固形臓器移植レシピエントにおける腸内細菌異常症の複数の指標は、全死因死亡率および原因特異的死亡率を予測する

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腸内細菌叢

オリジナル研究

固形臓器移植レシピエントにおける腸内細菌異常症の複数の指標は、全死因死亡率および原因特異的死亡率を予測する

Multiple indicators of gut dysbiosis predict all-cause and cause-specific mortality in solid organ transplant recipients

無料

1. http://orcid.org/0000-0002-3709-9193J CasperSwarte1、

2. ShuyanZhang1、

3. Lianne MNieuwenhuis2、

4. ランコ・ガセサ1,3、

5. Tim JKnobbe2、

6. TransplantLines研究者、

7. Vincent E DeMeijer4、

8. KevinDamman2、

9. Erik A MVerschuuren2、

10. Tji CGan2、

11. Jingyuan Fu5,6、

12. アレクサンドラ・チェルナコワ2

13. Hermie J MHarmsen7、

14. ハンス・ブロクザイル2

15. ステファン・J・L・バッカー2

16. ヨハネス・R・ビョーク1

17. Rinse KWeersma1

1. Dr Johannes R Björk, Gastroenterology and Hepatology, University Medical Centre Groningen, Groningen, Netherlands;bjork.johannes@gmail.com。

要旨

目的腸内細菌叢の組成は様々な疾患と関連しているが、長期的な転帰指標との関係については比較的知られていない。腸内細菌異常症は一般集団における死亡リスクと関連しているが、特定の疾患における全生存率との関係については広範に研究されていない。本研究では、固形臓器移植レシピエント（SOTR）を対象に、腸内細菌異常症と全死亡および原因特異的死亡との関係を詳細に解析した結果を発表する。

デザイン我々は、TransplantLines Biobank and Cohort（6.5年間の追跡調査による広範な表現型データを含む前向きコホート研究）の一部である、766人の腎臓、334人の肝臓、170人の肺、67人の心臓移植レシピエントの糞便サンプル由来の1337個のメタゲノムを解析した。腸内細菌異常症を解析するために、同じ地理的地域（オランダ北部）の一般集団のメタゲノム8208個を追加した。多変量Cox回帰と機械学習アルゴリズムを用いて、個々の種の存在量を含む腸内細菌異常症の複数の指標と、全死因死亡率および原因特異的死亡率との関連を解析した。

結果全死因死亡率および全死因特異的死亡率の両方と関連するマイクロバイオーム群集の全体的な変動を示す2つのパターンを同定した。各移植レシピエントと一般集団の平均との腸内マイクロバイオームの距離は、全死因死亡率および感染症、悪性腫瘍、心血管疾患による死亡率と関連していた。個々の菌種存在量に関する多変量Cox回帰により、全死因死亡率と関連する23菌種が同定され、機械学習アルゴリズムを適用することにより、全死因死亡率と関連する23菌種のうち19菌種からなるバランス（対数比の一種）が同定された。

結論腸内細菌異常症はSOTRにおける死亡率と一貫して関連している。この結果は、腸内細菌異常症が長期生存と関連するという観察を支持するものである。今回のデータから因果関係を推論することはできないため、長期予後を改善するために腸内細菌に直接作用する治療法を設計できるかどうかを判断する前に、メカニズムを理解するためにさらなる前臨床研究が必要である。

データ入手に関する声明

データは合理的な要求があれば入手可能である。本研究で使用した生のマイクロバイオームシーケンスデータと基本表現型は、European Genome-Phenome Archiveのアクセッション番号EGAD00001008907（https://ega-archive.org/datasets/EGAD00001008907）、EGAS00001006257（https://ega-archive.org/studies/EGAS00001006257）、EGAS00001006258（https://ega-archive.org/studies/EGAS00001006258）で入手可能である。患者の機密保持のため、メタゲノムデータセットに関連する臨床データセットは、University Medical Centre Groningenへのリクエストにより入手可能である。この臨床データセットへのアクセスには、データアクセスフォームのEメール(datarequest.transplantlines@umcg.nl)によるリクエストからなる最小限のアクセス手順が必要である。回答は2週間以内に送られる。このアクセス手続きは、データが研究／科学的目的のためにのみ要求されていることを確認し、収集されたデータが商業目的で使用されないことを明記した、TransplantLines参加者が署名したインフォームド・コンセントを遵守するためのものである。

https://doi.org/10.1136/gutjnl-2023-331441

Altmetric.comによる統計

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このテーマについて既に知られていること

• 現在の文献では、腸内細菌叢のシグネチャーが一般集団における死亡リスクと関連している可能性が示唆されている。

• 同種造血細胞移植を受けた患者では、腸内細菌叢の多様性が高いほど死亡率が低い。

• 肝移植および腎移植レシピエントは腸内細菌叢異常症に罹患しており、比較的イベント数の少ない以前の解析では、腸内細菌叢異常症が移植後の死亡率と関連していることが示された。

この研究で追加されたこと

• 腎移植、肝移植、心臓移植、肺移植のレシピエント全体にわたり、臓器移植の種類とは無関係に全死因死亡率と関連し、特に悪性腫瘍と感染症による死亡と関連する2つの全体的な微生物群集変動パターンを同定した。

• 腸内細菌異常症の複数の指標は、全死因死亡率、心血管疾患、悪性腫瘍、感染症による死亡を予測する。

• 我々は、全死因死亡率および原因特異的死亡率と関連する複数の細菌種を見出した。3つの異なる方法を用いて、固形臓器移植後の死亡リスクの増減に関連する複数の細菌種（異なる解析アプローチ間で共有）を同定した。

• 機械学習アルゴリズムを用いて、全死因死亡率と関連する19の細菌種のバランスを同定した。

本研究が研究、実践、または政策にどのように影響するか

• 我々の結果は、腸内細菌異常症が長期生存の予測因子であることを示す新たなエビデンスを支持するものであり、腸内マイクロバイオームを標的とした治療が患者の転帰を改善する可能性を示している。

はじめに

腸内細菌叢異常症は、明確な定義はないが、健康な腸内細菌叢と比較した場合、常在菌を犠牲にして病原体が増殖することによって典型的に特徴づけられる病態である。腸内細菌叢の異常は、炎症性腸疾患、肥満、糖尿病、がんなど、多くの疾患で観察されている1-4。さまざまな集団ベースのコホート研究では、一般的な健康状態と腸内細菌叢の関連性が大きく重複していることが報告されており、健康状態の悪化に共通する腸内細菌叢の異常が示唆されている5-7。

5-7。最近のエビデンスによると、これらの生物多様性異常のシグネチャーは、サンプリング時の個人の健康状態に関連するだけでなく、長期生存の予測因子にもなることが示唆されている。便サンプルのショットガン・メタゲノミクスによって特徴づけられた腸内細菌叢は、フィンランドの成人7211人を15年間追跡調査した特徴的な集団ベースの研究において、死亡率と関連していた8。特定の疾患集団における腸内細菌異常と患者の生存を関連付ける研究は少ないが、同種造血細胞移植ではその関係が広く研究されており、例えばアルファ多様性の低下は死亡リスクの上昇と関連している9。10我々は最近、固形臓器移植の設定において、肝移植および腎移植の両レシピエント（KTR）における腸内細菌叢異常の程度（各レシピエントのマイクロバイオームと一般集団のセントロイドとの距離）が、全死因死亡リスクの上昇と関連していることを報告した11。

本研究では、固形臓器移植レシピエント（SOTR）の大規模集団における全死因死亡率と原因特異的死亡率の両方に関する詳細な生存解析の結果を発表する。本研究では、肝臓、腎臓、心臓および肺移植レシピエントから、前回の解析と比較してサンプル数が3.7倍、イベント数が2.7倍となった。このSOTR集団は、ポリファーマシー、多疾患合併症、腸内細菌異常症の有病率が一般集団に比べて高いという特徴があるため11 12、腸内細菌異常症と長期生存の関係を研究する理想的なモデルとなる。このユニークなSOTR集団（n=1337）のメタゲノムと一般集団（n=8208）のメタゲノムとを用いて、腸内細菌叢と全死因死亡率および原因特異的死亡率との関係を分析した。これらの知見は、腸内細菌叢と長期的な健康転帰との関係に関する一般的な理解を深めるものであり、移植医療関係者だけでなく、より広い読者にとっても興味深いものである。

研究結果

SOTRの特徴

合計1337人のSOTRが、移植後一定の時期に糞便サンプルを提供し、TransplantLines Biobank and Cohort研究に組み入れられた。このうち766人がKTR、334人が肝移植レシピエント（LTR）、170人が肺移植レシピエント（LuTR）、67人が心臓移植レシピエント（HTR）であった。全レシピエントの平均年齢（±SD）は57歳（±13.0）、784人（59％）が男性、移植後の平均期間は全臓器型で7.6年（±8.0年）であった（図1）。追跡期間中（最小＝2.8年、最大＝6.5年）、合計162人（KTR88人、LTR33人、LuTR35人、HTR6人）が死亡した（オンライン補足表1）。このうち48人（28％）が感染関連死亡、38人（23％）が心血管関連死亡、38人（23％）が悪性腫瘍関連死亡、40人（25％）がその他の原因で死亡した（オンライン補足表1）。

補足資料

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図1

コホートの概要。(A）死亡数を含む、移植タイプごとのレシピエント数の概要。(B)移植タイプごとの男女数および(C)組み入れ時の年齢。(D）移植からの年数の関数としての死亡数。

解析の最初の部分では、各移植レシピエントの腸内細菌叢について、腸内細菌異常症の複数の指標を計算した： シャノン多様性指数、一般集団の平均マイクロバイオーム構成との距離、抗生物質耐性遺伝子（ARG）と病原性因子（VF）の豊富さである。続いて、年齢、性別、体格指数（BMI）、移植後の年数を含む多変量Cox回帰を用いて、これらの各指標とレシピエントの全死因死亡率および原因特異的死亡率との関係を調べた。移植の種類ごとに全死因死亡率を別々に分析した。しかし、臓器タイプごとのイベント数が限られていたため、すべてのSOTRをプールして原因特異的解析を行った。解析の第2部では、個別または共同で死亡率を予測する細菌種を同定することを目的とした。移植レシピエントの死亡率と、(1)各菌種のCLR（中心対数比）変換相対存在量、および(2)一般集団における各菌種のCLR変換相対存在量（一般集団におけるより低い（25％パーセンタイル未満）またはより高い（75％パーセンタイル以上）としてグループ化）との関係を調査した。最後に、機械学習アルゴリズムを適用して、死亡率を最もよく予測するバランスを特定した。

コミュニティ全体の変動は死亡リスクと関連する

まず、種レベルのCLR変換相対現存量について主成分分析（PCA）を行った（これは組成データのゴールドスタンダードであるAitchison距離を生成する）。すべてのSOTRをプールした結果、主成分（PC）1と全死因死亡率との間に正の有意な関係（ハザード比（HR）1.32、95％CI 1.13～1.54、偽発見率（FDR）＝5.8×10-4）、PC3と全死因死亡率との間に負の関係（HR 0.80、95％CI 0.68～0.93、FDR＝4.0×10-3；図2A,B）が観察された。PC3はまた、KTRおよびHTRの死亡率の低下と関連していた（KTR：HR 0.73、95％CI 0.59～0.89、FDR＝2.2×10-3；HTR：HR 0.34、95％CI 0.12～0.95、FDR＝0.03；図2C）。このことは、PC1への負荷が高い細菌種は死亡率の増加と関連し、PC3への負荷が高い細菌種は死亡率の減少と関連していることを示唆している。これをさらに分析すると、PC1に最も大きな正の負荷を示した（したがって死亡率と関連した）5つの菌種は、Ruminococcus gnavus、Clostridium clostridioforme、Clostridium symbiosum、Hungathella hathewayi、Clostridium innocuumであった（図2E）、 また、PC3に最も大きな正の負荷を示した（したがって死亡率と逆相関）5つの菌種は、Bifidobacterium adolescentis、Dorea longitena、Bifidobacterium longum、Collinsella aerofaciens、Eubacterium rectaleであった（図2F）。PC2、PC4、PC5は死亡率とは有意な関連を示さなかった（FDR>0.10；オンライン補足図1、オンライン補足表2）。原因別解析では、PC1は悪性腫瘍および感染症による死亡と関連していた（悪性腫瘍：HR 1.64、95％CI 1.20〜2.24、FDR＝2.0×10-3；感染症：HR 1.42、95％CI 1.20〜2.24、FDR＝2.0×10-3）： 悪性腫瘍：HR 1.64、95％CI 1.06～1.89、FDR=0.01；図2A,B,D）、PC3は悪性腫瘍による死亡リスクの低下と関連していた（HR 0.68、95％CI 0.49～0.94、FDR=2.0×10-2）。最後に、死亡状況はマイクロバイオーム種組成の変動を有意に説明した（PERMANOVA：R2=0.1％、p=4.1×10-3；移植臓器の種類で層別化したPERMANOVA： R2=0.1％、p=0.01）。

補足資料

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図2

全死因死亡率および原因特異的死亡率についてそれぞれPC1およびPC3で行ったCox回帰分析の結果を示すフォレストプロット。(C)PCAプロットで、ドットはレシピエントと異なる色の移植タイプを表す。丸と十字はそれぞれ追跡調査時に生存しているレシピエントと死亡しているレシピエントの中心を表す。(D) 点がレシピエント、色が異なる死因、十字がセントロイドを表すPCA。(E,F）PC1とPC3でそれぞれ正負の負荷量が最も大きい上位10種。I.:Intestinimonas。(G)腸内細菌異常症指標ごとの全原因および原因別。PCA：主成分分析。

腸内細菌異常症指標は全死因死亡率および原因特異的死亡率と関連している

すべてのSOTRについて実施した原因特異的解析では、シャノン多様性指数が悪性腫瘍による死亡と関連していた（HR 0.71、95％CI 0.54～0.93、FDR＝0.01）。次に、各移植レシピエントの腸内細菌叢と一般集団の平均組成との距離を算出し、多変量Cox回帰を行った。この解析により、一般集団との距離がすべてのSOTRにおいて全死因死亡リスクの上昇と有意に関連していることが明らかになった（HR 1.29、95％CI 1.11～1.51；FDR＝9.3×10-4；図2G、オンライン補足図2）。原因別解析では、一般集団との距離は感染による死亡（HR 1.46、95％CI 1.11～1.93、FDR=7.2×10-3）、悪性腫瘍（HR 1.39、95％CI 1.02～1.89、FDR=0.03）、心血管疾患（HR 1.36、95％CI 1.01～1.87、FDR=0.04；図2G）と関連していた。最後に、ARGとVFが豊富であればあるほど、全死亡リスクが上昇することがわかった（ARG：HR 1.27、95％CI 1.09〜1.47、FDR＝2.2×10-3、図2G、VF：HR 1.14、95％CI 1.09〜1.47、FDR＝0.04）： HR1.14、95％CI1.01～1.27、FDR=0.03、図2G）、原因別解析では感染による死亡（ARG：HR1.45、95％CI1.10～1.90、FDR=8.0×10-3、VFs： VF：HR1.28、95％CI1.09～1.51、FDR＝3.0×10-3、図2G）。シャノン多様性指数と全死因死亡率との間には、レシピエントをまとめて分析した場合、あるいは移植の種類によって層別化した場合には、有意な関連は観察されなかった（FDR>0.05、オンライン補足表3および4）。これらを総合すると、シャノン多様性が低いこと、一般集団と比較して組成が非類似であること、ARGとVFが豊富であることは、死亡率の上昇と関連していた。

複数の種が死亡率と関連している

年齢、性別、BMI、移植後の年数を調整した多変量Cox回帰モデルにおいて、CLRを変換した相対存在量が全死因死亡率と関連していた合計23種（16％；FDR＜0.10）を同定した（オンライン補足表5）。すべてのSOTRを解析したところ、4種のClostridium属（C. innocuum：HR 1.35、95％CI 1.18～1.54、FDR＝0.001；C. clostridioforme： C.symbiosum：HR1.35、95％CI1.17～1.57、FDR＝0.003；C.bolteae：HR1.32、95％CI1.157～1.52、FDR＝0.004）で、全死因死亡率（図3A；オンライン補足表5）および原因特異的解析における感染による死亡（オンライン補足表6；図3B）と正の相関を示した。死亡リスクの上昇と関連していたその他の種には、H. hathewayi（HR1.29、95％CI 1.12～1.50、FDR＝0.01）、Veillonella parvula（HR1.29、95％CI 1.12～1.49、FDR＝0.01）、R. gnavus（HR1.26、95％CI 1.09～1.46、FDR＝0.03；図3A；オンライン補足表5）が含まれる。原因別解析では、H. hathewayi（HR1.48、95％CI 1.18～1.92、FDR＝0.08）とV. parvula（HR1.57、95％CI 1.21～2.03、FDR＝0. 04）は感染による死亡と関連しており（オンライン補足表6；図3B）、R. gnavusの生息数は悪性腫瘍による死亡と関連していた（HR 1.83、95％CI 1.34～2.49、FDR＝0.04；オンライン補足表6；図3B）。また、すべてのSOTRを解析したところ、より低い死亡リスクと関連する複数の生物種が同定された。例えば、酪酸産生菌Eubacterium hallii（HR0.75、95％CI 0.63〜0.89、FDR＝0.01）、ファーミキューテス菌CAG 83（HR0.77、95％CI 0.66〜0.90、FDR＝0.01）、Gemmiger formicilis（HR0. 77、95％CI 0.66～0.89、FDR＝0.01）およびFaecalibacterium prausnitzii（HR0.83、95％CI 0.73～0.95、FDR＝0.05）は死亡リスクの低下と関連していた（図3A；オンライン補足表5）。死亡リスクの低下と関連していた他の常在菌には、Adlercreutzia equolifaciens（HR0.77、95％CI 0.66～0.91、FDR＝0.02）、Prevotella copri（HR0.77、95％CI 0.65～0.91、FDR＝0.03）、Asaccharobacter celatus（HR0. 79、95％CI 0.67〜0.93、FDR＝0.04）、D. longicatena（HR0.80、95％CI 0.68〜0.93、FDR＝0.04）、Bifidobacterium adolescentisおよびB. longum（HR0.80、95％CI 0.68〜0.95、FDR＝0.07およびHR 0.83、95％CI 0.72〜0.96、FDR＝0.08）であった。最後に、我々の知見の一般性を検証するために、一般集団の死亡率データを分析した。この分析では、全死因死亡率と2種のビフィズス菌（B. adolescentis（HR=0.95、p=2.0×10-16）とB. longum（HR=0.93、p=2.0×10-16）との間の保護的関連が再現された。） しかし、移植コホートでみられたその他の関連は再現できなかった。

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図3

複数の生物種が全死因死亡率および原因特異的死亡率と関連している。(A)多変量Cox回帰モデルにおいて全死因死亡率と関連した生物種を示すフォレストプロット。95％CIを伴うHRは、偽発見率（FDR）補正p値とともにプロットされている。(B）多変量Cox回帰モデルにおいて原因特異的死亡率と関連した存在量の種を示すフォレストプロット。HRと95％CIおよびFDR補正p値を示す。

我々はこの解析をさらに一歩進め、移植を受けた患者の生物種のCLR変換相対存在量が一般集団の平均範囲から外れているかどうかに基づいて分類し（GPでは高い：＞75％パーセンタイル、GPでは低い：＜25％パーセンタイル）、この二値層別化によって死亡率との関連が強くなったかどうかを調べた。この指標は、我々の細菌異常指標である「一般集団の平均値との距離」に似ているが、代わりにマイクロバイオーム組成のレベルとは対照的に、種ごとの腸内細菌異常の程度を示すものである。すべてのSOTRを分析したところ、前回の分析でも死亡率と関連していた細菌種（FDR<0.05で11/16種、FDR<0.1で22/23種）が、より強いHR（FDR<0.05で；図4）で見つかった。例えば、前回のCox回帰モデルで全死因死亡率と正の相関を示した4つのClostridium種（C. innocuum、C. clostridioforme、C. symbiosum、C. bolteae）は、今回の解析で最大1.8倍のHRを示した（増加範囲：最小値＝1.3、中央値＝1.35、最大値＝1.8；図4；オンライン補足表7）。

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図4

一般集団と比較したレシピエントの死亡確率を示すカプラン・マイヤー曲線。移植レシピエントにおける各生物種のCLR変換相対存在量が、一般集団における「平均」範囲から外れているか（高い（75％分位点以上）か（25％分位点未満））を分類した。棒グラフは、低値群（25％未満の分位数；Q1）と高値群（75％超の分位数；Q4）の死亡患者の割合をそれぞれ示している。(A）対象種の存在率が高い（一般集団におけるQ4）移植レシピエントは、Q1群のレシピエントと比較して死亡リスクが減少した。(B）対象種の存在量が少ない（一般集団におけるQ1）移植レシピエントは、Q4群のレシピエントと比較して死亡リスクの減少を示した。CLR、中心対数比。

ポリファーマシー、腸内細菌叢、死亡率の関係

ポリファーマシー、腸内マイクロバイオーム、死亡率の関係を解析するために、一連の解析を行った。まず、年齢、性別、移植後の年数を補正した多変量Cox回帰を用いて、ポリファーマシーと死亡率の関係を分析した。この分析に先立ち、免疫抑制剤と抗生物質の種類に基づいてレシピエントをクラスタリングし、異なる投薬レジメンを定義した（この分析により7つの投薬レジメンが同定された。） この分析では、どの投薬レジメンも死亡率との間に有意な関連を認めなかった（p>0.05）。次に、多変量線形モデルに独立変数として、投薬レジメン、年齢、性別、移植後の年数を含めることで、種のCLR変換相対存在量と投薬使用との関係を分析した。これらのモデルから、すべての投薬レジメンを相互に比較する事後対比を計算した。検証した672の組み合わせのうち、151が有意であった（FDR<0.05、オンライン補足図3A,B）。最後に、7つの投薬レジメンのそれぞれと死亡率との間の関係が、上記のセクションで死亡率との関連が認められた32の細菌種のいずれかによって媒介されているかどうかを調べるために、媒介分析を行った。しかし、これらの細菌種のいずれによっても有意な媒介効果は観察されなかった（p>0.05；オンライン補足図3C）。

腸内細菌叢の機能的可能性は死亡率と関連している

年齢、性別、BMI、移植後年数を調整した多変量Cox回帰モデルにおいて、全死因死亡率と有意に関連した代謝経路（MP）は合計4（3％）、VFは20（28％）、ARGは0（0％）であった（FDR＜0.10；オンライン補足表10～13）。ペプチドグリカン生合成I（HR 0.74、95％CI 0.63～0.88、FDR＝0.042）、ウリジン一リン酸生合成（HR 0.76、95％CI 0.66～0.89、FDR＝0.042）、補酵素A生合成II（HR 0. 78、95％CI 0.68～0.90、FDR=0.042）およびL-ヒスチジン生合成（HR 0.78、95％CI 0.66～0.92、FDR=0.086）は、全死亡リスクの低下と関連していた（オンライン補足表8）。原因特異的解析では、フルクトース6-リン酸からの解糖I（HR 0.88、95％CI 1.48〜3.96）およびII（HR 0.90、95％CI 1.47〜4.08）は、感染による死亡リスクの低下と関連していた（FDR＜0.10；オンライン補足表9）。

我々は、全死因死亡率（FDR<0.10；オンライン補足表10）と関連する複数のVF遺伝子を発見した。例えば、付着・浸潤をコードする12遺伝子（VF0221、VF0404、VF0506、FDR<0.10；オンライン補足表11）、鉄の取り込みをコードする7遺伝子（VF0123、VF0136、VF0227、VF0228、VF0229、FDR<0.10；オンライン補足表10）、II型分泌系をコードする1遺伝子（VF0333）が、全死亡リスクの上昇と有意に関連していた。原因特異的解析の結果はオンライン補足表11にある。

最後に、p<0.05で全死因死亡と関連した32のARGを発見した。これらのうち、6つは心血管疾患による死亡と、10つは感染症による死亡と、そして最後に10つは悪性腫瘍による死亡と関連していた（FDR>0.10；オンライン補足表12-13）。しかし、これらの32のARGのうち、多重検定補正後（FDR>0.05）で死亡率と有意に関連したものはなかった。

死亡率予測バイオマーカーとしての腸内細菌叢

最後に、予測バイオマーカーを同定するために、機械学習アルゴリズムCoDaCoReを用いた。このアルゴリズムは、すべてのSOTRにおいて、結果、この場合は死亡（打ち切り時の死亡／生存）を最も予測するバランスを同定する（「方法」のセクションを参照）。まずこの機械学習アルゴリズムをトレーニングセット（80%）に適用し、次に残りの患者数を含むテストセットでモデル性能を評価した。トレーニングセットとテストセットには、同じ割合のイベントが含まれていた。このアルゴリズムは、テストセットにおいて88％の分類精度を持つ19種からなるバランスを同定した（テストセットにおける曲線下面積（AUC）＝0.68；図5A,B）。この天秤では、分子セット（幾何平均が死亡を予測する種）は8種（Bacteroides eggerthii、B. fragilis、H. hathewayi、C. bolteae、C. clostridioforme、C. symbiosum、Ruminococc. symbiosum、Ruminococcaceae bacterium D16、Escherichia coli；図5A；オンライン補足表14）、分母集合（幾何平均が死亡率を予測する種）は11種（B. adolescentis、B. longum、Adlercreutzia equolifaciens、A. celatus、P. copri. E. hallii、Anaerostipes hadrus、Coprococcus comes、D. longicatena、Fusicatenibacter saccharivorans、G. formicilis；図5A；オンライン補足表14）。これらの種のCLR変換相対存在量はすべて、前回の解析で個々に死亡率と関連していた（FDR<0.10；図3A；オンライン補足表5）。最後に、同定されたバランスが、年齢、性別、BMI、移植後の年数を調整した多変量Cox回帰においても死亡率を予測できるかどうかを検証した。その結果、このバランスは確かに全死亡リスクの上昇と関連していた（HR 1.74、95％CI 1.48〜2.04、p＝1.60×10-11、図5C）。移植レシピエントをこのバランスの中央値より低いか高いかで層別化したところ、HRはほぼ1.4倍上昇した（HR 2.40、95％CI 1.71〜3.35、p＝3.40×10-7、図5D）。

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図5

機械学習アルゴリズムは死亡率を予測する対数比を同定する。(A）同定されたCoDaCoRe比に含まれる種。(B）テストセットにおけるCoDaCoReによって同定されたバランスの識別力を示す受信者動作特性（ROC）曲線。(C）HRの95％CIを表す水色の領域におけるHRとバランスとの関係。(D)すべてのSOTRにおいて、対数比の中央値が低い（オレンジ）と高い（青）を持つレシピエントのKaplan-Meier曲線。AUC、曲線下面積、B、ビフィドバクテリウム、F、フシカテニバクター、R、ルミノコッカス科、SOTR、固形臓器移植レシピエント。

次に、本研究にも含まれている一般集団コホートにおいて、これらの所見を確認できるかどうかを分析した。CoDaCoReで同定された予測バランスに基づく多変量Cox回帰を、一般集団コホートで行った。合計すると、バランスに含まれた19種のうち11種が、一般集団において最低有病率20％を超えて存在していた（オンライン補足図4、「方法」のセクションを参照）。一般集団では、算出されたバランスは死亡率と有意な関連はなかった（HR 1.06、95％CI 0.99～1.15、p＝0.11）。SOTRの集団は一般集団とは異なるため11、一般集団から(1)腸内マイクロバイオーム健康指数6スコアが最も低い10％と最も高い10％、および(2)移植コホートの平均値に対するAitchison距離が最も高い10％と最も低い10％の個人を選択した。一般集団のいずれのサブセットにおいても、バランスと全死因死亡率との間に有意な関連は認められなかった（1：HR 1.00、95％CI 0.86～1.17 p＝0.98、2：HR 1.17、95％CI 0.99～1.34 p＝0.07）。

考察

本研究では、TransplantLinesコホートおよびバイオバンク研究から得られたSOTR集団において、全死因死亡率および原因特異的死亡率の両方と関連する腸内細菌叢の詳細な解析を報告する13。一般集団対照との腸内マイクロバイオームの距離、レジストーム、VFの豊富さは、死亡リスクの高さと関連していた。われわれは、死亡率に関連する腸内細菌シグナルが、以前に疾患に関連した種から構成される一貫したものであることを発見した。興味深いことに、SOTRにおけるある種の豊富さが、一般集団における「正常」範囲から外れている場合、それは死亡率も予測することを発見した。全体として、我々の結果は、腸内細菌異常に関連するシグネチャーが、様々なタイプの臓器移植における死亡率と関連していることを示している。

多様性解析は、以前に報告された結果と一部一致していた。シャノン多様性が低い患者は、悪性腫瘍関連死亡リスクが29％高かった。しかしながら、プールされたSOTR解析においても、臓器タイプ別に層別化した解析においても、シャノン多様性と全死因死亡率との間に有意な関係は観察されなかった。したがって、造血幹細胞移植および肝移植レシピエントにおけるシャノン多様性と死亡率との間の既報の関連を確認することはできなかった10 11。FINRISK研究で実施された腸内マイクロバイオーム死亡率解析と同様に、全死因死亡率および原因特異的死亡率とマイクロバイオーム群集全体の変動を表すパターンとの間に有意な関係が観察された8。すべての死亡率解析において、一貫した腸内微生物のシグナルが観察された。

具体的には、C. clostridioforme、C. symbiosum、C. bolteae、およびV. parvulaと R. gnavusを含むいくつかのクロストリジウム属の菌量が、SOTRにおける死亡率の上昇、および一般集団における複数の疾患と関連していることがわかった。対照的に、P. copri、D. longicatenaおよびF. prausnitziiは、SOTRにおける死亡率の低下および一般集団における一般的な健康状態と関連していた5。さらに、SOTRの腸内細菌叢が一般集団と比較してどの程度異なっているかは、全死因関連死亡率、感染症関連死亡率、心血管関連死亡率および悪性腫瘍関連死亡率と関連していた。この関係は、我々の研究では個々の細菌種で一致していたが、FINRISK研究と比較すると、我々のSOT集団ではF. prausnitziiの存在量が多いほど死亡リスクが低いという所見のみが再現された8。しかし、FINRISK研究ではCox回帰分析が属レベルで行われ、分類学的分類にSHOGUNが使用されたのに対し、我々は種レベルで分析を行い、分類学的プロファイリングにMetaPhlAnを使用したため、2つの研究の比較可能性が制限された可能性がある。

我々は、G. formicilis、F. bacterium CAG 83、E. hallii、F. prausnitziiの4つの酪酸産生種15-18の生息数が少ないほど、死亡率が増加することを観察した。酪酸は短鎖脂肪酸であり、腸管バリアの維持、抗炎症作用、抗肥満作用、抗酸化作用など、腸内において広範な有用性を有している19 20。KTRおよびLTRでは、一般集団の対照群と比較して酪酸産生菌の存在量が少ないこと、またKTRでは酪酸産生菌の存在量の低さが健康関連QOLの低さと関連していることが以前に観察されている11 21-23。これらの結果は、酪酸レベルの低下がSOTRの死亡率に直接関与している可能性を示唆している。酪酸産生菌数の減少は、造血幹細胞移植レシピエントにおける移植片対宿主病および移植関連死亡率の増加と関連していた24。興味深いことに、H. hathewayi、R. gnavusおよびR. D16が死亡率の増加と関連していることが観察された。これら3つの細菌種は、以前から腸管バリア機能の維持に関連していた。例えば、R. gnavusはグリコシダーゼ酵素によって糖鎖やムチンを消化することができ、これはバリア機能の維持に重要であるが、粘液の分解が進むと粘液層や腸の完全性が損なわれる25。H. hathewayiは、腸のバリア機能を維持する役割を持つグリコサミノグリカンを分解することができ、糖鎖の過剰な分解が腸のバリア機能を低下させ、感染症への感受性を高めることが以前に示されている26。複数のVF遺伝子が高い死亡率と関連しており、潜在的なバリア機能の喪失と組み合わさることで、SOTRに大きなリスクをもたらす可能性がある。酪酸産生の低下、粘液と糖鎖の分解の増加による腸管バリアーの完全性の喪失が、これらの機能を持つ動物種と死亡率との間に観察された関連に関与している可能性がある。しかし、これらの仮説を確認するためには、さらなる分析を行う必要がある。今回の結果は、SOTRにおける酪酸産生菌や粘液分解菌の役割と死亡率に関する更なる研究を正当化するものである。酪酸産生プロバイオティクスの使用は、SOTRの予後を改善する有望な手段となりうる27。

本研究の長所は、SOTRのサンプルサイズが大きいことと、同じオランダ人集団から大規模な対照群を得たことである。このデータセットにより、腸内細菌異常症の有病率が高い体外受精患者グループにおいて、腸内細菌叢の死亡率に関連するシグネチャーを特定することができた。本研究の限界は、観察研究であるため、報告された関連性の因果性や方向性を推論できないことである。観察された腸内細菌異常症を改善すれば移植後の生存率が改善する可能性があるが、観察された関連は因果関係ではなく、全身状態の悪化などの間接的な影響から生じている可能性もある。今後の研究では、本研究で観察された腸内細菌叢の死亡関連シグネチャーにどのような因子が影響しているのかを明らかにする必要がある。本研究のもう一つの限界は、我々のコホートが横断的であるため、移植後の時点が一定でなかったことである。原因特異的死亡率解析では、検出力にも限界があり、また悪性腫瘍の分類を広範に行ったため、腫瘍特異的解析を行うことができなかった。最後に、腸内細菌叢の動的な（すなわち、時間依存的な）性質を捉えるためには、今後の研究では縦断的なデザインも有益であろう。

本研究は、腸内細菌異常症の有病率が高いSOTR集団における腸内細菌叢の死亡率に関連するシグネチャーを明らかにした。これらの知見は、腸内細菌叢と健康との関係に関する一般的な理解だけでなく、移植コミュニティにとっても興味深いものである。我々の結果は、腸内細菌叢異常症が長期生存と関連していることを示す新たなエビデンスを支持するものであり、腸内細菌叢を標的とした治療が患者の転帰を改善する可能性を示すものであるが、その因果関係はまず特定されるべきである。

研究方法

研究デザイン

TransplantLines Biobank and Cohort study（臨床試験登録番号NCT03272841）から得られたすべてのSOTR横断的腸内マイクロバイオームデータを対象とした13。TransplantLines研究については以前に詳述されており、2015年6月からオランダのUniversity Medical Center Groningen（UMCG）で行われた成人のSOTRおよび腎臓ドナーの可能性があるすべての被験者を対象とすることを目的としていた13。TransplantLinesプロジェクトでは、移植後のさまざまな時間におけるベースラインサンプルとして、1人当たり1サンプルが含まれた。TransplantLinesとDMPの糞便サンプルは、同じ手順で採取され、同じDNA抽出プロトコールで処理された（下記参照）。

臨床データ

TransplantLines試験では、すべての移植レシピエントにアンケートに答えてもらい、血液、尿、糞便サンプルを採取した。TransplantLines試験の試験計画の根拠、組み入れ／除外基準、無作為化に関する詳細を含む詳細な説明は、Eisengaら13に記載されている。2022年1月1日を打ち切り日として、参加者が生存しているか死亡しているかを確認するために臨床記録が評価された。患者が死亡している場合は、死因を評価し、死因を心血管、感染、悪性腫瘍、その他の関連する死亡カテゴリーに分類した。サンプリング時点では、急性拒絶反応の患者はいなかった。われわれは、腸内マイクロバイオームデータが入手可能な一般集団8208人の死亡率データを収集した。データをオランダ統計局（CBS）の広範な登録にリンクさせることで、サンプル収集から2023年5月1日の打ち切り日までの追跡期間中に死亡した合計139人を観察した。死因に関するデータはなかった。

患者および一般の参加

本研究のデザイン、実施、報告、普及計画には、患者および/または一般市民は関与していない。

検体の選択と腸内マイクロバイオームデータの作成

糞便サンプルの採取とその後の処理

患者には研究受診の前日に糞便サンプルを採取してもらった。FecesCatcher（TAG Hemi VOF, Zeijen, The Netherlands）が患者の自宅に送られた。糞便は採取され、適切なチューブに入れて保存され、採取後すぐに自宅で凍結保存された（-18℃）。凍結した糞便サンプルはUMCG職員が採取し、DNA抽出まで-80℃で保存した。

DNA抽出

微生物DNAは、QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（Qiagen、ドイツ）を用いて、製造業者の指示に従って抽出した。この目的のために、QIAcube（Qiagen、ドイツ）自動サンプル調製システムを使用した。ライブラリー調製は、Qubit 4 Fluorometerを用いて測定した総DNA量が200 ng以下のサンプルについてはNEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illuminaを用いて行い、200 ngを超えるDNA収量のサンプルについてはNEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illuminaを用いて行った。ライブラリーは製造元の指示に従って調製した。メタゲノミックショットガンシークエンシングはIllumina HiSeq 2000シーケンスプラットフォームを用いて行い、サンプルあたり約8Gbの150bpペアエンドリードを生成した（平均7.9Gb、標準偏差1.2Gb）。ライブラリーの調製とシーケンシングはNovogeneとMGIで行った。

メタゲノムデータ処理

KneadData（V.0.5.1）28を用いてイルミナアダプターと低品質リード（Phred score <30）をフィルター除去し、Bowtie2（V.2.3.4.1）29を用いてヒトゲノム（hg19）にアライメントされたリードを除去した。リードの品質はFastQC toolkit (V.0.11.7)を用いて調べた。マーカー遺伝子のデータベースmpa_v20_m200を用いて、MetaPhlAn3（V.3.7.2）29で分類学的アライメントを行った。Metacycパスウェイは、HUMAnN2（V.0.11.1）31を用いてプロファイリングした。細菌のVFとARGは、病原細菌のVFsデータベース（2016年8月19日）データベース（http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm）と包括的抗生物質耐性データベース（V.1.1.1）（https://card.mcmaster.ca/）に対して、shortBRED（shortbred_identify.py（V.0.9.5）（51）とshortbred_quantify.pyツール（V.0.9.5））を用いて別々に同定した。真核生物またはウイルスの存在量がマイクロバイオーム全体の25%を超える場合、または総リード深度が1,000万未満の場合は、さらにサンプルを除外した。合計で1132の分類群（17 phyla、27 class、52 order、98 family、231 genera、705 species）が同定された。有病率10%、相対存在量閾値0.01%でフィルタリングした結果、141種、149MPが残った。以下、総和正規化を適用した。VFとARGについては、有病率10%の遺伝子のみを対象とした。解析は、UMCGおよびUniversity of Groningen (RUG)で利用可能な高性能コンピューティングインフラストラクチャ上のCentOS (release 6.9)にローカルにインストールしたツールとデータベースを用いて行った。マイクロバイオーム処理に使用したスクリプトの例は、https://github.com/GRONINGEN-MICROBIOME-CENTRE/TransplantLines。

統計解析

メタゲノムシーケンスデータは構成的な性質を持つため32、アルファ多様性の計算とCoDaCoReの実行を除き、すべての解析の前にCLR変換を用いてデータを変換した。我々は、教師なしクラスター分析（veganRパッケージのvegdistと「Jaccard」非類似度を用いて、statsRパッケージのhclust関数からWard D凝集による階層的クラスター分析を実行する）を用いてポリファーマシーを分析し、移植患者の7つの異なる投薬レジメン共同体を同定した。PCA分析の場合、CLR変換した相対量を入力として、サンプル空間はいわゆるAitchison geometryとし、サンプル間の距離はAitchison距離で特徴付けた33。Rのvegan 34パッケージを用いてShannon Diversity Indexを算出した。dysbiosis指標と死亡率との関連を分析するために、Rパッケージsurvival（V.3.5-5）の関数coxph()に実装されている多変量Cox比例ハザードモデルを用いた。独立変数として性別、BMI、移植からの年数を含めた。Salosensaariらの cox_wrapper関数を使用して、CLR変換した種の存在量と死亡率との関係を分析した8。Rのmediationパッケージのsurvreg()関数とmediate()関数を使用して、Cox回帰の多変量媒介分析を行った。veganパッケージのadonis2()関数を用いて、死亡率の距離ベース解析を行った。死亡状態、生存期間、年齢、移植からの期間をモデルに含め、すべてのSOTRについて、また9999通りの並べ替えで移植の種類によって層別化した用語の限界効果を評価した。ディスバイオーシスと腸内マイクロバイオームとの関係をさらに解析するため、一般集団の腸内マイクロバイオームデータを使用し、一般集団の分位数に従ってSOTRのCLR変換種存在量を再分類した。最後に、CoDaCoRe35を適用して、死亡状態を従属変数として、SOTR集団の死亡を最もよく予測する細菌の対数比またはいわゆるバランスを同定した。次に、SOTRごとに最も予測しやすい比率を計算し、この比率についてCox回帰分析を行った。すべての解析で多重検定の補正としてFDRを適用した36。

データ入手に関する声明

データは合理的な要求があれば入手可能である。本研究で使用した生のマイクロバイオームシーケンスデータと基本表現型は、European Genome-Phenome Archiveのアクセッション番号EGAD00001008907（https://ega-archive.org/datasets/EGAD00001008907）、EGAS00001006257（https://ega-archive.org/studies/EGAS00001006257）、EGAS00001006258（https://ega-archive.org/studies/EGAS00001006258）で入手可能である。患者の機密保持のため、メタゲノムデータセットに関連する臨床データセットは、University Medical Centre Groningenへのリクエストにより入手可能である。この臨床データセットへのアクセスには、データアクセスフォームのEメール(datarequest.transplantlines@umcg.nl)によるリクエストからなる最小限のアクセス手順が必要である。回答は2週間以内に送られる。このアクセス手続きは、データが研究／科学的目的のためにのみ要求されていることを確認し、収集されたデータが商業目的に使用されないことを明記した、TransplantLines参加者が署名したインフォームド・コンセントを遵守するためのものである。

倫理声明

公表に関する患者の同意

該当なし。

倫理承認

すべての参加者はサンプル採取前にインフォームド・コンセントに署名した。TransplantLines（METc2014/077）およびLifelines（METc2017/152）は、UMCGの地元の機関倫理審査委員会（IRB）によって承認された。両研究はUMCGバイオバンク規則を遵守し、世界医師会（WMA）のヘルシンキ宣言およびイスタンブール宣言に準拠している。

謝辞

TransplantLines-およびLifelinesコホートとバイオバンク研究の参加者全員に感謝する。フローニンゲン大学情報技術センター（RUG）の支援とPeregrine高性能計算クラスターへのアクセス提供、ゲノムコーディネーションセンター（UMCGおよびRUG）の支援とCalculonおよびBoxy高性能計算クラスターへのアクセス提供に感謝する。MMHPプロジェクトとMGIには、本研究のサンプルの塩基配列を決定していただいた。

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脚注

• X@CasSwarte、@jingyuan_fu、@HarmsenHermie、@WeersmaLab、@WeersmaLab。

• JRBとRKWは同等に貢献した。

• 共同研究者TransplantLines investigatorsC. Annema、F. A. J. A. Bodewes、M. T. de Boer、K. Damman、A. Diepstra、G. Dijkstra、C. S. E. Doorenbos、M. F. Eisenga、M. E. Erasmus、C. T. Gan、A. W. Gomes Neto、E. Hak、B. G. Hepkema、F. Klont、H. G. D. Leuvenink、W. S. Lexmond、G. J. Nieuwenhuis-Moeke、H. G. M. Niesters、L. J. van Pelt、A. V. Ranchor、J. S. F. Sanders、M. J. Siebelink、R. J. H. J. A. Slart、D. J. Touw、M. C. van den Heuvel、C. van Leer-Buter、M. van Londen、E. A. M. Verschuuren、M. J. Vos。

• 貢献者HB、JCS、SJLB、RKW、JRBがプロジェクトの構想・設計を行った。JCS、SJLB、RKWは資金を獲得。TJK、JCS、HB、EAMV、TCG、SJLBがサンプルを収集。JCSとJRBはデータの分析と解釈を行った。JCS、JRB、SJLB、RKWが原稿を執筆。JCS、RG、RKW、JRBは原稿を修正した。SZ、LMN、RG、TJK、VEDM、KD、EAMV、TCG、JF、AZ、HJMH、HBが査読に参加。JCS、SJLB、JRBおよびRKWは、本研究の作業および実施に関する全責任を負う。著者全員が最終版の原稿を承認した。

• 資金提供この研究は、オランダ経済・気候政策省（非該当）、Seerave財団（非該当）、Chiesi Farmaceutici（PA-SP/PRJ-2020-9136）、Astellas BV（非該当）、Dutch NWO/TTW/DSM（プロジェクト番号14939）、EU Horizon Europe Program（miGut-Health 101095470）、Netherlands Organization for Scientific Research（非該当）から資金提供を受けた。

• 競合利益TransplantLines Biobank and Cohort studyは、Astellas BV（TransplantLines Biobank and Cohort study）およびChiesi Pharmaceuticals BV（PA-SP/PRJ-2020-9136）から資金提供を受け、官民パートナーシップを刺激するためにTop Sector Life Sciences and Healthが提供するPPP手当によりオランダ経済・気候政策省から共同出資を受けた。TransplantLinesコホートの腎臓部分の配列決定は、オランダのNWO/TTW/DSMパートナーシッププログラムであるAnimal Nutrition and Health（プロジェクト番号14939）からSJLBへの助成金により行われ、RKWはSeerave Foundation、オランダ科学研究機構（NWO）、EU Horizon Europe Programme助成金miGut-Health：personalised blueprint of intestinal health（101095470）の支援を受けている。JFは、オランダ心臓財団IN-CONTROL (CVON2018-27)、ERC Consolidator grant (grant agreement No. 101001678)、NWO-VICI grant VI.C.202.022、Stichting AmmodoによるAMMODO Science Award 2023 for Biomedical Sciences、オランダ政府教育文化科学省によるNWO Gravitation project (024.003.001)のNetherlands Organ-on-Chip Initiativeの支援を受けている。

• 患者および公衆の参加患者および公衆は、本研究のデザイン、実施、報告、普及計画には関与していない。

• 証明および査読委託ではなく、外部査読を受けた。

• 補足資料この内容は著者から提供されたものである。BMJ Publishing Group Limited（BMJ）の審査を受けておらず、査読を受けていない可能性がある。また、査読を受けていない可能性もある。議論されている意見や推奨事項はすべて著者のものであり、BMJが承認したものではない。BMJは、本コンテンツに依拠することから生じるすべての責任および義務を否認します。コンテンツに翻訳資料が含まれる場合、BMJは翻訳の正確性および信頼性（現地の規制、臨床ガイドライン、専門用語、薬剤名、薬剤投与量を含むが、これらに限定されない）を保証せず、翻訳および翻案その他から生じる誤りおよび／または脱落について責任を負わない。
  

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