腸内細菌叢はノトバイオティクスマウスにおける胆汁酸による小腸腫瘍形成を予防する
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原著論文｜オープンアクセス｜2024年8月29日
腸内細菌叢はノトバイオティクスマウスにおける胆汁酸による小腸腫瘍形成を予防する
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エスター・ワートマン1
,
デヴィッド・ワイレンセク1
, ...
トーマス・クラヴェル1
Microbiome Res Rep2024;3:44.
10.20517/mrr.2024.20|© The Author(s) 2024.
著者情報
論文ノート
引用
要旨
目的：腸内細菌叢は腸腫瘍の発生に関与している。さらに、欧米食は大腸がんの危険因子であり、微生物叢と胆汁酸代謝の両方に変化を誘導する。そこで我々は、APC1311/+ブタにおいて、欧米食が誘発する微生物叢の変化と二次的な胆汁酸産生が疾患増悪に及ぼす因果関係を調べることを目的とした。
方法 無菌Apc1368N /+マウスに遺伝子操作したAPC 1311/+ブタの便を接種し、糞便微生物叢移行実験を行った。Apc1368 N/+マウスの対照群は無菌のままであった。すべてのマウスに、対照食、または二次胆汁酸産生を刺激するために一次胆汁酸であるコール酸（CA）を添加した同じ食餌を与えた。
結果 予想に反して、CAを与えた無菌マウスは上部小腸の病変数が多かったが、微生物によるコロニー形成によって減少した。同じマウス（無菌、CA食）では、小腸が顕著に長くなった（平均約10cm増）。大腸病変はまれで、対照ブタの便を受け、CA飼料を与えたマウスでのみ観察された。多様性と組成の分析から、微生物叢の移行は不完全であったことが示された。それにもかかわらず、西洋食に関連した微生物叢を投与されたマウスは、対照動物とは別にクラスター化していた。CA食の微生物叢への影響はそれほど顕著ではなく、主に対照ブタの便を受け取ったマウスで観察された。レシピエントマウスの胆汁酸分析から、表現型と胆汁および盲腸中の特定の胆汁酸種との関連が明らかになった。
結論 この記述的研究は、腸の形態形成と腫瘍形成における食餌-微生物叢-胆汁酸の相互作用の重要性を強調している。
図解抄録
キーワード
腸内細菌叢、胆汁酸、大腸がん、動物モデル、糞便微生物叢移行
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はじめに
大腸がん（CRC）は世界のがん関連死の9.3％を占め、2020年には190万人が新たに罹患し、935,000人が死亡する[1]。CRC罹患率はヨーロッパと北米で最も高いが、アジアとラテンアメリカでは急速に増加している[2]。CRC罹患率の増加は、赤身肉や加工肉の摂取量の増加を含む欧米食の摂取量の増加などのライフスタイルの変化に起因している[3-5]。ヒトを対象とした研究では、高脂肪・低繊維食がCRCリスクの粘膜バイオマーカーの増加[6]や二次胆汁酸であるデオキシコール酸（DCA）の糞便中濃度の上昇[7]と関連していることが示されている。疫学的データでも、CRC患者の便中DCA濃度の上昇が報告されているが[8,9]、実験的に因果関係はまだ確立されていない。
CRCは遺伝的事象の蓄積により数年かけて発症する[10]。CRCの研究には、発病までの期間が短いいくつかのマウスモデルが用いられており、その多くはAPC遺伝子の機能喪失に基づくものである[11,12]。しかし、散発性のヒトCRCとは対照的に、ApcMutモデルは通常小腸に腫瘍を発症する[13,14]。野生型マウスをAOM（アゾキシメタン）やDSS（デキストラン硫酸ナトリウム）で化学処理すると大腸に腫瘍が発生するが、このようなモデルでは急性の上皮障害や炎症が問題となる。最近、ColemanらはnATF6IEC遺伝学的大腸がんモデルマウスを開発し、無菌のnATF6IECマウスにおいて微生物叢の移入を介した微生物の原因的役割を実証した[15]。しかし、マウスは食事と疾患の相互作用を研究するには理想的ではない。ブタの食習慣と消化生理はヒトに近く、ヒトで介入を行うのに比べ、遺伝、環境因子、食餌組成をより厳密に制御することが可能である[16]。以前、我々は、赤肉とラードを豊富に含む食餌が、大腸腫瘍形成の遺伝子改変APC1311/+ブタモデルにおいて、糞便微生物叢プロファイルを有意に変化させ、疾患を悪化させることを見出した[17]。しかし、微生物叢の変化とそれに伴う糞便中DCA濃度の上昇の因果関係は検証されておらず、これは糞便中微生物叢移植（FMT）実験によって行うことができる。
Wangらは、一次胆汁酸であるコール酸（CA）を0.4％（w/w）の飼料で16週間摂取させると、ApcMin /+マウスの腸腫瘍数が増加することを見出した[18]。Caoらは、飲料水に0.2％のDCAを12週間添加したところ、ApcMin /+マウスで同様の結果が得られた[19]。後者の著者らはまた、DCAを投与したドナーの微生物叢を投与された、正常にコロニー形成されたストレプトマイシン処理ApcMin /+マウスが、腸腫瘍数の増加を示したことも見出した[19]。さらに、DCAとTβMCAは、ApcMin /+マウスにおいて腸管幹細胞の増殖と悪性腫瘍を増加させることが示された[20]。ヒトドナーの微生物叢もまた、マウスにおける因果関係の検証に用いられている。CRC患者由来の糞便微生物叢を投与されたApcMin/+ マウスと健常対照マウスとでは、より多くの腸腫瘍が発生した[21]。同様に、CRC患者からのFMTを抗生物質処理または無菌C57BL/6マウスに投与すると、AOM処理では高悪性度異形成、巨視的ポリープが生じ、AOM処理なしでは結腸内の増殖細胞の割合が高くなった[22]。ヒトに関連した微生物叢は、CRCや他の様々な疾患におけるマイクロバイオームの変化の因果関係を調べるために広く用いられている。しかし、移植の有効性は文書化されなければならず、試験されたドナーとレシピエントの数、レシピエントの場合はリターとケージの影響に注意を払わなければならない[23]。
ここで我々は、遺伝子操作されたAPC1311/+ブタにおいて、食餌による腸内細菌叢の変化と疾患増悪に伴うDCA産生の増加が、疾患誘発に因果関係があるかどうかを明らかにしようとした[17]。そこで、ブタから無菌Apc1638 N/+マウスへのFMTを行い、病理、微生物叢、胆汁酸代謝への影響を調べた。
方法
マウス
実験は、EU指令2010/62/EUに従い、LANUV倫理承認nr.81-02.04.2018.A425のもとで行った。Apc1638N/+マウス[B6/J.129-(Apc1638N)tm]は、ドイツのRWTHアーヘン大学病院の実験動物科学研究所の無菌アイソレーター（フレキシブルフィルムアイソレータータイプ2D、NKPisotec）で無菌条件下で飼育した。室温は21～24℃、湿度は30～70％に保たれ、昼夜12時間：12時間のサイクルで飼育および実験が行われた。
実験計画のスキームは補足図1Aにある。無菌ヘテロ接合体マウスは、4週齢（離乳後）にISOcage P-BioExclusion System（ISO30P, Tecniplast, Italy）で管理された無菌ケージに移された。オートクレーブ（121℃）処理した標準飼料（ssniff Spezialdiäten GmbH, cat. nr. V1534-300）とオートクレーブ処理した水道水を自由摂取させた。糞便サンプルを採取し、グラム染色後、顕微鏡観察により無菌状態を確認し、嫌気性寒天培地および好気性寒天培地で最長7日間培養した。マウスには、ドナーブタからの新鮮な解凍・凍結保存（20％v/vグリセロール；-80℃）した糞便微生物叢を150μL［または最大10％（v/w）体重］経口経口投与によりコロニー形成させた。2回目の投与は72時間後に行い、厳密に無酸素状態にある種の生着を促進させた。選択したドナーブタのデータ（表現型、微生物叢、胆汁酸）は補足図2にある。コロニー形成が安定するまでの3週間後、マウスをコントロール食（CD食；ssniff Spezialdiäten GmbH, cat. nr. S5745-E902）、または一次胆汁酸コール酸を0.2％（w/w）濃縮した同食（CA食；ssniff Spezialdiäten GmbH, cat. nr. S5745-E903）を与える群に分けた。すべての飼料は放射線照射（2×25kGy）により滅菌した。マウスは毎日観察され、ボディコンディショニング、一般的な健康状態、行動、ブリストル便のスコアを含むスコアがつけられた。体重は毎週記録した。クリティカルスコア（あらかじめ定義された採点基準で20点以上）に達したマウスは、実験終了前にサンプリングした。それ以外のマウスは30週齢（コロニー形成後26週齢）でサンプリングした。
遺伝子型決定
遺伝子型決定には、耳穿孔によるマウス組織を用いた。400μLの抽出バッファー（1M Tris, pH 8; 0.5M EDTA; 5M NaCl; 20% SDS）および10μLのプロテイナーゼK（Carl Roth, Germany, cat.Nr.7528.1）と共に組織をインキュベートし、55℃で一晩振盪してDNAを抽出した。ボルテックス後、組織溶解液（200 µL）を、200 µLのイソプロパノール（Carl Roth、ドイツ、cat. nr. 6752.1）の添加によるDNA沈殿に用いた。DNAは遠心分離（10分、9,600g、RT）により得、200μLのTEバッファー（pH7.5）に溶解し、55℃で一晩振盪した。遺伝子型判定は、2X One Taq Mastermix（New England Biolabs、cat. nr. M0482）、フォワードプライマー1本（5'-CAGCCATGCCAACAAAGT）、リバースプライマー2本（野生型は5'-GCCAGCTCATTCCTCCACTC、変異型は5'-GCCAGCTCATTCCTCCACTC）を用いたPCRで行った。PCRの設定は以下の通り： 94℃（60秒）の初期変性、変性（94℃、20秒）、アニーリング（58℃、20秒）、伸長（68℃、20秒）、最終伸長（68℃、60秒）を30サイクル行った。ゲル電気泳動でバンドを観察した。実験にはヘテロ接合体Apc1638 N/+マウスを用いた。
サンプリング手順
30週齢（すなわち、コロニー形成後26週齢）で、マウスをイソフルラン過剰投与により安楽死させた（Abbvie、cat. nr. 10182054）。シリンジ（1010ステリカン、27G×0.5インチ、0.4×12mm、ブラウン社製）を用いて心臓血液を採取し、そのうち10μLをNaClで希釈し、ノイバウアー改良計数室（深さ0.02mm）を用いて赤血球（RBC）計数を行った。腹膜にデスモイドがないか調べ、消化管を摘出した。小腸と結腸の長さを測定し、腸を十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸に分けた［補足図1B］。脾臓の重量を記録した。盲腸と結腸の内容物は別々に採取し、スナップ凍結した。小腸と結腸を縦に切り開き、双眼鏡で病変の有無を調べた。病変の可能性のあるものは4%緩衝ホルムアルデヒド（Otto Fischar GmbH & Co. KG, cat. nr. 27281）で24時間固定し、パラフィンに包埋した。
組織学的分析
パラフィン包埋した腸病変のサブセットをヘマトキシリン・エオジン（HE）で染色し、前述のように解析した[24]。
便潜血検査
グアイアック便潜血検査は、ヒトのCRCスクリーニングに一般的に用いられる便検査である[25]。マウス個体から採取した新鮮な糞便ペレットを3穴スライドテスト（hemoCARE, CARE diagnostica Laborreagenzien GmbH, cat.nr.005031-E/D）の3フィールドに広げた。乾燥後、現像液を1-2滴滴下し、約1分後の色の変化を目視で観察した。約1分後に目視で色の変化を観察した。1～3の間で任意の点数をつけた[補足図3]。
胆汁酸分析
胆汁酸は液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（LC-MS/MS）により定量した。簡単に説明すると、D5-γMCA、D5-βMCA、D5-αMCA、D4-TβMCA、D4-TαMCA、およびD5-HDCAを内部標準混合物に加え、Kinetex® 2.6 µm Biphenyl 50 × 2.1 mmカラム（Phenomenex、Torrance、CA、USA）で分離した。胆汁は分析前に500倍に希釈した。胆汁サンプルは70%イソプロパノール中でビーズビートによりホモジナイズし、乾燥重量に調整した[27]。胆汁サンプル（10 nL）と糞便サンプル（0.1 mg 乾燥重量）をアセトニトリル沈殿にかけた。詳細な方法は別稿で述べる。
16S rRNA 遺伝子アンプリコン配列決定および解析
メタゲノムDNAは、前述[28]と同様に糞便内容物および糞便サンプルから単離した。16S rRNA遺伝子のV3-V4領域の増幅と塩基配列決定は、前述[29]と同様に行った。生シーケンスリードは、UPARSE[31]に基づくIMNGSパイプライン[30]を用いて処理した。以下の設定を適用した。バーコードのミスマッチは最大1件、fastq quality scoreは最小20で対になっていないリードをトリミング、最小350、最大350。350bp、最大500bp。500bpの長さのシングルリード、またはペア配列のアンプリコン。ペア配列の予想エラー率0.005。50 mismatch during merging of reads; min. 70% identity of alignment during scoring merge; 20 bp trimming at the forward and reverse side of the sequences; min. 0.0025 (0.25%) relative abundance cut-off (rel. abundance in at least one sample). USEARCH version 11[32]を用いて、ペアリング、クオリティフィルタリング、操作上の分類単位（OTU）へのクラスタリングを行った。非16S配列の除去はSortMeRNA v4.2[33]を用いて行った。配列アライメントと分類学的分類はSINAバージョン1.6.1とSILVAリリース128[34]を用いて行った。Fasttreeを用いて最尤近似木を計算し、2,000リード未満のサンプル（85件中9件）は解析から除外した。
前述の解析の結果、1サンプルあたり5,484±2,609リードが得られ、R[35]のRheaを用いてさらに処理した。Rarefaction曲線を補足図4に示す。偽分類群の可能性を排除するため、0.25%以下のSOTUまたは細菌ファミリーの相対存在量はNAに設定した。図に示した選択したSOTUはEZBiocloud[36]を用いて同定した。すべての SOTU 配列は、97% の配列類似度を同一性カットオフとして、公表されている菌株[Supplementary Table 1]に対してブラストされた。その結果、SOTU66はE. murisと100％の配列類似性を示し、e値は0、ビットスコアは739であった。
統計
微生物分類群の統計的比較には、全サンプルで80%の有病率カットオフを適用した。ヒートマップの作成では、平均値の計算のために NA を 0 とみなした。ヒートマップは、R[37]のComplex Heatmapパッケージで作成した。微生物分類群の有無は、Rhea[35]のフィッシャーの正確検定で検定した。他のすべての統計分析は、R[38]のrstatixパッケージを使用して行った。使用した検定に関する具体的な情報は、図の凡例に記載されている。
結果
無胚葉Apc1638 N/+マウスの上部小腸における食餌誘導性腫瘍におけるコール酸
我々は以前に、西洋食（赤肉とラードを多く含むRL食）を与えた遺伝子操作APC 1311/+ブタの結腸におけるポリープの数と大きさの増加が、腸内細菌叢の実質的なシフトと関連していることを観察した[17]。このような微生物叢の変化の原因的役割を調べるために、無菌Apc1638 N/+マウス[14,39]に、対照食（CTRLドナー）またはRL食（RLドナー）を与えたブタの凍結保存便サンプルをコロニー形成させた（各食餌群につきn= 3ドナーブタ）[補足図2]。追加の対照群は無菌のままであった。その後、3群すべてのマウスに、対照食（CD食；CTRLおよびRLドナーはそれぞれ17匹および19匹；無菌コントロールはn＝12匹）、または第一胆汁酸コール酸0.2％（w/w）を添加したCD食（CA食；CTRLおよびRLドナーはそれぞれ20匹および21匹；無菌コントロールはn＝12匹）を与え、微生物叢によるDCA産生を促進させた。
予期せぬことに、CA食を与えたGFマウスは、すべてのコロニー形成されたレシピエントマウスと比較して、腸管病変の数が有意に多いという特徴を示した［図1A］。この影響は、主に、中等度異形成腺腫に分類される、脾臓周囲および十二指腸に形成された病変によって引き起こされた［図1B］。このように、複雑な豚の微生物叢をマウスにコロニー形成させることで、この腫瘍形成モデルマウスにおけるCAによる腸管病変の形成を防ぐことができるようであった。病変数の増加に加えて、CA食を与えた無菌マウスは、コロニー形成マウスと比較して、小腸が有意に長く（平均長さはGF-CA対CTRL-CAで58％増）、結腸も有意に長かった（13％増）［図1C］。脱落や便潜血には群間で有意差は認められなかった［補足図6AおよびB］。病変数が多いことと一致して、無菌マウスは赤血球数が最も少なかった。これは貧血の徴候であり、このモデルにおける腫瘍関連罹患の典型的な徴候である［補足図6C］。予想されたように、腸管外病変は主にApc遺伝子座のヘテロ接合性の消失[14]によって引き起こされる結合組織の良性デスモイドであったが、コロニー化や食餌によって変化しなかった［補足図6D］。体重は、複合微生物叢をコロニー形成し、CA食を与えた雄マウスで最も高かったが［補足図6E］、CDを与えたGFマウスは、個体間の顕著な差は観察されたものの、脾臓の重量が高いという特徴を示した［補足図6F］。
図1. FMT後のApc1638 N/+マウスの表現型。(A）各ドナーと食事の組み合わせにおける腸管病変の数。下：腫瘍が確認された腸の巨視的画像例。左：CA食の生殖細胞フリーマウスのPAR（赤丸）に複数の腫瘍（腺腫）があり、さらに十二指腸に2つの腸病変がある（赤矢印）。右： CA食を与えたCTRLマウスの回腸にできた腫瘍（腺腫）（赤矢印）。2つの病変の組織学的解析例を補足図5に示す；（B）腸領域ごとの病変数；（C）小腸と結腸の長さ（平均±標準偏差）。この図の旧版はEsther Wortmann（筆頭著者）の博士論文に掲載された[40]。パネル(A)と(B)では、病変の平均数を白線で示す。統計： 統計：Kruskal-Wallis法、Dunnの多重比較、Benjamini-Hochbergによる調整**P.adj < 0.01;***P.adj < 0.001;****P.adj < 0.0001）。FMT: Fecal microbiota transfer; PAR: periampullary region; CTRL: control donor microbiota、すなわち、CTRL食を与えたブタの糞便でマウスをコロニー形成した; CA: cholic acid-supplemented diet（レシピエントマウス）; GF: germfree; RL: RL donor microbiota、すなわち、RL食を与えたブタの糞便でマウスをコロニー形成した; CD: control diet（レシピエントマウス）。
Apc1638 N/+マウスの大腸腫瘍形成には、欧米食による微生物叢の変化とDCA産生量の増加が関与しているという当初の仮説の検証はできなかったが、微生物叢と胆汁酸の相互作用による実質的な影響が小腸で観察された。レシピエントマウスに腫瘍が生じなかったことを調べるため、16S rRNA遺伝子アンプリコン解析により腸内細菌叢を解析した。
微生物叢の多様性と組成はドナーブタとレシピエントマウスで異なっていた。
リッチネス（種の総数）とシャノン有効数（均等性を考慮した数）の両方を比較した結果、実験終了時の便ドナーインキュラム（1食あたり3匹のドナーブタそれぞれについて2個の凍結保存便サンプルの塩基配列を決定）とレシピエントマウスの糞便内容物との間で、多様性が約3倍減少していることが明らかになった（P< 0.001）［図2A］。コロニー形成から3週間後のレシピエントマウスの便では、多様性はわずかに増加したが、それでもドナーマウスよりはるかに低かった［補足図7］。すなわち、レシピエントマウスの微生物叢プロフィールはドナーの便のプロフィールとは明らかに異なっていた。それにもかかわらず、CTRLまたはRLブタの微生物叢をコロニー形成させた2群のレシピエントマウスは、別々のクラスターを形成していた［図2B］。次に、単一分子種［species-level Operational Taxonomic Units（SOTUs）］の移入を調べた。少なくとも1つのレシピエントマウスまたはドナーインキュラムに存在する269のSOTUの総ランドスケープの中で、23（9％）が全グループで共有されていた［図2C］。さらに21個（7％）と13個（5％）のSOTUが、それぞれCTRL群とRL群のドナーとレシピエントの間で共有された。α多様性の減少［図2A］、および検出されたすべてのSOTUの約15％がドナー特異的であったという事実と合わせて考えると、ブタの糞便から無菌Apc1638 N／＋マウスの腸への種の生着が不完全であったことが確認された。合計22（8％）および16（6％）のSOTUが、それぞれCTRL群およびRL群のレシピエントマウスでのみ検出された［図2C］。これらの菌種はブタの腸内ではサブドミナント集団に属していた可能性が高いが、マウスではドミナントコミュニティの一部であった。これらの種は、個体間で出現率が大きく異なるものの、β多様性解析［図2B］で見られたCTRL群とRL群の別々のクラスタリングに寄与していた。
図2. 移植効率を評価するための16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングを用いた糞便微生物叢解析。(A）種の豊富さとシャノン有効数。ドナーの微生物叢の種類を色で示す（CTRL、青；RL、赤）。(B)一般化UniFrac距離に基づくNMDSとして示した微生物叢プロファイル。(C)少なくとも1匹のドナーブタまたは1匹のレシピエントマウスで検出されたSOTUの分布（ベン図）。SOTUの総数は269個であった；（D）全グループまたは1つの微生物叢タイプ（ドナーまたはレシピエント）のみで検出されたSOTU、または既知のDCA産生者の参照16S rRNA遺伝子配列と一致したSOTU。陽性値のみをプロット。（E）各群に特徴的であったSOTUのヒートマップ（各群のサンプルの100％に蔓延）。列はドナーと対応するレシピエントマウスを表す。ボックス内の色は平均値としての相対量を示す。配列決定されたサンプル数：左はドナー（濃い色）、1ブタあたりn= 2クリオストック、右はレシピエント（薄い色）、CTRL微生物叢についてはn= 10-13マウス、水色、RL微生物叢についてはn= 7-13マウス、薄い赤。この図の旧バージョンは、Esther Wortmann（筆頭著者）の博士論文に掲載された[40]。CTRL： コントロールドナー微生物叢、すなわちCTRL食を与えたブタの糞便でマウスをコロニー形成したもの；RL: RLドナー微生物叢、すなわちRL食を与えたブタの糞便でマウスをコロニー形成したもの；NMDS: 非計量多次元尺度法；SOTUs: 特定分子種；DCA: デオキシコール酸。
RL群およびCTRL群ともに、すべてのドナーとレシピエントから2種類のSOTUが検出された： SOTU6（Blautia faecicolaに対して99.5％の配列同一性）とSOTU25（Phascolarctobacterium succinatutensに対して99.1％）であった［図2D］。未記載種に対応する3つのSOTUは、CTRLグループのドナーとレシピエントの両方に特徴的であった： SOTU328（93.6％がXylanibacter rarus（旧Prevotella rara））、SOTU343（88.3％がDuncaniella muris）、SOTU635（88.0％がSphaerochaeta pleomorpha）であった。2つのSOTUはRL群のドナーとレシピエントのみに認められた： SOTU2（100％がAkkermansia muciniphila）とSOTU77（Dielma fastidiosa）であった。次に、ドナーとレシピエントの微生物叢をスクリーニングし、既知のDCA産生菌の存在を調べた。その結果、ヒットしたのはSOTU66（Extibacter murisに対して100％）のみで、これは全群で検出されたが、CTRLレシピエントマウスでは相対的な存在量が高かった［図2D］。このように移行した微生物叢のタイプに特異的なSOTUは少数であったが、支配的なSOTUの大部分は宿主依存性（ブタまたはマウス）であり、ドナーのタイプ（CTRLまたはRL食を与えたブタ）によるものではなかった［図2E］。
次に、レシピエントマウスの微生物叢に注目し、特にドナーの微生物叢の種類と食餌（すべてのマウスに対照食または一次胆汁酸CAを補充した食餌を与えた）による違いを調べた。
レシピエントマウスの微生物叢は食餌よりもドナーの影響を強く受けた
コロニー形成後3週間の安定化期間の後、すべてのレシピエントマウスを対照食（CD食）または0.2％（w/w）の一次胆汁酸CAを添加した同食（CA食）のいずれかにした。微生物叢の構造を比較したところ、主にドナーのタイプによってクラスタリングが見られたが、CTRLレシピエントはRLレシピエントよりもCA食の影響をより強く受けていることも示された［図3Aおよび補足図8］。このことは、CA食を与えたCTRLレシピエントマウスでは、リッチネスとシャノン有効数が低いことに反映された［図3B］。豊富なSOTUのユークリッドクラスタリング（少なくとも1つの群における相対的存在度が1％以上）を、各ドナー-食餌の組み合わせ（n＝12；2つのドナー微生物叢タイプ、各3匹のドナーブタ、2つのレシピエント食餌）について、全マウスにわたる平均出現量を用いてプロットしたところ、ドナー間の個体間差は観察されたものの、ドナー微生物叢タイプ（CTRL、青色対RL、赤色）が、レシピエント食餌（淡色対濃色）と比較して、微生物叢組成に強い影響を及ぼすことが確認された。RLドナーのレシピエント916人と937人は別々にクラスタリングしており（樹状図の左端）、これは主にSOTU2（Akkermansia muciniphila、100％）とSOTU4（Phocaeicola vulgatus、99.8％；以前はBacteroides vulgatus）によるものであった［図3C］。SOTU（全マウスで検出され、少なくとも1つのドナー食群で1％を超える相対量で検出された）の有病率と豊富率の統計的比較から、SOTU21（Mucispirillum schaedleri, 97.2％）については有意差が認められ、CA食のCTRLレシピエントで最も高かった［図3D］。対照的に、SOTU26（Desulfovibrio piger、99.3％）はCD食のCTRLレシピエントで最も多く、RLレシピエントでは非常に少なかった［図3D］。SOTU8（Bacteroides uniformis、100％）とSOTU33（Bilophila wadsworthia、100％）はRLレシピエントでのみ検出され、SOTU33はCA飼料を与えたRLマウスで有意に上昇した［図3D］。DCA産生種Extibacter murisの16S rRNA遺伝子配列と一致するSOTU66はCTRLレシピエントで相対存在量が高かったが、これは食餌とは無関係であった［図3D］。優占細菌科のレベルでは、CA飼料を摂取したRLレシピエントではDesulfovibrionaceaeが有意に増加した［図3E］が、これは主にM. Oscillospiraceae（オシロスピラ科）、Ruminococcaceae（ルミノコッカス科）、Tannerellaceae（タンネレラ科）などの他の細菌ファミリーは、食事による影響よりもドナー微生物叢のタイプによる影響の方が大きかった［図3E］。
図3. 異なるブタ便サンプル（CTRLまたはRLドナー；それぞれ青色および赤色）でコロニー形成し、CDまたはCA食（それぞれ明色および暗色）を与えたレシピエントマウスにおける微生物叢プロファイル。(A）NMDSプロットで示した一般化ユニフラック距離（PERMANOVAP.adj = 0.057）；（B）各ドナー-食餌の組み合わせのリッチネスとシャノン有効数；（C）支配的なSOTU（少なくとも1つのグループで平均相対存在量＞1％）の比較分析。各列はドナーと餌の組み合わせを表し、ユークリッド距離によってクラスタリングされた。ドナーのイノキュラムにおける所定のSOTUの有病率は右側のバーで示されている。各 SOTU の最も近い分類学的ヒット（EZBiocloud に基づく）を種名で示し、括弧内に配列同一性のパーセンテージを示す；（D）有病で豊富な SOTU（全レシピエントマウスの 80%超に存在。> 少なくとも1つのグループで1％以上）、グループ間の差異を強調；（E）優勢な細菌ファミリーの出現における大きな差異。選択/試験の基準は（D）と同じであった。統計： Kruskal Wallis with Dunn's multiple comparison, Benjamini-Hochberg correction (*P.adj < 0.05;**P.adj <0.01;***P.adj < 0.001;****P.adj < 0.0001)。この図の以前のバージョンは、Esther Wortmann（筆頭著者）の博士論文に掲載された[40]。CTRL： CTRL: Control donor microbiota、すなわちCTRL食を与えたブタの糞便でマウスをコロニー形成；RL: RL donor microbiota、すなわちRL食を与えたブタの糞便でマウスをコロニー形成；CD: control diet（レシピエントマウス）；CA: cholic acid-supplemented diet（レシピエントマウス）；NMDS: non-metric multidimensional scaling。
要約すると、ブタのドナー微生物叢から無菌Apc1368 N/+への細菌分類群の移行は部分的であり、これが遠位腸における腫瘍誘導の欠如に寄与したと考えられる。多様性と組成の違いは、ドナーの微生物叢のタイプによるものと、特定のケースでは食餌によるものが観察された。しかし、CAを与えたすべてのコロニー形成マウスは、無菌マウスに比べて小腸病変が少なく、腸が短かったので、観察された微生物叢の違いは表現型とは無関係であった［図1］。微生物叢による胆汁酸代謝と無菌マウスに見られるCA誘発性表現型を研究するという当初の目的から、次にマウスの盲腸と胆汁中の胆汁酸レベルを測定した。
コロニー形成と食事による胆汁酸の変化
食餌中の胆汁酸補給と組み合わせた無菌マウスの上部小腸における予想外の表現型のため、胆汁中の胆汁酸を測定した。胆嚢内の総胆汁酸レベルは、コントロール食（CD）とCA食の無胚乳マウス間で同程度であった［図4A、上段］。対照的に、個々の胆汁酸については有意差があった：CA食の生殖細胞フリーマウスでは、タウロコール酸（TCA）がほとんどの胆汁酸を占めたのに対し、CD食のマウスの胆汁にはほとんどがタウロ-β/ω-ムリコール酸（Tβ/ωMCA、図4A、上段）が含まれていた。無胚乳マウスの盲腸における食餌の影響としては、CAを添加した場合、総胆汁酸レベルが有意に高くなり、主にTCAレベルが顕著に上昇したことが原因であった［図4A、下段］。
図4. Apc1368 N/+マウスの胆嚢および盲腸における胆汁酸濃度。(A）無胚葉マウスの胆嚢（上）および盲腸（下）における支配的な胆汁酸種の濃度（群ごとの平均濃度＞0.5μmol/mL）；（B）マウスの盲腸における胆汁酸濃度に対するコロニー形成および食餌（CA補充）の影響。無菌マウスのデータはパネルa（下段）と同じ。βMCAとωMCAは解析で区別できなかったので、β/ωMCAとして示した。統計：（A）無胚葉マウスにおける食餌群の比較： (B)各食餌の微生物群比較： Kruskal-WallisにBenjamini-Hochberg補正を加えた多重比較とDunn検定による一対比較（*P.adj < 0.05;**P.adj < 0.01;***P.adj < 0.001）。CA：コール酸添加食（レシピエントマウス）。
無菌マウスとコロニー形成マウスの盲腸内の胆汁酸を比較すると［図4B］、微生物コロニー形成により総胆汁酸レベルが上昇し、CTRL微生物叢をコロニー形成しCA飼料を与えたマウスでは有意に高い値を示した。CAは食餌に添加されたが、無菌マウスの盲腸内では豊富ではなかった。これは、CAが小腸で速やかに吸収され、肝臓でTCAに抱合され、微生物叢に胆汁酸ヒドロラーゼ（BSH）が存在しないため、腸で脱共役できないことを示唆している。RLレシピエントマウスの盲腸では低レベルの共役胆汁酸しか検出されなかったことから、微生物叢内のBSH活性が高いことが示唆された。すべてのコロニー形成マウスの特徴は以下の通りであった： (i)ムリコール酸異性体レベルの上昇、(ii)予想通り、第二胆汁酸DCAの検出。DCAレベルは、CTRLマウスで観察されたSOTU 66（DCA産生菌E. murisと100％類似）の相対的存在量が高いことを反映して、CA食を摂取したRLマウスに対してCTRLマウスでわずかに上昇したようであった［図3D］。
結論として、CA飼料を与えた無菌マウスで観察された小腸の表現型は、対照飼料を与えたマウスと比較して、胆汁中のTCA濃度が高く、Tβ/ωMCA濃度が低く、結腸マウスと比較して、盲腸内の非共役胆汁酸（CA、αMCA、β/ωMCA）濃度が低く、二次胆汁酸DCAが存在しないことと関連していた。微生物叢がどのように胆汁酸代謝を制御し、CA誘発腫瘍負荷と小腸の肥大化に影響を与えるかを理解するためには、さらなるメカニズム研究が必要である。
考察
食事組成はCRCリスク、腸内細菌叢、および胆汁酸代謝に影響を及ぼす。本研究では、大腸腺腫のAPC 1311/+ブタモデルにおいて、西洋食によって誘発された腸内細菌叢の変化が、gnotobioticApc1368 N/+マウスに移植する際に有害な影響を及ぼすかどうかを調べた。
食餌中のCA（0.2％w/w、23週）は、生殖細胞なしのApc1368 N/+マウスの上部小腸（肺周囲領域および十二指腸）における病変形成を刺激した。これまでの研究では、メスのApcmin /+マウスにおける一次胆汁酸の影響について、コロニー形成の状態や対象となる腸の部位という点で、相反する結果が報告されている。Mahmoudらは、ヒトではCA以外の主要な一次胆汁酸であるが、マウス肝臓ではさらにムリコール酸（MCA）に変換されるため少量しか産生されない0.5％のチェノデオキシコール酸を10週間食餌介入すると、従来のコロニー形成マウスの十二指腸の病変数が増加することを見出した[41]。Wangらは、食餌中のCA（0.4％、12週間）が病変数を増加させたが、主に小腸の中・遠位部であった[18]。重要なことは、本モデルでは微生物のコロニー形成によって病変形成が抑制されたことである。このことは、レシピエントマウスの食餌（CAを含むか含まないか）やコロニー形成に使用した微生物叢の種類（すなわち、対照食または西洋食を与えたブタ由来）に関係なく起こったことから、CA誘発十二指腸発がんにおける微生物の保護的役割は、明らかに異なる微生物群集によってももたらされることが示された。このことは、Wangらによる、結腸した雌マウスの遠位小腸におけるCA誘発腸管発がんが、抗生物質カクテル（アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシン、メトロニダゾール）による処理で微生物攪乱後、消失したというデータと矛盾する[18]。このことから、微生物叢による胆汁酸代謝の制御は、小腸上部では保護的であるが、小腸遠位部では保護的ではないことが示唆される。
我々の実験におけるもう一つの観察は、CA食を与えた無菌Apc1368 N/+マウスの小腸がかなり長くなったことである。これまでの研究で、無菌マウスではコロニー形成マウスに比べて小腸が長くなることが報告されている[42,43]が、胆汁酸の影響については研究されていない。小腸の延長は、対照食を与えたApc1368 N/+の無胚乳マウスでも起こったが（RL-微生物叢をコロニー形成したマウスと比較して有意に）、これは食餌中のCAによってかなり増強された。最近、Nguyenらは、スモールヘテロダイマーパートナー（SHP）と呼ばれる胆汁酸輸送制御因子の腸特異的欠失による腸管内腔のCAレベルの上昇が、1％CA食を5日間与えた雄マウスの回腸における絨毛長および杯細胞数の変化と関連していることを報告した[44]。小腸の長さは評価されなかったが、この所見はCAが組織形態形成の基礎となる分子過程に関与していることを示唆している。
生殖細胞を持たないApc1368 N/+マウスでは、飼料にCAを補充すると、胆汁酸組成がTβ/ωMCAからTCAにシフトした。従来のマウスでは、TCAとTMCAの比率は約2：1であったが、無胚葉マウスでは1：1であったと報告されている[45]。CA食を与えた無菌Apc1368 N/+マウスでは、TCAとTβ/ωMCAの比は14：1と高く、これらのマウスの胆汁酸プールのバランスが崩れていることが示唆された。興味深いことに、CA飼料でコロニー形成されたマウスの比率は約6：1（CTRLレシピエント）および3：1（RLレシピエント）であり、コロニー形成によって胆汁酸のバランスが正常化したことが示された。CA種とMCA種の比率は、マウスにおける胆汁酸プールの疎水性を決定する上で重要な役割を果たしており、その結果、コレステロール吸収に影響を与える[45,46]。CA食を与えた無菌Apc1368 N/+マウスの胆汁中および腸内のTCA濃度が異常に高いのは、微生物が産生するBSHがないためであり、そのためコレステロール吸収が亢進し、細胞増殖が損なわれている可能性がある。また、無菌マウスで観察された腫瘍形成に直接関係している可能性がある。上部小腸は、DNA損傷作用を持つことが知られている分泌胆汁に直接さらされるからである[47]。このことは、ヒトのFAP症候群で臨床的に関連する上部腸管の腫瘍は、CRCとは異なる病因を持つことを示しているのかもしれない[48]。対照食を与えた無胚葉マウスで腸管長が増加したのは、他の理由によるのかもしれない。TβMCAはFXRアンタゴニストであり、Lgr5+幹細胞の増殖を促進することが見出された[20]。一方、TCAはFXRアゴニストであり、マウス腸管細胞の増殖を促進することがわかった[49]。コロニー形成マウスの遠位腸におけるDCAなどの二次胆汁酸の産生は、腸の上部領域にも間接的な影響を及ぼしている可能性がある。
本研究は、食事介入とCRCとの関連において、ブタからマウスへの糞便微生物叢移植の効果を検討した最初の研究である。微生物叢移植の効果が不完全であったのは、凍結保存したサンプル中の微生物の生存率が変化していたためかもしれない。さらに、宿主の食餌、胆汁酸プール組成、または腸内生理の違いが、特定の種の生存に影響を与えた可能性もある。例えば、マウスはタウロ共役胆汁酸を主に産生するが、ブタ肝臓の胆汁酸のほとんどはグリシンに共役している[50,51]。さらに、マウスのみで検出され、ドナーのブタでは検出されなかったSOTUは、ブタの腸内に存在していた可能性があるが、相対量が少なく、アンプリコンシークエンシングでは検出できなかった（相対量が0.25％未満など）。部分的な微生物叢の移植にもかかわらず、我々はレシピエントに与えた微生物叢の種類と食餌の興味深い影響を観察した。SOTU33（Bilophila wadsworthia、100％）とSOTU8（Bacteroides uniformis、100％）はRLレシピエントでのみ検出された。Bacteroidesと Bilophilaの両種は胆汁に耐性があり、ヒトの動物性食摂取後に増加することが判明している[7]。B. wadsworthiaの増殖は、タウリンのさらなる代謝によりTCAによって促進されることが示された[52]。CRC患者の便におけるメタゲノム解析とメタボローム解析を組み合わせた結果、B. wadsworthiaの発生とDCAレベルとの間に正の関連があることが報告された[9]。しかし、この種はゲノム中にbaiオペロンをコードしていない。我々のFMT試験におけるRLレシピエントマウスには腸病変が少なかったことから、これらのマウスで観察されたB. wadsworthiaの増加は宿主に有害な影響を及ぼさなかった。CTRLレシピエントは二次胆汁酸であるDCAのレベルが高く、SOTU66（E. murisに対して100％）のレベルが高いことと一致していた。RLレシピエントの盲腸におけるタウロ共役胆汁酸のレベルがCTRLレシピエントと比較して有意に低いことは、彼らの微生物叢が胆汁酸を脱共役する能力が高いことを示唆している。CTRL群では盲腸内の胆汁酸の総量が多かったことから、これらのマウスは小腸での胆汁酸の吸収が低く、その結果、盲腸内細菌叢に影響を与えたことが示唆された。我々の研究は、FMT実験の結果の誤解を招く解釈を避けるためには、ドナーとレシピエントの微生物叢を詳細に分析することが不可欠であることを示している。
本研究には明らかな限界がある。それは記述的な研究であり、胆汁酸を与えた無菌マウスで観察された表現型の根底にある分子メカニズムは示されていない。さらに、gnotobioticマウスを用い、十分な数のマウスを用い、仔マウスやケージの影響を考慮し、腸内で厳密に嫌気性細菌を生着させるために通常適切なコロニー形成プロトコルを用いて、十分にデザインされた研究を行うよう注意したが、微生物叢移植の効果は最適ではなかったため、当初の仮説について明確な結論を導き出すことができなかった。
結論として、APC1311/+ブタからの微生物叢移植は、gnotobioticApc1368 N/+マウスに大腸腫瘍を誘発しなかった。対照的に、CAは無菌条件下で十二指腸の病変と小腸の伸長を誘導した。この表現型は、胆汁中のTCAとTβ/ωMCAレベルの変化、およびDCAのような二次的胆汁酸産生の欠如と関連していた。根底にある分子機構と潜在的な臨床的意味を調べるためには、さらなる研究が必要である。
宣言
謝辞
以下の方々に感謝いたします： (i)Apc1638 N/+マウスの繁殖にご協力いただいたSusan Jennings（Functional Microbiome Research Group、Institute of Medical Microbiology、University Hospital of RWTH Aachen）、(ii)マウスサンプリングのお手伝いなど、マウス実験中のご協力いただいたAlina ViehofとAtscharah Panyot（Functional Microbiome Research Group、Institute of Medical Microbiology、University Hospital of RWTH Aachen）、(iii)マウスサンプリングの計画にご協力いただいたAnna Sichler（Technical University of Munich, School of Medicine, Klinikum rechts der Isar, Department of Surgery）。
著者の貢献
実験計画、データ解釈、原稿執筆： Wortmann E、Clavel T
実験の実施： 実験の実施：Wortmann E、Wylensek D、Hermeling S
データ解析： データ解析：Wortmann E、Wylensek D
開発した方法： ベーシックM、ハーメリングS、ブライヒA、リービッシュG
必要不可欠なリソースとインフラの提供： Basic M、Bleich A、Haller D、Tolba R、Liebisch G、Janssen KP、Clavel T
資金を確保した： Bleich A、Haller D、Tolba R、Liebisch G、Clavel T
図表作成： Wortmann E
プロジェクトのコーディネート： Clavel T
データおよび材料の利用可能性
16S rRNA遺伝子アンプリコンのデータセットはENAに寄託され、以下のプロジェクト番号で利用可能： PRJEB73361。
財政的支援およびスポンサー
Basic M、Bleich A、Haller D、Janssen KP、Clavel Tは、ドイツ研究財団（DFG）から資金援助を受けた：プロジェクト番号395357507 - SFB1371 "Microbiome Signatures"。Clavel TはDFGから追加助成を受けた：プロジェクト番号453229399。
利益相反
ハラーDはMicrobiome Research Reports誌の編集委員であり、他の著者は利益相反がないことを宣言している。
倫理的承認と参加同意
本実験は、EU指令2010/62/EUに従い、LANUV倫理承認nr.81-02.04.2018.A425の下で実施された。
公表に関する同意
該当なし。
著作権
© The Author(s) 2024.
補足資料
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Wortmann E, Wylensek D, Basic M, Hermeling S, Bleich A, Haller D, Tolba R, Liebisch G, Janssen KP, Clavel T. 腸内細菌叢はgnotobioticマウスにおける胆汁酸による小腸腫瘍形成を防ぐ。Microbiome Res Rep2024;3:44. http://dx.doi.org/10.20517/mrr.2024.20
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Wortmann E, Wylensek D, Basic M, Hermeling S, Bleich A, Haller D, Tolba R, Liebisch G, Janssen KP, Clavel T. 腸内細菌叢は、gnotobioticマウスにおける胆汁酸による小腸腫瘍形成を予防する。マイクロバイオーム研究報告。2024; 3(4):44. http://dx.doi.org/10.20517/mrr.2024.20
シカゴ/トゥラビアンスタイル
Wortmann, Esther, Klaus-Peter Janssen, and Thomas Clavel. 2024. "腸内細菌叢はgnotobioticマウスにおける胆汁酸による小腸腫瘍形成を防ぐ"Microbiome Research Reports. 3, no.4: 44. http://dx.doi.org/10.20517/mrr.2024.20
ACSスタイル
Wortmann, E.; Wylensek D.; Basic M.; Hermeling S.; Bleich A.; Haller D.; Tolba R.; Liebisch G.; Janssen K.P.; Clavel T. 腸内細菌叢は同胞性マウスにおける胆汁酸による小腸腫瘍形成を防ぐ。Microbiome. Res. 2024,3, 44.http://dx.doi.org/10.20517/mrr.2024.20
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特集号
本稿は、特集「食事、マイクロバイオーム、がんの相互作用を探る」に属する。
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