慢性脳梗塞モデルラットにおける腸内細菌叢移植と短鎖脂肪酸の認知機能障害に対する保護効果

慢性脳梗塞モデルラットにおける腸内細菌叢移植と短鎖脂肪酸の認知機能障害に対する保護効果
蘇 紹華、陳 明、呉 毅枋、林 起、王 大鵬、孫 潤、海 建
初出：2023年1月10日
https://doi.org/10.1111/cns.14089
Shao-Hua SuとMing Chenはこの研究に等しく貢献した。
この論文について
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概要
目的
慢性脳虚血病態における腸内細菌叢および代謝産物である短鎖脂肪酸（SCFAs）の変化について，その役割と機序は明らかでない．本研究では，慢性脳低灌流（CCH）により誘発される腸内細菌叢とSCFAsの代謝プロファイル，およびCCH誘発海馬神経細胞障害に対する糞便微生物移植（FMT）およびSCFAs投与の効果と機序について検討した．

研究方法
両側総頸動脈閉塞（BCCAo）を用いてCCHモデルを構築した。糞便および海馬の腸内細菌叢とSCFAsプロファイルを16SリボソームRNA配列決定およびガスクロマトグラフィー質量分析により評価した。海馬の組織ではRNA配列解析が行われた。また、ウェスタンブロット、免疫沈降法、免疫蛍光法、ELISA法により、潜在的な分子経路と差異遺伝子を検証した。認知機能については、Morris水迷路試験により評価した。ミトコンドリアとシナプスの超微細構造は、透過型電子顕微鏡で検査した。

結果
慢性脳梗塞は糞便中の酢酸およびプロピオン酸の減少、海馬の酢酸の減少を誘発したが、FMTおよびSCFAs投与後、糞便中の微生物群集構造および組成を変化させることにより回復させた。さらに、海馬では、FMTとSCFAsの補充により、ミクログリアとアストロサイトの活性化を抑制するとともに、ミクログリアの表現型をM1からM2へと切り替えることで抗神経炎症作用を発揮した。さらに、FMTとSCFAsの投与は、神経細胞の損失とミクログリアによるシナプスの損失を軽減し、シナプス小胞の融合と放出のプロセスを正常に維持し、結果としてシナプスの可塑性を改善させた。さらに、FMTとSCFAsの補給は、ミトコンドリア代謝のリプログラミングを介して酸化的リン酸化の機能不全を防止した。FMTとSCFAsの投与による上記の効果は、CCHによる認知機能障害の抑制につながった。

結論
慢性脳虚血による神経細胞傷害を軽減するために，FMTとSCFAsの補充は腸内細菌叢に基づく実行可能な戦略であることが明らかになった．

1 はじめに
腸内細菌叢（GM）は、腸-脳軸に沿ったダイナミックな双方向コミュニケーションを通じて、免疫系、代謝系、神経系の発達と機能を制御することが近年明らかにされている。1 GMの組成変化は、宿主の恒常性に影響を与え、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、自閉症、精神疾患などの中枢神経系（CNS）に関する複数の疾患と密接に関連していることが知られているが2-6 CNS関連の疾患に対するGMの役割は依然として不明である。

腸内細菌叢の変化は、ミクログリアを介した神経炎症および頭蓋内虚血傷害による認知障害に関連しており7, 8、急性脳虚血（CI）および脳卒中の潜在的危険因子として認識されている9。しかし、慢性的な脳梗塞に対するFMTの長期的な治療効果についてはまだ明らかにされておらず、さらなる検討が必要である。

これまでの研究によると、ラットおよびヒトのGMは、Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteriaの4つの系統が支配的である。また、ラットのGMではLactobacillus属とTuricibacter属が優勢であり、Bifidobacterium属とFaecalibacterium属は優勢ではない。GMの菌種は、環境因子や病気の状態によって、病原性にも通性にもなりうる。また、同じ種がある疾患の発症を促進する一方で、別の疾患を予防する可能性もある。14 しかし、慢性CIに対するGMの影響はほとんど不明である。

細菌が産生する短鎖脂肪酸（SCFA）には、主に酢酸、プロピオン酸、酪酸が含まれ、血液脳関門（BBB）を通過し、様々な神経活性特性や腸-脳シグナル伝達経路への影響により、脳のプロセスに大きな影響を与える15, 16 SCFAは、免疫経路、内分泌経路、迷走神経経路、体液経路を通じて脳機能を調節し17、神経炎症、腸管ホルモンおよび神経栄養因子の分泌、ならびに神経機能、学習、記憶、および気分に直接的または間接的に影響を与える迷走神経求心性の活性化に影響を与えることが報告されている。SCFAはまた、虚血性脳卒中後の神経炎症および神経学的障害を緩和することが見出されており18、したがって、内障害の有効な治療法となる可能性がある。10 しかしながら、SCFAはGMのディスバイオシスに大きな影響を与えることが示されており、SCFAの内障害に対する効果は議論の余地があることが示されている。さらに、慢性的な脳梗塞に対するGMを標的とした介入の潜在的なメディエーターとしてのSCFAの効果について調査した研究は比較的少ない。以前の研究では、カニクイザルの脳梗塞後6ヶ月および12ヶ月にGMが産生するSCFAが有意に減少することが示された11。したがって、GMが産生するSCFAの効果がさらに明らかになれば、微生物を用いた慢性内耳治療の戦略が拡大する可能性がある。

ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）は、中枢神経系の疾患において重要な役割を果たしており、クラス I（HDAC1-3, 8）、II（HDAC4-7, 9, 10）、III（Sirtuin1-7）、および IV（HDAC11）に分類されます19。 19 海馬では、HDAC1、HDAC2、HDAC8が認知機能障害に関連する神経炎症を促進することが報告されており20、HDAC3は樹状突起棘密度およびシナプス可塑性に関連するタンパク質のレベルを低下させることが報告されています21。さらに、HDAC6の活性の増加は、記憶障害と関連しています22。対照的に、HDAC4およびHDAC5の発現レベルおよび活性は、軽度外傷性脳損傷後に海馬でダウンレギュレートされます23。さらに、酢酸での長期処理により、HDAC2、HDAC5、HDAC7およびHDAC8のmRNAレベルが低下することが示され24、SCFAがHDACの発現を媒介すると示唆されています。この仮説の検証にはさらなる調査が必要であるが、慢性的なCIにおいては、HDACsの抑制がSCFAの最も重要な効果である可能性がある。

慢性CIとは，脳血流の低下が長期間続く状態を指し，慢性脳低灌流（CCH）により維持されると考えられている．本研究では，ヒトの慢性CI状態を模倣したCCHのラットモデルを用いて，海馬損傷に対するSCFAのGMおよび代謝プロファイルを検討した．さらに、FMTとSCFAsの補充を適用し、慢性CIに対する新しい効果的な治療法を設計するために、CCH誘発海馬損傷の治療に対するGMとSCFAsの潜在的な役割とメカニズムを評価した。

2 材料と方法
2.1 動物と実験プロトコール
すべての動物実験のプロトコルは、同済病院の Institutional Animal Care and Use Committee によって承認され、Guide for the Care and Use of Laboratory Animals に従って実施された。雄のSprague-Dawleyラット（年齢、5週、体重[BW]、180±10g）は、上海実験動物研究センター（中国、上海）または中英Sippr/BK実験動物有限公司から購入し、同済病院（中国、上海）で飼育した。(上海、中国)から購入し、病原体を含まない特定の動物施設において、12時間の明暗サイクル、23±1℃、60％の一定湿度、餌と水への自由なアクセス下で飼育した。1週間の馴化期間後、ラットは、（1）偽手術群、（2）両側総頸動脈閉塞（BCCAo）群、（3）BCCAo＋FMT群、（4）BCCAo＋SCFAs群の4群のいずれかにランダムに振り分けられた。実験タイムスケジュールを図1に示す。

詳細は画像に続くキャプションに記載
図1
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パワーポイント
キャプション
12週目に、ラットはモリス水迷路による空間学習の評価後に犠牲になった。新鮮な糞便サンプルと脳組織は、解析のために直ちに採取されるか、-80℃で保存された。

2.2 BCCAoの手順
BCCAo後8-12週目に、ヒトの脳血流低下を模倣してラットのCCH相を維持した25。したがって、本研究では、慢性CIを模倣して12週間BCCAoを継続した。その後，ペントバルビタールナトリウム50 mg/kgBWを腹腔内投与し，麻酔をかけた．両側総頸動脈を正中切開して露出させ、その後5-0絹糸でしっかりと二重結紮した。shamラットはBCCAoラットと同じ処置を行ったが、両側総頸動脈の結紮は行わなかった。

2.3 抗生物質、FMT、およびSCFAs処理
BCCAo + FMT群のラットには、バンコマイシン100 mg/kg BW、硫酸ネオマイシン200 mg/kg BW、メトロニダゾール200 mg/kg BW、アンピシリン200 mg/kg BWからなる抗生物質カクテルを毎日4日間胃ろうで投与し、GMを枯渇させた。10。

Sham群ラットの新鮮な糞便を採取し、直ちに滅菌生理食塩水で100 mg/mLに希釈し、8000×g、4℃で5分間遠心分離して最終的なGM懸濁液を得た。BCCAo＋FMT群の各ラットには、最終GM懸濁液2 mlを12日間連続で胃内投与した26。さらに、FMTの効果を維持するため、上記の操作を3日に1回、12週間行った。

BCCAo + SCFAs 群のラットには、67.5 mM 酢酸ナトリウム、25.9 mM プロピオン酸ナトリウム、40 mM 酪酸ナトリウムからなる SCFAs のカクテル（Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO, USA）を毎日 0.1 ml/10 g BW で胃内投与し、12 週間連続投与した 27, 28。

2.4 16S リボソーム RNA (rRNA)遺伝子配列の決定
糞便サンプルは凍結保存し、BioNovoGene Co. (Suzhou, China) に送り、16S rRNA 遺伝子の塩基配列を決定した。QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) を用いて、糞便サンプル（250 mg, wet weight）から全 DNA を製造者の指示に従って抽出した。各DNAサンプルについて、16S rRNA遺伝子のV3およびV4超可変領域を、プライマー対341F（5′-CCT AYG GGR BGC ASC AG-3′）／806R（5′-GGA CTA CNN GGG TAT CTA AT-3′） で増幅させた。その後、PCR産物をAxyPrep™ DNA Gel Extraction Kit (Axygen Scientific, Inc., Union City, CA, USA)を用いて精製した。その後、精製したPCR産物を等モル濃度でプールし、QuantiFluor™-ST蛍光光度計（Promega Corporation, Madison, WI, USA）で定量し、NovaSeq PE250 sequencing instrument (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) でメーカー指定のシーケンシングを実施した。

サンプル内の GM 種の多様性を評価するために，Chao1 リッチネス指標と存在量ベースのカバレッジ推定量（ACE）多様性指標を算出し，Mann-Whitney U 検定で比較した．主座標分析は、サンプル間のGM種の多様性を評価するために使用された。微生物相の異常は、GMの各分類群の相対存在量をファミリーおよび種レベルで計算することにより評価した。効果量を用いた線形判別分析を用いて、GM種の存在量の違いを明らかにした。これらのデータは、BioProject データベース（識別コード：PRJNA869931）で閲覧可能である。

2.5 SCFAsプロファイリング
糞便サンプル（100 mg）および海馬組織（60 mg）中のSCFAs量は、TRACE™ 1310-ISQ LT GCシステム（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いたガスクロマトグラフ質量分析（GC-MS）により、株式会社バイオノボジーンが実施した。SCFAsの標準物質は、アセテート、プロピオン酸、ブチレート、イソブチレート、バレレート、イソバレレート、カプローエートの混合物を使用した。キャリアガスにはヘリウムを用い，1 ml/minの一定流量で流した。サンプル（1μl）を10:1のスプリット比で注入した。インジェクター、トランスファーライン、イオンソースの温度はそれぞれ250℃、250℃、230℃に設定した。初期温度は90℃で2分間維持し、その後10℃/分で120℃、5℃/分で150℃、25℃/分で250℃まで昇温した。最終温度は2分間維持した。データ取得は、電子衝撃式イオン化法70eV、フルスキャンモードで行い、m/z範囲は35-780とした。

GC-MSデータの正規化、変換、異常値除去、スケーリングはRソフトウェア（v3.3.2）を用いて実施した。SCFA の 7 種類の代謝物濃度を定量化し，ノンパラメトリックな Mann-Whitney U 検定で比較した。部分最小二乗法による判別分析を用いて、群間の差異を明らかにした。

2.6 RNA配列決定
凍結海馬組織のRNA-seqは、Suzhou BioNovoGene Co, Ltd.によって実施された。簡単に言えば、RNeasy Miniキット（Qiagen GmbH）を用いてRNAを精製した。精製したRNAは、製造者の指示に従って、NovaSeq Pe250 Platform (Illumina Inc.)を用いて配列決定した。遺伝子セットの濃縮解析は、Kyoto Encyclopedia of Genes and GenomesとGene Ontologyデータベースを参考に行った。差次的発現遺伝子（DEG）は、確率（p）値<0.05および｜log2（fold change）｜>0.5の基準で判定した。これらのデータは、BioProjectデータベース（識別コード：PRJNA827266）でアクセス可能である。

2.7 モリス水迷路
円形プール(直径1.8 m、高さ60 cm)を東西南北の4象限に分割した。ラットは1日4回、4日間連続して訓練を受けた。訓練期間中、南西側中央の水面下1 cmに白い台(直径9 cm)を設置した。各試行において、ラットがプラットフォームに到着するまでの時間は最大で60秒であった。プラットフォームに到着したラットは15秒間プラットフォームに留まり、他のラットは手動でプラットフォームまで誘導した。脱出潜時は、同日に行った4回の試行におけるプラットフォーム発見までの平均時間として算出した。5日目にはプラットフォームを設置せず、プール内で60秒間自由遊泳させ、プラットフォーム滞在時間の割合、プラットフォーム通過回数、遊泳速度、遊泳経路を測定した。すべてのデータは、コンピュータ化されたビデオシステムで記録された。

2.8 ミトコンドリアの分離
ミトコンドリアは、Qproteome Mitochondria Isolation Kit（Qiagen GmbH）を用いて単離した。簡単に言えば、海馬組織（20 mg）を切り刻み、プロテアーゼ阻害剤溶液を含む溶解バッファー2 ml中でホモジナイズし、1000 gで4℃、10分間遠心分離した。その後、上清を回収し、1.5 ml の氷冷した破砕バッファに再懸濁し、6000 g で遠心分離した。第二上清を回収し、750 μl のミトコンドリア精製バッファに再懸濁し、ミトコンドリア精製バッファ層上に添加した。14000gで15分間遠心分離した後、ミトコンドリアを含むペレットを、8000gで10分間の遠心分離を介して1.5mlのミトコンドリア保存バッファーで3回洗浄した。最後に、精製したミトコンドリアを膜電位検出用のミトコンドリア保存液に再懸濁するか、-80℃で保存し、後の分析に用いた。

2.9 ミトコンドリア膜電位
ミトコンドリア膜電位は、JC-1 染色キット（Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China）を用いて測定した。簡単に言うと、高純度ミトコンドリア（10μl）を JC-1 染色試薬（100μl）中で 10 分間インキュベートした。画像は蛍光顕微鏡（IX71；オリンパス株式会社、東京、日本）を用いて撮影した。赤色蛍光と緑色蛍光の比率を算出し、各群の分離ミトコンドリアの膜電位を評価した。健常ミトコンドリアはフロー解析図の第 1 象限が多く、赤色蛍光の強度が高く、緑色蛍光の強度が低い。一方、損傷ミトコンドリアはフロー解析図 の第 4 象限が多く、赤色蛍光の強度が低く、緑色蛍光の強度が高いことが示された。

2.10 海馬組織のアデノシン三リン酸（ATP）量と電子輸送連鎖（ETC）複合体I-V活性
海馬組織のATP量およびETC複合体I-V活性は、市販のアッセイキット（北京太陽生物科学技術有限公司、中国・北京）を用いて、メーカーの説明書に従って定量化した。簡単に説明すると、等量の海馬タンパク質をウェルにロードし、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドNADHデヒドロゲナーゼ（複合体I）とATP量については340 nm、シトクロムcレダクターゼ（複合体III）またはシトクロムcオキシダーゼ（複合体 IV）については550 nm、コハク酸コエンザイムQレダクターゼ（複雑なII）については605 nm、F0F1 ATPase（複雑なV）については660 nmの分光光度計で吸収を測定した。ATP量はμmol/mLで、ETC複合体I〜V活性はμmol/mg proteinで表した。

2.11 ジヒドロエチジウム（DHE）染色
活性酸素種（ROS）は、DHEで染色することにより検出した。簡単に説明すると、組織サンプルを10mM DHE（Beyotime Institute of Biotechnology）中で室温、暗所で30分間インキュベートした後、倒立顕微鏡（IX71；Olympus Corporation）で観察した。DHE 染色の結果は、フローサイトメトリーで確認した。

2.12 免疫蛍光標識法
脳組織を4％パラホルムアルデヒドで4℃、一晩固定し、正中線に沿って分割した。半球切片を順次脱水し、パラフィンに包埋後、5μm 厚の冠状切片に切り出し、免疫蛍光標識した。トリスエチレンジアミン四酢酸緩衝液で抗原を回収した後（pH9. 0）で抗原回収した後、脱パラフィンした切片を10％非免疫ヤギ血清とともに室温で30分間インキュベートし、神経核抗原（希釈、1：200；Abcam、ケンブリッジ、米国）、電離カルシウム結合アダプター分子1（Iba-1）（希釈、1: 250；Abcam）、インターロイキン-1β（IL-1β）（希釈、1：250；Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA）、アルギナーゼ1（Arg-1）（希釈、1：250；Proteintech, Rosemont, IL, USA）、ポストシナプス密度95（PSD95）（希釈、1：200；Cell Signaling Technology，Inc. , Danvers, MA, USA）、グリア線維酸性タンパク質（GFAP）（希釈、1:200; Abcam）を、加湿器内で4℃、一晩静置した。リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、切片をテトラエチルローダミンイソチオシアネート標識二次抗体（希釈、1：200；サンタクルーズバイオテクノロジー社、ダラス、テキサス州、米国）で37℃、1時間染色した。海馬 CA1 領域の陽性細胞を共焦点蛍光顕微鏡（LSM 700; Carl Zeiss AG, Jena, Germany）で可視化した。

2.13 ウェスタンブロット解析
海馬組織を氷冷した緩衝液でホモジナイズした後、10,000 g、4℃で5分間遠心分離を行った。その後、ウェスタンブロット解析のために上清を回収した。簡単に言うと、タンパク質サンプル（20μg）を8％、10％、12％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で分離し、ポリビニリデン・ジフルオリド膜にエレクトロブロッティングし、HDAC6に対する抗体（希釈度、1: 1500; Abcam）、オクルディン（希釈、1:2000; Abcam）、クローディン5（希釈、1:500; Invitrogen Corporation）、早期成長応答1（Egr1）（希釈、1:1000; Cell Signaling Technology、Inc. )、脳由来神経栄養因子 (BDNF) (希釈、1:1500; Abcam)、小胞関連膜タンパク質2 (VAMP2) (希釈、1:1000; Abcam)、シナプトソーム関連タンパク質25 (SNAP25) (希釈、1:1000; Abcam),syntaxin 1a(Stx1a) (希釈、1: 1500; Abcam）、成長関連タンパク質43（Gap43）（希釈、1：1500; Abcam）、シナプトフィシン（Syp）（希釈、1：1000; Abcam）、N-methyl-D-aspartate receptor 1（NMDAR1）（希釈、1：1000； Abcam）、PSD95（希釈、1：1000； Cell Signaling Technology、Inc. )、NADH:ユビキノン酸化還元酵素サブユニットB2 (Ndufb2) (希釈、1:500; Abcam)、ATP合成酵素膜サブユニットc遺伝子座1 (Atp5mc1)(dilution, 1:500; Abcam), 電圧依存アニオンチャネル1 (VDAC1) (dilution, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), βアクチンを含む。 )、β-アクチン(希釈、1:5000; Abcam)を4℃で一晩、続いて西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギまたはマウス免疫グロブリンG二次抗体を室温で1時間添加した。タンパク質のバンドの検出は、強化化学発光基質溶液（EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA）を用いて行った。タンパク質の定量は、内部コントロールとしてβ-actin または VDAC1 の光学密度に対して行った。

2.14 免疫沈降（IP）解析
簡単に言うと、ホモジネートした海馬組織（200μg）をStx1a抗体（3μg）と共に4℃で一晩インキュベートした。IPバッファで15分間3回洗浄した後、タンパク質をプロテインGセファロースビーズ（シグマ・アルドリッチ株式会社）および抗体混合物とともに4℃で2時間インキュベートした。その後、沈殿物を 10,000 g で 1 分間遠心分離し、IP バッファーで 3 回洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去した。その後、免疫複合体化ビーズをローディングバッファーに再懸濁し、95℃で5分間加熱し、10,000 gで遠心分離した。最後に、上清をStx1aおよびSNAP25のイムノブロッティング検出に適用した。残りのホモジネートはインプットコントロールとして使用した。

2.15 酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA)
海馬組織中のアセチル-コエンザイムA（アセチル-CoA）の量は、市販のELISAキット（Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China）を用いて、製造者の説明書に従って定量化した。簡単に言うと、等量のタンパク質をウェルにロードし、450nmの波長で光学密度を測定し、標準曲線と比較した。結果は ng/ml タンパク質として表した。

2.16 電子顕微鏡観察
シナプスとミトコンドリアの超微細構造変化を観察するために、海馬 CA1 領域の新鮮な 1 mm 厚の冠状切片を 2.5% グルタールアルデヒドで 4°C で一晩固定し、0.1 M リン酸緩衝食塩水で 3 回洗浄した後、1% 四酸化オスミウムで 4°C で 2 時間固定し、段階的エタノールで脱 水しエポキシ樹脂中に包埋した。無作為に選んだ超薄切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、電子顕微鏡で観察した（Philips Healthcare, Best, Netherlands）。

2.17 統計解析
データは、平均値±平均値の標準誤差で示した。比較は一元配置分散分析、次いで多重比較のためのポストホックダネット検定を用いた。p値＜0.05は統計的に有意であるとみなした。

3 結果
3.1 FMTとSCFAはCCHによって誘発されたGMのディスバイオーシスを改善した
BCCAo後12週目に、BCCAo群ではChao1 richnessおよびACE diversity indexがsham群に比べ有意に減少し（いずれもp＜0.001）、GMの多様性がCI延長とともに徐々に減少していることが示された（図2A）。しかし、FMT単独では、Chao1 richnessおよびACE diversity指数が有意に増加し（それぞれp = 0.019および0.034）、CCHによるGMの減少に対してFMTがプラスの効果を持つことが示唆された。Bray-Curtis unweighted unique fraction metric distanceに基づく主座標分析によって決定されるβ多様性は、GM組成の違いを反映しており、偽薬群とBCCAo群（ADONIS、p＝0.002）、BCCAo群とBCCAo＋FMT群（ADONIS、p＜0.001）、BCCAoとBCCAo＋SCFAs群（ADONIS、p＜0.001）間で、はっきりと別グループ化のパターンが確認された（図2B）。さらに、4つの治療群間で共有または固有の操作的分類単位（OTU）の数を示すために作成したベン図では、BCCAo後12週目に、偽薬群で103/1094、BCCAo群で55/984、BCCAo＋FMT群で88/1062、BCCAo＋SCFAs群で69/986の固有のOTUを確認しました(図2E)。さらに、4群間の分類群存在度の違いを科および種レベルで評価した。ファミリーレベルでの上位10分類群の詳細な分析により、FMTまたはSCFAsは、Prevotellaceae（BCCAo vs. BCCAo + FMT、p = 0.003）の相対存在度を有意に増加させることが実証された。 003）、Ruminococcaceae（BCCAo vs. BCCAo + FMT, p = 0.017）、Erysipelotrichaceae（BCCAo vs. BCCAo + SCFA, p = 0.004）、およびAckermansiaceae（BCCAo vs. BCCAo + FMT, p = 0.001; BCCAo vs. BCCAo + SCFAs, p = 0. 003）であることが明らかになった。 001）、一方、上位10種の腸内細菌を種レベルで特異的に分析すると、FMTまたはSCFAsはLactobacillus johnsonii（BCCAo vs. BCCAo + FMT, p = 0.03）、Ruminococcus_sphere（BCCAo + SCFAs）の相対存在度を顕著に増加することが実証された。 03）、Ruminococcus_sp_N15_MGS_57（BCCAo vs. BCCAo + FMT, p = 0.002）、およびAkkermansia muciniphila（BCCAo vs. BCCAo + FMT, p = 0.001；BCCAo vs. BCCAo + SCFAs, p = 0.001）はBCCAo後12週で上昇した（図2C,D）。さらに、4群間のGMバイオマーカーの変化をさらに調べるために線形判別分析を行ったところ、FMTとSCFAsは科レベルでRuminococcaceae、目レベルでClostridia_UCG_014の集団を濃縮することが示された（図2F）。

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図2
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パワーポイント
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これらの結果から、CCHはGMの組成を変化させ、FMTとSCFAsはRuminococcaceaeとClostridia_UCG_014の存在量を増加させることによって慢性CI後のGMをリモデリングしたことが示唆された。

3.2 FMTとSCFAsはGMを調節することにより、CCHによる酢酸含量の減少を緩和した。
SCFAs の微生物代謝産物は、微生物叢-腸-脳軸の重要な調節因子として提案されている。そこで、GC-MSを用いて、各群の糞便試料および海馬組織中のSCFAs濃度を検出した。部分最小二乗法による判別分析により、SCFAsの微生物代謝産物の群間差が明確に示された（図3C,D）。酢酸とプロピオン酸の含有量は、BCCAo後の糞便サンプルで減少し（それぞれp = 0.036と0.009）、FMTとSCFAsによる処理で元に戻った（それぞれp = 0.046/0.028と0.036/0.02）（図3A）30興味深いことに、海馬組織ではBCCAo後に明らかに酢酸のみが減少し（p = 0.008）。 008）、FMTおよびSCFAsによる治療後に正常レベルに回復した（それぞれp = 0.008および0.008）（図3B）、海馬組織の代謝物のうち最大の変化は、CCHに対するFMTおよびSCFAsによる治療後に酢酸で生じたことが示唆された。

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図3
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酢酸の産生量の増加が、慢性CI状態でのFMTおよびSCFAs投与後のGMの変化によるものかどうかをさらに検討するために、糞便中の16S rRNAおよびSCFAsの代謝物のGC-MSによる複合的な解析をその後行った。その結果、FMT および SCFAs 処理後の酢酸含量の増加は Ruminococcus_sp_N15_MGS_57 の存在量の増加と正の相関があり（それぞれ p = 0.02、0.025）（図 3E、F）30 、酢酸の生成量の増加は CCH に対する Ruminococcus_sp_N15_MGS_57 の増加から生じたと考えられることが示された。

3.3 FMTとSCFAは、ヒストン修飾、シナプス機能、ミトコンドリアエネルギー代謝の調節を通じて海馬の回復を促進した。
CCHに応答する海馬に対するFMTおよびSCFAの効果に潜在的に関与する下流シグナル伝達因子を同定するために、海馬のトランスクリプトームプロファイルをin vivoで評価した。Gene Ontology解析の結果、ヒストン修飾に関連する5つのダウンレギュレーションされたパスウェイが特定された一方、神経細胞体、細胞増殖の制御、シナプスとエネルギー代謝を含むいくつかのアップレギュレーションされたパスウェイがFMTとSCFAsと関連していた（図4A,C）。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomesに基づくと、酸化的リン酸化経路はFMTおよびSCFAsと有意に相関していた（図4A,C）。さらに、遺伝子セット濃縮解析により、酸化的リン酸化、抗酸化活性、シナプス小胞サイクル、ミトコンドリア呼吸鎖複合体I、ATPase活性、酸化還元酵素活性がFMTおよびSCFAsによる処理後に著しく上昇することが確認された（図4E）。これらの経路には様々な DEGs が関与しており、そのうちのいくつかをさらに検証した。シナプス（Gap43、Syp、Stx1a）、ミトコンドリアエネルギー代謝（Ndufb2、Atp5mc1）、虚血後の炎症と損傷（Egr1）32、33に関連する遺伝子をウェスタンブロット解析で確認し、ボルカノプロットに含めた（図4B、D）。これらの結果は、炎症反応、神経細胞の成長、シナプス、エネルギー代謝が、FMTとSCFAsによる治療後の顕著なシグナル伝達経路である可能性を示しており、さらなる調査が必要である。

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図4
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3.4 FMTとSCFAはCCH誘発の認知機能障害を軽減した
我々の以前の研究で説明したように、34 CCHは認知機能障害につながる可能性がある。RNA-seq の結果に基づいて、神経細胞成長、シナプス可塑性、炎症反応など、いくつかの認知関連経路が FMT と SCFA に反応した。そこで、古典的なモリス水迷路を用いて、4群間の認知機能を観察した。BCCAo群のラットは、訓練期間中の逃避潜時が長く、プラットフォームの横断や目標象限への滞在時間が短く、空間学習能力の低下が確認された。しかし、FMTとSCFAは、この現象を顕著に改善した（図5A-C）。さらに、BCCAo群のラットは無目的にプラットフォームを探す傾向があったが、BCCAo＋FMTおよびBCCAo＋SCFAs群のラットはプラットフォームを焦点的に探すことを示した（Figure 5E）。これらの結果は、FMTとSCFAsの認知機能障害に対する効果を示しています。先行研究では、海馬のCA1領域における神経細胞の損失が認知障害と強く関連していることが示された34。そこで、神経核抗原発現の免疫細胞化学的解析も行ったところ、CCHによる神経細胞損失はFMTおよびSCFAsによって明らかに抑制された（図5H、I）。このことは、SCFAsが遊離脂肪酸受容体とHDACの阻害を介して微生物相-腸-脳の相互作用に影響を与えている可能性を示唆している14。しかし、遊離脂肪酸受容体は海馬ではほとんど発現していない。そこで、海馬におけるHDACのタンパク質レベルをさらに評価した。その結果、CCHはHdac6タンパク質レベルを顕著に上昇させ、FMTとSCFAによって有意に低下させた（図5F、G）。この治療戦略は、HDACの阻害を介してCCH誘発認知機能障害を部分的に改善できることが示された。

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図5
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3.5 FMTとSCFAはCCHによる海馬のシナプス機能障害を抑制した
脳虚血は海馬のシナプスの可塑性を低下させる可能性があり、35 認知機能障害との関連が指摘されている。RNA-seq の結果、シナプス小胞、シナプス前、シナプス後密度、ニューロン間シナプス、シナプス組織、シナプス小胞輸送などのシナプス経路が、FMT および SCFAs 処理後に発現が増加することが示された。そこで、CA1領域におけるシナプスの超微細構造を4群間で比較した。CCH群では、シナプス前膜とシナプス後膜が不明瞭でぼやけ、シナプス間隙が広く、シナプス後膜の密度が低かった。しかし、FMTとSCFAは、シナプス前後膜が明瞭で、シナプス間隙が狭く、シナプス後部の密度が高くなり、シナプスの超微細構造を改善した（図6G）。次に、シナプス前タンパク質マーカーSypおよびGap43、シナプス後タンパク質マーカーPSD95およびNMDAR1、ならびにシナプス小胞ドッキング／融合関連タンパク質Stx1a、SNAP25およびVAMP2の発現パターンをウェスタンブロット分析により評価した。その結果、BCCAo群ではSyp、Gap43、PSD95、NMDAR1、Stx1aのタンパク質発現量が有意に減少しており、CCHがシナプス前／シナプス後膜の破壊と、シナプス小胞のエクソサイトーシスに関連していることが示唆された。しかしながら、BCCAo群と比較して、BCCAo＋FMT群およびBCCAo＋SCFAs群では、これらのマーカーのタンパク質レベルが顕著に上昇し、FMTおよびSCFAsによってシナプス伝達が少なくともある程度回復したことを示している（図6A,B）。

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図6
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可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（SNARE）複合体は、シナプス小胞に存在する小胞-SNAREタンパク質VAMP2とシナプス前膜に存在する標的-SNAREタンパク質Stx1aおよびSNAP25から構成されており、膜融合を促進してシナプス神経伝達物質の放出を導く36興味深いことに、CCHはStx1aのタンパク質レベルを著しく減少したが、VAMP2とSNAP25は減少しなかった（図6A, B）．SNARE複合体がCCHによって影響を受けるかどうかを判断するために、Stx1a抗体でIP分析を行い、Stx1aとSNAP25の結合を評価した。さらに、Stx1a/SNAP25複合体におけるSNAP25のタンパク質量を測定するために、ウェスタンブロット解析を行った。IPの結果、IP中のSNAP25と入力中のSNAP25の比率はCCHによって著しく低下し、CCHに反応してStx1aとSNAP25の結合が弱まったことが示された。しかし、この傾向はFMTとSCFAによって逆転し、CCHによるSNAP25のStx1aからの解離を防いでいることが示唆された（図6C,D）。

3.6 FMTおよびSCFAは、CCH後の海馬組織において、ミクログリアの偏光パターンを再構築し、シナプスの巻き込み現象を緩和した。
Egr1 は、マクロファージの分化と活性化を制御する転写因子であり、ミクログリアとアストロサイトの活性化と密接な関係がある37, 38。本研究では、Egr1 の mRNA 発現が CCH によって急激に上昇し、FMT と SCFAs による処理によって回復した。そこで、Egr1 のタンパク質レベルを測定するためにウェスタンブロット分析を行い、mRNA の結果を確認した（図 6A,B）。続いて、ミクログリアの活性化と極性を、ミクログリアとM1およびM2サブタイプのマーカーとして、それぞれIba-1、IL-1β、およびArg-1の免疫蛍光分析によって評価した。IL-1β陽性細胞の比率はCCH群で上昇したが、FMT群およびSCFAs群では上昇しなかった。それにもかかわらず、Arg-1陽性細胞の割合は、FMTおよびSCFAsによる処理後にダウンレギュレートされた（図7A,B,E,F）。Iba-1+IL-1β+およびIba-1+Arg-1+細胞の比率は、CCHによって著しく増加し、CCHがミクログリアの活性化およびM1サブタイプへの分化を誘導することが示唆された。FMTおよびSCFAsによる処理後、Iba-1+およびIba-1+IL-1β+細胞の割合は有意に減少し、Iba-1+Arg-1+細胞の割合は有意に増加しており、FMTおよびSCFAsによる処理がミクログリア活性化を抑制し、M2サブタイプへの分化を促進することが確認できた（図7A、B、D、G、H）。また、アストロサイトの活性化をアストロサイトのマーカーであるglial fibrillary acidic proteinの免疫蛍光法で評価したところ、ミクログリアの活性化と同じ傾向を示した（図7C,I）。つまり、FMTとSCFAsによる処理は、転写因子Egr1の発現とミクログリアおよびアストロサイトの活性化を抑制するとともに、M1表現型からM2表現型への分化を促進し、抗神経炎症作用を示すことが明らかとなった。さらに、M1炎症性ミクログリアは、タイトジャンクションタンパク質の調節を介してBBBの健全性の障害に寄与する39, 40。そこで、BBBの健全性のマーカーとして、クローディン5やオクルディングなどのタイトジャンクションタンパク質のタンパク質発現量を測定した。その結果、CCHによってクローディン5とオクルーディンの発現レベルが顕著に低下したが、FMTとSCFAsによる治療によってこれらの傾向は逆転し、この治療戦略によってBBBの完全性が維持されていることが示唆された（図6A,B）。さらに、CCHに対するミクログリアとシナプス消失の関連性を確認するために、海馬組織におけるIba-1とPSD95の発現パターンを調査した。Iba-1陽性パンクタの増加とPSD95陽性パンクタの減少以外に、CCHはIba-1陽性パンクタに包まれたPSD95陽性パンクタを増加させ、CCHが海馬のシナプスを巻き込むことを誘導していることが示唆された。しかし、Iba-1とPSD95の共局在化は、FMTとSCFAsによる処理後に減少しており（図6E、F）、ミクログリアによるシナプスの巻き込みに対する保護効果があることが示唆された。

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図7
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3.7 FMTとSCFAsは海馬ミトコンドリアの傷害を防ぐ
RNA-seqの結果に基づき、FMTおよびSCFAsによる処理後のCCHに反応して上昇した経路は、ATP代謝過程、ミトコンドリア呼吸鎖、および電子伝達活性に関連していた（図4A,C）。そこで、透過型電子顕微鏡でミトコンドリアの超微細構造を評価したところ、CCH群ではミトコンドリアの異常な膨潤、曖昧なクリステー、膜の断片化が見られ、FMT群およびSCFAs群で大幅に軽減された（図8D）。さらに、ミトコンドリア膜電位をJC-1染色のフローサイトメトリーで評価した。その結果、正常な膜電位を有するミトコンドリアの数は、CCH群では偽薬群と比較して著しく減少したが、FMTおよびSCFAsによる処理後に顕著に増加することが示された（図8E,F）。さらに、海馬のミトコンドリアのエネルギー代謝の乱れがCCHと関連しているかどうか、およびFMTとSCFAsによる治療の潜在的影響を調べるために、海馬の組織におけるミトコンドリアETC複雑I-V活性とATP含量を測定した。その結果、CCHはミトコンドリアETC複合体I-Vの活性を低下させ、最終的にATP生成量を低下させたことから、CCHがミトコンドリアの酸化的リン酸化を阻害していることが確認された。しかし、これらの現象は、FMTとSCFAsによる処理によって逆転した（図8A,B）。酸化的リン酸化の非効率性は活性酸素の蓄積を促進し、ミトコンドリア機能障害をもたらすことが報告されている41。その後、ミトコンドリアの活性酸素生成量をDHE染色のフローサイトメトリーにより評価した。活性酸素の量は、CCHによって顕著に上昇したが、FMTおよびSCFAsによる処理によって顕著に減少し（図8G、H）、それによってCCHによって誘発されたミトコンドリアエネルギー代謝異常に対する保護効果が示された。

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図8
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CCH誘発ミトコンドリア機能障害に対するFMTおよびSCFAsの効果の基礎となる潜在的メカニズムをさらに調べるために、2つの重要なDEG、ETC複合体IおよびVのサブユニットであるNdufb2およびAtp5mc1のタンパク質発現レベルを測定した。その結果、CCHはNdufb2とAtp5mc1のタンパク質レベルを劇的に低下させ、ミトコンドリアETC複合体IとVがCCHによるミトコンドリア酸化的リン酸化の機能不全に重要な役割を果たすことを裏付けた。しかしながら、Ndufb2およびAtp5mc1のタンパク質発現の減少は、FMTおよびSCFAsによって緩和され、ミトコンドリア代謝の再プログラミングを介して慢性CIに対する保護効果を示した（図8I,J）。アセチル-CoAは、トリカルボン酸サイクル、酸化的リン酸化、ATP産生を増加させることが報告されており、エネルギー産生の中心的役割を担っている43。そこで、海馬のアセチル-CoA含量をELISAで評価した。予想通り、CCHは海馬のアセチル-CoA含量を著しく低下させたが、FMTとSCFAsによる処理で逆転したことから、酢酸産生の増加が海馬のアセチル-CoA含量を改善することが示唆された（図8C）。

4 ディスカッサーション
本研究は、慢性的なCIがGMの構造と組成を変化させ、糞便中の酢酸およびプロピオン酸含量を減少させ、海馬の酢酸含量を減少させることができるという証拠を初めて示したものである。FMTとSCFAは、Akkermansia、Ruminococcus、Turicibacterを含むGMのいくつかの細菌群の割合を濃縮することによって、CCH誘発GMディスバイオシスを緩和し、糞便酢酸およびプロピオン酸生成と海馬酢酸生成を大幅に強化することができた。注目すべきは、BCCAo vs. BCCAo + FMT群およびBCCAo vs. BCCAo + SCFAs群の比較で、Ruminococcus_sp_N15_MGS_57が唯一酢酸生成に密接に関係する腸内細菌であり、CCHに対するFMTおよびSCFAsの効果にRuminococcus_sp_N15_MGS_57および酢酸が関与しているかもしれないという確認が得られたことである。FMTとSCFAは、BBB関連タイトジャンクションタンパク質のアップレギュレーション、ミクログリアとアストロサイトの活性化の抑制、ミクログリア極性をM1からM2サブタイプに切り替えることによってCCH誘発神経炎症から保護された。さらに、FMTとSCFAは、ミクログリアが介在するシナプス損失の抑制、神経細胞損失の防止、シナプス前後膜の正常な機能とシナプス小胞の融合の維持を介して、CCH誘発認知機能障害から保護された。さらに、FMTとSCFAは、ミトコンドリア膜電位の正常化、活性酸素の蓄積の減少、ミトコンドリアETCと酸化的リン酸化の促進により、海馬のミトコンドリア機能を回復させた。FMTとSCFAは、HDACsの阻害を介して神経保護効果を発揮する可能性がある。これらの知見を総合すると、慢性的なCIに対するFMTおよびSCFAによる海馬の神経保護が支持される。

GMが脳機能に及ぼす影響に関する概念は、まだ初期段階にある。肝硬変患者の研究では、ルミノコッカスが臨床的変数とは無関係に良好な認知機能と関連していることが示された44。一方、パーキンソン病患者の別の研究では、ルミノコッカスの豊富さは認知機能と負の相関があることが示された45。さらに、高齢者の2つの無作為化対照試験では、認知機能に対するルミノコッカスの効果について矛盾した結果が報告されている。46, 47以上の結果から、ルミノコッカスが認知機能に及ぼす影響は非常に複雑で、疾患の状態に左右されることが示唆されます。酢酸産生の減少がミクログリアの活性化および認知機能の低下と関連することが、蓄積された証拠によって明らかにされている。48-50 ERK/JNK/NF-κB 経路の抑制、糞便中のSCFAsにおけるプレバイオティクス変化、迷走神経刺激が、上記の効果の基礎となるメカニズムであるかもしれない。これまでの研究と一致して、CCHは糞便および海馬組織の酢酸含有量の著しい減少を引き起こし、海馬のミクログリアの活性化および分極化、ならびに認知機能障害を引き起こし、これらはFMTおよびSCFAsによって回復された。さらに、Ruminococcusは主にイノシトールと糖アルコールを代謝し、ギ酸を利用して酢酸を生成する51。本研究では、スピアマン相関分析により、Ruminococcus_sp_N15_MGS_57が酢酸生成と正相関することがさらに確認され、慢性CIに対するFMTおよびSCFAsの海馬神経保護作用にRuminococcus_sp_N15_MGS_57が豊富に存在することが影響するかもしれないと示唆された。SCFAsとの有意な関係は認められなかったが、AkkermansiaとTuricibacterは、イソフラボン、植物性エストロゲン、リン酸化酵素など他のGM関連代謝因子を介して脳機能に影響を与える可能性があり、さらなる研究が必要である。

酢酸の補給は、うつ病のマウスモデルにおいてHDACの阻害を介して海馬のシナプス可塑性を改善することが示されている24。59 これまでの研究結果と同様に、FMTとSCFAはCCHによって減少したSyp、Gap43、PSD95、NMDAR1などのシナプス前後のタンパク質の発現を顕著に上昇させ、FMTとSCFAによるシナプスの恒常性維持による保護効果を確認し、それはまたシナプス微細構造の観察によって確認された。さらに、シナプス小胞はシナプス前膜と融合することで神経伝達物質を分泌し、これが神経細胞間の情報伝達の中心的なステップとなる60。先行研究では、シナプス前部でのシナプス小胞の融合障害が虚血再灌流障害後の認知機能障害に寄与することが明らかになった24。したがって本研究では、慢性CI状態でSNARE複合体形成のシナプス小胞融合に障害が発生していることが確認された。Stx1a は標的 SNARE タンパク質であり、シナプス小胞の放出に必要な SNARE 複合体の構成要素である。Stx1aは、シナプス小胞の放出に必要なSNARE複合体の構成要素であり、Stx1aなしではシナプス伝達は進行しない。本研究では、FMTとSCFAはCCHによって誘発されたStx1aタンパク質レベルのダウンレギュレーションを逆転させた。我々の知る限り、本研究は、Stx1aが慢性CIおよびFMTとSCFAの有効性の主要な調節因子であることを示す最初の証拠を提供するものである。興味深いことに、2つのSNAREタンパク質であるVAMP2とSNAP25の発現量には有意な変化が見られなかった。しかし、CCHはStx1a/SNAP25複合体からのSNAP25の解離を促進し、target-SNARE形成を阻害した。一方、FMTとSCFAはStx1aからのSNAP25の解離を阻害し、FMTとSCFAがSNARE複合体を維持することによってシナプス伝達を強化することが示された。Stx1aおよび標的SNAREタンパク質複合体は、慢性CIに対する微生物叢に基づく治療における潜在的な調節標的である。これらの知見を総合すると、シナプス可塑性とシナプス小胞の融合および放出が、慢性CIに対するFMTおよびSCFAsの採用するメカニズムである可能性が示唆された。

ミクログリアはCNSの自然免疫エフェクター細胞であり、脳の恒常性を維持する。SCFAは、高フルクトース食を与えたマウスにおいて、海馬の神経炎症抑制効果を示すことが示されている63。本研究では、CCHはBBB関連タイトジャンクションタンパク質の機能を低下させ、ミクログリアとアストロサイトの活性化を抑制し、M1/M2ミクログリアの比率を増加させ、海馬の神経細胞損失を促進し、慢性CI状態における海馬の神経炎症が確認されました。しかし、FMTとSCFAは、オクルーディンやクローディン5などのタイトジャンクションタンパク質のレベルを上昇させることでBBBの完全性を保護し、ミクログリアとアストロサイトの活性化を抑制することで神経炎症を抑え、炎症性M1サブタイプから抗炎症性M2サブタイプへの切り替えを促進し、その後神経細胞の損失を回復させました。64興味深いことに、慢性CI状態では、CCHによって活性化されたミクログリアがシナプス後マーカーであるPSD95と共局在化し、海馬においてシナプス前ではなくシナプス後の端末を巻き込んでいることが示されたが、これはFMTとSCFAによって著しく軽減された。この知見は、GMとSCFAの代謝物の関連性に関する別の研究65と一致しており、シナプスの喪失に対するGMとSCFAの重要なメカニズムの一つである可能性が示唆された。

zinc finger転写因子であるEgr1のノックアウトまたは阻害は、パーキンソン病モデルマウスにおいて、ミクログリアとアストログリアの活性化を抑制し、ドーパミン作動性ニューロンを保護したことから、アストロサイトによるEgr1発現増加が、ニューロン死と神経炎症反応の両方に重要な役割を果たすことが確認された38。一方、神経細胞におけるEgr1の誘導は、多くの神経細胞活動と密接に関連し、シナプスおよび神経細胞の可塑性に対する保護効果を示しています。67 CNSにおけるEgr1の機能は複雑で、様々な環境因子によって制御されています。慢性CI状態において、アストログリア活性化はCCHによって増強され、FMTおよびSCFAsによって回復されました。Egr1のタンパク質発現プロファイルはアストログリアと同じであり、慢性CI状態では主にアストロサイトからEgr1が誘導され、神経炎症促進活性を示すことが示唆された。

ミトコンドリアの主な生理機能は、ミトコンドリア ETC を介した酸化的リン酸化による ATP 生成である68 。酸化的リン酸化の効率が悪いと、活性酸素の蓄積とそれに続くミトコンドリア機能障 害につながる42 。本研究では、ミトコンドリア ETC と酸化的リン酸化の障害により、慢性 CI 状態では ATP 産生の低下、活性酸素過剰、ミトコンドリア機能不全に陥ることが示唆され ている。FMTとSCFAは、酢酸、アセチル-CoA、ATPの含有量を増加させ、ミトコンドリアETC複合体I-Vの活性を上昇させ、ミトコンドリア機能障害を軽減させた。これらの結果は、海馬の酢酸およびアセチル-CoAの増加が、慢性CIによるミトコンドリアエネルギー代謝障害に対するFMTおよびSCFAsの有益な効果に少なくとも部分的に寄与している可能性を示している。さらに、Ndufb2 および Atp5mc1 のタンパク質レベルが FMT および SCFAs によって有意に変化したことから、ミトコンドリア ETC 複合体 I および V が FMT および SCFAs によって制御される酸化的リン酸化の主要な部位である可能性が示唆された。さらに、慢性CIに適した細胞モデルがないことから、今後、慢性CI状態の神経細胞、ミクログリア、アストロサイトを含む異なるCNS細胞におけるミトコンドリア酸素消費量を調査する研究が必要である。

結論として、これまでの研究で、微生物叢-腸-脳軸が虚血性脳卒中および神経変性疾患の治療成績に影響を及ぼす可能性が確認された。70, 71本研究は、慢性CIによる認知機能障害には、腸-海馬軸への変化、GMディスバイオシス、SCFAsの減少が関与するという証拠を初めて提示したものである。FMTとSCFAsは、Ruminococcus_sp_N15_MGS_57と代謝産物の酢酸の腸内含有量を増やすことによって、シナプス小胞の正常な融合と放出を維持しながら、ミクログリアが媒介する神経炎症とシナプス損失を抑制し、海馬シナプス可塑性を改善し、ミトコンドリアETCによる酸化的リン酸化障害の緩和を行うことによって神経保護効果を及ぼした。これらの知見は、慢性的なCIに伴う神経損傷を軽減するために、SCFAsの含有量を増加させるGMベースの戦略を強調するものである。

著者
Shao-Hua Su、Ming Chen、Jian Haiが研究の企画を行った。Ming Chen、Yi-Fang Wu、Jun Sunは実験を行った。Qi LinとDa-Peng Wangはデータを分析した。CM、Yi-Fang Wu、Qi Lin、Da-Peng Wang、Jun Sunは図の作成に参加した。原稿はShao-Hua SuとJian Haiが作成した。全著者が論文を読み、原稿を承認した。

謝辞
本研究は、中国国家自然科学基金（助成番号：81974209、81601146、81771410、81902521）および上海セーリングプログラム（助成番号：19YF1432800）の支援を受けて行われました。

利益相反
著者は、本論文に関して利益相反がないことを宣言する。