がある [50]。

図5. 治療前のPCOS群腸内細菌叢組成と治療により期待される効果。赤：治療効果のレーダーチャート、黒：治療効果なし。統計的に有意な変化（）はアスタリスク（*）で示す。

メトホルミン治療の効果、特に治療成功の指標となる月経周期の完全な回復を予測するために、いくつかのeXtreme Gradient Boosting（xGBoost）[51]モデルが開発された。糞便中のSCFAsレベル、VAの相対濃度、AAとPAの絶対濃度に基づくモデルは、高い精度（83％）と完全な感度（100％）を示したが、特異度は比較的低かった（71％）（図S3 ）（表1 ）。

表1. XGBoostモデルの性能指標： 精度、感度、特異度、最適閾値。

さまざまな細菌の属、種、科、および真菌のカンジダ属を考慮した別のxGBoostモデルでは、完全な治療効果を予測するための性能指標が大幅に改善された（図S4 ）。このモデルは、93％の優れた精度、86％の感度、100％の特異性を達成した（表1）。

xGBoostモデルが糞便SCFAsレベルと微生物相の特徴を組み合わせると（図S5a,b ）、100％の完璧な感度を維持したが、特異度は71％と再び低くなった。

最後に、BAとVAの絶対血清濃度と相対濃度を利用して、別のxGBoostモデルを開発した（図S6）。このモデルは、感度100％、精度91％、特異度80％という優れた性能を示した（表1、図6）。メトホルミン治療に対する反応を予測することは、PCOS患者に対する治療戦略の最適化を可能にする。予後が予断を許さない患者に対しては、別の方法や併用療法を考慮することが望ましい。

図6. メトホルミン治療の全効果を予測するXGBoostモデルのleave-one-out cross-validationによって得られた受信者動作特性（ROC）曲線。青：糞便SCFAに基づくモデル、赤：糞便微生物叢に基づくモデル、緑：糞便SCFAと微生物叢の複合データ、黒：血清SCFAに基づくモデル。AUC：曲線下面積。

この研究には考慮すべきいくつかの限界がある。まず、サンプル数が対照18例に対して症例69例と著しく不均衡である。この不均衡にもかかわらず、解析の結果、潜在的PCOSマーカーについて高い倍数変化と中程度のCohen's d効果量が得られ、有望な結果が示唆された。しかしながら、本研究は単一施設での研究であるため、メトホルミン治療の有効性を予測するために開発されたモデルの一般化可能性を高めるためには、今後の研究においてサンプルサイズを拡大し、多様な民族グループを組み入れることが極めて重要である。

第二に、SCFAの分析は4つの主要な細菌代謝物のみに限定された： AA、PA、BA、VAである。今後の研究では、SCFAプロファイルとその意味をより包括的に理解するために、長鎖脂肪酸や分岐鎖脂肪酸を追加してパネルを拡大することが有益であろう。

最後に、本研究にはプラセボ群が存在しないことが、もう一つの限界を示している。今後の試験にプラセボコホートを含めることで、研究されている介入の有効性と安全性に関して、より強固な比較と結論が可能になるであろう。今後の研究においてこれらの限界に対処することは、所見の妥当性を強化し、PCOSとそれに関連する治療法のより微妙な理解に貢献するであろう。

3. 材料および方法

3.1. 研究デザイン

この前向き研究は、2020年7月から2023年2月までの期間に、Academician V.I. Kulakovにちなんで命名された国立産科・婦人科・周産期医療研究センターの科学・外来部門を最初に受診した患者を対象とした。参加者全員が署名入りのインフォームド・コンセントを提供した。

PCOS群の組み入れ基準は、当センターでの初診時にPCOSの臨床的および検査的徴候の両方が確認されることであった。参加者の年齢は18～35歳（25.3±5.9歳）であった。逆に、アンドロゲン分泌性卵巣腫瘍や非代償性内分泌疾患、遺伝子スクリーニング（CYP-21）やクッシング症候群で同定された先天性副腎過形成、コントロールされていない性器外の健康問題がある場合は、PCOS群から除外された。さらに、本試験に参加する前3ヵ月以内に脂質低下薬、ホルモン薬、抗生物質、プロバイオティクス、インスリン感作薬を使用したことのある者も除外された。その他の除外基準には、妊娠、腸の機能に影響を及ぼす可能性のある消化器疾患、様々な原因による慢性炎症状態の継続的な増悪、登録前3ヵ月未満に発生した消化管や泌尿生殖器系に関連する急性炎症性疾患が含まれた。

対照群では、参加者は18歳から35歳（26.6±5.0）で、臨床的なアンドロゲン亢進症の所見がなく、月経周期が規則正しく保たれていることが条件であった。対照群の除外基準はPCOS群のものと同じであった。

PCOSは、ロッテルダム・コンセンサスによって確立された臨床ガイドラインに従って診断された。これらの基準には、乏無排卵、高アンドロゲン血症、多嚢胞性卵巣形態が含まれる。乏無排卵は、月経周期が35日を超えるか、または月経が年間8回未満であることを特徴とする。高アンドロゲン血症は、テストステロン値の上昇やFerriman-Gallwey多毛症スケールでの異常スコアなど、さまざまな臨床徴候によって同定することができる。さらに、多嚢胞性卵巣の形態は経腟超音波検査で評価され、いずれかの卵巣に20個以上の卵胞が存在するか、卵巣容積が10cm³以上であることがこの基準を示している。

PCOS診断のための臨床的推奨に沿い、ホルモンのプロフィール検査は、自然月経またはプロゲステロン誘発月経周期の2日目または3日目に行われた。さらに、月経周期の5～7日目に骨盤内臓器の超音波検査が行われた [52]。

末梢血血清サンプル中のIL-6およびTNF-レベルは、"Vector-Best"(Koltsovo, Russia)のテストシステムを用いた固相酵素免疫測定法を用いて定量した。測定値は、Infiniti F50プレート分光光度計（TECAN, Männedorf, Switzerland）を用いて得られた。さらに、レプチンとアディポネクチンのレベルは、市販のキットを利用した固相酵素免疫測定法によって測定した： レプチンについては "Leptin ELISA" (DBC, London, ON, Canada)、アディポネクチンについては "Human Adiponectin ELISA" (BioVendor, Brno, Czech Republic)を用いた。CRP値は、自動分析装置（BA-400、Biosystems社、スペイン、バルセロナ）の比濁法を用い、特に「C反応性蛋白（CRP）」（Biosystems社、スペイン）と表示された試薬を用いて血清中で評価した。

血糖および脂質プロファイル分析は、自動分析装置BA-400（Biosystems、スペイン）を用いて、光度法と比濁法の両方を用いて行った。糖代謝異常の診断とインスリン抵抗性の評価のために、75gのブドウ糖負荷による2時間の経口ブドウ糖負荷試験を行った。この試験中、空腹時グルコースと免疫反応性インスリン濃度が測定され、その後2時間を通して60分間隔で測定が行われた。インスリン抵抗性の恒常性モデル評価（HOMA-IR）は、グルコース（mmol/L）×インスリン（μIU/mL）/22.5を用いて算出した。HOMA-IRの指標値が2.7より大きいことを、以前の研究で確立されたように、インスリン抵抗性の診断基準として用いた [53]。負荷後グルコース値が7.8mmol/Lを超えると耐糖能障害を示し、空腹時グルコース値が6.1～7.0mmol/Lの範囲も潜在的な糖代謝の問題を示していた。

体組成は、Lunar 8743装置（GE Medical Systems社、米国ウィスコンシン州マディソン）を用いたDXAで評価した。評価には、いくつかの重要なパラメータの分析が含まれた：総体脂肪率、総体脂肪量、体幹脂肪量、およびアンドロイドとグノイドの脂肪比。総体脂肪率が30％以上であれば、体脂肪過多とみなされた。さらに、内臓脂肪組織の体積と質量は、Corescan Pty Ltd.（オーストラリア、パース）の「CoreScan」プログラムを用いて測定した。(オーストラリア、パース）の "CoreScan "プログラムを用いて内臓脂肪組織の体積と質量を測定した。内臓脂肪組織の過剰は、測定された内臓脂肪質量が235gを超えた場合に診断された[54]。検査パラメータの基準範囲は表S5に示す。

その結果、PCOSと診断された69人と対照群の18人からなる87人の患者から糞便および血清サンプルが採取された（表2）。

表2. 対照群（）とPCOS群（）で得られた検体数（糞便と血清）。

すべてのPCOS患者（）は6ヵ月間のメトホルミン療法を受け、1日1500mgの「グルコファージ-ロング」（Merck Sante社、フランス、リヨン）を服用した。治療目標はすべての患者で同じであり、特に月経周期の完全な回復であった。メトホルミン治療の効果は次のように分類された：完全な効果は月経周期の完全な回復、部分的な効果は月経回数の増加、効果なしは乏月経または無月経の持続である（表3）。

表3. PCOS群（n＝69）のメトホルミン治療後に得られた検体数（糞便および血清）。

3.2. 検体の採取と保存

糞便サンプルは、容積8～10cm3の滅菌容器に採取し、提供された指示に従って、嫌気的条件を作り出すためのガス発生組成物（AnaeroGen、ThermoScientific社、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を入れた袋に入れて研究室に運んだ。実験室到着後、各サンプルは2つの部分に分けられた。最初の部分は容量1.5～2cm3のプラスチック製エッペンドルフチューブに移し、SCFAの完全性を維持するため、直ちに-80℃で凍結した。第二の部分は微生物学的分析用に確保した。血清サンプルは、静脈穿刺により抗凝固剤無添加のバキュテナー・チューブに採取した。採取後、チューブを4000rpmで15分間遠心分離し、血清と血球を分離した。得られた上清血清は、ラベル付きスクリューキャップチューブに注意深く移し、さらに分析するまで-80℃で保存した。

3.3. SCFAのGC/MS定量分析

本研究では、PCOSと診断された女性の糞便および血液試料中のSCFA、特にAA、PA、BAおよびVAを定量するために、質量分析付きガスクロマトグラフィー（GC/MS）を用いた精密で高感度な方法を採用した。GC/MS法は、代謝研究において重要な指標であるこれらのSCFAを正確に測定できることで有名である[55,56,57]。我々は、誘導体化せずにSCFAsを分析するのに特に効果的な、GC/MSシステム内の高極性固定相カラムを利用している。また、液体-液体抽出[58,59]と試料への酸性化を行い、SCFAが主に未解離の形で存在するようにすることで、疎水性と揮発性を高めた[60,61,62]。

3.3.1. 化学物質と試薬

PCOS女性および対照群から得られた血清および糞便試料中のSCFAsの包括的なGC/MS分析のために、Sigma-Aldrich（米国ミズーリ州セントルイス）などの信頼できるサプライヤーから入手した様々な高品質の化学物質および試薬を使用した。分析には、AA（99％以上）、PA（99.5％以上）、BA（99.5％以上）、VA（99％以上）などの標準物質が用いられた。定量精度を高めるために内部標準物質（IS）を利用した： 血清AAの定量にはAA-d4（99.5％以上）（AA*）を添加し、血清PA、BA、VAの定量にはBA-1,2-13（98％以上）（BA*）を、糞便中のAA、PA、BA、VAの定量にはBA-1,2-13（98％以上）（BA*）を使用した。

糞便サンプル調製時のサンプルの再構成と希釈にはミリQ水を使用し、サンプルの酸性化には1.0 M塩酸（HCl）を適用した。メチルtert-ブチルエーテル（MTBE）をSCFAの液体-液体抽出（LLE）の溶媒として使用し、生物学的マトリックスからの脂肪酸の効果的な抽出を確実にした。

SCFAの正確な定量を容易にするため、適切な濃度のIS作業溶液を調製し、試料に添加した。GC/MS分析に使用するすべてのガラス器具、プラスチック器具、消耗品は、分析プロセスの完全性を維持するため、厳密に洗浄・校正された。本研究で得られた結果の正確性と信頼性を保証するため、すべての化学物質と試薬は、標準的な実験室のプロトコールに従って細心の注意を払って取り扱われた。

3.3.2. 標準溶液の調製

各SCFAの標準溶液を水で調製した。PA、BA、VAについては濃度を100 mMとし、AAについては1000 mMとした。さらに、SCFAの作業溶液と校正溶液も水で調製した。IS溶液は、正確な測定を容易にするため、正確な濃度で調製した。BA* ISの濃度は以下の通りである： 糞便試料中のAA測定用には15,000μM、糞便試料中のPA、BA、VA評価用には1500μM、血清中のPA、BA、VA濃度測定用には50μMであった。一方、AA* ISは、血清中のAAを正確に測定するために500 µMの濃度で調合された。

すべての溶液は4℃で保存した。これらの溶液の安定性は週ごとに評価され、その結果、相対標準偏差は5%未満であった。

3.3.3. 検体の調製

血清検体は分析前に4℃で解凍した。糞便検体は、分析直前に糞便 50 mg あたり 1000 µL の割合で Milli-Q 水を加えて再構成した。その後、糞便サンプルを5分間ボルテックスし、適切な混合を確実にした後、10分間超音波ホモジナイズし、さらに5分間ボルテックスした。ホモジナイズした糞便を15,000rpmで5分間遠心分離し、上清を分離した。糞便中の SCFA 濃度は、未処理の糞便 50 g あたりマイクロモル（µM）単位で測定した。

3.3.4. 抽出手順

標準溶液、血清サンプル、またはホモジナイズした糞便由来の上清から 100 µL を 500 µL のプラスチックチューブに移した。その後、各試料に10 µLの1.0 M HClを加え、溶液を酸性にした。SCFAの定量を容易にするため、各試料に10 µLのIS作業溶液を添加した。得られた混合試料を1分間ボルテックスした後、15,000 rpmで5分間遠心分離し、相を効果的に分離した。

得られた上清100 µLを新しい500 µLプラスチックチューブに移した。LLEを開始するため、各チューブに200µLのMTBEを加えた。LLEプロセスは、混合物を20分間激しくボルテックスすることで活性化され、標的化合物の徹底的かつ効率的な抽出が行われた。その後、チューブを15,000 rpmで5分間遠心分離し、相分離を促進した。抽出されたSCFAを含むMTBE相から100 µLを、ガラスインサートを取り付けたオートサンプラーバイアルに移した。最後に、サンプルをGC/MSで分析し、SCFAを定量した。

3.3.5. GC/MSパラメーター

試料分析は、Agilent 7890B ガスクロマトグラフと Agilent 5977B GC/MSD シングル四重極質量分析計（Agilent, Santa Clara, CA, USA）を組み合わせ、クロマト分離には HP-FFAP カラム（長さ 25m、直径 0.32mm、膜厚 0.5μm）を用いた。注入口温度は250℃に設定され、注入量は1 µLであった。糞便および血液サンプルの調査には、2つの別々のGC/MS条件が利用された。糞便については、システムは10:1の比率でスプリットモードで作動した。一方、血清については、セプタムパージスプリットモードに切り替え、スプリットベントへのパージ流量を0.1分で100 mL/minとするスプリットレスモードを採用した。純度99.9999%以上のヘリウムガスをキャリアーガスとして、1.5 mL/minの一定流量で使用し、セプタムパージは3 mL/minとした。GCオーブン温度プログラムは、SCFAを効率的に分離するために最適化された：初期温度60℃を1.5分間保持し、40℃/分で100℃まで昇温し、1分間保持し、さらに10℃/分で158℃まで昇温し、最後に100℃/分で240℃まで昇温した。ポストランタイムは240℃で指定された。トランスファーライン、イオン源、四重極の温度は、それぞれ250℃、230℃、150℃に維持された。分析物の効率的なイオン化を確実にするために、70eVのエネルギーを持つ電子イオン化が採用された。

分離・同定法の開発では、Kimら（2022年）が発表した最近の研究で概説された以前の研究に記載されたアプローチが利用された[56]。このアプローチは、分析試料の特異的な特性、入手可能な材料および分析標準に対応するように調整された。GC/MSメソッドの最適化において、MSデータ取得は39～87のm/z範囲にわたってフルスキャンモードで行われた。条件の選択と化合物の同定は、化学標準物質の注入によって導かれた。保持時間と対応するマススペクトルを比較し、分析物の正確な同定を確実にした。条件はS/N比が最大になるように微調整され、SCFAのピークをサンプル中に存在する他の揮発性物質から効果的に分離した。

最後に、ターゲットイオン(m/z60.0-AA, BA, VA;m/z62.0-BA*;m/z63.0-AA*;m/z74.0-PA)を用いた選択イオンモニタリング(SIM)モードで分析対象物の定量を行い、確認イオン(m/z43.0-AA;m/z45.0-PA;m/z46.0-AA*m/z73.0-BA, VA;m/z75.0-BA*)で確認した。化合物の統合は特定のm/z値に基づいて行われた。データの取得と解析はMasshunter定量プログラムを用いて行い、クロマトグラフィーとマススペクトルデータの処理と解釈を容易にした。

3.3.6. 検量線作成

糞便中のSCFAを定量するために、キャリブレーションの直前にSCFAのストック溶液から2系列のキャリブレーション溶液を調製した。第1系列は100～3500 µMのAA溶液、第2系列は10～350 µMのPA、BA、VAの混合溶液である。その後、10 µLのBA* IS（それぞれ1500 µMと50 µM）と10 µLの1M HClを加えた。水で希釈した7段階の検量線（検量線：図S7）と4段階の品質管理（QC）を調製し、抽出手順と同様に抽出した。AA定量用の検量線レベルは100、500、1000、1500、2000、2750、3500μMであった。AA定量用のQCレベルは500、1500、2000、3500μMであった。PA-BA-VA混合物の定量における検量線レベルは、結果的に各成分の10、50、100、150、200、275、350μMであった。PA-BA-VA混合物の定量におけるQCレベルは、各成分の50、150、200、および350μMであった。ブランク、検量線レベルおよびサンプルのクロマトグラム例を図S8に示す。

血清中のSCFAを定量するため、PA、BA、VAは0.2～10 µM、AAは2～100 µMの濃度の溶液を調製した。次に、5 µLのAA*と5 µLのBA*のISを1 M HClとともに加えた。水で希釈した8段階の検量線（検量線：図S9）と4段階のQCを調製し、抽出手順と同様に抽出した。検量線レベルは0.2、0.6、1、2、4、6、8、10 µMであった。QCレベルは0.2、2、6、10 µM。ブランク、検量線、検体のクロマトグラムを図S10に示す。

検量線は、対応するISに対する各SCFAのピーク面積比を各SCFA濃度に対してプロットし、次いで線形回帰を行うことで作成した。各 SCFA の検量線の直線性は、決定係数（R2 ）値が 0.99 を超えることで評価した。検出限界（LOD）は、3.3×SD/b（SDはY切片の標準偏差、bは直線回帰曲線の傾き）として算出した。定量限界（LOQ）は3×LODとして計算した。

3.4. 糞便微生物叢分析

腸内関連微生物のDNA（補足S2参照）をリアルタイムPCR法により糞便検体から検出した。この目的のために、Proba-Cito試薬キット（DNA-Technology LLC、モスクワ、ロシア）を用いてDNA抽出を行った。その後の分析は、腸内細菌叢の最も重要なメンバーの評価用に特別に設計されたEnterflorキット（DNA-Technology LLC、ロシア）を用いて行った。

3.5. 統計分析

血清および糞便検体由来のSCFAを、微生物叢の特徴とともに、有意閾値を.に設定したMann-Whitney検定を用いて、PCOS群と対照群の間で比較した。統計的に有意な変化を示したシグネチャーは、さらにスピアマン検定を用いて相関性を評価した。

臨床パラメータは、糞便および血清由来のSCFA、ならびに微生物叢の特徴との関連について、有意水準を.0としたSpearman検定を用いて評価した。さらに、体脂肪量、総脂肪量、総脂肪の相対組成、および内臓脂肪量について、生化学パラメータとの関連を評価した。また、糞便中のSCFAと糞便微生物叢との関連についても、有意水準を.0としたスピアマン検定を用いて解析した。

糞便および血清SCFAと糞便微生物叢のデータを用いて、治療の完全な成功、特に月経周期の回復を予測する診断モデルを作成した。XGBoostモデルは、そのような除外がモデルの精度を向上させるという条件で、段階的に特徴を除外する反復プロセスを通じて開発された。感度と特異度は、感度および特異度の合計を最大化することによって最適な閾値を決定し、1対1のクロスバリデーションを用いて計算した。

データ処理は、Rバージョン4.3.2で研究室が作成したスクリプトを使用し、モデル作成にはXGBoostパッケージバージョン1.7.6.1 [51]を採用した。

4. 結論

本研究は、腸内細菌叢がPCOSの病因において極めて重要な役割を果たしているという説得力のある証拠を提供するものである。我々は、日和見病原体の過剰増殖と同時に、腸内および代謝の健康に関連する有益な細菌の減少によって特徴づけられる、PCOS女性における微生物組成の著しい変化を強調した。

特筆すべきは、SCFA産生のアンバランス、特にAAとVAのレベルの増加は、先行研究と一致しており、PCOSの文脈における腸内細菌叢と肥満の間の複雑な相互作用を示唆している。血清中のSCFA濃度は糞便中濃度と有意な相関を示さなかったが、血清中のAAの存在は、高体重指数、インスリン抵抗性、慢性的な低悪性度炎症などの重要な症状に対して保護的な役割を果たす可能性があり、その潜在的な治療的関連性を強調している。

メトホルミン療法は有益であることが証明され、内分泌・代謝パラメータの有意な改善と腸内細菌叢組成の顕著な変化をもたらした。この治療により、糞便中のAA濃度が正常化しただけでなく、腸内細菌叢も回復した。BAとVAの血清濃度に基づくわれわれの予測モデルは、メトホルミン治療の有効性を予測する上で、かなりの感度と精度を示した。PCOSに対する個別化された治療戦略は、微生物叢プロフィールがあまり良好でない患者において、食生活の改善と共生サプリメントの摂取を取り入れることが可能であろう。

まとめると、今回の知見は、腸内細菌叢、SCFAs、およびPCOSの病態生理学の間の複雑な関係を明らかにするものである。微生物の不均衡の同定とSCFAの変化の意味するところは、治療戦略に役立つ重要な洞察を提供するものである。これらの関係を促進する根本的なメカニズムを解明し、治療プロトコルを最適化し、最終的にこの複雑な疾患に罹患した女性の臨床転帰を改善するためには、今後の研究が不可欠である。