マイクロバイオームLPSの免疫原性のばらつきはヒトの自己免疫に寄与する

2022年12月20日 16:00

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マイクロバイオームLPSの免疫原性のばらつきはヒトの自己免疫に寄与する
Tommi Vatanen, Aleksandar D. Kostic, [...], and Ramnik J. Xavier

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関連データ
補足資料
要約
衛生仮説によれば、欧米諸国における自己免疫疾患の罹患率の増加は、初期の微生物曝露の変化により免疫成熟が変化することで説明できるかもしれない。我々は、フィンランドとエストニアで早期発症の自己免疫疾患が多いがロシアでは少ない北欧の乳児222人を対象に、出生から3歳までの腸内細菌叢の発達を追跡調査した。その結果、ロシアではバクテロイデス属細菌は少ないが、フィンランドとエストニアでは優勢であることがわかった。したがって、彼らのリポ多糖（LPS）曝露は、強力な自然免疫活性化物質である大腸菌よりもむしろ、主にバクテロイデスから生じていることになる。我々は、バクテロイデスLPSが大腸菌LPSとは構造的に異なり、自然免疫シグナル伝達およびエンドトキシン耐性を阻害すること、さらに、大腸菌由来のLPSとは異なり、B. dorei LPSは非肥満糖尿病マウスの自己免疫疾患発症を抑制しないことを示している。このように、免疫抑制微生物による早期のコロニー形成は、免疫教育の側面を排除する可能性がある。

はじめに
衛生仮説によれば、乳幼児期に特定の微生物や寄生虫に早期に接触することは、免疫系の発達に役立ち、アレルギー疾患や自己免疫疾患に対する防御になるとされている。実際、いくつかの研究により、1型糖尿病（T1D）、多発性硬化症、その他の自己免疫疾患の発生率は、衛生状態の改善や幼児期の感染症の発生率の減少に関連して、世界的に勾配があることが示されている（総説あり（Bach、2002；Bach and Chatenoud、2012））。同様に、喘息やアレルギーの発症率も、農場環境にさらされた子供たちでは減少している（von Mutius and Vercelli, 2010）。この効果の説明の1つは、個人の生活環境から微生物を除去して感染症を予防するための衛生対策が、かえって腸内常在菌叢を変化させ、免疫系の教育に重要な微生物を排除している可能性を想定している（Bach、2002; von Mutius and Vercelli、2010)。したがって、マウスモデルを用いた研究により、保護的な微生物叢を早期にコロニー形成することで、遺伝的に感受性の高い動物における自己免疫性糖尿病の発症リスクを減少させることができることが示されている（Markleら、2013年）。同様に、微生物叢の構成は、マウスをアレルギーから保護することができる（Stefkaら、2014）。しかし、有益な微生物群集と有害な微生物群集の区別や、その効果の基盤となる機能的なメカニズムは、まだ十分に理解されていません。

フィンランドとロシアン・カレリアとの国境には、免疫疾患発生における世界的な勾配の縮図が存在し、フィンランドではロシアン・カレリアに対してアレルギーの発生率が2～6倍高く（セイスカリら、2007）、T1Dおよびその他の自己免疫疾患の発生率が5～6倍高い（コンドラショワら、2008a；コンドラショワら、2008b）。近隣のエストニアでは、経済発展と生活水準の向上に伴い、T1Dとアトピーの発生率は、ここ数十年の間に、ロシアン・カレリアと同様の割合からフィンランドの割合に移行している（Teeaarら、2010；Voorら、2005）。この3つの集団を「生きた実験室」として、DIABIMMUNE研究（http://www.diabimmune.org/）は、エスポー（フィンランド）、ペトロザボーツク（ロシア）、タルトゥ（エストニア）から合計約1,000人の幼児を募集した。乳児は、広範な臨床的メタデータの収集とともに、毎月の便サンプリングによって出生から3歳まで追跡された。このコホートは、免疫介在性疾患と関連した乳児腸内細菌群の縦断的な機能プロファイルとしてはこれまでで最大であり、衛生仮説（Peet et al.、2012）の基盤となりうる微生物生態と分子メカニズムを理解する前例のない機会となっている。

自己免疫とアレルギーの原因となる宿主-微生物間の免疫相互作用を明らかにするため、本研究のために選択したDIABIMMUNEコホートの乳児785人の腸内細菌群集において、縦断的メタゲノム特性解析を行いました（図1Aおよび図1B）。菌株レベルでの微生物同定を行い、ロシア、フィンランド、エストニアの子どもたちの初期腸内細菌叢の構成、多様性、安定性に大きな違いがあることを明らかにした。さらに、これらの微生物群集の機能的可能性を定量化し、その寄与する生物間で遺伝子ファミリーやパスウェイを層別化しました。この広範なデータセットは、幼児の腸内細菌叢研究の貴重なリソースであり、DIABIMMNUNE Microbiomeのウェブサイト（http://pubs.broadinstitute.org/diabimmune）からアクセスできます。

図1
図1
DIABIMMUNE コホート
本研究では、ヒトの縦断的なメタゲノム解析と新規の分子免疫機構の同定を結びつけています（図1C）。このデータセットを詳細に解析した結果、フィンランドとエストニアの乳児は、ロシアの乳児と比較して、Bacteroides属を多く保有していること、リポポリサッカライド（LPS）生合成遺伝子が豊富であることを発見した。このLPSは、ロシア人幼児のマイクロバイオームで主流であった大腸菌由来のLPSとは構造的にも機能的にも異なるものであることが明らかになった。さらに、T1D発症との関連が指摘されているBacteroides dorei由来のLPS（Davis-Richardsonら、2014）は、大腸菌で見られる6糖のリピドA構造とは異なり、4糖および5糖のリピドA構造を有することを実験的に明らかにした。さらに、B. dorei LPSは、ヒト細胞において、大腸菌LPSに対する免疫刺激および炎症性サイトカイン応答を抑制した。これらの結果は、フィンランド人とエストニア人の子どもにおいて、微生物叢由来のLPSの違いが免疫教育の一側面を阻害している可能性を示唆しており、ヒトの腸内細菌叢と免疫疾患の罹患性を結びつける潜在的なメカニズムの1つを明らかにするものであった。

研究結果
研究コホート
HLAリスククラス分布が類似しており、性別が一致していることを根拠に、各国から74人の乳児のサブコホートを選択した（図1A、1B、表S1）。各児童について、3年間の月1回の検便、母乳育児、食事、アレルギー、感染症、家族歴、薬剤使用に関するアンケート、臨床検査、および臨床検査が収集された。DIABIMMUNEコホートの募集基準に従って、すべての対象者はHLAによって自己免疫の感受性が高まっていた（図1B）（Larizzaら、2012；SollidとThorsby、1993）。これらの小児は3歳までしか追跡されていないため、アレルギー疾患や自己免疫の兆候を見ることはできないが、実験室検査では、フィンランドとエストニアの乳児にアレルゲン特異的感作とT1D関連抗体の血清陽性の高い陽性率が認められた（図1B、下）。

また、フィンランドではT1D自己抗体の陽性率が高く、コホート内のT1D自己抗体陽性率に勾配があることも観察された。1つ以上のT1D関連自己抗体で血清陽性を示した乳児の数は、フィンランドで16人、エストニアで14人、ロシアで4人であった。年長者（7-15歳）を対象とした他の研究では、ヘリコバクター・ピロリ（15倍）、トキソプラズマ・ゴンディ（5倍）、A型肝炎ウイルス（12倍）に対する抗体が高いことからわかるように、ロシア・カレリアの子どもはフィンランドの子どもよりもかなり高い微生物曝露量を示している（セイスカリら、2007年）。年長児におけるこのような病原体曝露の増加は、フィンランドの都市部では衛生レベルが高いためか、多様な微生物への曝露率が全体的に高いことを示唆している。

腸内細菌叢の地域的傾向
生後3年間の腸内細菌叢の組成を概観するために、1,584のサンプルから16S rRNA遺伝子のV4領域を配列決定し（図S1）、このコホート内でいくつかの強いハイレベルな傾向を観察した。主座標プロット（図2A）では、年齢以外に、特に生後1年間において、国が主な変動要因であることが示された。国ごとの分離可能性をさらに確認するため、生後170日から260日の間に採取したサンプルの属レベルのデータを用いて、ランダムフォレスト分類器のセットを訓練した。この分類器は高い分類精度で国を予測することができた（フィンランド人対ロシア人でAUC = 0.944）（図2B）。フィンランド人とエストニア人の間では、分類の精度が最も低く（AUC = 0.546）、初期の微生物プロファイルはこの2つの国でかなり均質であることが示唆されました。フィンランド人およびエストニア人サンプルと比較したロシア人サンプル間の違いは、門レベルの組成（図2C）ですでに明白であり、2つの明確な特徴で表された。まず、フィンランド人とエストニア人の子どもは、3年間を通してバクテロイデーテスのレベルが高かった（FDR補正p = 5.4 × 10-15、実験手順の補足を参照）。第二に、ロシア人は生後1年間、放線菌のレベルが高かった（FDR補正後p=0.014）。後者の差は時間とともに解消され、2歳を過ぎると有意ではなくなった。バクテロイデーテス門の存在量は、フィンランド国内でもコホート全体でも血清インスリン自己抗体（IAA）レベルと相関していた（p = 0.017、図S2および補足の実験手順）。微生物群集データに適応した線形モデリングツールであるMaAsLinを使用して、メタデータと分類群間の関連性の広範なテストを実施した（Morgan et al.）したがって、報告されたすべての国レベルの差は、出生様式、母乳育児およびその他の食事要因、抗生物質の使用、および年齢などのすべての主要な交絡効果で補正された（補足の実験手順を参照）。表1は、メタデータと微生物叢の間の選択された関連性を強調したものである。国による分類学的差異、アレルゲン特異的IgEに関連する分類学的変化、その他の収集したメタデータに関連する微生物の変化などの結果の包括的リストは、http://pubs.broadinstitute.org/diabimmune でアクセスできる。

図2
図2
乳児期早期の微生物生態の国による違い
表1
表1
メタデータと微生物相の関連性
個々のサンプル内の微生物相の多様性（アルファ多様性）は、微生物相が成人の組成に向かって発達するにつれて、年齢とともに増加した（図S3A）（Koenig et al.、2011）。しかし、ロシア人は、フィンランド人およびエストニア人と比較して、最初の1年間は、有意に低い微生物相の多様性を示した（図S3B）。この差は、ロシア人において、その期間にアクチノバクテリア門とビフィドバクテリウム属が2倍に過剰発現していたことで説明できる（図2Cおよび図2D）。最後に、国によって分類群内の安定性に違いがあることも明らかになった。これらの違いは、早い時間帯と遅い時間帯に採取したサンプルを比較したときに特に顕著に表れた（図S3CおよびS3D）。ロシア人は、初期の時間窓で最も優勢なビフィドバクテリウム属を除いて、生後3年間は全体的により可塑的な微生物相を有していた。一方、フィンランド人とエストニア人では、バクテロイデス門とバクテロイデス属が観察期間全体を通してより安定していた。これらの結果から、ロシア人対フィンランド人、エストニア人の微生物相の間には、世界的に強い違いがあり、その差は1年目に最も大きく、2年目、3年目には解消されることが明らかになった。

種および菌株レベルの微生物動態
乳児のマイクロバイオームについて、より完全で高解像度の分類学的見解を得るために、785サンプルの代表的なサブセットについて、深い全ゲノムショットガンメタゲノムシーケンスを実施した（図S1）。まず、MetaPhlAn 2.2 (Metagenomic Phylogenetic Analysis 2.2) (Truong et al., 2015) を用いてメタゲノムリードを種レベルまで詳細に分類学的構成を調査し、フィンランドとロシアでBacteroides属とBifidobacterium属に複数の異なる豊富な種を観察しました（図2D）。注目すべきは、フィンランド人とロシア人の間で最も大きな倍率の変化を示したBacteroides種は、以前にT1D発症と関連したB. doreiでした（Davis-Richardson et al.、2014）。85個の便サンプルのDNAに対して定量PCR（qPCR）を実行し、メタゲノミクスデータの妥当性を確認した。B. doreiおよびE. coli種の補間された絶対量は、ユニバーサル16Sプライマーを用いて細菌の総量を推定したときにメタゲノミクスデータが予測した絶対量とよく一致した（図S3Eおよび補足の実験手順）。

次に、最近開発された菌株ハプロタイピングツールであるConStrainsを用いてメタゲノミクスデータを菌株レベルで解析し、乳児の微生物叢の多様性と安定性を評価した（Luo et al.、2015）。全株プロファイルの60%において、コミュニティは単一の支配的な株（種内存在率90%以上）を持つ種で構成されており、種内、サンプル内ハプロタイプ多様性スコアが低いことに反映されていた（図S4A）。しかし、FaecalibacteriumやVeillonellaなどいくつかの属の種は、より複雑な株構成を示す二峰性のハプロタイプ多様性分布を有していた。さらに、菌株の多様性は年齢とともに増加する傾向があった（図S4B）。菌株の安定性を経時的に分析した結果、種は(i)安定したまま単一の優勢株を維持するか、(ii)元の優勢株が新しい優勢株に置き換わる、菌株「スイープ」を経験する傾向があることがわかった（図S4C）。また、サンプルの縦方向の距離と、対応する株の安定性の間に逆相関があることが確認された（図S4D）。また、菌株の安定性と比較試料の平均多様性を比較したところ、逆相関が見られ、多様性の低い菌株プロファイル（すなわち、単一優占株の挙動）は、多様性の高い菌株プロファイルと比較して、より安定である傾向があることが示された（図S4E）。対象属のうち、Bifidobacterium属は、ロシア人と比較して、菌株の多様性と安定性がより均等に分布していることから、フィンランドの子どもでは安定した単一菌株コミュニティを確立できないことが観察された（図2Eおよび図2F）。一方、バクテロイデス属細菌は、フィンランド人、ロシア人ともに安定した単系統の群集を形成する傾向があった（図2E、図2F）。

集団間で異なる微生物機能
国によって異なる分類学的差異がもたらす機能的・代謝的影響を調査するため、次に、HUMAnN2 (Abubucker et al., 2012) を用いてメタゲノム配列のゲノム機能的可能性を解析し、定量化した遺伝子量（100万リードあたりのキロベース数、RPKM）と遺伝子存在論（GO）用語の関連付けを行いました。微生物の多様性で観察されたように、マイクロバイオームの機能的多様性も、ロシアではあまり複雑でない構成で始まったが、3年間の期間の終わりまでに大きな多様性に達するように発展した（図S5A）。初期（1年目）と後期（1年目以降）の両方の時間窓で、フィンランド人とロシア人の間で存在量が有意に異なる複数のGOカテゴリーを同定した（図3A）。例えば、シデロフォア関連機能は、病原性関連機能だけでなく鉄回収機能も含み、フィンランドの乳児で高く、おそらくフィンランドでの病原性生物の増加を反映していると思われる。2国間の差分カテゴリーの包括的なリストは、図S5Bおよび表S2に示した。

図3
図3
機能差、HMO利用率、リピッドA生合成
解糖系機能は2つの集団間で差分的に豊富であった（図3A）ため、ミルクオリゴ糖代謝の違いを計算機で調べることにした。最初の1年間の腸内細菌叢の構成は、母乳育児であれ哺乳瓶育児であれ、乳児が利用できる唯一の栄養源であるミルクによって大きく形作られる（(Sela and Mills, 2010)にレビューあり）。ビフィドバクテリウム属とバクテロイデス属は、ヒトのミルクオリゴ糖（HMO）代謝菌の2つの主要なグループである（Marcobal et al.、2011）。Bifidobacteriumのうち、B. bifidumとB. longum（ロシア人に多い）はHMOを代謝することができるが、B. breve（フィンランド人に多い）はHMOから遊離した単糖を容易に利用するものの、そのままのHMOを代謝できない（Locascio et al.、2009)。この観察から、フィンランド人とエストニア人の子供のHMO代謝はバクテロイデス属細菌によって行われ、ロシア人のそれはB. bifidumとB. longumによって行われるという仮説が導き出された。実際、善意のHMO遺伝子クラスター（Sela et al., 2008）に属する遺伝子の分類学的由来を解析したところ、HMO利用遺伝子の平均存在量は3カ国間でほぼ等しいものの（RPKMにおける平均±SD：フィンランド 460±372、エストニア 462±331、ロシア 504±469）、ほとんどの遺伝子がロシア人ではBifidobacterium、フィンランド人とエストニア人ではBacteroidesに付与された（図3Bおよび図S5C）。ロシア人のB. bifidumが多いのは、母乳育児の結果ではないことに注意したい。フィンランドの乳児はロシア人より平均して母乳育児期間が長い（平均±SD 母乳育児／日。フィンランドの乳児はロシア人より平均して母乳育児期間が長い（平均±SD 母乳育児／日数：フィンランド 268 ± 149、エストニア 307 ± 217、ロシア 199 ± 165）。

最も重要なことは、LPSの機能に関連するGO用語、LPS生合成プロセス（GO:0009103）とリピドA生合成プロセス（GO:0009245）が国によって存在量に著しい差があり（図3A、3C）、フィンランドとエストニアの被験者の微生物群集がより多くのLPSを生産することが示されたことである。この分子は、哺乳類の細胞で強い免疫反応を引き起こすため、特に興味深いものです（Cullen et al.） LPSの免疫賦活特性を担うサブユニットであるリピドAの生合成に寄与する種を分解したところ、2つの重要な見解が得られました。3カ国すべてにおいて、大腸菌はリピドAの生合成に大きく寄与していたが、フィンランドとエストニアでは他の多くの細菌種がリピドAの生合成の可能性に寄与し、その多くはBacteroides属に属していた（図3Dと図3E）。Bacteroides属に由来するLPSサブタイプは、他の腸内細菌から分離されたLPSと比較して、低い内毒性を示すことが示されている（Hofstadら、1977）。このことから、3つの集団の主要な菌種に由来するLPS亜型の免疫原性に違いがあるかどうかを検討した。

LPS亜型の対照的な免疫原性
LPSの構造の種間差は、自然免疫反応を誘発する能力の変化と関連している（Whitfield and Trent, 2014）。特に、LPSの脂質Aドメインは、TLR4複合体の認識と活性化を通じて免疫シグナル伝達を担う（Kimら、2007）。そのため、脂質Aの構造変化はTLR4による認識に影響を与え、微生物生態の複数の側面に影響を与える（Cullenら、2015; WhitfieldおよびTrent、2014）。我々は、LPSを精製し（下記参照）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析計を用いて、2つの細菌種（型株）のリピドAドメインの構造を調べました。最も一般的な免疫賦活性リピッドA構造の代表としてE. coli、そして国によって最も量の異なるBacteroides属であるB. doreiを用いた（図2およびand3D）.3D）。大腸菌から抽出した脂質Aは、質量電荷比（m/z）1798.3で優勢なピークを生じ、2つのリン酸基と6つのアシル鎖を有する大腸菌脂質Aの公表されている［M-H］-イオン構造（予測精密質量: 1797.2 m/z）と一致しました（図4A）。B. doreiから抽出した脂質Aは、m/z 1690.9と1436.2に2つの優勢なピークを生じ、それぞれリン酸基が1つ、アシル鎖が4つと5つの[M-H]-イオン構造（予測される精密質量：1689.2 m/z と 1435.0 m/z）と一致しています (図4B).

図4
図4
LPS分子の構造とトレロジェニック機能への影響
我々のB. dorei型株のLPSが臨床サンプルを代表していることを確認するために、6人の健康なドナーの便からB. dorei株を分離し、LPSの構造比較解析を行った。その結果、すべてのB. dorei株でLPSの構造的特徴は一致していた（図S6A、S6B）。従って、B. doreiのLPSの構造と機能に関する我々の知見は、患者においても再現される可能性が高い。

広範なリピドAの構造-機能研究により、アシル鎖の数がLPSによる免疫活性化の強い決定因子であること（Hajjarら、2002；Needhamら、2013）、ペンタ-およびテトラ-アシル化リピドA構造がTLR4応答の低下を引き起こすこと（Herathら、2011）などが示されてきた。LPSサブタイプ間の構造の違いの影響を理解するために、我々はサンプル中のLPS負荷に寄与する細菌種に由来するLPSの免疫原性を評価した（図3E参照）。最も寄与の大きい15菌種のうち、Table S3に示す11菌種からLPSを精製することができた。我々はまず、これらの菌株から精製したLPSを用いて、腸内に存在するものと同様のLPS応答性細胞型を含み、したがって粘膜白血球の一般的な代理人である初代ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を刺激した（Ardeshirら、2014；Sokolら、2008）。大腸菌由来のLPSは、初代PBMCにおけるNFκB依存性サイトカインIL-10、TNFα、IL-1β、及びIL-6の産生によって測定されるように強い応答をもたらしたが（図5A及びS7A）、B. dorei由来のLPSは用量にかかわらずいかなる応答も引き出すことができなかった。一方、B. dorei由来のLPSは、投与量によらず全く反応を示さず、Bacteroidetesのメンバー（Bacteroides speciesとPrevotella copri）由来のLPSもこれらの炎症性サイトカインの産生を誘導する能力が著しく損なわれていた。次に、これらの同じ株のLPSで刺激したヒト単球由来樹状細胞でのサイトカイン産生を測定したところ、同様の結果が得られた（図5BおよびS7B）。また、大腸菌由来のLPSはTLR4-NFκBレポーター細胞において高レベルのルシフェラーゼ活性を誘発したが、Bacteroides属はこれらの細胞において炎症性シグナルを誘発しなかった（図5CおよびS7C）。

図5
図5
異なる細菌株由来のLPSの免疫賦活特性
メタゲノム解析の結果、フィンランドとエストニアの乳児の腸内には、大腸菌とB. dorei LPSがしばしば共存していることが明らかになった。そこで、大腸菌のLPSを基本量とし、ヒト初代免疫細胞にB. doreiのLPSを比率を上げながら共培養し、LPS間の相互作用の可能性を検討したところ、B. doreiのLPSは、大腸菌のLPSと同じ比率で共培養されていました。そして、ベースラインの大腸菌LPS刺激に対する炎症性サイトカインの産生量の変化を測定したところ、大腸菌LPS刺激はサイトカインの産生を抑制した。サイトカイン産生は、ヒト初代PBMC（図5D）および単球由来樹状細胞（図5E）において、B. dorei LPSによって阻害された。これは、IAA血清陽性の乳児に典型的な抑制性LPSと刺激性LPSの比率の計算上の予測に対応するものであった（図S2）。PBMCにおけるサイトカイン産生と同様に、NFκB-ルシフェラーゼ活性はB. dorei LPSによって用量依存的に阻害された（図S7D）。また、臍帯血単核細胞を調べたところ同様の結果が得られた（図S7EおよびS7F）ことから、今回の観察結果は乳幼児のナイーブな免疫系の反応を反映していることが示唆された。以上の結果から、B. dorei LPSは、大腸菌由来のLPSによる免疫刺激を抑制する作用を持ち、その効力は生体内で観察されるLPSサブタイプの比率と一致していることが明らかとなった。

これまで、LPSの免疫原性にはLipid Aのリン酸化パターンが関与していることが提唱されていた。しかし、リピドA構造がB. doreiと同一であるが、大腸菌と同様の2つのリン酸基を有するB. thetaiotaomicronの変異株（ΔLpxF）からのLPSは、LPS免疫原性の増加やその阻害能の変化は認められなかった（図S7GおよびS7H）。このことは、リピドAのリン酸化状態が、我々の観測の基礎となるメカニズムである可能性が低いことを示唆している。

LPSによる免疫細胞の刺激は、エンドトキシン耐性として知られる現象である、繰り返しの免疫チャレンジに対する一時的な不応性を誘発する（Watson and Kim, 1963）。この免疫抑制機構はもともと敗血症で報告されたものであるが、衛生仮説（Biswas and Lopez-Collazo, 2009）が示唆する微生物曝露による免疫防御効果など、自然免疫無反応の他の多くの生理学的背景を支えていると考えられている。我々は、大腸菌および B. dorei の LPS サブタイプの、初代ヒト単球におけるエンドトキシン耐性を誘導する効力を評価した。大腸菌LPSへの最初の暴露は、試験したすべての条件付け用量で再刺激時のTNFα産生を妨げた（図5F）。一方、B. dorei LPSのコンディショニングは、最高濃度でもこれらの細胞でのサイトカイン産生を阻害せず、大腸菌LPSより少なくとも4桁低い効力に相当した。したがって、B. doreiが産生するLPSは、保護的なエンドトキシン耐性を誘導することができない。最後に、エンドトキシン耐性誘導期にB. dorei LPSを大腸菌LPSに添加すると、用量依存的に大腸菌LPSによるエンドトキシン耐性の確立が妨げられた（図5G）ことから、乳児腸内にB. doreiが存在すると、大腸菌LPSによる保護免疫耐性の確立が妨げられる可能性があることが示唆された。

LPSによる免疫抑制がin vivoでの自己免疫の発症と関連していることを示すために、T1Dの非肥満性糖尿病（NOD）モデルマウスにおいて、異なるLPSサブタイプの糖尿病発症への影響を評価した。E. coli LPSの腹腔内（i.p.）注入は、血糖値で測定されるように、発症の遅延と疾患の全体的な発生率の低下をもたらしました（図5H）。一方、B. dorei LPSは、模擬注射群（PBS）と比較して、糖尿病の発症を遅らせず、また発症率も低下させなかった。興味深いことに、図5Iに示すように、i.p. E. coli LPS注射の24時間後にNODマウスから分離した脾臓細胞は、さらなるin vitro自然免疫刺激に対して低反応であったが、B. dorei LPSはその応答を変えなかったことも明らかになった。このことは、大腸菌LPSはB. dorei LPSではなく、NODマウスのin vivoでエンドトキシン耐性を誘導できることを示している。これらの結果は、免疫賦活性LPSへの曝露が、免疫系の反応性を調節することにより、免疫介在性疾患からの保護に貢献することを示唆している。

考察
腸内細菌は、自己免疫疾患やアレルギー疾患の素因に影響を与える重要な因子であることを示唆する証拠が増えてきている。ここでは、環境的に異なる3つの集団間で乳児の腸内細菌叢の発達を特徴づけ、BifidobacteriumやLPS産生Bacteroides種などの重要な腸内微生物の有病率にこれらの集団間で著しい差があることを明らかにした（図6）。このことは、フィンランド人とエストニア人の初期微生物群集は、ロシア人と比較して、より多くのLPSを産生することを示唆しています。さらに、主要な微生物LPSのサブタイプにおける機能的および構造的な違いも明らかにした。特に、ヒトの腸内細菌群の異なる構成要素によって産生されたLPSは、TLR4、NFκBの活性化およびエンドトキシン耐性を刺激したり、積極的に抑制したりすることを明らかにしました。したがって、単なるLPSの量ではなく、異なるLPSサブタイプの性質と構成が、微生物由来のLPSカクテルによって引き起こされる免疫活性化のレベルを決定しているようである。重要なことは、大腸菌由来のLPSの免疫原性サブタイプを注射すると、NODマウスの生体内でエンドトキシン耐性が誘導され、これらのマウスの糖尿病の発生率が低下することである。これらの効果は、B. doreiのLPSでは観察されなかった。このことから、微生物由来のLPSは、これまで考えられていたよりも複雑な形で長期的な免疫抑制機構に影響を与える可能性があることが示唆された。

図6
図6
HMO利用菌の違いが免疫教育の違いにつながる
特定のバイオマーカーがないため、私たちのコホートにおけるロシア人とフィンランド人の乳児の早期LPS曝露の違いがどのような影響を及ぼしたかを判断することはできない。しかし、LPSがT1Dの病態生理に直接影響を及ぼすという命題は、マウスを用いた過去の研究によってさらに裏付けられている。例えば、Wenら（2008）は、マイクロバイオームの構成要素が免疫系の活動を調節し、その結果、NODマウスの疾患発生が変化することを証明した。さらに、LPSは、i.p.注射（Aumeunierら、2010）および経口ガベージ（SaiおよびRivereau、1996）により、NODマウスのT1D進行に直接的な影響を及ぼしている。NODマウスにおけるT1Dの発症および発生に対するマイクロバイオームの影響は、LPS/TLR4シグナル伝達経路の重要な構成要素であるTLR4およびMyD88に依存している（Guldenら、2013；Wenら、2008）。これらの研究を総合すると、腸内細菌が産生する異なるLPSサブタイプへの曝露が免疫調節に寄与し、自己免疫の経過を変化させるというモデルを支持するものである。

マウス研究の限界の一つは、マウスとヒトのLPS共受容体MD2の違いにより、ヒトでは拮抗性あるいは沈黙性のLPSサブタイプが、マウスでは刺激性と認識されることである（Hajjar et al.、2002）。しかし、マウスが大腸菌LPSに反応し、B. dorei LPSに反応しないことから、B. dorei LPSの非免疫原性は両種ともMD2とは無関係である可能性が示唆された。また、B. dorei LPSのヒトにおける拮抗作用の具体的な機序については、今後検討する予定である。

本研究は、3つの異なる乳児集団における微生物群集の形成について深いレベルで理解することを達成した。その結果、微生物分類群とDIABIMMUNE研究で収集された豊富なメタデータ（食事情報、出産形態、抗生物質の使用など）との間に多くの関連性があることが明らかになりました（表1参照）。アレルゲン特異的IgEやT1D自己抗体血清反応に対する微生物の変化など、微生物相の興味深い特徴を数多く含む我々の知見の包括的なリストは、http://pubs.broadinstitute.org/diabimmune で見ることができる。

私たちの分析は、マイクロバイオームから生物活性のある微生物産物を同定し、その特徴を明らかにするための、一般化できる発見と検証のプロセスをより広く実践するものです（図1C）。まず、表現型が異なる集団間で豊富に存在する微生物プロセスを特定し、それらを特定の微生物に割り当て、最終的に、試験管内で異なる免疫反応を誘導するこれらの経路内の構造的差異（例えば、LPS）を特定することから始めました。LPS生合成は最も強いシグナルの一つであり、免疫活性化との関連性が確立しているため、最初のメカニズム追跡調査としてターゲットとした。私たちの研究対象には、微生物の代謝（例えば解糖）から鉄の取り込みに至るまで、腸内の多くの機能的差異が追加されているため、将来的にはこれを拡大することが可能である。

我々は、HMO代謝が、生後1年間におけるビフィドバクテリウム優占とバクテロイデス優占の腸内細菌叢の確立および／または維持の潜在的要因であることを発見したが、これはおそらく、2つの属が共通のエネルギー源としてHMOを獲得するために競合するからである（Marcobalら、2011年）。母親も環境ストレス下にあり、その影響を乳児に移す可能性があることを考えると、微生物群集組成の決定におけるHMO代謝の重要な役割は、衛生仮説と一致する。経膣分娩では、初期の乳児の腸内コロニー形成者のほとんどが母親の腸に由来し（Backhedら、2015）、おそらく母乳中の微生物群によって統合される（Huntら、2011）。このコホートの乳児の臍帯血のトランスクリプトーム解析では、LPS曝露に対する反応に似たシグナルが検出され、これらの乳児が出生前から環境ストレスにさらされていることが示唆された（Kallionpaaら、2014年）。

衛生仮説の効果は、1つのメカニズムだけでなく、むしろ環境要因の複雑な相互作用によって媒介されている可能性が高い。これらの要因には、複数の異なる寄生虫、蠕虫、微生物、ウイルスに対する免疫応答が含まれる可能性が高い。今回、私たちは、その一因となりうる要因として、初期にコロニー形成する共生細菌の免疫原性を明らかにしました。私たちの微生物叢の様々なメンバーが単独で、あるいは組み合わせてどのように免疫系の発達に寄与しているかを理解することは、フィンランドのような国で増加している自己免疫疾患の傾向を変えるかもしれないプロバイオティクス介入法の開発にとって重要なステップとなるであろう。

実験手順
研究コホート
国際的なDIABIMMUNE研究は、フィンランド（エスポー）、エストニア（タルトゥ）、ロシア（ペトロザボーツク）で、自己免疫のリスクをもたらすHLA対立遺伝子（Larizzaら、2012；SollidとThorsby、1993）を持つ乳児を持つ832家族を募集した。新生児は、毎月の採便、定期的な検査、および母乳育児、食事、アレルギー、感染症、家族歴、薬物の使用、臨床検査に関するアンケートによって追跡調査された。この研究では、国によってHLAリスククラスの分布が類似しており、性別が一致していることから、国ごとに74人の乳児のデータが解析対象として選択された。

便サンプルの採取とDNA抽出
便サンプルは参加者の両親によって採取され、次に地元の研究センターに行くまで家庭用冷凍庫（-20℃）で保管された。その後、サンプルはドライアイスでヘルシンキのDIABIMMUNE Core Laboratoryに輸送された。その後、サンプルはDNA抽出のためにBroad Instituteに輸送されるまで-80℃で保管された。便からのDNA抽出は、QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN)を用いて行った。

16S rRNA 遺伝子のライブラリー構築、配列決定、解析およびショットガン・メタゲノミクス
16S rRNA遺伝子ライブラリーは、Kosticら（2015）の既述に従って構築した。メタゲノムライブラリーは、Nextera XT DNA Library Preparation kit（Illumina）を用いて調製した。16Sおよびメタゲノムライブラリーは、Illumina HiSeq 2500プラットフォームで配列決定した。16SデータはQIIMEで処理し、Greengenes分類マップに従って分類を割り当てた。メタゲノムデータは、分類学的プロファイリングのためにMetaPhlAn 2.2 (Truong et al., 2015)、機能的プロファイリングのためにHUMAnN2 (http://huttenhower.sph.harvard.edu/humann2) を使用して分析した。メタデータとの関連は、微生物群集データに適応した線形モデリングシステムであるMaAsLinを使用して解析した（http://huttenhower.sph.harvard.edu/maaslin）。メタゲノムサンプルは、サンプル間で種のコア遺伝子へのマッピングリードから検出されたSNPパターンをデコンボリューションすることによって種内株ハプロタイピングを行うConStrains (Luo et al., 2015) を使用して追加的に分析された。詳細な方法論については、Supplemental Experimental Proceduresを参照。

細菌株とLPS精製
本研究で使用した細菌株を表S3にまとめた。LPS精製は、ホットフェノール-水法（Hirschfeldら、2000年）により行った。

ヒト免疫刺激アッセイ
初代ヒトPBMC、in vitroで分化した単球由来樹状細胞、またはhTLR4を発現するHEK293-NFκBレポーター細胞を、様々な株から精製したLPSの指示用量で刺激した（Table S3）。初代細胞では、24時間後の上清中のサイトカイン濃度をサイトカインビーズアレイ解析（BD biosciences社）により測定した。HEK-293細胞では、刺激をLuciferase（BrightGlo、Promega。

エンドトキシン耐性アッセイ
ヒトPBMCから初代単球を分離し、B. doreiまたはE. coliから精製したLPSの存在下で18〜20時間インキュベートした後、細胞を洗浄しcRPMIで3日間培養した。単球は5μg/mlのザイモサンを標準用量で投与された。20時間後に上清を回収し、サイトカインビーズアレイヒト炎症キット（BD Biosciences社）を用いて、製造元の指示に従って分析した。

NODマウスにおける糖尿病発症
すべての動物実験は、NIBRのInstitutional Animal Care and Use Committee (IACUC)によって承認されたプロトコールの下で実施された。NOD/ShiLTjマウスはJackson Laboratoryから購入した。8週齢のマウス9〜12匹のグループに、大腸菌またはB. doreiから精製した10μgのLPSを週1回、4週連続で腹腔内投与した。非空腹時血糖値は毎週モニターした。実験者は、各グループの治療内容を盲検化した。300mg/dLを超える測定値が1回あった動物、または250mg/dLを超える測定値が2回連続した動物は、糖尿病と判断した。

NODマウスにおけるエンドトキシン耐性
5匹のマウスのグループに、大腸菌またはB. doreiのいずれかから精製した10μgのLPSをi.p.注射した。24時間後、脾臓細胞を分離し、ザイモサン（2.5μg/ml）でin vitroで再刺激した。TNFα濃度は24時間後にサイトカインビーズアレイで評価した。

補足資料
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謝辞
Tiffany PoonとScott Steelman（Broad Institute）には配列作成とサンプル管理に、Leon Murphy（Novartis）には実験デザインに、Katriina KoskiとMatti Koski（ヘルシンキ大学）にはDIABIMMUNE研究における調整とデータベース作業に、Chengwei Luo（Broad Institute）には株の解析に、Natalia Nedelsky（マサチューセッツ総合病院）には執筆と図作成における編集協力に感謝します。T.V.はJDRFとHecse（Helsinki Doctoral Programme in Computer Science）からの資金援助を受けている。H.L.とT.V.はThe Academy of Finland Center of Excellence in Systems Immunology and Physiology Researchからの資金援助を受けている。A.D.K.はHelen Hay Whitney財団のMerck Fellowとして、またBroad InstituteのLawrence H. Summers Fellowとして支援を受けている。M.K.は、欧州連合第7次フレームワークプログラムFP7/2007-2013（助成金202063）およびフィンランドアカデミー分子システム免疫学・生理学研究センター（決定250114）から支援を受けた。R.J.X.は、JDRF、米国国立衛生研究所（NIH）の助成金U54 DK102557、R01 DK092405、P30 DK043351、Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust、MIT Microbiome Informatics and Therapeutics Centerからの助成を受けています。

脚注
著者協力

T.V.とA.D.K.は16Sとメタゲノム解析のデータ作成を行った。A.D.K.とT.D.A.はメタゲノミクスデータを検証するためにqPCRを行った。E.H.とT.W.C.はLPS精製と免疫学的アッセイを実施し、データ解析を行った。T.V.、A.D.K.、E.H.、T.W.C.、E.A.F.、H.V、C.H、D.G、および R.J.X. が論文をまとめ、執筆しました。T.V., A.D.K., E.H., T.W.C., V.T., S.M., D.G., M.K., R.J.X.がプロジェクトリーダーを務めた。H.S.、A.-M.H.、A.P.、R.U.、N.D.、S.M.V.、M.Kがコホート研究の設計を行った。A.D.K.、E.H.、T.W.C.、J.A.P.、S.J.SがLPS研究のデザインを担当した。T.V.、A.D.K.、D.G.はDNAシーケンス実験とサンプル管理パイプラインを設計した。T.V.、E.A.F.、M.Y.、R.K.、J.I.、C.H.、D.Gが方法と研究開発をリードした。A.-M.H.、A.P.、V.T.、R.U.、S.M.、N.D.、J.I.、S.M.Vが臨床サンプルを収集した。H.L.、C.H.、D.G.、T.W.C.、M.K.、R.J.X.が治験責任医師となった。これらのデータのNCBI BioProject IDはPRJNA290380であり、一般に公開されているすべてのシークエンスデータを含む。著者は利益相反を報告しない。
出版社からの免責事項：この原稿は、出版が決まった未編集の原稿をPDFファイル化したものです。お客様に対するサービスとして、この原稿の初期バージョンを提供しています。この原稿は、コピー編集、組版、校正を経て、最終的な引用可能な形で出版される予定です。また、本ジャーナルに適用されるすべての法的免責事項が適用されることをご了承ください。

論文情報
セル Author manuscript; available in PMC 2017 May 5.
最終編集版として掲載
Cell. 2016 May 5; 165(4): 842-853.
オンライン公開 2016 Apr 28. doi: 10.1016/j.cell.2016.04.007
PMCID：PMC4950857
NIHMSID: NIHMS782558
PMID: 27133167
Tommi Vatanen,1,2,22 Aleksandar D. Kostic,1,3,4,22 Eva d'Hennezel,5,22 Heli Siljander,6,7,8 Eric A. Franzosa,1,4 Moran Yassour,1 Raivo Kolde,3 Hera Vlamakis,1 Timothy D. Arthur, 1 Anu-Maaria Hämäläinen, 9 Aleksandr Peet, 10 Vallo Tillmann, 10 Raivo Uibo, 11 Sergei Mokurov, 12 Natalya Dorshakova, 13 Jorma Ilonen, 14,15 Suvi M. Virtanen,16,17,18 Susanne J. Szabo,5 Jeffrey A. Porter,5 Harri Lähdesmäki,2 Curtis Huttenhower,1,4 Dirk Gevers,1,23 Thomas W. Cullen,5,23 Mikael Knip,6,7,8,19,23 and Ramnik J. Xavier1,3,20,21,23,*, on behalf of the DIABIMMUNE Study Group
1MITおよびハーバード大学のブロード研究所、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国
2アールト大学理学部コンピューターサイエンス学科、02150エスポー、フィンランド
3計算統合生物学センター、マサチューセッツ総合病院およびハーバード大学医学部、ボストン、マサチューセッツ州02114、米国
4ハーバード大学公衆衛生学部生物統計学科（米国マサチューセッツ州ボストン、02115年
5ノバルティス生物医学研究所（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ、02139
6ヘルシンキ大学小児病院、ヘルシンキ大学病院、00290ヘルシンキ、フィンランド
7ヘルシンキ大学糖尿病・肥満研究プログラムユニット、00290ヘルシンキ、フィンランド
8タンペレ大学病院小児科、33521タンペレ、フィンランド
9ヘルシンキ大学病院小児科、Jorvi病院、02740エスポー、フィンランド
10タルトゥ大学小児科、エストニア、タルトゥ大学病院、51014タルトゥ、エストニア
11タルトゥ大学トランスレーショナル・メディスン研究所免疫学部門、50411タルトゥ、エストニア
12ロシア連邦カレリア共和国保健社会開発省、レーニン通り6、185035ペトロザボーツク、ロシア連邦
13ペトロザボーツク州立大学家庭医学科，Lenin Street 33, 185910 Petrozavodsk, Russian Federation
14トゥルク大学免疫遺伝学研究所、20520トゥルク、フィンランド
15東フィンランド大学臨床微生物学教室、70211クオピオ、フィンランド
16国立保健福祉科学院保健局、00271ヘルシンキ、フィンランド
17タンペレ大学健康科学部、33014タンペレ、フィンランド
18ピルカンマー病院地区・小児保健研究センター、大学・大学病院、33521タンペレ、フィンランド
19フォルクハルサン研究センター、00290ヘルシンキ、フィンランド
20消化器ユニットおよび炎症性腸疾患研究センター、マサチューセッツ総合病院およびハーバード・メディカル・スクール、ボストン、マサチューセッツ州02114、米国
21マサチューセッツ工科大学マイクロバイオーム情報学・治療学センター、マサチューセッツ州ケンブリッジ、MA 02139、USA
*Correspondence: ude.dravrah.hgm.oiblom@reivax (R.J.X.)
22Co-筆頭著者
23Co-シニアオーサー
著作権表示
出版社からの免責事項
この記事の出版社による最終編集版はCellにあります。
この記事は訂正されています。第165巻1551ページの訂正箇所をご覧ください。
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