雄マウス腸の代謝ランドスケープから、微生物の活動によって決まる異なるニッチが明らかになった
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発行：2023年5月22日
雄マウス腸の代謝ランドスケープから、微生物の活動によって決まる異なるニッチが明らかになった
https://www.nature.com/articles/s42255-023-00802-1
カリン・H・U・マイヤー
ジュリアン・トルーイヨン
...
ウヴェ・ザウアー
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ネイチャーメタボリズム (2023)この記事を引用する
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メトリックの詳細
要旨
哺乳類の腸の異なるニッチには多様な微生物が生息しているが、腸の代謝に対する空間的な変化の寄与は依然として不明である。我々は、健康なコロニー形成マウスと無菌マウスの腸に沿った縦断的なメタボロームのマップを提示する。このマップにより、小腸のアミノ酸から大腸の有機酸、ビタミン、ヌクレオチドへと一般的にシフトしていることが明らかになった。また、コロニー形成マウスと無菌マウスの代謝マップを比較することで、異なるニッチにおける多くの代謝物の起源を明らかにし、場合によっては、根本的なプロセスの推測や生産種の特定を可能にします。小腸の代謝ニッチに及ぼす食事の影響は知られているが、明確な空間パターンは、小腸の代謝系に対する微生物の影響を示唆している。このように、我々は腸内代謝のマップを提示し、代謝物と微生物の関連性を明らかにすることで、生物活性化合物の空間的発生を宿主または微生物の代謝と結びつける基礎を提供します。
主な内容
哺乳類の腸内には、腸内細菌叢と総称される多種多様な微生物が生息しています1,2。微生物叢は消化機能や免疫機能に寄与しており、その乱れは複数の疾患と関連している3,4. 消化機能や感染症の予防（または原因）に加え、腸内微生物は宿主や他の微生物に影響を与える生物活性化合物の供給源でもあります3。小腸と大腸は生理的に最も区別され、保存された組成の分類群によってコロニー形成されている4,5。十二指腸は、食事の栄養、膵胆道、胃の分泌物を受け取ります。組織の透過性、吸収性輸送タンパク質、pH、制御シグナル、免疫反応の地域差により、小腸の空腸と回腸のサブリージョンがさらに区別されます5。動物モデルを用いた群集プロファイリングにより、異なる腸管領域における微生物相の組成が明らかにされています4,6,7。これらの縦断的な違いだけでなく、内腔内容物と腸管粘液8との間には、生理学と微生物叢の組成に関してかなりの違いが存在する。粘液は、特に大腸において、架橋したムチン糖タンパク質からなる緻密なマトリックスであり、腸内上皮細胞を内腔やその微生物叢から分離している9。また、厚い外側の結腸粘液層は、ムチンを分解することに特化した微生物の生息地であり、栄養源でもある8,10。消化管の機能的景観に関する洞察は、腸管粘液に生息し分解するClostridia、大腸で特徴的な短鎖脂肪酸やアミノ酸誘導体を生産する特定のFirmicutes、または様々な腸の部位における特定のビタミン生産細菌に例えられる3、11、12、13、14、15を増加させています。
分類学的組成や代謝活性の生物地理学的な違いは、糞便サンプルを用いて評価することができない。なぜなら、説明力が限界の範囲内で遠位結腸に限定されると考えられるからである4,16。特に小腸では、食餌の流入、急速な移行時間、消化酵素や抗菌剤の分泌が腸内プロセスを支配し、マイクロバイオームを形成している6,17,18. 因果関係を明らかにするためには、異なる腸内小領域における細菌集団とその代謝プロセスに関する詳細な情報が、代謝物の起源を特定するのに役立ちます。食事成分の大部分は小腸で代謝・吸収され、食物繊維や有害生物、摂取したタンパク質や脂質のごく一部が近位結腸微生物叢に利用されることになる17。したがって、小腸にも存在する微生物由来の生理活性化合物の多くを含め、糞便サンプルからは微生物活動の多くが明らかにならない19。ヒトの小腸の微生物活動を分析するには、内視鏡検査の前に手術、非常に大規模な経口挿管やパージが必要です。そのため、腸の全体像を調べるには、動物モデルが使用されます20,21。最近の例では、コロニー形成されたマウスの腸の長さに沿った代謝物濃度を報告し、すべての臓器の化学反応に影響を与える微生物由来の新しい胆汁酸結合体を発見し、微生物と宿主への影響の因果関係を確立しています7。腸内ニッチには数多くの微生物が存在し、その代謝活動も多様であることから、今回発見された胆汁酸は、代謝産物に基づく宿主-微生物、微生物-微生物の相互作用の膨大な空間が解明されるのを待つ一例である。
我々は、健康な雄の特定病原体フリーマウス（SPF）と無菌マウスの腸内15カ所の管腔内容物および粘液中の腸内局所代謝と群集組成を明らかにした。小腸と大腸の管腔内容物と粘液の4つの主要な腸内生息環境を特徴付けることに加え、この代謝ランドスケープにより、これまで考慮されていなかった小腸内の代謝プロセスが明らかになりました。さらに、35種類の腸内化合物を微生物由来の代謝物として同定し、ニッチに特化した腸内代謝の研究の基礎となることを明らかにしました。
研究成果
コロニー形成マウスにおける腸内メタボロームの生物地理学的特徴
腸管に沿ったメタボローム組成を系統的に示すため、雄のSPF C57BL/6Jマウス5匹の腸全体を15カ所で離散的に採取し（拡張データ図1a）、内腔内容物と腸管粘液を分離しました。生物学的変動を最小限に抑えるため、10～14週齢のマウスは標準的な実験用飼料を自由摂取し、サンプリング前に4時間絶食させ、食物の大部分が盲腸に到達するようにした21。各メタボロームサンプルには、細胞内微生物の代謝物と、食事、マウス、または微生物の活動に由来する細胞外代謝物が含まれているため、高塩濃度での化学物質クラスの複雑な混合物となりました。これらの腸内関連化合物を定量化するために、液体クロマトグラフィー飛行時間型質量分析計（LC-TOF-MS）ワークフローを採用しました22。簡単に説明すると、メソッドの実行時間を最適化し、アミノ酸やヌクレオチド代謝、糖などの炭素源、胆汁酸、発酵産物など、腸内メタボロームの特徴である138種類の代謝物を定量するための分析標準物質を用意しました（拡張データ図1bおよび補足表1）。これら138の代謝物のうち、128は品質管理パラメータに基づいて確実に定量することができました（Supplementary Table 1およびSupplementary Data）。これらの代謝物のSPF腸管内腔における平均濃度は、小腸で約290nmol mg-1サンプル、大腸で1.5μmol mg-1でした。
SPFの内腔内容物と粘液の空間分解分析により、マウス腸の不均一な代謝ランドスケープの特徴を明らかにすることができました。15部位にわたる代謝物プロファイルは、含有量について階層的にクラスタ化され（図1a）、比較を容易にするために、粘液プロファイルは含有量クラスタに従ってソートされた（Extended Data図1c）。胆汁酸、アミノ酸およびその誘導体は、すべての部位で検出可能であったが、最大濃度を示す3つの主要部位（胃、小腸、大腸）の空間的パターンが明確であった。胃の内容物は、主にアミノ酸が高濃度であることが特徴であった（図1a）。タンパク質生成アミノ酸とその誘導体は、ほとんど小腸にしか存在しなかった。大腸のクラスターは、有機酸、ビタミン、ヌクレオチド代謝の化合物で占められていた。主成分分析（PCA）では、小腸と大腸を分離し、主に第1主成分に沿ってアミノ酸とその誘導体が駆動し、2つの領域間のグローバルな違いを裏付けている（図1b）。大腸では、第2主成分により、管腔内容物と粘液のメタボロームプロファイルがさらに分離されました。全体として、管腔内容物の代謝物濃度は粘液に比べて平均1.7倍高く、胆汁酸、炭素源、アミノ酸誘導体、有機酸が分離を促進した（図1cおよび補足表2）。粘液中では、スペルミジン、クレアチン、リンゴ酸のみが管腔サンプルよりも有意に多く含まれていた（P ≤ 0.05, fold change ≥3）。高いスペルミジン濃度は、特に大腸において健全な粘液層を維持するために重要な、微生物のポリアミン産生の結果と推定された23 (Fig. 1c and Extended Data Fig. 1d). ポリアミン濃度が高いことに伴い、ポリアミン前駆体のアルギニンとオルニチンの濃度は、大腸粘液では内腔内容物よりも低かった（Extended Data Fig.1dおよび補足表2）。
図1：雄SPFマウスのメタボロームの生物地理学的特徴。
a, 雄SPFマウスの内腔内容物サンプルからの代謝物存在量の階層的クラスタリング解析。定量化された全128代謝物の存在量は、15カ所のサンプリング地点で、5匹のマウスから平均したzスコア正規化濃度として示されている。ユークリッド距離に基づくクラスタリングにより、消化管の3つの主要な生理的領域（胃、小腸、大腸）に対応する3つの主要なクラスタが特定されました。代謝物はMetaCycに従って色分けされている（右下）。 b, 腸全体をカバーする150個の管腔および粘液サンプルすべてに基づく、個々の雄SPFマウスの代謝物濃度のPCA。PCAは、zスコアで正規化した代謝物濃度について、1サンプルあたり5匹のマウスで実施した。色は腸の部位ごとにグループ化された部位を示し、記号は内腔または粘液を、大腸内容物クラスターはグレーでハイライトされている。 c, 内腔内容物と粘液サンプル間の代謝物濃度の差分分析。濃度は、それぞれの生息地内の5匹の雄マウスについて、15カ所すべてのサンプリング部位で平均したものである。正または負の倍数変化は、それぞれ内腔または粘液の濃度が高いことを示す。P値は、多重検定のためのBenjamini-Hochberg補正を伴う両側一対標本Student's t-testを用いて算出し、-log10変換して表示している。濃度が有意に異なる代謝物（絶対log2(fold change) ≧ 1.5、補正P ≦ 0.05）は、下のボックスで定義したMetaCyc分類に従って色分けしています。内腔と粘液のサンプリングタイプは、ボルケーノプロットの対応する部分に合わせ、左側に模式的に表現しています。略号 FC、fold change。
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小腸と大腸を区別する特定の代謝物を特定するために、サンプリング部位と個体間で、小腸と大腸の平均代謝物濃度から、内腔内容物と粘液について別々に倍率変化を計算しました。この差分解析により、小腸、特に粘液中のアミノ酸および関連代謝物の濃度が高いことが明らかになりました（図2a、bおよび補足表3）。小腸の粘液層はかなり薄いため、タンパク質生成アミノ酸の濃度が高いのは、サンプリング時の内腔からのキャリーオーバーによる可能性も否定できません。その代表例がヒスチジンとトリプトファンで、これらの濃度は小腸全域で一貫して高く、大腸ではすぐに低下した（図2c）。大腸では、有機酸、ビタミン、アミノ酸やヌクレオチドの代謝に関わる化合物の濃度が高いという特徴がありました（図2a、b）。全体として、31種類の代謝物が、細菌負荷の高い大腸の内腔内容物または粘液において、小腸と比較して少なくとも4倍高い濃度を示し（補足表3）、微生物の活性を示唆した。また、酪酸/イソ酪酸などの短鎖脂肪酸、グリセリン酸などの糖分解物、4-ヒドロキシフェニルアセテートなどのアミノ酸分解物が急激に増加しており、微生物の発酵が広範囲に及んでいることが示された（図2d）。PCAでは腸管粘液内の領域が区別されなかったにもかかわらず（図1b）、差分解析により粘液中のアミノ酸から発酵産物への明確な代謝シフトが明らかになり（図2a（下）、図2b（右）、図2c）、小腸と大腸の粘液生息地の代謝の違いを示す証拠となりました。
図2：雄SPFマウスの小腸と大腸のメタボロームの違い。
a, 内腔（上）と粘液（下）の小腸と大腸のサンプル間の代謝物濃度の差分解析。データポイントは、5匹の雄マウスについて、10箇所の小腸と4箇所の大腸の間で計算された平均倍率変化値を表す。負の値は小腸で、正の値は大腸で、それぞれ濃度が高いことを表しています。y軸は、両側一対標本Student's t-testと多重検定のためのBenjamini-Hochberg補正を用いて計算した-log10変換したP値を表示する。有意に濃度が異なる代謝物（絶対log2(fold change) ≧ 2、補正P≦0.05）は、ボックス（左下）で定義したMetaCyc分類に従って色分けしている。 b, 図1aの差分解析から内腔と粘液の小腸と大腸で有意に変化した代謝物（絶対log2(fold change) ≧ 2、補正P ≦ 0.05). P値は、多重検定のためのBenjamini-Hochberg補正を伴う両側対偶Student's t-testを用いて算出した。ドットの色は倍数変化を、ドットの大きさは有意性を表す。代謝物はMetaCycに従って分類し、ボックス（左下）で定義した。 c,d, SPF粘液または内腔の15箇所の腸管におけるヒスチジンとトリプトファン（c）およびグリセレートと4-hydroxyphenylacetate（d）の空間プロファイルをそれぞれ示す。斜線を引いた線は、5匹の雄マウスの濃度測定値の平均±s.e.m.の移動平均を示す。略語：cec, caecum; col, colon; duo, duodenum; ile, ileum; jej, jejunum; sto, stomach; TMAO, trimethylamine N-oxide.
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メタボローム全体のパターンから、小腸や大腸内の個々の部位を区別することはできませんでしたが、これらの部位におけるマウス個体間の差は予想通り24と大きかったため（図1b）、代謝物の約1/3が異なる縦断プロファイルを示しました（図3および補足表4）。小腸の代謝物濃度を階層的にクラスタリングした結果、十二指腸、空腸、回腸のいずれかに最大濃度を持つ代謝物の3つのグループが得られた（Extended Data Fig.2）。管腔サンプルでは3つのクラスが均等に分布していたが、小腸サンプルではほとんどの粘液濃度が回腸に向かって減少した（拡張データ図2b,c）。十二指腸で高濃度の代謝物は、フルクトース（図3a）および他の単糖類で、おそらく遠位小腸に到達する前に宿主に吸収された残留食物成分であると考えられる14,25。リボフラビン濃度は空腸の内容物で最も高く、微生物による生産または残留食物ビタミンに由来する14,15,26。回腸内容物の高いアラントイン濃度（図3a）は、おそらく共食いマウスの上部小腸におけるプリン代謝物の微生物分解に起因しており27、グアニンおよびグアノシンの高い十二指腸粘液濃度（図3b）およびチョウ食によるグアニンおよびグアノシンの大きな流入と一致していた。空腸粘液のクレアチン濃度が高いのは、食事由来のクレアチンによるものと考えられるが、濃度の低下は、さまざまなクレアチントランスポーターやクレアチン代謝酵素を発現する高エネルギー要求性の腸管細胞による取り込みによるものと考えられる28．大腸では、階層的クラスタリングにより、管腔内容物の最大濃度は主に遠位結腸で、粘液のピーク濃度は大腸全体でより均一に分布していた（Extended Data Fig.3）。内腔内容物では、ウラシル濃度は遠位結腸で最も高く、酪酸/イソ酪酸は遠位結腸に向かってわずかに減少しているように見えた（図3c）酪酸は結腸細胞29の主要エネルギー源となっている。大腸粘液では、フルクトースの分解産物であるグリセリン25は盲腸でピークに達したが、結腸では急激に低下した。以上のことから、小腸代謝物42種の縦断的な濃度プロファイルの要因として、微生物活動が考えられる。
図3：雄のSPFマウスの腸に沿った縦方向の代謝物パターン。
a-c、小腸内容物（a）および粘液（b）、または大腸内腔内容物または粘液（c）において濃度差のある代謝物のプロファイルの例。斜線を引いた線は、雄マウス5匹の濃度測定値の平均±s.e.m.の移動平均を示す。小腸のある領域からの代謝物濃度が隣接する領域と比較して有意に異なる場合は、星印で示した（*P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001）. 十二指腸と空腸の比較におけるフルクトース腸内含有濃度： P = 0.0245；空腸対回腸のリボフラビン腸内含有濃度：P = 0.0432；空腸対回腸のアラントイン腸内含有濃度：P = 0.0220；十二指腸対空腸のグアニン粘液濃度： P = 0.0005；十二指腸と空腸のグアノシン粘液濃度： P=0.0129、空腸と回腸のクレアチン粘液濃度：P=0.0278。P値は、両側一対標本Student's t-testを用いて算出した。略語：スト、胃、デュオ、十二指腸、ジェジュ、ジェジュンム、イレ、イレウム、セック、盲腸、コル、コロン。
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SPFマウスの腸内代謝マップでは、小腸と大腸の管腔内容物と粘液が、複数のサンプリング部位でほぼ一貫したメタボロームパターンを持つ主要なニッチであることが強調されています。小腸のアミノ酸とその誘導体の濃度が高く、大腸のビタミンと発酵産物の濃度が高いという一般的なシフトは、大腸の微生物活動の活発化によって引き起こされると推定され、31種類の代謝物の微生物起源が示された。さらに、測定された128代謝物のうち42代謝物について、小腸内での実質的なパターンを定量化しました。このような代謝の違いは、少なくとも部分的には、腸の異なる領域における微生物の活動に起因すると考えられるため、次に微生物叢の役割について調査しました。
微生物叢は腸内代謝ランドスケープに影響を与える
微生物活動が盛んなことで知られる大腸の高い代謝物濃度（図2a）と小腸の空間的な代謝物パターン（図3）は、微生物由来であることを示す間接的な証拠にすぎませんでした。これらの代謝物は、微生物由来である以外に、微生物に対する反応として産生される宿主の代謝物、残留する食事成分、脱落した腸管細胞からの細胞内代謝物である可能性もあります。腸内代謝における微生物の影響についてより直接的な証拠を得るため、また影響を受ける代謝物の経時的変化を解剖するため、5匹の雄性無菌C57BL/6Jマウスを用いて、空腹後に同じ15カ所で腸内内容物と粘液を採取するマッチング実験を行いました。一般に、少なくとも3分の2の代謝物は細菌が存在すると濃度が高くなり、SPFマウスでは内腔内容物の50％近く、粘液の30％の代謝物が無菌マウスに比べて少なくとも2倍の濃度になった（拡張データ図4a、補足表5および6）。SPFマウスで特に濃度が高かった代謝物は、胆汁酸、有機酸、芳香族化合物、ビタミン類、アミノ酸誘導体などだった（補足表5、6）。無菌マウスで高濃度であった代謝物の約4分の1は、主に炭素源、ヌクレオチドおよびアミノ酸代謝の化合物で、食事由来である可能性があり、SPFマウスでは微生物相によって枯渇していた30。
微生物由来の可能性がある上記31種類の代謝物のうち、24種類はSPFマウスの大腸において、無菌マウスと比較して平均濃度が少なくとも4倍高かった（図4aおよび補足表7）。短鎖脂肪酸の酪酸/イソ酪酸、イソバレレート/バレレート、二次胆汁酸のリトコール酸、ヒデオキシコール酸は、SPFマウスの大腸で少なくとも14倍高い濃度であった。このような高濃度は、大腸に豊富に存在する低酸素・低pH耐性のバクテロイデス類によるよく知られた形成と一致する4,31。ビオチン、インドール-3-プロピオン酸、グリセロールは、SPFマウスからのみ検出され、微生物由来であることを示す強力な証拠となった。インドール-3-プロピオン酸は、トリプトファン代謝に起因する腸内細菌由来の化合物として確立されている13,32。31種類の大腸代謝物のほとんどについて、微生物由来であるという我々の仮説は、標的研究または以前に観察された無菌マウスよりもコロニー形成マウスで高いレベルのいずれかと一致しました3,19,30,32,33（図4aおよび補足表7）。ユビキタス細胞内代謝物である2-オキソグルタル酸のSPF濃度が高いこと（図4b）は、以前に説明したように、高い細菌負荷によって説明できる可能性が高い34。微生物由来の代謝物として新たに同定されたのは、ヒドロシンナメート、3-ヒドロキシブチレート、カプロン酸、アデノシン、フコース/ラムノースである（図4cおよびExtended Data Fig.4b）。フェニルアセテートおよび4-ヒドロキシフェニルアセテートと同様に、ヒドロシンナメートも芳香族アミノ酸の発酵から生じる可能性があり、いくつかの腸内微生物についてin vitroで示されている35。同様に、3-ヒドロキシ酪酸およびカプロン酸も発酵産物である36。フコースやラムノースなどの糖類は、分泌される微生物のグリコシドヒドロラーゼによって食物繊維から解放される可能性が高い。これまでの観察19,30と同様に、無菌マウスではクレアチンおよびグアノシンの大腸内濃度が高く、宿主または食事由来であることが示唆された（図4a）。以上のことから、無菌マウスよりもSPFマウスの方が代謝物濃度が高いことから、大腸濃度が高い31種類の代謝物のうち24種類が微生物由来または微生物による宿主産生であることを裏付ける証拠となりました。
図4：大腸代謝に対する微生物叢の影響。
a,小腸より大腸の濃度が高く、微生物由来と仮定される31代謝物の存在量倍率変化（差分解析による有意な変化代謝物；図2a、b）。内腔内容物（左）と粘液（右）のlog2変換された倍数変化は、SPFマウス雄5匹対胚芽なしマウス雄5匹の4つの大腸サンプリング部位の平均濃度から算出した。ボックスプロットは20点のデータに基づいており、中央値のlog2(fold change)は赤で示され、ボックスは25～75パーセンタイルを含み、ウィスカーは外れ値とみなされない最も極端なデータ点まで伸びています。灰色の部分は、絶対log2(fold change) ≤ 2を示す。左の記号は以前の証拠を示す：（）特定の代謝物に関する一般的な知識、例えばKohらやde Aguiar Vallimら29,66を参照、（Δ）Hanら19の証拠は、代謝物の存在量の差を識別するためにSwiss-Webster無菌マウスと従来のマウスの比較を使用、（□）松本ら33の証拠。松本ら（33）は、SPF BALB/c マウスの糞便懸濁液を胃に接種した無菌マウスと「元無菌」マウスを用いて、代謝物をマウス由来または微生物由来に分類した。（）Marcobal ら（30）は、無菌マウスと従来の Swiss-Webster マウスを用いて代謝物レベルを比較した。解説を含め、使用したすべてのデータは、Supplementary Table 7に記載されている。また、（◯）は雄のSPFマウスでのみ検出された代謝産物を示す。b,c、SPFおよび無菌の管腔内容物および粘液中の2-オキソグルタル酸（b）およびヒドロシンナメート（c）の大腸内濃度。実線のバーは、雄マウス5匹からの測定値を、大腸4部位で平均した濃度の平均値を示す。対応する20個のデータポイントは丸で表示されている。略号： FC, fold change; cont, luminal content; GF, germ-free; muc, mucus.
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代謝物濃度の上昇に対する食事の影響を除外するため、アンターゲットフローインジェクション分析飛行時間型質量分析法（FIA-TOF-MS）37を使用して、チャウ食ペレットの組成を測定した。簡単に説明すると、腸内サンプルに使用されるプロトコルに従って、3つの食物ペレットを溶解して抽出した。正確な質量と同位体のパターンに基づいて、1,379個の代謝物イオンを推定的にアノテーションした。イオン化効率の違いにもかかわらず、測定された強度から、検出された化合物の相対的な存在量をおおよそ推定することができました。見かけの存在量の分布は、著しく歪んでいた。17種類の代謝物がペレットに記録された全シグナルの50％を占め（補足表9）、二糖類が最も多く寄与していた（平均14％）。その他の豊富な代謝物は、アデニン、リンゴ酸、ヘキソース、リジン、グアノシン、グアニン、トリプトファンであった。プリンヌクレオチドであるグアノシンおよびグアニンの食餌中濃度が高いことから、無菌マウスに多く存在し、SPF腸内では濃度が低く、プリン分解物であるアラントインが同時に増加することが観察されました。最も重要なことは、微生物に関連する24種類の代謝物のうち、飼料組成に0.05%以上寄与するものはなかったことです。したがって、食事に含まれるこれらのマーカーが果たす役割は小さいと思われる。
最後に、SPFマウスの小腸で縦断的なパターンを持つ42種類の代謝物の中から、微生物由来の証拠を探した。フェニル乳酸を除き、10カ所のサンプリング部位を平均すると、SPFマウスでは無菌マウスの4倍の濃度になるという基準に合致するものはなかった（Extended Data Fig.5a）．しかし、小腸内の特定の場所では、十二指腸、空腸、回腸を別々に考えた場合、8つの管腔内容物と2つの粘液代謝物がSPFマウスで無菌マウスの4倍の濃度に達した（図5aおよび拡張データ図5b、c）。例えば、プリン代謝の最終産物であるアラントインの濃度は、SPFマウスの小腸全体で上昇し、回腸で最大となったが、無菌マウスでは低いレベルにとどまった（図5b）。また、食事中のプリン代謝物であるグアニン、グアノシン、ヒポキサンチンの濃度は、SPFマウスでは無菌マウスよりも低く、微生物による分解とそれに続くアラントインへの変換が確認された（図5c）。クレアチンは、SPFマウスと無菌マウスの両方の粘液で最初に濃度が上昇したが、無菌マウスではベースラインまで低下し、SPFマウスの空腸で最大になった（図5d）。最初の濃度上昇の一致は、おそらく飼料中の存在によるものであるが、空腸での差分パターンは、腸細胞によるクレアチン消費の微生物生産または微生物の変化のいずれかを示していた35。SPFマウスでピーク濃度が高くなった他の8つの代謝物には、いくつかのアミノ酸またはヌクレオチドの代謝関連化合物が含まれていた。例えば、芳香族インドール由来のインドールアセチルグリシンは、その濃度がSPF小腸全体で変動したが、無菌マウスの遠位小腸では検出限界以下であり（拡張データ図5b）、微生物の影響を強く示唆した。小腸のシチジン5-一リン酸、ウラシル、ヒスチジンの濃度が一貫して高いことは、細胞内微生物の代謝物として最もよく説明される。このように、大腸の24種類の代謝物に加えて、小腸の11種類の代謝物が微生物由来であることを示す証拠が得られました。
図5：小腸の代謝に対する微生物叢の影響。
a, 雄SPFマウスで雄無菌マウスに比べて少なくとも4倍高い濃度を持つ代謝物のヒートマップ表示、特に小腸の一箇所と小腸全体とで比較。左側の列は、小腸の全10カ所の平均的な対数変換した倍率変化（SPF対無菌）を示し、次の3つの列は、十二指腸、空腸または回腸の平均的な倍率変化（SPF対無菌）を別々に描いている。空間プロファイル（図3と同様、ここではすべてを示していない）から、隣接する領域と異なる領域（十二指腸、空腸、回腸）を特定した。アスタリスクで示されたその領域では、微生物の関与が明確な違いを引き起こし、その結果、SPFが無菌の濃度よりも高くなると考えられる。 b, SPFと無菌の管腔内容物中のアラントイン濃度の空間プロファイル。c,SPFと無菌の管腔内容物および粘液中のグアニン、グアノシン、ヒポキサンチンの小腸内濃度. 実線の棒は、5匹の雄マウスから、10箇所の小腸の測定値の平均濃度を示す。d,SPFおよび無菌粘液中のクレアチン濃度の空間プロファイルを示す。斜線を引いた線は、5匹の雄マウスによる濃度測定の平均±s.e.m.の移動平均を示す。略号： FC, fold change; GF, germ-free; vs., versus; sto, stomach; duo, duodenum; jej, jejunum; ile, ileum; cec, caecum; col, colon; cont - luminal content; muc - mucus; NaN, not a number (fold changes cannot calculate).
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空間的な代謝物パターンは、微生物と関連付けることができる
メタボロームパターンが微生物組成と関連しているかどうかを調べるために、同じ産駒の雄SPFマウス5匹の十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸の16SリボソームRNAシーケンスを用いて、管腔内容物と粘液のコミュニティ組成をプロファイリングしました。5カ所すべてにおいて、コミュニティは門レベルでFirmicutes、科レベルでLachnospiraceae、Oscillospiraceae、Lactobacillaceae、Bacteroidaceaeに支配されていた（Extended Data Fig.6a）。予想通り7、Bacteroidalesの相対的な存在量は大腸、特に内腔サンプルで増加し、短鎖脂肪酸と二次胆汁酸の濃度が高いことと一致した。メタボロームパターンと同様に、群集組成は小腸の3つの部位でほぼ一定であった。組成に関する管腔内容物と粘液の主な違いは、管腔内容物では一般に多様性が高く、アッケシソウが相対的に多いことであった（拡張データ図6a）。これらの違いは空腸で最も顕著であり、内容物全体の20%までがアッケシソウ科の生物であった。
測定された腸内メタボロームに対する微生物の寄与を評価するために、検出された各微生物の酵素プールを予測するPICRUSt2ツール38を使用して、マイクロバイオームの機能的潜在能力を決定しました。得られたすべての潜在的な微生物反応のセットを、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）データベースから得たマウスの代謝反応の既知のセットと比較することにより、代謝物を宿主（7）、マイクロバイオーム（13）またはその両方（81）にリンクする可能性があるものに分類した（図6a）。例えば、SPFマウスにおけるスペルミンとヒドロシンナメートの高濃度は、それぞれ宿主由来とマイクロバイオーム由来で最もよく説明されます。生産種を特定するために、SPFマウスの腸内に沿って代謝物と微生物の存在量を空間的に相関させました。全体的に相関係数は正規分布を示し、620の代謝物-微生物ペアが有意な共起を示した（P < 0.01）（図6b）。潜在的な微生物生産の予測を精緻化するために、SPFマウスが無菌マウスよりも豊富であった代謝物のみを考慮しました（fold change >2）。上記の予測された微生物の代謝反応に基づき、さらに予測された微生物が、対になる代謝物を含む反応を触媒する酵素を持つペアに限定して分析を行いました。その結果、14の異なる細菌目に属する91の微生物の存在量と20の代謝物の相関から、148組の潜在的な微生物代謝産物を予測した（図6cおよび補足表10）。代謝中間体であるn-アセチルグルタミン酸や果糖分解産物であるグリセリン酸は、それぞれ41種類、22種類の微生物と関連していることがわかった。10種類の代謝物は、3つ以下の微生物とより具体的にリンクしており、そのうち酪酸、チェノデオキシコール酸、ラムノース、コハク酸は1つの微生物とリンクしていた。SPF対無菌時の変化量が最も大きい代謝物である酪酸とチェノデオキシコール酸については、それぞれ、短鎖脂肪酸生産者として知られるLachnospiraceae39の未分類のグループとLachnospiraceae NK4A136グループのメンバーを責任微生物として特定した（図6d）。このように、特定の微生物と代謝物の空間的な共起が観察されたことで、微生物の活動との関連性がさらに強まったと考えられる。
図6: メタボライトと微生物の関連性。
a,微生物代謝機能のPICRUSt2予測とマウス代謝ネットワークに基づき、宿主関連または微生物関連に分類された128の測定代謝物の重なりを示すベン図。大半の代謝物が宿主関連と微生物関連のいずれにも分類できず、7代謝物が宿主関連、13代謝物が微生物関連である。27の代謝物はいずれの代謝ネットワークとも一致しなかった。 b, 126,336の代謝物-微生物ペアの相関係数の分布。拡大したバーは、P値、SPF-germ-free fold change、代謝酵素の存在に関する閾値を適用することで、予測される機能的代謝物-微生物ペアの数が148に減少することを示す。 c, bで定義した閾値を満たす正相関代謝物-微生物ペアのユニーク代謝物と対応する微生物目とのリンクを示すサンケイ図。d,SPF内腔サンプルにおける代謝物濃度と関連微生物の空間プロファイル。斜線を引いた線は、5匹の雄マウスによる濃度測定の平均±s.e.m.、相対的な微生物の存在量の平均±s.e.m.を示す。略号：duo, duodenum; jej, jejunum; ile, ileum; cec, cecum and col, colon.
出典データ
フルサイズ画像
考察
我々は、健康な雄のSPFマウスと無菌マウスにおける腸内代謝の解剖学的に解決されたマップを報告し、小腸と大腸の内腔内容物と粘液が4つの代謝的に異なるニッチとして明らかにした。小腸のメタボロームはアミノ酸で占められており、大腸は発酵産物、ビタミン、ヌクレオチド代謝の化合物が高濃度に含まれていることが特徴で、大腸の微生物の密度がはるかに高いことと一致していた4。物理化学的および免疫学的特性8,40と同様に、腸を覆う人口密度の高い外側粘液層は、微生物由来のポリアミンとクレアチンが最も特徴的な代謝的特性を持っていた。クレアチンとスペルミジンなどのポリアミンは、特に微生物群が存在する場合、健全な粘液層の維持に重要な役割を果たすことが知られている35,41,42. タンパク質生成アミノ酸の濃度が非常に高いことから、小腸の薄い粘液層と大腸の厚い粘液層が区別された4。これは、おそらく内腔内容物からの拡散または酵素を介したタンパク質分解の結果である。
このデータセットでは、4つの主要な腸管ニッチの特徴に加えて、小腸内の42種類の代謝物の空間的パターンを解明しました。小腸は、本来アクセスが困難な腸管の一部であり18、微生物が多くの生物活性化合物を生産する場所です19。胃の下流にある十二指腸では、フルクトースやその他の単糖類が高濃度に存在し、おそらく、後に宿主に吸収される食事成分の分解に起因している14,25,43。小腸の末端では、プリン代謝物が微生物によって変換され、回腸内容物中のアラントイン濃度が高くなった証拠を発見した。同様に、SPFマウスの小腸では、インドールアセチルグリシンなどのインドール誘導体の濃度が高く変動しており、これまで主に大腸で報告されてきた微生物由来であることを示唆した44。インドールは宿主の消化を制御する腸内ホルモンの放出を制御するため、微生物のインドール代謝は重要である45。また、インドール誘導体は、上皮のバリア機能を制御するアリール炭化水素受容体を介してアゴニストとしてシグナルを発信し、結果として腸の炎症を抑制する6,46. このように、我々の高解像度メタボロームデータは、小腸のサブ領域における微生物に関連した代謝ダイナミクスに関する洞察を提供し、Tabula Sapiensプロジェクト47の転写データなどの既存のリソースに機能情報を追加し、その他の包括的研究7を行います。しかし、機能性代謝物のデータは、微生物組成よりもはるかに少ない変動に見えますが、これは腸内細菌叢の機能的な冗長性によって説明されると思われます48。
SPFマウスでは無菌マウスと比較して濃度が高いことから、小腸と大腸でそれぞれ11種類、24種類の代謝物について微生物由来であることを示すエビデンスが得られました。さらに、マイクロバイオームの代謝ポテンシャルを予測し、空間共起解析を行うことで、20種類の代謝物について、特定の微生物が潜在的な生産者であることを特定することができました。小腸の代謝ニッチは主に食事と宿主の消化活動によって決定されるが16、腸内細菌叢は脂質や胆汁酸代謝以外にも小腸代謝の形成に寄与していることが示された6,49。例えば、回腸のアラントイン濃度が高いのは、微生物によるプリン体の分解に起因すると考えられ、一般に窒素が制限される腸内環境において窒素を供給する可能性があります50。SPFマウスの空腸におけるクレアチン濃度の継続的な上昇は、無菌マウスの低濃度とは対照的であり、微生物による生産、宿主腸管細胞によるクレアチン消費の変化35、51、肝臓や腎臓におけるクレアチン生産の刺激28のいずれかを示唆している。大腸における24種類の微生物由来の代謝物には、短鎖脂肪酸の酪酸/イソ酪酸やイソバレレート/バレレート、微生物に関連する二次胆汁酸のリトコール酸やヒデオキシコール酸など、いくつかの確立した微生物産物が含まれている31,52,53. これらの化合物の異なるサブセットが、結腸したマウスの糞便または結腸に非常に多く含まれることは、これまでにいくつかの研究で報告されているが、我々は、ヒドロシンナメート、アデノシン、3-ヒドロキシブチレート、カプロン酸およびフコース/ラムノースを微生物代謝由来の化合物として新たに確認した。ラムノースとアデノシンは、その生成に必要な酵素を持つ特定のクロストリジウム菌やバチルス菌に関連している可能性があります。他の3つの新規化合物については、共存する微生物が潜在的な生産者であるが、このような相関関係は、クロスフィードされた代謝物による微生物の増殖から間接的に生じることも考えられる。一方、ヒドロシンナメート（3-フェニル-プロピオン酸とも呼ばれる）は、真核細胞では生産できない。したがって、SPFマウスの大腸内濃度が無菌マウスに比べて259倍高いのは、クロストリジウム13を介したフェニルアラニンとチロシンの変換によると推定され、これはSPFマイクロバイオーム全体のおよそ半分を占める大腸内のクロストリジウムの存在量と一致する4,13,29。ケトン体である3-ヒドロキシ酪酸は、肝臓で主に生産される宿主の代謝物であるが、我々の16Sデータで同定された様々なクロストリジウムの潜在的産物でもある。SPFマウスの大腸における10倍以上の濃度は、微生物による分泌、微生物による宿主の3-hydroxybutyrate産生の誘導、またはその両方の組み合わせによるものと考えられ、その解明にはさらなる実験が必要である。
私たちの知る限り、私たちは、マウスの腸全体に沿って、乱れのない内腔と粘液の代謝の解剖学的なin vivoマップを初めて提供することができた。これにより、食事介入、疾患モデル、特定の腸の部位について調査した先行研究の知見も統合することができた。雄性コロニー形成マウスと無菌マウスの代謝ランドスケープを比較することで、異なるニッチにおける多くの代謝物の起源を明らかにし、場合によってはその根底にあるプロセスを推測することができました。これらの関連性は、相関分析によって特定の代謝物-微生物間の関連性を特定することでさらに強化されました。糞便との比較はできませんが、これらの代謝の違いや、報告されている微生物相の違い7,16に基づき、腸は、単コロン化マウス54で実証されたように、糞便サンプルだけで近似するにはあまりにも変化に富んだ環境であると結論付けています。また、我々のデータセットは、腸内代謝に関する今後の研究の出発点となるものである。
方法
マウスとサンプリング
すべてのマウス実験は、スイス連邦および州の規則に従って行われた。ベルン州の動物実験委員会から許可を得ている。雄のC57BL/6Jマウスは、スイスのベルン大学のクリーンマウス施設で繁殖・維持された。C57BL/6Jバックグラウンドの雄のコロニー型SPFマウスはEnvigo社から購入した。雄の無菌C57BL/6Jマウスは、帝王切開で入手し、フレキシブルフィルムアイソレーター内で無菌飼育で維持した。1群につき5匹の複製動物を使用した。すべてのマウスは10〜14週齢で、病原体がないことが確認され、平均温度20℃、湿度40％の環境下で14時間明暗サイクルで維持した。すべてのマウスは、標準的な実験室のKliba Nafag 3436 chow食と水を自由摂取した。マウスは、小腸の通過を完了させる4時間の絶食後、概日リズムによる変動をコントロールするために、同じ時刻に頸椎脱臼で殺された55。残留飼料は盲腸に存在するため、複製マウスはより比較可能である。腸管内容物および腸管粘液のサンプルは、以前に説明したように、腸に沿った15カ所で収集した8。簡単に言うと、腹部切開により全消化管を切除した。異なる腸領域（胃、小腸、盲腸、結腸）を分離し、縦に開き、管腔内容物を除去し、腸壁から粘液を掻き取った。サンプルは液体窒素で瞬間凍結した。
腸内サンプルおよびフードペレットからの代謝物抽出
50mgのサンプルから、重量あたり20体積の80℃のミリポア水中で代謝物を抽出した。サンプルを10秒間ボルテックスし、Eppendorf Thermomixerで最高速度（1,500 r.p.m.）で80℃で3分間インキュベートし、10秒間ボルテックスし、室温で20,000gで3分間遠心分離をした。上清から150 µlを96ウェルマイクロタイタープレートに移し、-80 ℃で保存した。質量分析では、保持時間基準化合物である9-アントラセンカルボン酸（Sigma-Aldrich）を含む移動相（メタノール/水/酢酸 49.6:49.6:0.8 v/v/v）で1：1希釈し、分析まで-20℃で保存した。食品ペレットからの代謝物抽出は、ペレット3個を秤量し、20 mlのミリポア水に室温で一晩溶解させた。翌日、10 mlのミリポア水を加え、10秒間ボルテックスした。1 mlの食品ペレット懸濁液を80 ℃に加熱し、上記の方法で代謝物を抽出した（Eppendorf Thermomixerで最高速度（1500 r.p.m. ）で80℃にて3分インキュベーション、10秒間ボルテックス、室温にて20,000gで3分遠心分離）。上清から150 µlを96ウェルマイクロタイタープレートに移し、分析まで-80℃で保存した。測定前に、サンプルはMilliQ水で1:20に希釈した。
化学物質
HPLCグレードのメタノールとイソプロパノール、すべての化学物質、オンライン質量参照用の緩衝液添加剤、サンプル調製用化学物質は、Sigma-Aldrich、Agilent Technologies、Cayman Chemicalsから購入しました。HPLCグレードの水は、LC-Pak（Merck）を装備したIQ7000 MilliQ浄水システムを使用して得た。
LC-TOF-MSを用いたメタボライトプロファイリング
サンプルは、Dual Agilent Jet Stream Electrospray Ionization (Agilent Technologies) を使用して、Agilent 6550 accurate mass Q-TOF 質量分析計と結合した Agilent 1290 Infinity LC システムで分析されました。注入量は 4 µl で、Zorbax SB-Aq 1.8 µM 2.1 × 50 mm カラムと Zorbax SB-C8 ガードカラム、高速分離カートリッジ (2.1 × 30 mm 3.5 μm) を使用してクロマトグラフィー分離が行われました。溶出は、2%の移動相B（メタノール中0.2% v/v酢酸）から始めて、13分かけて98%の溶離液Bに徐々に変化させる流速0.6 ml min-1の線形勾配を使用しました。その後、2%移動相A（MilliQ水中0.2%v/v酢酸）を1.5分間アイソクラティックに流し、2%溶離液Bで1分間平衡化した。データ取得は、エレクトロスプレーイオン化を正負モードで行い、2GHz拡張ダイナミックレンジ取得モードでm/z 50からm/z 1700の質量範囲でフルスキャン分析を実施した。オンライン質量軸補正のため、プリンとヘキサキス（1H，1H，3H-テトラフルオロプロポキシ）ホスファジン（HP-0921；Agilent Technologies）を移動相に添加した。エレクトロスプレーの設定は以下の通り：イオンスプレー電圧、3.5kVネガティブモードおよび4kVポジティブモード；キャピラリー温度、325℃；乾燥ガスフロー、10l min-1；ネブライザー圧力45p.s.i.です。
FIA-TOF-MSを用いた非標的代謝物プロファイリング
Agilent シリーズ 1100 LC ポンプと Gerstel MPS2 オートサンプラー、およびデュアル Agilent Jet Stream エレクトロスプレーイオン化 (Agilent Technologies) を用いた Agilent 6550 精密質量 Q-TOF 質量分析装置からなるセットアップで、マイナスイオン化モードで作動する FIA-TOF-MS を使用して、アンターゲット metabolomics測定を実施しました。流速は、1mMのフッ化アンモニウムで緩衝したイソプロパノール／ミリQ水（60：40v／v）からなる移動相の150μl min-1であった。さらに、オンライン質量軸校正化合物として、1 mMの3-amino-1-propanesulfonic acidと1 µMのhexakis phosphazine（HP-0921; Agilent Technologies）を移動相に追加した。注入量は5 µlで、測定は無作為に、二重注入で行った。質量スペクトルは、4GHzの高分解能設定を用いて、1.4スペクトル/秒の頻度で0.48分間、m/z 50からm/z 1,700まで記録した。エレクトロスプレーの設定は以下の通り：イオンスプレー電圧、3.5 kVネガティブモード、キャピラリー温度、325 ˚C、乾燥ガスフロー、5 l min-1、ネブライザー圧力30 p.s.i. です。フラグメンター、スキマー、オクトポールの電圧は、それぞれ175、65、750Vに設定した。
校正用標準液の調製
Sigma-Aldrich社から入手した138種類の精製単一化合物のストック溶液を、MilliQ水、エタノール-水、メタノール-水混合物、またはジメチルスルホキシドのいずれかに別々に溶解し、その後600μMまで混合して調製した（すべての標準物質の全リストは、補足表1を参照）。混合物を分注し、SpeedVacセットアップ（Christ）で0.12 mbarで完全乾燥させ、-80℃で保存した。作業溶液は、0.4%（v/v）酢酸を含むMilliQ水で調製し、使用前に濾過した。
校正曲線は、MilliQ水で7桁（17.9pMから150μM）に及ぶ24点連続希釈シリーズから、またマトリックス効果を評価するために、プールした研究サンプルバックグラウンドで得られました。そのため、希釈したマトリックスに、連続希釈した標準混合物を混ぜた。標準物質は、正負のイオン化モードで、測定の最初と最後に測定しました。
定量性
標準希釈系列の測定値について、対数変換したイオンカウント対対数変換した濃度の線形回帰を行い、R2値を最大化する目的で、濃度上限から最大6希釈ステップ、下限希釈から12データポイントの反復除去が可能でした。定量下限および直線性上限は、それぞれ許容される最低希釈段階および最高希釈段階として決定されました。代謝物濃度は、導出された傾きと切片に基づいて計算されました。直線範囲内の値のみが、さらなる分析に考慮されました。138種類の代謝物のうち、128種類はこれらの基準に基づいて確実に検出・定量することができました。各代謝物について、最大5種類の修飾（脱プロトン化アニオン、プロトン化カチオン、ナトリウム付加カチオン、ダイマーカチオン、ダイマーナトリウム付加カチオン）を測定し、線形フィット（最高R2値）、線形範囲、データセット内の信頼できるカバー率（最大検出サンプル数）に基づいて、修飾を手動で選択しました。選択された修飾、それぞれの標準物質の線形フィット、および最終的なデータセットは、補足表1に記載されています。メタボライト濃度は㎟で報告されている（㎟frac{{mathrm{nmol}}}{{mathrm{mg}};{}mathrm{sample}}}）.
データ処理、解析、可視化
LC-TOF-MS データについては、MassHunter Quantitative Analysis B.07.00 ソフトウェア (Agilent Technologies) を用いて、前処理、ピークピッキング、アノテーションを実施しました。代謝物は、MetaCyc56 (https://metacyc.org/) に従って分類されました。さらなるデータ解析、統計および可視化は、MATLAB R2021b (MathWorks) の Bioinformatics および Statistics ツールボックスに組み込まれた関数を使用して、生データのエクスポート後に実施されました。グラフ、イラスト、プロットは、Illustrator（Adobe）を使用して最終決定した。
腸内サンプルの16S rRNA配列決定
5匹のSPFマウスについて、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸の5つの部位で、粘液と管腔内容物の両方を別々にサンプリングしました。製造者の説明書に従ってDNAを抽出した後（QIAamp PowerFecal DNA Kit, Qiagen）、地球マイクロバイオームプロジェクト57,58,59でベンチマークされたプロトコルに従って、縮退プライマー515FYと806Rを用いて16S rRNA遺伝子可変領域3および4にわたるアンプリコンを作成した。PCRで増幅したアンプリコンをゲル精製し（MinElute Gel Extraction Kit、Qiagen）、イルミナシーケンスアダプターとバーコードを加え、ビーズベースのクリーンアップ（AMPureビーズ、Beckman Coulter）を行った。サンプルは、Functional Genomics Center ZurichでIllumina MiSeqを使用して配列決定されました。72サンプルからの合計16,557,915シーケンスリード（中央値＝173,616）は、dada2 v.1.14（ref. 60）を用いたAmplicon Sequence Variants（ASVs）の推論のための入力となった。プライマー配列（515FY = GTGYCAGCMGCCGCGTAA, 806R = GGACTACNVGGTWTCTAAT）はcutadapt v.2.8 (ref. 61) を用いて除去し、両プライマーを含み少なくとも75ベース長の挿入物のみを下流の解析に残した。次に、dada2 RパッケージのfilterAndTrim関数（maxEE = 2, truncQ = 3, trimRight = (40, 40)）を使用してリードを品質フィルタリングした。learnErrors関数とdada関数は、pool = pseudoをパラメータとしてサンプル推論を計算するために使用されました。mergePairs関数でリードをマージし、removeBimeraDenovo関数（method = pooled）でバイメラを除去した。残りのASVは、IDTAXA分類器62とSilva v.138データベース63を組み合わせて、http://www2.decipher.codes/Downloads.html、分類学的にアノテーションされました。1,000リード未満のサンプル（合計9サンプル）は、下流の解析には考慮されませんでした。得られたASVの存在量表は、vegan Rパッケージのrrarefy関数を用いて、サンプル間のシーケンス深度の違いを補正するために、共通のシーケンス深度（サンプルあたり6,000リード；つまり、残りの63サンプルすべての最小値）にダウンサンプリングしました。各分類レベルの存在量表は、同じ分類群に属するASVの存在量を合計することで計算した。
統計解析
統計解析は、MATLAB R2021b (MathWorks)のBioinformaticsおよびStatisticsツールボックスに組み込まれた関数を使用して行った。2つのグループ間（例えば、異なるサンプリングサイト間）の値を比較し、対の標本Studentのt検定（MATLAB Statistics toolboxに実装）を使用して統計的有意性を計算した。一般に、5匹の雄マウスが生物学的複製として機能した。実験は繰り返さなかった。統計的差異を算出するために使用した正確なサンプル数は、各図の凡例に示されている。偽発見率は、計算されたP値を多重検定で補正することでコントロールし（Benjamini-Hochberg手順）、補正P値≦0.05を統計的に有意と見なした。
メタボライトと微生物との関連性解析
マイクロバイオーム内の機能的存在量を予測するために、分析したASV（補足表10）に対してPICRUSt2 v.2.5.1（ref. 38）を使用し、検出された各微生物のEnzyme分類番号のリストを作成した。次に、予測されるマイクロバイオーム代謝ネットワークを酵素分類リストから再構築し、bioservices64 pythonパッケージを使用してKEGGのMus musculus代謝ネットワークと比較しました。測定された代謝物は、その起源を予測するために、どちらのネットワークにもマッピングされました。微生物と代謝物の全サンプルサイトにわたる空間相関は、Scipy v.1.9.3 (ref. 65) pythonパッケージを使用して、各ペアについてスピアマン係数として計算しました。
報告書の概要
研究デザインに関する詳細な情報は、本記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryでご覧いただけます。
データの入手方法
LC-TOF-MSの生データはMassIVEに寄託されており、アクセッションコードMSV000091478 (https://doi.org/10.25345/C5K06XB0Q)で入手可能です。16S rRNAシーケンスデータは、NIH Sequence Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA944604) からBioProject ID PRJNA944604で入手できます。KEGGデータベースは、代謝物-微生物間の関連付けのリソースとして使用されました。ソースデータは本論文に添付されています。
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参考文献のダウンロード
謝辞
G. S. Guiralには、シーケンスデータの処理に協力していただき、メソッド固有の情報を提供していただきました。A. OthmanとK. Ortmayrには、メタボロミクスワークフローの設定にご協力いただき、ありがとうございました。米国国立衛生研究所RO1（GM117324）、スイス国立科学財団（SNSF Sinergia CRSII5_177164）より米国とA.J.M.、ETH Fellowsプログラム（ETH Zurich Foundation）よりJ.T.への部分的資金提供を謝辞する。
資金提供
スイス連邦工科大学チューリッヒ校よりオープンアクセスファンドの提供を受けています。
著者情報
著者および所属
チューリッヒ工科大学分子システム生物学研究所、チューリッヒ、スイス
カリン・H・U・マイヤー、ジュリアン・トルイヨン、トビアス・フューラー、ニコラ・ザンボーニ、ウヴェ・ザウエル
ベルン大学病院内臓外科・医学科（スイス・ベルン市
ハイ・リー＆アンドリュー・J・マクファーソン
チューリッヒ工科大学微生物学研究所（スイス・チューリッヒ
メラニー・ラング、砂川伸一
貢献度
U.S.とA.J.M.がプロジェクトの構想を練った。K.H.U.M.はLC-TOF-MSワークフローの設定、代謝物抽出、ゲノムDNAおよび16Sアンプリコン調製を含むメタボロミクスおよび16Sシーケンスサンプル調製、メタボローム測定、メタボロームデータ処理、コードの記述を含むメタボロームおよびシーケンスデータ解析、すべてのメタボロームおよびシーケンスデータ作成と可視化を実施した。J.T.はメタボロームと微生物の共起性解析を行った。H.L.はK.H.U.M.の協力を得てマウス実験を行った。 M.L.は生のシーケンスデータの処理と解析サポートを提供した。T.F.とN.Z.は、プロジェクトの計画、測定、原稿へのコメントにおいてサポートと指導を行った。S.S.とA.J.M.は、原稿へのコメントを提供した。K.H.U.M.とU.S.は原稿を執筆した。
コレスポンディングオーサー
Uwe Sauerに連絡する。
倫理的宣言
競合する利益
著者は、競合する利益を宣言していない。
査読
査読情報
Nature Metabolismは、本作品の査読に貢献した匿名査読者に感謝します。プライマリーハンドリングエディター Ashley Castellanos-Jankiewicz、Nature Metabolismチームと共同で。
その他の情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権の主張に関して、中立を保っています。
エクステンデッドデータ
Extended Data 図1 雄のSPFマウスの生物地理。
a - 本研究で使用した15箇所のサンプリング部位の概略図。胃に1箇所、小腸に10箇所（十二指腸に3箇所、空腸に4箇所、回腸に3箇所）、大腸に4箇所（盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸に）。b - 本研究で用いたLC-TOF-MS法で測定した全128代謝物におけるMetaCyc化学クラスの割合（補足表ST1） c - 雄SPFマウスの腸管粘液からの代謝物存在量の階層的クラスタリング分析．全128種類の定量代謝物の存在量は、15カ所のサンプリング地点で5匹のマウスから平均した正規化濃度のzスコアとして示されている。クラスタリングは、管腔サンプルのユークリッド距離に基づいて行われ（図1a）、その結果、消化管の既知の3つの主要な生理学的領域、すなわち胃、小腸、大腸に対応する3つの主要なクラスタが特定されました。このヒートマップでは、比較のために、Y軸に沿った代謝物を図1aの順序に従ってソートしています。3つの主要クラスターに含まれる代謝物は、MetaCycに従って色分けされている（S1bと同様；補足表ST1）。 d - SPF内腔内容物と粘液大腸サンプルにおけるアルギニン、オルニチン、スペルミジンの代謝物濃度。プロットは20データポイント（大腸4部位、雄マウス5匹）、ボックスプロットは代謝物濃度の中央値を太い印で、25％および75％をボックスで示し、ひげは外れ値とみなされない最も極端なデータポイントに及ぶ。
出典データ
Extended Data 図2 男性SPF小腸サンプルの階層的クラスタリング。
a, b - 雄のSPFマウスの小腸内腔内容物（a）および粘液（b）サンプル10個の代謝物量の階層的クラスタリング解析結果。128種類の代謝物の存在量は、雄マウス5匹と十二指腸、空腸、回腸の各3サンプルから平均した正規化濃度のzスコアとして示した。これら3つの平均値（十二指腸、空腸、回腸）に基づき、階層的クラスタリングを実施した。有意に変化した代謝物をボックスとアスタリスクで示した（p-value ≤ 0.05）。P値は、両側一対標本Student's t-testを用いて算出し、補足表ST4で確認できる。ヒートマップのカラーキーは、小腸全体の代謝物の相対的な存在量の低～高を示す。 c - 内腔内容物（上）と粘液（下）の小腸におけるピーク濃度の3領域に対する分布。3本の棒は十二指腸、空腸、回腸の3つの領域を示し、Y軸はそれぞれの領域で代謝物のピーク濃度が発生する頻度を示す。略号：duo - 十二指腸、jej - 空腸、ile - 回腸。
出典データ
Extended Data 図3 男性SPF大腸サンプルの階層的クラスタリング。
a, b - 雄のSPFマウスの4つの大腸内腔内容物（a）および粘液（b）サンプルの代謝物量を階層的クラスタリング解析したもの。128種類の代謝物の存在量は、結腸（盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸）のサンプリング部位ごとに5匹のオスマウスから平均した正規化濃度のzスコアで示されている。階層的クラスタリングは、これらの4つの値に対してのみ行われた。有意に変化した代謝物をボックスとアスタリスクで示した（p-value ≤ 0.05）。P値は、両側一対標本Student's t-testを用いて算出した。ヒートマップのカラーキーは、大腸全体の代謝物の相対量が低いものから高いものを示す。 c - 大腸の内腔内容物（上）および粘液（下）におけるピーク濃度の分布を、4つの領域に関して描いている。4本のバーが領域を示し、Y軸はそれぞれの領域で代謝物のピーク濃度が発生する頻度を示す。略語：Cec - 盲腸、Acol - 上行結腸、Tcol - 横行結腸、Dcol - 下行結腸。
出典データ
Extended Data 図4 大腸の代謝に及ぼす微生物叢の影響。
a - 内腔内容物および粘液サンプルにおけるSPF対無菌比較の代謝物濃度フォールドチェンジの分布。5匹の雄マウスと15カ所のサンプリング部位について、それぞれの生息環境における代謝物ごとにフォールドチェンジを算出し、log2変換し、その分布をx軸に沿ったコンタープロットで表示した。y軸には頻度を表記した。log2倍変化がマイナスの場合は、無菌マウスの代謝物濃度が高いことを示し、log2倍変化がプラスの場合は、SPFオスのマウスの濃度が高いことを示す。b-SPFおよび無菌マウスの管腔内容物および粘液中のアデノシン、3-ヒドロキシブチレート、フコース/ラムノース、カプロン酸の大腸内濃度。実線の棒は、5匹の雄マウスからの測定値の平均濃度を示し、4つの大腸部位で平均化した。対応する20個のデータポイントは丸で表示されている。略号： FC - fold change; GF - germ-free; duo - duodenum, jej - jejunum, ile - ileum; cont - luminal content; muc - mucus.
出典データ
Extended Data 図5 小腸の代謝。
a - 小腸に縦断的なパターンを持つ42種類の代謝物（プロファイル例は図3、図5、補足表ST4参照）の小腸内平均濃度のLog2変換した倍率変化。内腔内容物（左図）および粘液（右図）において、男性SPFと男性無菌サンプルとの間で、10箇所のサンプリング部位と5つの生物学的複製で平均したFold変化量を算出した。ボックスプロットは、50個のデータポイントに基づき、log2倍変化の中央値を青色で示し、25％および75％をボックスで示し、ウィスカーは外れ値とみなされない最も極端なデータポイントまで伸ばし、外れ値はプラス記号でマークしています。b-SPFマウスおよび無菌マウスにおける管腔内容物または粘液濃度の空間的な代謝物プロファイルを示す。斜線を引いた線は、5匹の雄マウスによる濃度測定の平均±s.e.m.の移動平均を示す。略号 FC - fold change; GF - germ-free; duo - duodenum, jej - jejunum, ile - ileum, cec - cecum, and col - colon.
出典データ
Extended Data 図6 男性SPFの管腔内容物および粘液のマイクロバイオーム組成。
十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸の5部位における、雄SPFの内腔内容物（上段）と粘液（下段）の腸内全体の群集組成と差異。表示されているのは、ファミリーレベルでの相対的な微生物の存在量（％）である。上位95%はバラバラに表示され、5%未満は "その他 "に分類される。
出典データ
補足情報
報告書の概要
補足表1～10
補足表1～10は、10個の独立したタブを持つ1つのワークブックにまとめられています。データには、分子の詳細情報、具体的なフォールド変化、P値など、本文や図表を支える情報が含まれています。
補足データ
サンプルごとに処理され、定量化された代謝物データ。
ソースデータ
ソースデータ 図1
代謝物の存在量データ、主成分分析のスコア（PC1、PC2）、統計的なソースデータ（P値、フォールドチェンジ）。
ソースデータ Fig.2
統計的出典データ（P値およびフォールドチェンジ）、代謝物濃度データ。
ソースデータ Fig.
代謝物濃度データ。
出典データ Fig.
統計的な出典データ（P値およびフォールドチェンジ）、代謝物濃度データ。
出典データ Fig.
統計的出典データ（P値およびフォールドチェンジ）、代謝物濃度データ。
出典データ Fig.
KEGG識別子、統計的出典データ、代謝物濃度データ。
ソースデータ 拡張データ Fig.
代謝物の存在量データ、代謝物濃度データ。
出典データ 拡張データ Fig.
代謝物濃度データ。
出典データ 拡張データ Fig.
代謝物濃度データ。
出典データ 拡張データ Fig.
統計元データ、代謝物濃度データ。
出典データ 拡張データ Fig.
統計資料（p値、fold change）、代謝物濃度データ。
出典データ 拡張データ Fig.
微生物の存在量データ。
権利と許可
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Meier, K.H.U., Trouillon, J., Li, H. et al. Metabolic landscape of the male mouse gut identifies different niches determined by microbial activities. Nat Metab (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00802-1
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2022年6月28日受領
2023年4月6日受理
2023年5月22日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s42255-023-00802-1
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