羊のルーメン微生物相に関する宿主遺伝的制御とその乳牛形質への影響
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公開日：2022年11月24日
羊のルーメン微生物相に関する宿主遺伝的制御とその乳牛形質への影響
ギレルモ・マルティネス・ボジオ、アナベル・メイナディエ、...クリステル・マリー・エタンチェリン 執筆者表示
Genetics Selection Evolution 54巻 記事番号：77（2022） この記事を引用する
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メトリクス詳細
概要
背景
羊の乳量と乳質組成は、ルーメン微生物叢が飼料を消化する際に生成する揮発性脂肪酸、長鎖脂肪酸、微生物タンパク質、ビタミンに依存している。牛の場合、宿主ゲノムはルーメン微生物叢の量には低いか中程度の遺伝的支配力を持つが、乳牛形質には高い支配力を持ち、遺伝率は0.30以上であることが示されてきた。反芻動物、特に羊において、ルーメン微生物叢の存在量と乳牛形質に同時に影響を与える遺伝的相関関係や量的形質座（QTL）についての情報は少ない。そこで我々は、ルーメン細菌量に対する宿主遺伝の影響、およびルーメン細菌量といくつかの乳用形質との遺伝的相関を定量化し、ルーメン細菌量と乳用形質の両方に関連するQTLを同定することを目指した。
研究成果
ルーメン細菌量の遺伝率は0～0.29であり、306のOTUの遺伝率は0と有意に異なることがわかった。ゲノムワイド関連研究により、Ovis aries染色体（OAR）11上に乳中α-ラクトアルブミン濃度に関するQTLが、また、ルーメン細菌量に関する6つのQTL、すなわち、ルーメン細菌に属する2つのOTUに関するQTLが明らかになった。プレボテラ属に属する2つのOTU（OAR3、5）、リケネレア属_RC9_gut_group（OAR5）、Ruminococcus（OAR5）、Clostridia目UCG-014属（OAR10）、CAG-352（OAR11）についてであった。これらの検出された領域は、いずれもルーメン細菌量や乳牛形質と同時に関連していないが、Prevotellaceae, Lachnospiraceae, F082 という細菌ファミリーが OAR3, 5, 15, 26 に共局在するシグナルを示している。
結論
ラカイン種の乳用羊では、ルーメン微生物叢の量は宿主の遺伝によって部分的に制御されており、乳タンパク質や脂肪酸組成との遺伝的関連性は低く、Prevotellaceae, Lachnospiraceae, F082の3つの主要細菌ファミリーは、OAR3、5、15、26との特異的関連性を示している。
背景
反芻動物が植物繊維を消化できるのは、ルーメン内の共生微生物群のおかげである。この複雑な微生物群は、主にバクテリアで構成されているが、古細菌、真菌、原生動物も含まれている。細菌は繊維質の飼料を分解・発酵させて揮発性脂肪酸（FA）、微生物タンパク質およびビタミンを生産し、食物脂質を変換し、これらはすべて動物が維持、成長および授乳のために使用します[1]。ルーメン微生物叢は、乳牛の生産形質 [2,3,4] と、最近では乳用羊 [5] に関連していることが示されている。さらに、一部の著者は、ルーメン微生物叢の存在量は、宿主ゲノムによって低から中程度に制御されていることを実証しており [2、4、6]、これは、乳牛形質と関連する特定の微生物群を有する動物を選択する機会を提供する可能性がある。しかし、現在までのところ、羊のルーメン微生物叢と乳形質との間の遺伝的関連性についての研究は発表されていない。
乳用ヒツジにおいて、微細な乳組成形質は高品質チーズの生産に極めて重要である。乳中に存在するFAはそのテクスチャーと栄養価に影響を与え、タンパク質はその凝固能に影響を与え、ひいては熱安定性とチーズ収量に影響を与える[7]。ヒツジの乳製品形質は0.30から0.60と中程度から高い遺伝率（h2）を有しており[7, 8]、ヒツジゲノムには乳製品形質に関連する多くの量的形質座（QTL）と主要遺伝子が同定されている[7, 9, 10, 11]。QTLの検出は、潜在的な候補遺伝子の同定や、これらの関連形質の遺伝的発現を決定する基礎的なメカニズムの解明に寄与している。しかし、ルーメン微生物量については、関連する可能性のあるゲノム領域についての情報は限られている。したがって、ルーメン細菌量と乳質形質に同時に関連するQTLを同定することは、羊のルーメン微生物叢と乳質形質の間の遺伝的リンクと共有代謝経路の基礎を明らかにすることに役立つ。
我々は、ラカイン種の雌羊において、ルーメン微生物叢の存在量は宿主の遺伝に影響され、共有代謝経路を通じて乳牛形質と遺伝的に関連していると仮定した。そこで、Martinez Boggio らによって以前に記述されたデータセットの使用に基づいて、Martinez Boggio et al. [5]のデータセットを用い、(1)ルーメン細菌量に対する宿主遺伝の影響を遺伝率の推定により定量化すること、(2)ルーメン細菌と乳業形質の遺伝的関連を両者間の遺伝相関の推定により特定・定量化すること、(3)ゲノム全体関連研究（GWAS）により両者に共通のゲノム領域を特定しルーメン細菌量および乳業形質における遺伝的変動を規定するQTLおよびその潜在的基盤を明らかにすることを目的として研究を実施することになった。
研究方法
データ構造
データは、2015年から2019年にかけてINRAE Experimental Unit of La Fage（UE 321 agreement A312031、Roquefort、France）から入手した。多産のLacaune乳牛（平均体重77±9kg）を室内で飼育し、平均90％の牧草の乾草とサイレージに10％の大麦（総量ベース）を加えた混合飼料に、約150gの市販タンパク質濃縮物（乾物ベースで粗タンパク質の38％）を搾乳パーラーで配布して給与した。濃厚飼料と飼料の割合は、雌牛の必要量を満たすために飼料の摂餌量に応じて毎年調整し、5年間同じ量の栄養分を摂取させた。5 年間の平均で、雌牛は 3.27kg の乾物を摂取し、その中には 16% の粗タンパク質と 30% の粗繊維が含まれていた。INRAE La Fage の群れの遺伝的構造は、Martinez Boggio ら [5]が記述しているように、2 群の独立した雌牛で構成され、両群とも乖離選抜されたものである。簡単に言えば、遺伝的選択は乳体細胞スコア（SCS）の推定育種価（EBV）[8]、または乳量の変動係数（CV milk）として表される乳汁持続性（PERS）のEBVに基づいて行われた。これら2つの系統に属する雌牛をそれぞれ調査した（N = 700）。分岐系統に属する雌牛のSCSに関する遺伝的差異（SCS+ /SCS-）はSCS EBVの2.19単位［すなわち、遺伝的標準偏差（SD）3.60］であり、PERSに関するそれ（PERS+ /PERS-）はCV乳EBVの5.52単位（すなわち、遺伝的SD 2.10) であった。95頭の雌牛が追加でデータセットに含まれ、これらは最も古いSCS系統に由来するが、現在、他の形質との関連の可能性を調査するために、実験的なLacaune集団におけるサイトカインシグナリング2の抑制因子（SOCS2）遺伝子の変異対立遺伝子（T）の頻度を高めるように選択された。この対立遺伝子は、2015年に同定された変異に対応し[12]、Lacaune乳用羊の体細胞数の遺伝的分散の12％を説明するものである。したがって、最終的な実験データセットは、SCS選択下の298頭（SCS+ 94頭、SCS- 204頭）、PERS選択下の402頭（PERS+ 200頭、PERS- 202頭）、SOCS2変異の選択下の95頭を含む795頭の雌羊からなるデータであった。
ルーメンサンプリングおよび細菌群集の分析
ルーメンサンプリングは、乳汁採取後3日以内に行った。各雌牛から、真空ポンプと医療用胃管を用いてルーメン内容物を採取した。次に、QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen Ltd, West Sussex, UK）を用いて、製造者の指示に従って、80μLのルーメンサンプルからDNAを抽出・精製し、FastPrep装置（MP Biomedicals, Illkirch, France）で事前にビーズビーティングステップを実施した。16S rRNA V3-V4領域は、以下のプライマーを用いて30サイクルの第1ラウンドPCRによって増幅された。フォワードF343（5′-CTTCCCTACGACGCTTCCGATCTACGGRAGGCAGCAG-3′；［13］）およびリバースR784（5′-GGAGTTCAGACGTGCTTCCGATCTTACCAGGTATCTAATCCT-3；［14］）であった。Illumina MiSeq技術では250塩基のペアエンドリードとなるため、1回の実行でV3およびV4領域全体の極めて高品質な全長リードを生成するオーバーラップリードを得た。R784プライマーに付加された6塩基対（bp）のインデックスを用いて、イルミナアダプターも含む自作プライマー（フォワード（AATGATACGGCGACCGAGATCTACACTCTTTCCACGAC）およびリバース（CAAGCAGAAGACGCATACGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGT）で12サイクルの第2ラウンドPCR中に単一多重化が行われた。得られたPCR産物を精製し、製造元の指示に従ってGenomic and Transcriptomic Platform (INRAE, Toulouse, France) でIllumina MiSeqカートリッジ (Illumina, San Diego, CA, USA) にロードした。ルーメンサンプリング、DNA抽出、アンプリコンシークエンスに関する詳細は、Martinez Boggioら[5]に記載されています。795 サンプルの配列は、FROGS 3.0 パイプライン [15] を用いて、以下のように処理した。(i) プライマーミスマッチ、300 bpより短い、または500 bpより長い配列の除去、(ii) キメラの除去 (iii) FROGSのSwarmによる配列の再グループ化、距離は1に等しいパラメータを選択 (iv) クラスターフィルター、すなわち、, (v)SILVAデータベース(バージョン138)[17]を用いて、操作上 の分類単位（OTU）に分類した（追加ファイル1：表S1参照）。アバンダンステーブルと分類学のファイルは、R (v4.0.2) [18]にインポートされました。コアマイクロバイオームは、複数のサンプルにわたるOTUの出現率に基づいて定量化し、OTUが出現しなければならないサンプルの割合は90％に設定された[19]。
乳製品形質の分析
成熟雌牛 795 頭について、乳量（MY）、Fossomatic Cell Counter（Foss, Nanterre, France）で定量した乳体細胞数、乳脂肪およびタンパク質含量（それぞれ FC および PC）の公式記録を、28 ～ 133 日間の乳期（DIM）に入手した。午前と午後の搾乳時に 1 頭あたり 2 個の牛乳サンプルを採取し、Interprofessional Milk Analysis Laboratory（アグロラボ社、フランス、オーリヤック）で分析用に送付した。牛乳の FC と PC は、Milko-Scan™ FT6000 装置（Foss, Nanterre, France）を用いて中赤外（MIR）技術で分析された。このように、MY、FC、PCを分析し、FCとPCは午前と午後の乳量記録で重み付けした平均値としている。
これらの公式生乳記録から、563 頭の雌牛の MIR スペクトルを検索し、毎日の乳タンパク質、すなわち、以下の微細なプロファイルを予測した。4種のカゼイン：α-S1-カゼイン（αs1-CN）、α-S2-カゼイン（αs2-CN）、β-カゼイン（β-CN）およびκ-CN）、2種の乳清タンパク質：α-ラクトアルブミン（α-ラクトアルブミン）およびβ-ラクトグロブリン（β-ラクトグロブリン）、ならびにFA：すなわち、以下のような乳タンパク質の微細プロファイルを予測するために、563頭の雌牛のMIRスペクトルを検索した。飽和FA（SFA）、例えば酪酸（C4：0）、カプロン酸（C6：0）、カプリル酸（C8：0）、カプリン酸（C10：0）、ラウリン酸（C12：0）、及びパルミチン酸（C16． 0）、オレイン酸（cis-9 C18：1）、ルーメン酸（cis-9 trans-11 C18：2）、α-リノレン酸（C18：3n-3）などの不飽和FA（UFA）である。乳タンパク質と FA は、午前と午後の乳量記録で加重平均した 100 mL あたりの g 数で表示した。決定係数（R2）の値で推定されるMIR予測精度は、乳タンパク質とFAについて、それぞれFerlandら[20]とFerland-Calmelsら[21]から取得されたものである。カゼインのR2は0.82以上、β-ラクトグロブリンとα-ラクトアルブミンのR2はそれぞれ0.77と0.26であり、SFAとFAのR2はそれぞれ0.77と0.26であった。SFAとcis-9 C18:1のR2は0.93以上、cis-9 trans-11 C18:2とC18:3n-3のR2はそれぞれ0.91と0.74であった。SCSとPERSの2系統からなる集団の遺伝的構造を考慮し、2つの形質、すなわち平均泌乳体細胞スコア（LSCS）とCVミルクを追加で解析に含めた。
遺伝子型判定
795 頭の雌豚を対象に、血液検体からの DNA 抽出と遺伝子型判定を行った。これらの795頭の雌牛のうち、743頭が中密度一塩基多型（SNP）チップ（Illumina Ovine SNP50 BeadChip: 54,241 SNPs）を用いて遺伝子型を決定され、314頭がLaboratoire d'Analyses Génétiques pour les Espèces Animales (Jouy-en-Josas, France) で、429頭が Aveyron-Labo (Rodez, France)で決定されました。残りの52頭の雌羊は、Neogen社（米国、Lansing）の低密度SNPチップ（Illumina Ovine SNP15: 16,681 SNPs）で遺伝子型を決定し、その後Lacaune乳羊ゲノム選択プログラムの枠内で中密度SNPチップにインピュテーションした [22]．遺伝子型は、SNPについては90％、個体については95％の最小コール率に基づき、マイナーアレル頻度5％未満のSNPを除外する品質管理を行った。最終的なデータセットには、773人のジェノタイピングされた個体と35,492の常染色体SNPが含まれている。マーカーはOvis aries (OAR) 26常染色体上に配置され、Ovis aries genome assembly Oar_v3.1 [23]にマッピングされた。SOCS2遺伝子の変異に対応するSNPは、OAR3の地図に含まれていた（129,722,200 bp）。
統計解析
微生物叢の存在量データは、組成データである[24]。各サンプルの存在量は、使用した配列決定技術によって課せられた総和に制約される。したがって、情報はOTUの存在比に含まれ、生のカウントは無関係である。このことは、存在量間の相互依存性を生み出し、組成データとして考慮する必要がある[25]。そこで、カウントを中心化した対数比に変換するという、コンポジショナルデータ理論[26]に基づくアプローチを適用した。ゼロは対数比変換に適合しないので、OTU存在量データは、R（v4.0.2）[18]のzCompositionsパッケージ[28]のcmultRepl関数を通して幾何ベイズ乗算法[27]でゼロインプットされました。その後、R (v4.0.2) [18]の compositions パッケージ [29] の clr 関数で中心対数比 (CLR) 変換を行い、分散が 1 になるように標準化した。以下、OTU 豊かさとは CLR 変換した豊かさのデータを指す。
分散成分の推定
環境要因の検定は、各形質の分散を解析することで行った。統計的な有意性はP < 0.05で定義した。10%以上のOTUの存在量に対して有意であった環境因子はモデルに含まれた(表1)。すべての形質について、サンプリング年（5段階：2015～2019）、泌乳回数（3段階：2、3、4以上）、子羊のサイズ（2段階：1、2以上）を固定効果、DIM（28～133 DIM）を共変数として検定した。また、DNAサンプルのシークエンスラン（6段階）、DNAサンプルあたりの総配列数（5段階：≦5000；＞5000と≦10,000；＞10,000と≦15,000；＞15,000と≦20,000；＞20,000配列）、ルーメンサンプリングの時間（午前と午後）、動物のルーメンサンプリングの順序（8段階）を固定効果としたOTUアバンドランスを検証した。泌乳期間ベースで表現される LSCS と CV 乳については、乳記録対照回数を固定効果として含めた（4 段階：試験日数 4～6 日、7 日、8 日、9 日）。
表1 オペレーショナル分類単位（OTU）と乳製品形質に関する動物モデルに含まれる環境効果
フルサイズの表
本研究では、選択された形質（LSCSとCV乳）を各モデルの最初の2つの形質として含む多重形質モデル [30] の使用により、選択中の集団の構造を説明した。2つの多重特性モデルが用いられた。第一に、遺伝率を推定するために、各OTUの存在量または乳製品の形質を第三の形質とする三特性モデルを用いた。第二に、OTUの存在量と乳製品の形質の間の遺伝的相関を推定するために、各OTUの存在量と乳製品の形質をそれぞれ第三および第四の形質とする四特性モデルを用いた。遺伝的相関は、標準誤差の2倍以上の絶対値を持つものは0と異なるものとした。
データは以下の多重形質動物モデルを用いて解析した。
⎡⎣⎢⎢⎢⎢y1y2y3y4⎤⎦⎥⎥⎥⎥=⎡⎣⎢⎢⎢X10000X20000X30000X4⎤⎦⎥⎥⎥⎡⎣⎢⎢⎢b1b2b3b4⎤⎦⎥⎥⎥+⎡⎣⎢⎢⎢W10000W20000W30000W4⎤⎦⎥⎥⎥⎡⎣⎢⎢⎢a1a2a3a4⎤⎦⎥⎥⎥+⎡⎣⎢⎢⎢e1e2e3e4⎤⎦⎥⎥⎥,
(1)
ここで、y1, y2, y3, y4 は、LSCS, CV 乳、3-trait モデルでは OTU 濃度または 1 つの乳製品形質、4-trait モデルでは OTU 濃度および 1 つの乳製品形質に関する観測値のベクトルであ る。b1、b2、b3、b4は各形質について表1に記載した固定効果のベクトル、a1、a2、a3、a4は相加遺伝効果のベクトル、e1、e2、e3、e4は残効のベクトルである。X1、X2、X3、X4はそれぞれ固定効果とベクトルy1、y2、y3、y4を関係づける入射行列、W1、W2、W3、W4はそれぞれ相加効果とベクトルy1、y2、y3、y4を関係づける入射行列である。モデルの仮定は a∼N(0,A⊗P) and e∼N(0,I⊗R) で、⊗は二つの行列の直積、Aは血統関係行列、Iは恒等行列、PとRはそれぞれランダム加法効果と残差効果の遺伝分散-共分散行列を示す。ラコーネ種の血統は5世代の祖先までさかのぼる（N = 4296）。解析はBLUPF90+ソフトウェアで、OPTION法VCE [31]を用い、初期分散成分を得るためにEM-REMLの初期ラウンドを100回含むことにより行った。収束基準はBLUPF90ソフトウェアのデフォルトで設定されている1e-10を使用した。
2059 OTUの遺伝率推定値の有意性を検証するために、遺伝的制御がないという帰無仮説に対する経験的有意閾値を推定した。OTUについては、個体間でその存在量をランダムにシャッフルすることで帰無仮説を求めた。2つのOTU（ゼロが多いOTUと少ないOTU）を選び、ランダムシャッフルを10,000回行った。各順列とOTUについて、式(1)で示される3-traitモデルを用いてOTU存在量の遺伝率を推定した。誤差を5%とするため、遺伝率の推定値を高い順に並べ、上位5%のうち低い方の値を保持し、両OTUで得られた有意閾値は0.10となった。
遺伝率が0から有意に異なるOTUの中で、特定の細菌属が全OTUと比較して過大または過小に存在するかどうかを判断するために、フィッシャーの正確検定を用いて、両グループにおける同属のOTUの割合をP < 0.05で検定した。
ゲノムワイド関連研究
乳牛形質とOTU量のゲノムワイド関連研究（GWAS）は、シングルステップゲノムベスト線形不偏予測（ssGBLUP）アプローチを用いて実施した[32]。以下の単一形質モデルを使用した。
y=Xb+Wg+e,
(2)
ここで、y は OTU の存在量または乳製品の形質に関する観測値のベクトル、b は表 1 に記述した固定効果のベクトル、g は加法的遺伝効果のベクトル、e は残差のベクトルである。XとWはそれぞれbとgの入射行列である。モデルの仮定は、g∼N(0,Hσ2g)で、Hは血統とゲノムの関係を組み合わせた行列[33]、σ2gは相加的分散、e∼N(0,Iσ2e)で、Iは恒等行列、σ2eは残留的分散である。血統-ゲノム結合関係行列Hは以下のように構成した。
H=⎛⎝⎜⎜A11−A12A−122A21+A12A−122GA−122A21GA−122A21A12A−122GG⎞⎠⎟⎟,
(3)
は、遺伝子型別動物（「2」と表示）から非遺伝子型別動物（「1」と表示）へのゲノム関係G＝ZZ′／2∑pi（1-pi）［34］を投影したものである。行列A=[A11A21A12A22]は血統に基づく関係行列であり、ゲノム関係行列GはG=(1-α)(a+bZZ′2∑piqi)+αA22として構築し、aおよびbはGおよびA22の平均近交および平均関係を等化するために選び、αは小さな値(0.05)とした [34,35,36]．分散成分はBLUPF90+にOPTION法VCEを使用して推定した[31]。
式(2)のssGBLUPモデルを解いた後、式(4)のように繁殖値の推定値を逆解析してSNP効果を推定し[32, 37]、式(5)のように各SNPのP値を逆解析して推定した[38]。
aˆ|gˆ=(1-α)bZ′12∑piqiG-1gˆ2,
(4)
Pvaluei=2(1-Φ(∣aˆisd(aˆi)∣∣)) となる。
Var(aˆi)=12∑piqi(1-α)bz′iG-1(Gσ2g-Cu2u2)×G-1zi(1-α)b12∑piqi,
(5)
ここで、aˆはSNP効果の推定値、aˆiは各SNP iの推定値、gˆは繁殖値の推定値、Cu2u2行列はジェノタイピングした動物のEBVの予測誤差共分散を含んでいる。SNP効果およびP値はBLUPF90+およびPOSTGSF90を使用して計算した[31]。
Rのp.adjustパッケージ（v4.0.2）[18]の偽発見率（FDR）を用いて多重検定の補正を行った。各形質に対して、P < 0.10のゲノムワイドSNP有意性閾値とP < 0.30の示唆的閾値を適用した。ある領域でリードSNPを同定した後、1000メガ塩基対（Mbp）未満の距離にあり、ピークの上3分の1に含まれる有意なSNPを同じQTL領域内でグループ化した。RのCMplotパッケージ（v4.0.2）[18]を用いて、-log10（P値）をY軸にしたマンハッタンプロットを作成した。
同一染色体上、同一位置で検出された有意なSNPについて、対立遺伝子置換効果を推定した。以下のような単一形質モデルを用いた。
y=SNP+Xb+Wa+e である。
(6)
ここで、y は OTU 豊かの観測値のベクトル、SNP は y に対して検出された有意な SNP を固定効果として、SNP が第一対立遺伝子に対してホモ接合、ヘテロ接合、第二対立遺伝子に対してホモ接合の場合にそれぞれ 0, 1, 2 とコード化、b は OTU 豊かさの表 1 で述べた固定効果、a は付加遺伝効果、e は残差のベクトルである。XとWはそれぞれbとaの入射行列である。モデルの仮定はa∼N(0,A)、e∼N(0,I)で、Aは血統に基づく関係行列、Iは単位行列である。
ゲノムに沿った連鎖不平衡（LD）は、各染色体上の2つのSNPに対する対立遺伝子数の二乗相関として計算した。表現型分散の説明割合は、隣接する20のSNPからなるウィンドウ分散を定義し、本研究で定義された各QTL領域について、各SNPについて計算した。LDと説明される分散はPOSTGSF90[31]を用いて計算した。
有意なSNPについて同定された遺伝子は、Ovis ariesゲノムアセンブリOar_v3.1 [39]に基づいて、BioMartウェブインタフェースを用いてEnsemblデータベースから検索された。その後、DAVID機能アノテーションツール[40]を用いて、生物学的プロセスを含む過剰発現したGene Ontology（GO）生物学用語、およびKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）パスウェイを解析した[41]。
結果
バイオインフォマティクス解析の結果、795 頭の雌牛のルーメンサンプルから得られた 9,552,103 個の DNA 配列のうち、63%が保持されていた。その結果、751から168,785の配列で表される2059のOTUが存在し、1OTU当たりのDNA配列の中央値は1761であった。未知種頻度が95%であったため、最も細かい分類レベルは属のレベルであった。
全体として、795のルーメンサンプルから得られた2059のOTUは、11門、56科、112属に帰属していた。全サンプルの全配列に対する割合で表すと、最も代表的な門はBacteroidota（51％）、Firmicutes（44％）、Proteobacteria（3％）であった。次に分類学的なレベルでは、Prevotella属に代表されるPrevotellaceae（38%）、Lachnospiraceae（18%）（40属）、Ruminococcus属に代表されるRuminococcaceae（9%）、NK4A214_グループに代表されるOscillospiraceae（5%）、1属で表される3科が最も豊富であった。ChristensenellaceaeはChristensenellaceae_R-7_group（5％）、RikenellaceaeはRikenellaceae_RC9_gut_group（4％）であった。OTU存在量表におけるゼロ（ルーメンサンプルで検出されなかったOTU）の割合は、平均37.5％であった。
分析した乳製品の形質についての記述
本研究で分析した乳製品の形質に関する記述統計量は、表 2 に示すとおりです。各OTUの分散推定には、集団遺伝構造を考慮し、LSCSとCVミルクを含めた。
表2 Lacaune種雌牛の乳用形質の記述統計量と遺伝率（h2）。
原寸表
ルーメン菌の遺伝率
ルーメン細菌量の遺伝率は0〜0.29±0.07で、平均は0.04±0.03であった（追加ファイル2: 表S2参照）。これらの遺伝率の推定値に基づいて、0から有意に異なる遺伝率（h2 > 0.10、計算された経験的閾値による）、平均0.15 ± 0.04を持つ306 OTUのグループを発見した。これらの306 OTUのうち、OTUに占める割合で表すと、主な門はBacteroidota（61%）、Firmicutes（34%）、Spirochaetota（2%）であり、最も多く表れた10属は表3の通りであった。
表3 操作上の分類単位（OTU）にわたる平均・最大遺伝率、および属代表性レベル
原寸表
フィッシャーの正確検定に基づき、遺伝率が有意に高いOTUのうち、Prevotella属が有意に過剰発現していた（306 OTU中92）（P > 0.05）。
ルーメン細菌と乳牛形質間の遺伝的相関関係
306 個の OTU のそれぞれと、本研究で対象とした 18 種類の乳牛形質のそれぞれとの間の遺伝的相関を推定した。その結果、5508個の遺伝的相関が得られ、そのうち301個（すなわち、5％）が有意であった（すなわち、標準誤差の2倍より大きいものであった）。これは、1つまたは複数の乳製品形質と有意な遺伝的相関を示した96個のOTU存在量に相当する。81個のOTUはFCおよび乳FAと相関し（追加ファイル3：表S3参照）、56個のOTUはPCおよび乳タンパク質と相関し（追加ファイル4：表S4参照）、これら96個のOTU群のうち41個が両方の形質と相関していた。MYについては、ルーミン細菌との有意な遺伝的相関は見出せなかった。
乳脂肪量および脂肪酸との遺伝的相関関係
日脂肪量および乳脂肪酸は、17科に属する26属のOTUと有意な遺伝的相関を示した。有意な遺伝的相関が最も多く見られた菌種はPrevotellaceae, LachnospiraceaeおよびRuminococcaceaeであった（Fig.1）。有意な遺伝的相関は-0.97から-0.34、0.35から0.99の範囲であった。ミルクSFAはミルクUFAよりも多くの相関するOTUを共有していたが、C18:3n-3は最も多くのOTU（42 OTU）と相関するFAであった。
図1
図1
操作的分類単位（OTU）と脂肪含量（FC）および乳脂肪酸の間の遺伝的相関ネットワーク、すなわち、酪酸（C4:0）、カプロン酸（C6: 酪酸（C4：0）、カプロン酸（C6：0）、カプリル酸（C8：0）、カプリン酸（C10：0）、ラウリン酸（C12：0）、パルミチン酸（C16：0）、オレイン酸（c9-C18：1）、ルメン酸（c9t11-C18：2）、αリノレン酸（C18：3n-3）です。ノードはOTU（対応するファミリーに関連した色で、1つのOTUを持つ希少なファミリーは表現されていない）と乳製品の形質（白）を表している。ノードの直径は遺伝的相関の数に比例し、エッジの太さと色はそれぞれ遺伝的相関の値（- 0.97 から - 0.34 と 0.35 から 0.99 ）と符号（緑は正の符号、赤は負の符号）を表している。
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牛乳のSFA（C4:0〜C16:0）は41のOTUと相関し、そのうち26のOTUは少なくとも1つのSFAと正の相関があった。また、5つのOTUはすべてのSFAと相関し、遺伝的相関は様々であった。C8:0, C10:0, C12:0からなる密接なクラスター群は、Prebotellaceae、Lachnospiraceae、Oscilllospiraceaeファミリーの12 OTUと正の相関を共有していた（Fig. 1）. 牛乳のUFA（cis-9 C18:1, cis-9 trans-11 C18:2, C18:3n-3）は62のOTUと相関し、そのうち半数はPrevotellaceaeとRikenellaceaeに属していた。Prevotellaceae科の2つのOTUはすべてのUFAと相関したが、逆の相関符号を示した。
乳タンパク質含量およびタンパク質と遺伝的相関関係
日量タンパク質含量および乳タンパク質は、17科に属する23属のOTUと有意な遺伝的相関を示した。有意な遺伝的相関が最も多く見られた菌種はPrevotellaceaeとLachnospiraceaeであった（図2）。有意な遺伝的相関は-0.99から-0.33、0.36から0.98の範囲であった。図2には、20 OTUと排他的に相関するα-ラクトアルブミンに代表される形質と、OTUとほとんど負に相関するカゼイン（αs1-CN、αs2-CN、β-CN、κ-CN）およびβ-ラクトグロブリンのグループの2つのグループを示している。
図2
図2
OTUと乳タンパク質（α-S1-カゼイン（aS1-CN）、α-S2-カゼイン（aS2-CN）、β-カゼイン（b-CN）、κ-カゼイン（k-CN）、α-ラクトアルブミン（a-LAC）、β-ラクトグロブリン（b-LG）間の遺伝子相関関係ネットワーク。） ノードはOTU（対応するファミリーに関連した色で、1つのOTUを持つ稀なファミリーは表現されていない）と乳製品の形質（白）を表している。ノードの直径は遺伝的相関の数に比例し、エッジの太さと色はそれぞれ遺伝的相関の値（- 0.99 から - 0.33; 0.36 から 0.98 ）と符号（緑は正の符号、赤は負の符号）を表している。
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全てのカゼインが30個のOTUと相関し、そのうち5個は3個以上のCNと負の相関があった。Microbacteriaceae科に属するLeifsonia OTU1479は全てのCNと負の相関を示し、Lachnospiraceae科とPrevotellaceae科の4つのOTUは2つのCN（αs2-CNとκ-CN）とも相関があった。乳清タンパク質（α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリン）は47のOTUと相関し、そのうち8つは共通であった。Prevotellaceae、Lachnospiraceae、Muribaculaceaeの4つのOTUは、α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリンと同じ相関符号を示していた。
コアマイクロバイオーム
コアマイクロバイオームは275 OTUで全OTUの13％を占め、Prevotella属、Christensellaceae_R-7_group、Ruminococcus属など、最も多く存在する属に属していた。コアマイクロバイオームでは、44 OTUが有意な遺伝性（h2 > 0.10）を示し、遺伝性OTUの14％を占め、13 OTUは乳牛形質と遺伝的に相関していた。
乳牛形質とルーメン菌のGWAS
乳牛形質のGWAS
本研究に含まれる18の乳牛形質それぞれについて、GWASを実施した。GWASの結果を表4に示すが、乳量、α-ラクトアルブミン、α-S2-カゼイン、乳中カプロン酸（C6：0）およびカプリル酸（C8：0）濃度で22の有意なSNP（FDR＜0.10）が検出された。
表4 乳製品形質に関するゲノムワイド関連研究からの有意なSNPs
フルサイズの表
最も多くの有意なSNPがα-ラクトアルブミンについて7本の染色体上で検出され、OAR11にQTLが存在した（図3）。OAR11上のこのQTLは32.6から34.2Mbpのゲノム領域に位置する8つの有意なSNPを含み、そのLDスコアは0.24から0.52であった。QTL領域は表現型分散の2.5%を説明し、リードSNP（rs402411249）は最大-log10(P値)で5.77を示した。OAR6では、100.1～101.3Mbpの領域に1つの有意なSNPと1つの示唆的なSNPが検出され、LDスコアは0.56であった。
図3
図3
α-ラクトアルブミンのゲノムワイド関連研究のためのマンハッタンプロット。赤の水平線と灰色の破線は、それぞれ偽発見率の閾値0.10と0.30を示す。オレンジ色の点は、QTL領域内のSNPを示す。
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α-S2-caseinについては、OAR6上に有意なSNP（rs423428584）を検出し、全乳牛形質について本研究で得られた最も高いP値（- log10（P値）8.18）を示した。
SFA C6:0とC8:0については、OAR17上に同じ有意なSNP（rs405420878）が検出された（表4）。また、C6:0については別の有意なSNP（rs410355614）が、C4:0については示唆的なSNPとして-log10（P値）5.52で検出された（図4）。しかし、これらのSNP間のLDスコアは0.10未満であった。C8:0については、OAR2上に有意なSNP（rs415371608）が見つかり、これはC10:0に対する示唆的なSNPとして-log10（P値）5.25で同定されている。
図4
図4
酪酸（C4:0）、カプロン酸（C6:0）、カプリル酸（C8:0）のゲノムワイド関連研究のためのマンハッタンプロット。赤の水平線と灰色の破線は、それぞれ偽発見率の閾値0.10と0.30を示す。緑の点は形質間で共通するSNPを示す。
フルサイズ画像
乳量については、OAR15に有意なSNPが検出されたが、SOCS2遺伝子の変異に対応するSNPを含むOAR3にはシグナルが確認されなかった。
ルーメン菌のGWAS
遺伝率が0と有意に異なる306のOTU存在量それぞれについてGWASを行ったところ、56のOTUについて22の染色体に分布する94の有意なSNP（FDR < 0.10）を検出した（追加ファイル5：表S5を参照）。検出された94SNPsについて、様々なGO生物学的プロセスやKEGGパスウェイに関与する42の候補遺伝子を回収した（追加ファイル6：表S6参照）。さらに、表5に示すように、OAR3, 5, 10, 11上に6つのQTLが同定された。
表5 乳製品形質と共局在する染色体上のルーメン菌のゲノムワイド関連研究からの有意なSNPs
フルサイズの表
有意なSNPを持つ56のOTU群は、3つの門、11の科、23の属に属した。OTUの割合で表すと、Prevotellaceae科が最も多く、23 OTU（41％）、そのうち19 OTUがPrevotella属で、Lachnospiraceae（20％）、Ruminococcaceae（9％）がそれに続いた。
宿主ゲノムで検出され、ルーメン細菌量と関連する94個の有意なSNPについて、いくつかのゲノム領域でOTU量と乳牛形質に関するQTLと有意なSNPが示された（表5）。
OAR3
OAR3では、Prevotella OTU196のQTLが検出され、その中には2つの有意なSNPが高いLD（LDスコア0.67）で含まれていることが判明した。SNP rs419358934 は Prevotellaceae_UCG-001 OTU906 と共局在するシグナルを示し、その SNP のアレル置換効果は両方の Prevotellaceae OTU で同じ方向に変化した。さらに、各OTUについて、2つの候補遺伝子が同定されたQTLの外側に位置する、他の2つの有意なSNPを検出した（表5）。(1) サイトカインの負の調節（GO:0001818）、翻訳の負の調節（GO:0017148）、mRNAスプライシングの調節に関与する細胞毒性顆粒関連RNA結合タンパク質（TIA1）遺伝子（GO: 0048024）、および（2）ナチュラルキラー細胞の活性化（GO:0030101）、インターフェロンγ産生の正の調節（GO:0032729）および細胞シグナルと炎症プロセス（KEGG：oas04060）に関与するインターロイキン18受容体（IL18R1）遺伝子が挙げられる。
OAR5
OAR5 では、Prevotella OTU1843、Rikenellaceae_RC9_gut_group OTU546、Ruminococcus OTU1191 の3つの QTL が検出された。OTU1843のQTLは2つの有意なSNPを含み、そのうち1つ（rs402307868）はPossible_genus_sk018 OTU1631と共局在するシグナルを示していた。共焦点シグナルを持つSNPの対立遺伝子置換効果は、Prevotella OTUとPossible_genus_sk018 OTUで対照的なサインを示していた。Rikenellaceae_RC9_gut_group OTU546のQTLは、高LD（LDスコア0.74）の2つの有意なSNPを含んでいる。ルミノコッカスOTU1191のQTLは0.04Mbp離れたところに2つの有意なSNPを含むが、その領域のLDスコアは非常に低かった（< 0.10）。SNP rs418870684は新規遺伝子ENSOARG00000025325と関連していた。
OAR6
OAR6では、5つのOTUに対して6つの有意なSNPが検出されたが、QTLは検出されなかった。α-S2-caseinで有意なSNPが検出された領域（81.2Mbp）では、Acetitomaculum OTU612で2つの有意なSNPを検出したが、LDスコアが低く（< 0.20）、これら2つの形質で共有するSNPは検出されなかった。
OAR10
OAR10において、Clostridia目に属するOTU1386 UCG-014について、16.2Mbpに2つの有意なSNPを持つQTLが検出された。この2つの有意なSNPは高LD（LDスコア0.78）の領域に位置し、同じ遺伝子であるE3ユビキチン・プロテイン・リガーゼ（W5PCZ6_SHEEP）が検出された。W5PCZ6_SHEEP遺伝子は、ユビキチン依存性タンパク質異化過程 (GO:0006511)、多細胞生物の発生 (GO:0007275)、タンパク質安定性の制御 (GO:0031647) に関与しています。
OAR11
OAR11では、Ruminococcaceaeに属するCAG-352 OTU304に対して、2つの有意なSNPが完全LDで存在するQTLが検出された。しかし、この OTU304 の QTL は OAR11 上で検出されたα-ラクトアルブミンの QTL とは離れた場所にあった（32.6-34.2Mbp）。また、この QTL に含まれる候補遺伝子 HELZ は、GO の生物学的プロセスや KEGG パスウェイとは関連性がなかった。
OAR15
OAR15では、3つのPrevotella OTUで同じ有意なSNPであるrs409362751が検出され（表5）、アリル置換効果は3つのPrevotella OTUで同じように変化していることが確認された。このSNPについて、細胞接着の負の制御 (GO:0007162)、脂質の異化過程の負の制御 (GO:0050995)、代謝経路 (KEGG: oas01100) に関与する候補遺伝子phosphodiesterase 3B (PDE3B) を同定した。
OAR26
OAR26では、F082ファミリーに属するPrevotella OTU1336, Prevotellaceae_UCG-001 OTU906, OTU167で同じ有意なSNP、rs412469804が検出された。2つのPrevotellaceae OTUの対立遺伝子置換効果は同じ方向に変化したが、F082 OTU167では逆方向であった。
上記に示したように、OAR3, 5, 15, 26上の4つのSNPは同時にPrevotellaceae, F082, Lachnospiraceaeファミリーに属するOTUのルーメン存在量に影響を与えた（Fig. 5）. しかし、本研究で対象とした18の乳牛形質との間に共有ゲノム領域は検出されなかった。
図5
図5
ルーメン細菌量のゲノムワイド関連研究のマンハッタンプロットは、染色体3、5、10、11上の量的形質座（QTL）を示す。水平の赤線は、偽発見率の閾値0.10を示す。操作的分類単位(OTU)。Prevotella OTU196、Prevotella OTU1843、Rikenellaceae_RC9_gut_group OTU546、Ruminococcus OTU1191、Clostridia UCG-014/unknown family/unknown genus OTU1386、およびCAG-352 OTU304
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考察
本研究では、少なくとも部分的には、ラカイン乳牛のルーメン微生物叢の豊富さは宿主ゲノムの制御下にあり、共通の代謝経路をコードする共通のゲノム領域を通じて乳牛形質と遺伝的に関連しているという仮説を立てた。
ルーメン細菌と乳牛形質の遺伝性
ラコーンの乳牛で得られた結果は、ルーメン細菌量が宿主の遺伝学によって部分的に制御されていることを示すものであった。OTU の遺伝率は、ほとんどの値が 0 に近い非対称な分布を示したが、15% の OTU（2059 OTU 中 306 OTU）が低～中程度の遺伝率（0.10～0.29）を示し、これは他の反芻動物のルーメン細菌について報告されている結果 [2, 4, 6, 42, 43] と同様であった。しかし、遺伝率の範囲や有意な遺伝率を持つ OTU の割合には、いくつかの違いがある。例えば，Diffordら[2]とZhangら[6]は，同じ750頭の乳牛のデータセットを用いて，5～10％の属で遺伝率が0.17～0.25となり，2～6％のOTUで遺伝率が0.16～0.44と有意な推定値を得た．これらの結果は、16S rRNA遺伝子のシーケンスデータに基づくもので、我々がOTUについて見出した遺伝率の範囲と同様であるが、著者らは有意な遺伝率を持つOTUの割合をより低く得ている。また、異なる分類学的レベルでの作業によって観察された違い、すなわち、これらの著者らは属レベルでより低い遺伝率を報告している。しかし、Martínez-Álvaroら[43]は、ターゲットを絞らない「ショットガン」シーケンスを用いて、16%の属で有意な遺伝率が得られ、最大遺伝率0.60という高い遺伝率の幅があった。
306のOTUは、Liら[4]、Wallaceら[42]、Zhangら[6]が報告したように、BacteroidotaやFirmicutesなど、最も豊富な系統に属していた。さらに、属の代表性という点では、遺伝率が有意に高いOTUの中で、平均推定値0.15±0.04を示し、文献上では遺伝率の高い属とされるPrevotellaが過剰に存在した[4, 42]。マルティネス・アルバロら[43]が発表した結果との主な違いは、Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutesが主な門派を占めているが、これらの違いは、サンプル内のすべての微生物ゲノムを明らかにする「ショットガン」シーケンス技術によるものと考えられる。
一般に、研究間で観察される腸内細菌の違いは、いくつかの要因に起因すると考えられる。(1)使用されたシーケンス技術、これは下位の分類学的レベル（例えば、種）での所属を得るのに十分な情報を与えない、つまり、ほとんどの研究が属レベルで結果を報告し[2, 4, 6, 42]、我々の研究のようにOTUレベルではほとんど報告しない。 (2) DNA配列のバイオインフォーマット処理とその後の分析、これは分析すべきOTU総数およびそれらの所属に影響を与える（例えば、, Diffordら[2]とLiら[4]は16S rRNA遺伝子のV1-V3領域を増幅しており、V3-V4領域を増幅したため、彼らのOTUの一部は我々の研究で得られなかったことを意味する）、（3）分析に含まれる個体数、これは通常遺伝率推定の精度に影響を与え、より少ない動物を分析した研究との差を説明する[43]、（4）研究対象とする動物の種（bovine vs. sheep. 4）Hendersonらによって証明されたように、細菌量に差がある動物種（ウシとヒツジ）を調査したこと[44]。特に、反芻動物を対象とした他の研究との相違にもかかわらず、宿主によって遺伝的に制御されている細菌OTUの割合が最も高いことが報告された。
しかし、Wallaceら[42]が行ったように、これらの遺伝的OTUのみに基づいてコアマイクロバイオームを宣言することはできない。なぜなら、我々はほとんどの動物に存在する306 OTUのうち44 OTUのみを取得し、コアおよび全微生物で有意な遺伝性を有するOTUの同じ割合が観察されたからである。この結果は、コア微生物群は同じ環境にいる動物間で安定している微生物で構成されており、動物間で微生物が水平伝播する可能性を示唆しているため、予想されることである。したがって、宿主遺伝的に制御されたOTUのうち14％しかコア微生物叢に含まれないという結果は、ほとんどの微生物が環境から繰り返しやってきて、親からの垂直伝播ははるかに少ないことを意味している。
我々の知る限り、本研究は、同一農場の約800頭の乳牛から、同一の飼育条件でルーメン菌の遺伝的パラメータを推定した最初の研究である。
日乳量形質については、MYで0.28±0.06、PCで0.57±0.06、FCで0.59±0.06という中程度から高い遺伝量が得られた。初産牛を対象とした大規模な先行研究 [7, 8] と比較すると，我々の推定値は，年間ベースでは Rupp ら [8] の MY (0.28) と PC (0.51) に近い値であるが FC (0.41) は高く，日ベースでは Boichard ら [7] (PC 0.39, FC 0.29) と同じ値であった．
乳成分形質では，乳FAはBoichardら[7]がLacauneの雌牛で報告したように，中程度から高い遺伝率を示した．また，SFA は UFA よりも高い遺伝率を示した（Boichard ら[7]および乳牛の乳 FA をウェットラボ法で測定した Buitenhuis ら[3]）．乳タンパク質は中程度（α-ラクトアルブミンで 0.36 ± 0.08 ）から高程度（α-S2-カゼインで 0.68 ± 0.07 ）の遺伝率を示し、Lacaune 雌牛 [7] の報告よりわずかに高い。α-ラクトアルブミンの遺伝率の推定値は Boichard ら [7] と同様に低く、これは MIR スペクトル予測に基づくこの形質の精度が低く、R2 が 0.26 であるためと思われる[20]。したがって、α-ラクトアルブミンの結果は慎重に解釈する必要がある。
ルーメン細菌と乳牛形質との遺伝的相関関係
ルーメン細菌は宿主にとって極めて重要であることは否定できず、乳脂肪とタンパク質生産に貢献するFAと微生物アミノ酸を提供する[45]。しかし、最も豊富なPrevotellaceae、Lachnospiraceae、Ruminococcaceaeから96の遺伝的OTUのみが、一つ以上の乳FAおよびタンパク質と中程度から高い遺伝的相関（絶対値は0.33から0.99の範囲）を有していた。16S rRNA 遺伝子配列決定の精度が種レベルで低いことや、800 頭の雌牛という小規模なデータセットに基づく推定遺伝的相関の数が多い（5500 以上）ため、標準誤差が大きいものを除外しても、いくつかの偽相関が生じる可能性があるという本研究の限界にもかかわらず、これらの相関の全体的定量化は、ルーメン微生物相と表現型の関係を理解する上で興味深いものであった。
遺伝性OTUの乳製品形質への影響は弱く、それは我々の研究で得られた有意な遺伝的相関の数が少ないこと（平均301）、すなわち推定値全体の5％に過ぎないことからも明らかである。この数字は、コアマイクロバイオームにおいて乳製品形質と有意に関連したOTUの数を評価すると、96 OTU中13 OTUのみが遺伝的に関連したため、さらに小さくなった。しかし、興味深いことに、これらのOTUの中には、コアマイクロバイオームの一部であることから、宿主に関連する機能を持つものがあるかもしれない。ルーメン細菌と乳質形質の遺伝的相関は、数は少ないものの中程度から高い値を示しており、遺伝的影響が表現型に直接ではなく、微生物叢の存在量を通じて間接的に影響を与えることを目的とする場合、微生物叢組成を遺伝モデルに含めることが有用である可能性が示唆された。この点に関して、一部の著者は、微生物叢を介したこの間接的な遺伝的影響を考慮する方法論を提案している[46,47,48]。
我々の結果は、遺伝的なOTUのほとんどが乳製品形質に影響を与えないことを示している。このため、主に乳FAとタンパク質に見られる遺伝的関連は、微細な乳組成形質を改善するための選択基準として用いることは難しいが、このことは、関心のあるこれらの表現型に対する間接的遺伝効果を推定するための追加の情報源として遺伝モデルへ含めることを制限するものではない。
乳製品形質とルーメン菌のGWAS
遺伝性の OTU 群が乳組成形質に遺伝的に関連していることを証明した後、ルーメン細菌量と乳質形質に同時に影響を与える宿主ゲノム領域を特定するために、GWAS を実施した。乳製品形質のGWASでは、9つの染色体にまたがって分布する22の有意なSNPが検出された。これらの領域のうち、OAR6上の2つがα-ラクトアルブミンおよびα-S2-カゼインと関連を示した。α-S2-caseinについて検出されたSNP rs423428574は、カゼインに関する文献で主要遺伝子CSN1S2が報告されているOAR6の領域に位置していた[10, 11, 49]。また、Lacaune羊では、Boichardら[7]がOAR6上にα-S2-カゼインのQTLを検出したが、位置は報告されていない。我々は乳牛のα-ラクトアルブミンに対するQTLがOAR6上に検出されたという文献を発見していない。OAR11上では、8つの有意なSNPでα-ラクトアルブミンに対するQTLを検出した（図3）が、ここにはカゼインとβ-ラクトグロブリンに対する有意な領域も報告されている[7]。OAR3上には羊のα-ラクトアルブミンをコードする主要遺伝子LALBAが同定されているが[11]、本研究ではこの乳清タンパク質に対する有意なSNPは見いだせなかった。OAR2および20上に検出されたα-lactalbuminに関する有意なSNPsは、García-Gámezら[11]が乳用羊のタンパク質および脂肪収量と関連すると報告したSNPsに近いものであった。牛乳のSFAであるC6:0とC8:0については、OAR17上に同じSNPが検出され、C4:0についても示唆的なSNPが1つ同定された。García-Gámez ら [11] は OAR17 上に脂肪率と関連する有意な SNP (58.8 Mbp) を報告しており、Carta ら [9] は Lacaune 羊の戻し交配集団で OAR17 上に C6:0 および C8:0 に関する QTL と OAR8 上に我々が検出しなかったシグナルを追加で検出している。さらに、我々は OAR11 上で乳脂肪に関する SNP を検出しなかったが、Marina ら [10] はこの染色体上で乳脂肪合成の主要遺伝子 (ACACA と FASN) を報告している。
ルーメン細菌量のGWASでは、Liら[4]、Abbasら[50]、Zhangら[6]が報告したように、宿主ゲノム全体に分布するシグナルが検出された。しかし、OAR3, 15, 26 には、同じ SNP と共局在する Prevotellaceae OTU のシグナル、すなわち OAR5 には Prevotellaceae と Lachnospiraceae OTU の共局在、OAR26 には Prevotellaceae と F082 OTU の共局 在が主に 3 つの領域で検出された。このことは、宿主ゲノムのいくつかの領域がルーメン細菌量と関連していることを示唆しているが、Pérez-Encisoら[51]が提起した微生物叢量の原因SNPsの同定の難しさについての限界を考えると、この結果は、より大きなデータセットで確認されるべきものである。OTU量のQTLが検出されたゲノム領域から、Abbasら[50]が報告したように、宿主免疫系プロセス、調節、異化プロセスに関与するTIA1、IL18R1、W5PCZ6_SHEEP、PDE3Bなどの候補遺伝子候補を回収することができた。しかし、pleiotropicまたは密接に関連するQTLが両方の形質に同時に影響を与えるゲノム領域を検出しなかったため、OTUと乳製品形質の間で共有される代謝経路を同定することはできなかった。その理由として、本データセットは微生物解析としては大規模であるが、他の研究と比較してゲノム関連領域や多面的効果を検出するにはレコード数が少なすぎることが考えられる[52, 53]。
結論
大規模かつユニークなマイクロバイオームデータベースに基づく我々の知見は、ラカウネ雌牛のルーメン内の全細菌量のごく一部が、全細菌とコア微生物群の両方について宿主ゲノムに部分的に制御されており、少数の細菌がOAR3、5、15、26上の特定のゲノム領域と関連していることを実証するものであった。乳精組成とルーメン細菌との間の遺伝的相関はごくわずかであり、ルーメン細菌量と乳製品の形質との間に共有されるゲノム領域および代謝経路を特定することはできなかった。本研究では、16S rRNA 遺伝子配列を用いたため、種レベルの所属を特定することができず、どの微生物の機能が関与しているかを特定し、その機能を乳質形質と関連付けるための追加作業が必要である。そうすれば、微生物叢を介した間接的な遺伝的影響を考慮し、遺伝的評価モデルに微生物叢の存在量と微生物機能を組み込むことを検討することが可能になるであろう。
データおよび資料の利用可能性
本論文の結論を裏付けるデータセットは、NCBIリポジトリ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA723543）にて公開されている。
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謝辞
動物の世話とルーメンのサンプリングについて、INRAE の実験ユニットである La Fage (DOI: https://doi.org/10.15454/1.548325523466425E12)の技術スタッフに感謝する。また、微生物相サンプルの調製にご協力いただいた Béatrice Gabinaud 氏、DNA 配列決定にご協力いただいたトゥールーズの Get-Plage プラットフォーム、INRAE La Fage で生産された遺伝資源にアクセスいただいた Hélène Larroque 氏と Rachel Rupp 氏に感謝いたします。
資金提供
本プロジェクトは、INRAE および CRB-Anim (DOI: https://doi.org/10.15454/1.5613785622827378E12)から資金援助を受け、また GMB の博士論文には INRAE およびオクシタニー地方から共同資金援助があったことに感謝する。資金提供者は、研究デザイン、データの収集・分析・解釈、原稿執筆には一切関与していない。
著者情報
著者名および所属
GenPhySE, INRAE, ENVT, Université de Toulouse, 24 Chemin de Borde Rouge, 31326, Castanet-Tolosan、France
Guillermo Martinez Boggio、Annabelle Meynadier、Christel Marie-Etancelin
オーフス大学定量遺伝学・ゲノミクスセンター、Blichers Allé 20, 8830, Foulum, Denmark
アルバート・ヨハネス・ブイテンホイス（Albert Johannes Buitenhuis
貢献
GMBはすべての解析を行い、原稿を執筆した。AMとCMEは実験計画の立案と監督を行い、農場のサンプリングとデータ収集を管理した。CMEはジェノタイピングの編集と品質管理を行った。AM、CME、AJBは結果について議論し、原稿を改善した。最終原稿は全著者が読み、承認した。
共著者
Guillermo Martinez Boggio に連絡する。
倫理的宣言
倫理的承認と参加への同意
このプロトコルは、フランス高等教育・研究・革新省-動物倫理委員会から以下の承認番号で承認を受けた。APAFIS#6292-2016080214271984 v8.
論文発表の同意
該当なし。
競合する利益
著者らは、競合する利害関係を有しないことを宣言する。
追加情報
出版社からのコメント
Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して、中立的な立場をとっています。
補足情報
追加ファイル1：表S1.
操作的分類単位（OTU）の配列と対応する分類学上の所属。王国から種まで対応する所属を持つOTUのコンセンサス配列。
追加ファイル2: 表S2.
泌乳体細胞スコア（LSCS）、乳量変動係数（CV Milk）、運用分類単位（OTU）間の遺伝率（h2）および遺伝的相関（rg）。全2059 OTUの存在量と泌乳体細胞スコアおよび乳量変動係数との遺伝率および遺伝的相関関係。
追加ファイル3：表S3.
脂肪含量（FC）、乳脂肪酸、運用分類単位（OTU）間の遺伝的相関関係。OTU の存在量、脂肪含量、乳脂肪酸の間の遺伝的相関は、酪酸（C4:0）、カプロン酸（C6:0）、カプリル酸（C8:0）、カプリン酸（C10: 0）、ラウリン酸（C12：0）、およびパルミチン酸（C16：0）、オレイン酸（cis-9 C18：1）、ルーメン酸（cis-9 trans-11 C18：2）およびα-リノレン酸（C18：3n-3）である。
追加ファイル4：表S4.
タンパク質含量（PC）、乳タンパク質と操作的分類単位（OTU）の間の遺伝的相関関係。OTUの存在量、タンパク質含量、乳タンパク質（α-S1-カゼイン、α-S2-カゼイン、β-カゼイン、κ-カゼイン、α-ラクトアルブミン、β-ラクトグロブリンなど）間の遺伝的相関関係。
追加ファイル5：表S5.
GWASで得られた有意なSNPs（OTU）。各SNPで検出された候補遺伝子とともに、オペレーション分類学的ユニットのGWASから得られた有意なSNPs。
追加ファイル6：表S6.
マイクロバイオームGWASで検出されたSNPから回収された遺伝子IDの機能アノテーション。Ensemblプラットフォームから回収した遺伝子とDAVIDプラットフォームから回収した代謝過程とKEGGパスウェイに対する機能アノテーションの説明。
権利と許可
この記事は、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可するクリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下に提供されています。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。もし素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合には、著作権者から直接許諾を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの献呈放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジットラインに特に記載がない限り、この記事で利用可能になったデータに適用されます。
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この記事の引用
Martinez Boggio, G., Meynadier, A., Buitenhuis, A.J. et al. Host genetic control on rumen microbiota and its impact on dairy traits in sheep.（羊のルーメン微生物群に対する宿主の遺伝的制御とその乳牛形質への影響）. Genet Sel Evol 54, 77 (2022). https://doi.org/10.1186/s12711-022-00769-9
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受付終了
2022年5月3日
受理済
2022年11月09日
公開日
2022年11月24日